Değişik ortamlarda üretilen B. anthracis`in vejetatif ve spor

Değişik ortamlarda üretilen B. anthracis’in vejetatif
ve spor formlarından yapılan DNA ekstraksiyonlarının
etkinliğinin karşılaştırılması
Mesut ORTATATLI1, Ceren BERKMAN2,
Levent KENAR1, Hüseyin Avni ÖKTEM2,3,
GATA Tıbbi KBRN B.D. Başkanlığı, Ankara
2 NANObiz NanoBiyo Teknolojik Sistemler Ar-Ge LTD. ŞTİ, Ankara
3 ODTÜ Biyolojik Bilimler Bölümü, Ankara
1
Amaç:

Çalışmamızda sıvı ve katı besiyerinde
üretilen Bacillus anthracis’in vejetatif
ve spor formlarından yapılan DNA
ekstraksiyonlarında elde edilen DNA
miktarı ve saflığı açısından etkinlik
karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntem:
Örnek büyüklüğü için G*Power 3.1.3
paket programı kullanıldı.
 3 grup arası fark için %95 güven
aralığı, %80 power ve effect size=1
olması varsayımı ile her grup için örnek
sayısı 12 olarak hesaplandı.
 Tek yönlü varyans analizi (ANOVA)
uygulandı.

Gereç ve Yöntem:
Vegetatif Bacillus anthracis
 Sıvı BY: Tryptic Soy Broth (TSB)
 Katı BY: Koyun kanlı agar
 24 saat kültüre edildi.
 Bakteri sayısı mililitrede 108 olacak
şekilde, McFarland 0.5'e göre
ayarlandı.

Gereç ve Yöntem:
Sporulasyon için kanlı agarda üretilen
B. anthracis örnekleri buzdolabında +4
ºC’de bekletildi.
 Spor formasyonu gelişimi Schaffer
Fulton boyama yöntemi ile takip edildi.
 Sporulasyon oranı %95’e ulaştıktan
sonra McFarland 0.5'e göre ayarlandı.

Schaffer Fulton Boyama
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit
edilir.
b) Malaşit yeşili (% 5) solusyonu ile, alttan
ısıtılarak, 5 dakika boyanır.
c)Su ile yıkanır. Safranin (%0,5) veya
füchsin'le 30 saniye boyanır.
d) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon
objektifi ile muayene edilir.
Sporlar yeşil ve basiller ise kırmızı renkte
görülürler.
Schaffer Fulton Boyama
Gereç ve Yöntem:
DNA ekstraksiyonu için DNA4U
Bacterial Genomic (NANObiz, Ankara)
ticari kiti üretici firma önerileri
doğrultusunda kullanıldı.
 Elde edilen DNA’ların miktar ve saflık
analizleri spektrofotometrik yöntemle
gerçekleştirildi (sırasıyla, 260 nm
absorbans değeri ve 260/280 nm oranı
ile).

Bulgular:
Sıvı ve katı besi yerinden alınan
vejetatif basillerden sırasıyla ortalama
9.283.76 ng/l ve 4.221.49 ng/l
miktarında, 1.980.17 ve 2.830.87
saflıkta DNA elde edildi.
 Spor formundan ise 3.210.88 ng/l ve
3.982.07 saflığında DNA
ekstraksiyonu yapıldı.

Bulgular:

Her üç örnek grubundan elde edinilen
DNA miktarları ve saflıkları arasında
istatistiksel açıdan anlamlı düzeyde
fark saptandı (sırasıyla, p<0.001 ve
p=0.003).
Bulgular:
DNA Kaynağı
DNA Miktarı
DNA Saflığı
Sıvı BY
9.283.76 ng/l
1.980.17
Katı BY
4.221.49 ng/l
2.830.87
3.210.88 ng/l
3.982.07
<0.001
=0.003
Vegetatif
Spor
P değeri (ANOVA)
Bulgular:
DNA Kaynağı Karşılaştırma
(Mann-Whitney U)
DNA Miktarı
DNA Saflığı
Sıvı BY – Katı BY
0.000
0.001
Sıvı BY - Spor
0.000
0.000
Katı BY - Spor
0.046
0.141
Tartışma:

Moleküler çalışmaların temelini teşkil
eden genom ektraksiyonunda
bakterinin gram negatif ve pozitif
olmasının yanında çalışmamız üreme
ortamı ve vejetatif ya da spor
formunda olmasının da DNA miktar ve
saflığını belirleyen önemli bir faktör
olduğunu göstermiştir.
Tartışma:

Çalışmamızda kullandığımız, biyolojik
savaş ajanı tehdidinde özellikle spor
formunda kullanılma ihtimali en yüksek
olarak değerlendirilen B.anthracis’in
moleküler tanısında DNA eldesinin
beklenenden az olabileceği göz önünde
bulundurulmalıdır.