S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin

Turk J Vet Anim Sci
27 (2003) 505-514
© TÜB‹TAK
Araflt›rma Makalesi
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›*
Mine ER‹fi‹R, Sema TEM‹ZER OZAN
F›rat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dal›, Elaz›¤ - TÜRK‹YE
Gelifl Tarihi: 01.02.2001
Özet: S›¤›r rumen doku arginaz› k›smi olarak saflaflt›r›lm›fl, özellikleri araflt›r›lm›fl ve di¤er doku arginazlar›n›nki ile karfl›laflt›r›lm›flt›r.
Saflaflt›r›lm›fl enzimin spesifik aktivitesi rumen homojenat›ndan yaklafl›k 150 kez fazla bulunmufltur.
Nativ enzimin molekül a¤›rl›¤› sefadeks G-150 jel filtrasyonla 122 500 ± 2500, subünitelerinin molekül a¤›rl›¤› ise SDS-PAGE ve
sefadeks G-100 jel filtrasyonla 44 000 ± 1000 ve 34 500 ± 500 olarak saptanm›flt›r. Nativ enzim, iki farkl› molekül a¤›rl›¤a sahip
subünitelerin birleflmesi ile meydana gelen bir trimerdir.
Saflaflt›r›lm›fl enzim, aktivitesini buzdolab›, oda s›cakl›¤› ve derin dondurucuda giderek kaybetti¤inden dayan›ks›zd›r. Enzim -30 ºC
'de (derin dondurucuda) 9 günde aktivitesinin % 50'sini kaybetmektedir.
DEAE-sephacel kromatografi ile s›¤›r rumen doku arginaz›n›n tek bir anyonik formunun varl›¤› gösterilmifltir. Bir baflka deyiflle s›¤›r
rumen doku arginaz› tek bir izoenzim içermektedir. S›¤›r rumen dokusundan izole edilen arginaz›n, di¤er doku arginaz izoenzimleri
ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda A2 veya A4 formu olabilece¤i düflünülmüfltür.
Anahtar Sözcükler: S›¤›r rumen dokusu, arginaz, subünite, molekül a¤›rl›¤›
Cattle Rumen Tissue Arginase and Molecular Weights of Its Subunits
Abstract: The arginase was partially purified from cattle rumen tissue and its properties were investigated and thereafter compared
with those of other tissue arginases. The specific activity of the purified enzyme was found about 150 times greater than that of
the crude rumen homogenate.
The molecular weight of native arginase, estimated by gel filtration on a Sephadex G-150 column, was 122 500 ± 2500 and those
of subunits of the enzyme, estimated by SDS-PAGE and gel filtration on a Sephadex G-100 column, were 44 000 ± 1000 and 34
500 ± 500. This indicates that the native enzyme is a trimer composed of subunits with two different molecular weights.
The enzyme was unstable because it gradually lost its activity in a freezer, at +4 ºC and room temperature. The enzyme lost 50%
of total activity in 9 days at -30 ºC (in the freezer).
The presence of a single anionic form of arginase in cattle rumen tissue was demonstrated by DEAE-sephacel chromatography. Cattle
rumen tissue arginase contains only one isoenzyme. Arginase isolated from cattle rumen tissue may be arginase A4 or A2 form
when it is compared with those of other tissue arginase isoenzymes.
Key Words: Cattle rumen tissue, arginase, subunit, molecular weight
Girifl
L-argininin, üre ve L-ornitine dönüflümünü katalize
eden arginaz (L-arginin üreohidrolaz; EC 3.5.3.1) üre
döngüsünün anahtar bir enzimi olup, birçok organizmada
bulunur ve azot metabolizmas›nda temel bir rol oynar (1).
Gerek fare gerekse insan dokular›nda yap›lan
çal›flmalarda arginaz enziminin befl izoenzimi oldu¤u
saptanm›flt›r (2-9). ‹zoenzimlerin dokulara göre da¤›l›m›
flöyledir: Karaci¤er (A1, A2, A3, A5), böbrek, ba¤›rsak,
beyin (A1, A4), Gl. mandibularis (A3), fibroblast (A1, A3,
A4), eritrosit (A2, A4), tükürük ve Gl. parotis (A1), meme
bezi (A1, A2).
Hirsch-Kolb ve ark. (10), çeflitli üreoteliklerin
karaci¤er arginazlar›n›n molekül a¤›rl›klar›n› 120-160
kDa civar›nda bulmufllard›r. Brusdeilins ve ark. (11),
insan, domuz, s›¤›r, köpek, rat, fare karaci¤er arginaz
subünitelerinin molekül a¤›rl›klar›n› elektroforez ile
38500 ± 500 ile 39700 ± 400 aras›nda tespit
etmifllerdir.
* Bu çal›flma TÜB‹TAK (VHAG-1440) taraf›ndan desteklenmifltir.
505
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›
Üreotelik hayvanlar›n karaci¤erindeki arginaz›n ana
fonksiyonu amonya¤›n detoksifikasyonu için ürenin
üretimidir. Ancak, üre sentezi olmayan rumen gibi birçok
ekstrahepatik doku, arginaz› üre döngüsünden baflka
amaçlar için kullanmaktad›r. Argininin hidrolizinde ikinci
reaksiyon ürünü olan ornitin; poliamin, prolin ve glutamat
sentezi için bir prekürsördür (2,3,7,12-17).
S›¤›r rumen dokusu üre döngüsü ile üre sentez
edemez (18); ancak, aktif bir arginaz enzimine sahiptir
(12,19,20) ve bu dokudaki arginaz›n, amonya¤›n
detoksifikasyonundan çok azotlu bilefliklerin, rumen
içeri¤i ile rumen veni aras›nda resirkülasyonundan
sorumlu olabilece¤i ileri sürülmüfltür (19,20). Ancak,
rumen doku arginaz›n›n kesin fonksiyonu henüz
bilinmemektedir.
1960'l› y›llarda varl›¤› ortaya konulan s›¤›r rumen
doku arginaz enziminin fonksiyonu üzerine araflt›rmalar
yap›lm›flt›r. Ancak s›¤›r rumen doku arginaz› ile ilgili
çal›flmalar son derece s›n›rl› olup, rumen doku arginaz›n›n
ve subünitelerinin molekül a¤›rl›¤›, izoenzimlerinin var
olup olmad›¤› hakk›nda bir bilgi bulunamam›flt›r. Buradan
hareketle s›¤›r rumen doku arginaz›n›n belirtilen
özelliklerinin araflt›r›lmas› gerekli görülmüfltür.
Materyal ve Metot
Elaz›¤ Elet Tic. A.fi. Mezbahas›nda kesilen s›¤›rlardan
elde
edilen
rumenler
çal›flman›n
materyalini
oluflturmufltur.
Tiyosemikarbazid- Diasetilmonoksim- Üre (TDMU)
metodu (21) kullan›larak ve s›¤›r rumen doku arginaz›
için optimize edilen flartlarda (22) aktivite ölçülmüfltür.
Protein miktar›n›n ölçümünde Lowry (23) metodu
kullan›lm›flt›r.
Çal›flmada, bir ünite enzim 1 saatte, 37 ºC' de, Largininden 1 µmol üre oluflturan enzim miktar› olup,
spesifik aktivite µmol üre / saat / mg protein olarak ifade
edilmifltir.
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›:
Saflaflt›rma iflleminde önceden farkl› dokular için
uygulanm›fl ifllemlerin bir k›sm› s›¤›r rumen doku arginaz›
için uyarlanm›flt›r.
1-Tamponda homojenizasyon: Rumen homojenat›,
50 g k›y›lm›fl rumen dokusunun homojenizasyon çözeltisi
[0,05 M MnCl2.4H2O, 0,16 M KCl, 10 mM 2-
506
Merkaptoetanol içeren 0,01 M'l›k Tris-HCl tamponu
(pH:7,5)] ile 200 ml'ye tamamlan›p, homojenizatörde
(Sorvall Omni Mixer) 30 dakika kadar homojenize
edilmesiyle elde edilmifltir. Homojenat iki defa tülbentten
süzülmüfltür.
2-Homojenat›n santrifüjü: Homojenat so¤utmal›
santrifüjde +2 ºC'de 14 000 rpm'de 20 dakika (16 000g)
santrifüj edilerek homojenat süpernatant› elde edilmifltir.
3-Is›tma ifllemi: Süpernatant›n pH's› 7,5'a
ayarland›ktan sonra 60 ºC' deki su banyosunda 20 dakika
bekletilmifl ve bu süre içerisinde birkaç defa bagetle
kar›flt›r›larak s›cakl›¤›n eflit da¤›l›m› sa¤lanm›flt›r. Is›tma
iflleminden sonra homojenat, k›r›lm›fl buz içerisinde 5
dakika so¤utulmufltur. Is›tma sonucu denatüre olan
proteinleri uzaklaflt›rmak amac› ile, homojenat 14 000
rpm'de 20 dakika santrifüj edilmifltir. Elde edilen
süpernatant, süzgeç ka¤›d› ile süzülerek s›cakl›k
fraksiyonu elde edilmifltir.
4-Aseton ile ifllem: Bir önceki basamaktan elde edilen
süpernatanta, buz banyosunda 30 dakika içerisinde,
hacminin 1,5 kat› oran›nda -25 ºC'de bekletilmifl aseton
damla damla ilave edilmifltir. Kar›fl›m daha sonra 14 000
rpm'de ve -10 ºC'de 10 dakika santrifüj edilmifl,
süpernatant k›sm› at›lm›fl, peletler ise 35 ml
homojenizasyon
çözeltisi
içinde
cam-teflon
homojenizatörde homojenize edilmifltir. Daha sonra, 0,01
M Tris-HCl tamponuna karfl› 1 gece diyaliz edilen
homojenat, 17 000 rpm'de 20 dakika (25 000g)
santrifüje edilmifltir.
5-(NH4)2SO4 ile doyurma: Kat› amonyum sülfat % 45
(8,37 g/30,5 ml) doygunlu¤a eriflinceye kadar,
süpernatanta yavafl yavafl ve kar›flt›r›larak ilave edilmifltir.
Otuz dakikal›k kar›flt›rma iflleminden sonra 10 000
rpm'de 30 dakika (8500 g) santrifüj edilerek pelet k›sm›
at›lm›fl, süpernatanttaki doygunlu¤un % 60'a (12,07 g/
33ml) ulaflmas› için gerekli amonyum sülfat bir kez daha
ilave edilmifl ve ayn› ifllemler tekrarlanm›flt›r. % 60
amonyum sülfat doygunlu¤unun süpernatant› at›lm›fl ve
pelet, 5 mM 2-Merkaptoetanol içeren 0,01 M Tris-HCl
tamponunun (pH:8) 2 ml'sinde çözülmüfltür. Bu fraksiyon
diyaliz torbalar›na aktar›larak, ayn› tampona karfl› bir
gece diyalize edilmifltir. Tampon bu süre içerisinde 4 kez
de¤ifltirilmifl, diyaliz içeri¤i 11 000 rpm'de 20 dakika (10
000g) santrifüj edilmifltir.
6-DEAE-sephacel kromatografi: % 45-60
amonyum sülfat ile doyurulmufl diyaliz içeri¤i, DEAE-
M. ER‹fi‹R, S. TEM‹ZER OZAN
sephacelle paketlenmifl ve 5 mM 2-merkaptoetanol içeren
0,01 M Tris-HCl tamponunun (pH:8) 150 ml'si ile
dengelenmifl kolona (2,5x10 cm) uygulanm›flt›r; elüatlar
65 ml/saat ak›fl h›z›nda 3 ml'lik fraksiyonlar halinde
toplanm›flt›r. Enzim pH 8'de kolona adsorbe oldu¤undan
elüsyon için iyonik güç uygulanm›fl ve elüsyon ayn›
tamponda 0,01 M ile 0,5 M aras›nda NaCl'ün (9x30ml) 9
basamak konsantrasyon gradienti uygulanarak
gerçeklefltirilmifltir.
Aktif fraksiyonlar [73-84] birlefltirilmifl (fiekil 1) ve %
90 doygunluktaki amonyum sülfatla çöktürülerek
yo¤unlaflt›r›lm›flt›r. Pelet 0,01 M Tris-HCl pH: 7,5 (1 mM
MnCl2, 5 mM 2-merkaptoetanol, % 0,9 NaCl içeren)
tamponunun 2 ml'sinde çözülmüfl ve ayn› tampona karfl›
diyaliz yap›l›p 11000 rpm'de 20 dakika santrifüj
edilmifltir.
7-Jel Filtrasyon: Bir önceki basamaktan elde edilen
diyalize edilmifl örnek, % 0,9 NaCl içeren 0,01M Tris-HCl
tamponu (pH:7,5) ile dengelenmifl sefadeks G-150
kolonunda (2,5 x 27,5 cm) iyice saflaflt›r›lm›fl ve 280
nm'de absorbans al›nmay›ncaya kadar kolon tamponla
y›kanm›flt›r. Absorbanslar› yüksek olan tüplerde enzim
aktivitesine bak›larak, en yüksek aktiviteye sahip olan
tüpler [23-29] birlefltirilmifl (fiekil 2) ve sonraki
deneylerde enzim kayna¤› olarak kullan›lm›flt›r.
Molekül a¤›rl›¤› tayini:
a-Jel filtrasyonla nativ enzimin molekül a¤›rl›¤›n›n
tayini: S›¤›r rumen doku arginaz›n›n molekül a¤›rl›¤›
Andrews'in (24) metoduna göre tayin edilmifltir.
Kromatografi ifllemi, 0,1 M KCl içeren 50 mM Tris-HCl
tamponu (pH 7,5) ile dengelenmifl sefadeks G-150
süperfine kolonunda (2,5 x 27,5 cm) yap›lm›fl ve ayn›
mobil faz ile elüsyon gerçeklefltirilmifltir. Molekül a¤›rl›¤›
standart› olarak, Alkol dehidrogenaz (150 000), Albumin
(66 000), Karbonik anhidraz (29 000), sitokrom c (12
400) kullan›lm›fl ve % 5 gliserol içeren dengeleme
0.8
fiekil 1.
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n
DEAE-sephacel kromatografisi,
o- 28 nm’de absorbans,
•- Arginaz aktivitesi.
65 ml/saat ak›fl h›z›nda 3 ml’lik
fraksiyonlar toplanm›flt›r. Kolon
hacmi : 50 ml.
fiekil 2.
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n
Sefadeks G-150 jel filtrasyonu.
o- 28 nm’de absorbans,
•- Arginaz aktivitesi.
20 ml/saat ak›fl h›z›nda 3 ml’lik
fraksiyonlar toplanm›flt›r. Kolon
hacmi : 135 ml.
200
0.6
150
0.4
100
50
0.2
Arginaz aktivitesi (Ünite)
Absorbans (280 nm)
1.0
0.0
0
20
40
60
80
100
120
Fraksiyon numaras› (3 ml)
0.4
Absorbans (280 nm)
0.3
100
0.2
50
0.1
Arginaz aktivitesi (Ünite)
150
0.0
0
10
20
30
40
50
60
Fraksiyon numaras› (3 ml)
507
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›
tamponunun 1,5 ml'sinde bu standartlar s›ras› ile 7,5 - 15
- 4,5 - 3 mg olarak çözülmüfl ve kolona uygulanm›flt›r.
Arginaz›n elüsyonunda dengeleme tamponundaki KCl
yerine % 0,9 oran›nda NaCl içeren tampon kullan›lm›flt›r;
3 ml'lik fraksiyonlar toplanm›fl, elüsyon hacimleri (Ve)
saptanm›flt›r. Arginaz›n elüsyon hacmi 280 nm'de
absorbans ve enzimatik aktivitenin ölçülmesiyle
belirlenirken, herbir standart ve blue dekstran›n elüsyon
hacimleri 280 nm'de asborbans›n ölçülmesiyle tespit
edilmifltir. Void volümün (Vo) ölçülmesinde Blue dekstran
(3 mg) kullan›lm›flt›r.
b-Subünitelerin molekül a¤›rl›¤›n›n tayini:
SDS-PAGE ve Sefadeks G-100 jel filtrasyon ile
gerçeklefltirilmifltir.
SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfat- poliakrilamid jel
elektroforezi): Discontinuous SDS-PAGE tekni¤i
kullan›lm›flt›r. Laemmli (25) metodu, vertikal slab jel (10
x 8 cm) Hoefer SE 250 sistemine (Hoefer Scientific
Instruments, ABD) uygun olarak modifiye edilmifltir. Bir
mm kal›nl›¤›nda jeller haz›rlanm›fl ve stacking jelde % 3,
resolving jelde % 11 akrilamid kullan›lm›flt›r. Güç
kayna¤›, sabit ak›m modunda (20 mA /jel) kullan›lm›fl ve
so¤utma, çeflme suyu ile gerçeklefltirilmifltir.
SDS-PAGE sonucunda
birden
fazla
band
görüldü¤ünden
subünite
molekül
a¤›rl›¤›n›n
belirlenmesinde sefadeks G-100 jel filtrasyon iflleminin de
yap›lmas› gerekli görülmüfltür.
Sefadeks G-100 jel filtrasyon: Bu ifllem için
saflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku arginaz› önce EDTA ile
muamele edilmifl ve subünitelerine ayr›lmas› sa¤lanm›flt›r.
Saflaflt›r›lm›fl ve k›smen liyofilize edilmifl enzimin 1,5 ml'si
50 mM-EDTA ile 37 ºC'de 30 dakika inkübe edilmifltir (3,
26). Sefadeks G-100 kolonu (2,5 x 20,5 cm), 0,1 M KCl
içeren 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) tamponuyla
dengelenmifltir. Standart olarak Albumin (66 000),
Karbonik anhidraz(29 000), Sitokrom c (12 400)
kullan›lm›flt›r. Standartlar % 5 gliserol içeren dengeleme
tamponunun 1,5 ml'de s›ras› ile 13 - 4,5 - 3 mg olacak
flekilde çözülmüfl ve sefadeks G-100 kolonuna
uygulanm›flt›r. EDTA ile muamele edilen arginaz›n
elüsyonu 1 mM EDTA ve % 0,9 NaCl içeren 50 mM TrisHCl (pH 7,5) tamponuyla sa¤lanm›flt›r; 1,7 ml'lik
fraksiyonlar toplanm›fl, 280 nm'de absorbanslar›
ölçülerek protein içeri¤i ve enzim aktivitesi kontrol
edilmifl, elüsyon hacimleri (Ve) saptanm›flt›r. Void
volümün (Vo) ölçülmesinde Blue dekstran (3 mg)
kullan›lm›flt›r.
508
Bulgular
Arginaz oligomer formunda aktiftir ve enzimin
oligomer formlar› (izoenzimleri) iyon de¤iflim
kromatografisiyle ayr›labilir. S›¤›r rumen doku
arginaz›n›n farkl› iyonik formlar›n›n da¤›l›m›
kromatografiyle incelenmifltir. Rumen arginaz› pH 8 'de
anyon-de¤iflim kolonuna ba¤land›¤›ndan arginaz
aktivitesinin, ön tamponla y›kama ile elüe edilen
fraksiyonlar›n hiçbirinde tespit edilemedi¤i, arginaz›n
tümünün kolona ba¤land›¤› ve fiekil 1'de görüldü¤ü gibi
aktivitenin tuz gradientiyle (0,25-0,3 M NaCl içeren, 10
mM pH's› 8 olan Tris-HCl tamponu ile) tek bir simetrik
pik halinde elüe edildi¤i saptanm›flt›r. fiekil 1 tipik elüsyon
modelini göstermektedir. Bu sonuç s›¤›r rumen doku
arginaz›n›n tek bir iyonik formunun (izoenziminin)
oldu¤unu göstermektedir.
Sefadeks G-150 jel filtrasyon basama¤›nda da aktivite
tek bir pik halinde görülmüfltür (fiekil 2).
Homojenat haz›rlan›rken tamponda kullan›lacak
konsantrasyonunun
saptanmas›
optimal
MnCl2
amaçlanm›fl ve en iyi sonuçlar 50 mM MnCl2 içeren
tamponda elde edilmifltir (Tablo 1). Daha düflük ve daha
yüksek MnCl2 konsantrasyonlar› kullan›ld›¤›nda
solüsyonlar›n bulan›kl›l›¤› artm›fl ve aktivitenin düfltü¤ü
gözlenmifltir.
S›¤›r rumen doku arginaz› bu saflaflt›rma basamaklar›
sonunda % 9,59 verimle 145,90 kat saflaflt›r›lm›flt›r.
Bafllang›çta spesifik aktivitesi 2,21 olan arginazdan, k›smi
saflaflt›rma sonunda, spesifik aktivitesi 145,90 misli
artt›r›larak 322,45 olan k›smen saf arginaz elde edilmifltir
(Tablo 2). K›smi olarak saflaflt›r›lm›fl arginaz, kendi
molekül a¤›rl›¤› ve subünitelerin molekül a¤›rl›klar›n›n,
zamana ve s›cakl›¤a ba¤l› stabilitenin saptanmas› amac› ile
kullan›lm›flt›r.
Sefadeks G-150 kolonundaki jel filtrasyonla nativ
enzimin molekül a¤›rl›¤› 122 500 ± 2 500 Da olarak
bulunmufltur (fiekil 3).
Enzimin subünitelerinin molekül a¤›rl›¤›; saflaflt›r›lm›fl
enzimin, SDS-PAGE (fiekil 4)'e uygulanmas›yla ve EDTA
ile muameleden sonra sefadeks G-100 jel filtrasyonla
(fiekil 5) saptanm›flt›r. EDTA'n›n varl›¤›nda enzimin inaktif
subünitelerine dissosiye oldu¤u ve Mn iyonlar›n›n
varl›¤›nda subünitelerin nativ formu oluflturmak üzere
tekrar birleflti¤i saptanm›flt›r. Hem SDS-PAGE hem de
sefadeks G-100 jel filtrasyonla enzimin tek tip
subüniteden kurulmad›¤› (subünitelerin benzer olmad›¤›)
M. ER‹fi‹R, S. TEM‹ZER OZAN
De¤iflen Mn+2 konsantrasyonu
Tablo 1.
Protein
Arginaz aktivitesi
Spesifik aktivite
mM
mg/ml
Ünite
Ünite/ mg protein
0
16,75
10,24
0,61
5
14,49
45,13
3,11
10
13,53
48,58
3,59
50
13,17
54,34
4,12
100
28,08
53,53
1,90
200
46,99
42,48
0,90
Tablo 2.
Homojenattaki
arginaz
aktivitesinin
Mn+2
iyon
konsantrasyonuna ba¤›ml›l›¤›.
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›.
Saflaflt›rma basamaklar›
Total enzim aktivitesi
(Ünite)
Total protein
(mg)
Verim
(%)
Homojenat
3157,64
1422,96
Homojenat süpernatant›
3094,18
1176,28
60 ºC'de ›s›tma
3046,67
816
Asetonla muamele
2525,93
157,68
79,99
16,01
7,24
%45-60 (NH4)2SO4 doygunlu¤u
1459,80
29,66
46,23
49,21
22,26
DEAE-sephacel kromatografi
824,74
10,32
26,11
79,91
36,15
Sefadeks G-150 jel filtrasyon
303,11
0,94
9,59
322,45
145,90
100
Spesifik aktivite
(Ünite/mg protein)
Saflaflt›rma
(Misli)
2,21
-
97,99
2,63
1,19
96,48
3,73
1,68
Ünite = µmol üre / saat
Molekül a¤›rl›¤› x 10-3
1000
oligomerik yap›daki nativ enzimi oluflturdu¤u
saptanm›flt›r. Bu veriler nativ enzimin oligomer yap›da
oldu¤unu ve ancak 3 homolog subüniteden oluflmad›¤›n›
göstermektedir.
1
A
2
100
3
4
10
1.0
fiekil 3.
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Ve / Vo
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n molekül a¤›rl›¤›n›n tayini.
Standartlar: 1- Alkol dehidrogenaz, 150 000. 2- Albumin,
66 000. 3- Karbonik anhidraz, 29 000. 4Sitokrom c, 12 400. A- Saflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku
44 000 ± 1 000 ve 34 500 ± 500 Da molekül a¤›rl›¤›nda
iki farkl› subüniteden meydana geldi¤i bulunmufltur. Nativ
enzim molekül a¤›rl›k ve subünitelerin molekül a¤›rl›k
oran›, nativ enzimin trimerik yap›da oldu¤unu ve ikisi 45
000 ve biri 35 000 molekül a¤›rl›kl› 3 subünitenin
biraraya gelerek toplam 125 000 molekül a¤›rl›kl›
Enzimin aktivitesini koruyabildi¤i s›cakl›k ve sürenin
saptanmas› yani enzimin saklanmas› için gereken flartlar›n
(süre ve s›cakl›k) tespit edilmesi için enzimin zamana ve
s›cakl›¤a karfl› direnci ölçülmüfltür. Bu amaçla
saflaflt›r›lm›fl enzim oda s›cakl›¤›, buzdolab› ve derin
dondurucuda porsiyonlar halinde bekletilmifl ve belirli
zaman aral›klar›ndaki aktivite kayb› ölçülmüfltür. fiekil
6'da görüldü¤ü gibi her üç ortamda da enzim dayan›ks›z
olup, h›zla aktivitesini kaybetmektedir. En fazla aktivite
kayb› oda s›cakl›¤›nda olmas›na karfl›n, derin
dondurucuda da aktivite kayb›n›n süratli oldu¤u
gözlenmifl ve yaklafl›k 9 gün içerisinde aktivitenin yar›ya,
30 gün içerisindeyse % 85'lere geriledi¤i bulunmufltur.
Derin dondurucuda saklama s›ras›nda bile h›zl› aktivite
kayb›n›n görülmesi enzim çal›flmalar›n›n çok k›sa süre
içerisinde bitirilmesinin zorunlulu¤unu göstermektedir.
509
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›
I, II, III : Sefadeks G-150 basama¤›ndan sonraki enzim.
IV : DEAE- sephacel basama¤›ndan sonraki enzim.
V : Standartlar
Rf
1.0
1
0.8
2
0.6
B
3
A
4
5
0.4
6
0.2
0.0
1
fiekil 4.
10
Molekül a¤›rl›¤› x 10-4
SDS-PAGE ile s›¤›r rumen doku arginaz›n›n subünitelerinin molekül a¤›rl›¤›n›n tayini.
Standartlar: 1- α-Laktalbumin,14 200. 2- Tripsinojen, 24 000. 3- Karbonik anhidraz, 29 000. 4-Gliseraldehit- 3-P- dehidrogenaz, 36
000. 5- Yumurta albumini, 45 000. 6- S›¤›r albumini, 66 000. A ve B- Saflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku arginaz›n›n subüniteleri (A-45
000 B-35 000).
100
Molekül A¤›rl›¤› x 10-3
1
A
B
2
3
10
1.0
fiekil 5.
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Ve / Vo
Sefadeks G-100 jel filtrasyonla s›¤›r rumen doku
arginaz›n›n subünitelerinin molekül a¤›rl›¤›n›n tayini.
Standartlar: 1- Albumin, 66 000. 2- Karbonik
anhidraz, 29 000. 3- Sitokrom c, 12 400. A ve BSaflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku arginaz›n›n subüniteleri (A45 000, B- 35 000).
Tart›flma
Rat meme (7) ve böbrek (17) arginaz› so¤uk asetonla
yap›lan ifllemde denatüre olarak aktivitesini büyük ölçüde
kaybetti¤inden rat meme ve böbrek arginaz›n›n
saflaflt›r›lmas›nda bu basamaktan kaç›n›lm›flt›r. Rat meme
ve böbrek arginaz›n›n aksine, rumen doku arginaz› rat
karaci¤er arginaz› (27) gibi so¤uk asetonla ifllem ile
denatüre olmaz. S›¤›r rumen doku arginaz› saflaflt›rmadaki
›s› ile ifllem (60 ºC 20') basama¤›nda, rat meme (55 ºC 20')
ve böbrek (58 ºC 1') arginaz›n›n aksine rat karaci¤er
arginaz› (60ºC 25') gibi ›s›ya daha dayan›kl›d›r.
510
Arginaz DEAE-sephacel kolonuna ba¤lanmakta ve
0,25-0,3 M NaCl ile elüe edilmektedir (fiekil 1). Bu
basamakta elüsyon tamponunda MnCl2 kullan›lmam›fl ve
arginaz KCl yerine NaCl ile elüe edilmifltir. ‹yon de¤iflimi
basama¤›nda pH 8'de tampon içerisindeki MnCl2
presipitat oluflumuna yol açm›flt›r (28). Alkali pH'da
+2
+4
arginaz aktivitesini de etkileyen Mn 'nin Mn 'e okside
olmas› (29) nedeniyle bu basamakta tampondan MnCl2
ç›kar›lm›flt›r. Berüter ve ark. (29) insan karaci¤er ve
eritrositlerinden arginaz›n saflaflt›r›lmas›nda DEAEselluloz basama¤›nda tampondaki KCl'ün aktivite tayinini
interfere etti¤ini ve düflük aktiviteye neden oldu¤unu
bulmufllard›r. Bu çal›flmada da ayn› sonuç elde
edildi¤inden KCl yerine NaCl kullan›lmas›na karar
verilmifltir.
Yap›lan çeflitli çal›flmalarda arginaz›n multiple formlar›
(izoenzimleri) tespit edilmifltir (2-5,7-10,30-32).
Arginaz›n farkl› canl› ve dokulardaki multiple formlar›n›
belirten bu çal›flmalar›n aksine, s›¤›r rumen doku
arginaz›n›n, DEAE-sephacel kromatografi profilinde tek
bir arginaz piki olarak elüe edildi¤i bulunmufltur (fiekil 1).
Bu sonuç iyon de¤iflim kromatografisi ile tek bir arginaz
piki elde edilen di¤er çal›flmalarla uyumludur. ‹nsan
plasentas› (33), lökemik lenfosit ve granülositleri (34),
mandibular tükürük bezi-A3 (5), tükürü¤ü-A1 (6) ile soya
(28) ve bo¤a testisi-A1 (35)'nden s›¤›r rumen doku
M. ER‹fi‹R, S. TEM‹ZER OZAN
Spesifik aktivite
300
fiekil 6.
250
Saflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku
arginaz› üzerine farkl› saklama
ortamlar› ve zaman›n etkisi.
200
150
Derin dondurucu
100
Buzdolab›
50
Oda ›s›s›
0
0
5
10
15
20
25
Saflaflt›rma iflleminden sonra geçen süre (Gün)
arginaz› gibi tek arginaz formu elde edilmifltir. S›¤›r
rumen doku arginaz›n›n DEAE-sephacel kromatografi ile
ayr›labilen tek bir anyonik formunun varl›¤› ilk olarak
gösterilmifltir.
S. cerevisia'den saflaflt›r›lm›fl arginaz›n sefadeks G200 jel filtrasyonda aktivite içeren fraksiyonlar›
toplan›p -19 ºC'de sakland›¤›nda enzimin en az›ndan 2 ay
stabil kald›¤› tespit edilmifltir (36). Hirsch-Kolb ve ark.
(10), çeflitli memeli hayvanlar›n karaci¤erinden
saflaflt›rd›klar› arginaz›n derin dondurucuda birkaç hafta
boyunca aktivite kayb› göstermedi¤ini gözlemlerken, saf
soya arginaz›n›n +4 ºC'de en az 1 ay dayan›kl› oldu¤u
bulunmufltur (28). ‹nsan böbrek A1, karaci¤er A5 formlar›
-20 ºC'de depoland›¤›nda molekül a¤›rl›¤›n›n uzun zaman
120 000 olarak kald›¤›, halbuki A2, A3, A4 formlar›n›n çok
daha az dayan›kl› oldu¤u ve özellikle de arginaz A2'nin
süratle subünitelerine dissosiye oldu¤u bulunmufltur (5).
Sefadeks G-150 basama¤›ndan sonra s›¤›r rumen
doku arginaz›n›n incelenen her üç ortamda da aktivitesini
kaybetti¤i saptanm›flt›r (fiekil 6). Berüter ve ark. (29)
insan eritrositinden arginaz›n saflaflt›r›lmas› s›ras›nda
benzer inaktivasyonu gözlemlemifller ve saflaflt›r›lm›fl
eritrosit arginaz›n›n +4 ºC'de 3 gün bekletilme sonras›nda
aktivitesini tamamen kaybetti¤ini bildirmifllerdir.
Tükürük arginaz› ise rumen doku arginaz› ve di¤er
arginazlar›n tersine 0 ºC'de depolanmada daha
dayan›kl›d›r ve 2 gün sonras›nda hiç görülmeyen aktivite
kayb›n›n, bir hafta sonra ancak % 20'lere ulaflabildi¤i
gözlenmifl, fakat -10 ºC'de afl›r› derecede dayan›ks›z
oldu¤u ve bir gün sonras›nda aktivite kayb›n›n % 50'lere
ulaflt›¤› saptanm›flt›r (6). Rat böbrek arginaz›
saflaflt›r›lm›fl s›¤›r rumen doku arginaz›na benzer flekilde -
30
15 ºC'de 12 günde total aktivitesinin % 75 'ini kaybetti¤i
halde, aksine 4 ºC'de ayn› sürede aktivitesini
kaybetmedi¤i bulunmufltur (17). Enzimin elde edilmesinin
düflüklü¤ünün (Tablo 2) enzimin dayan›kl› olmamas› ve
h›zl› aktivite kaybetmesinden (fiekil 6) ileri gelebilece¤i
düflünülmüfltür.
Farkl› türlerden elde edilen subünite molekül
a¤›rl›klar› biribirine yak›nd›r; örne¤in, B. caldovelox 31
(37), A. nidulans 40 (38), N. crassa 38,3 (39), E. coli
35 (40), rat böbrek arginaz› 30 (3), insan lökemik
granülosit ve lenfositleri 37 (34), karaci¤eri (29) ve
eritrositi 35 (29,41), yer solucan› sindirim sistemi 27
(42), s›¤›r karaci¤eri için 42 (31) kDa'dur. Sadece soya
arginaz›nda 60 kDa'luk çok daha büyük subünitenin
varl›¤› bulunmufltur (28).
Nativ enzim molekül a¤›rl›k ve subünitelerin
molekül a¤›rl›k oran› arginazlar›n monomer, dimer,
trimer, tetramer, heksamer, oktamer formlar›na sahip
oldu¤unu göstermektedir.
Günümüze kadar saflaflt›r›lm›fl arginazlar molekül
a¤›rl›klar›na göre 3 s›n›f içerisinde toplanabilir. Bu
s›n›flardan ilkini düflük molekül a¤›rl›kl› monomer
(40,42) ya da dimer (43) yap›l› arginazlar
olufltururken, ikincisini orta molekül a¤›rl›kl›
proteinleri içeren 120 kDa'luk trimerik veya
tetramerik
arginazlar
(2,5,8,10,26,29,30,3436,38,41,44,45), üçüncü grubuysa daha büyük
molekül a¤›rl›kl› proteinleri içeren yaklafl›k 200-250
kDa molekül a¤›rl›¤›ndaki heksamer veya oktamer
yap›l› arginazlar oluflturur (37,39,45,46).
Nativ s›¤›r rumen doku arginaz›n›n molekül a¤›rl›¤›
sefadeks G-150 jel filtrasyonla 125 000 (fiekil 3),
511
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›
subünitelerin molekül a¤›rl›¤› SDS-PAGE (fiekil 4) ve
sefadeks G-100 jel filtrasyonda (fiekil 5) 45 000 ve 35
000 olarak bulunmufl ve bu bulgular›n s›¤›r rumen doku
arginaz›n›n iki farkl› subüniteden oluflan trimer yap›da
oldu¤unu gösterdi¤i kan›s›na var›lm›flt›r. S›¤›r rumen
doku arginaz› molekül a¤›rl›¤› ve subünite say›s› ile 2.
s›n›fa sokulabilir, ancak iki farkl› molekül a¤›rl›¤a sahip
subünite içermesi ile di¤er arginazlardan farkl›d›r. S›¤›r
rumen doku arginaz›n›n molekül a¤›rl›¤› di¤er üreotelik
türlerde ölçülen molekül a¤›rl›klar›n›n s›n›rlar›
içerisindedir. Ancak rumen doku arginaz› üzerinde
çal›fl›lmad›¤›ndan bu çal›flman›n bulgular› ancak di¤er
doku arginazlar› ile karfl›laflt›r›labilmifltir.
Çal›flmalar s›ras›nda aktivite tayinlerinde enzim
aktivitesinin de¤iflken oldu¤u farkedilmifltir. Rumen doku
arginaz›n›n aktivitesindeki de¤iflkenli¤in molekül
a¤›rl›klar› farkl› subünitelerin her zaman uygun dördüncül
yap›y› oluflturamamalar›ndan ileri gelebilece¤i söylenebilir.
Arginaz›n farkl› subünite yap›lar›n›n önemi tam olarak
ortaya konulmam›fl olmas›na karfl›n, enzim aktivitesinin
regülasyonunda önemli olabilece¤i belirtilmifltir (45).
Spolarics ve Bond (47) kontrol ve streptozotosin ile
muamele edilmifl diabetik farelerin karaci¤erinden
saflaflt›rd›klar› arginaz›n SDS-PAGE 'de iki subünite formu
gösterdi¤ini ve bu subünitelerin yaklafl›k 35 000 ve 38
000 Da molekül a¤›rl›¤›na sahip olduklar›n› bulmufllard›r.
SDS-PAGE
jelinde
saflaflt›r›lan
subünitelerin
dansitometrisinde 35 000 Da'luk subünitin, 38 000 Da'luk
subünitenin yaklafl›k iki kat› kadar oldu¤u saptanm›flt›r.
Arginaz subünitelerinin çoklu¤unun, farkl› genlerin
varl›¤›ndan ya da arginaz proteininin posttranslasyonel
modifikasyonlar›ndan kaynaklanabilece¤i öne sürülmüfltür.
Rat karaci¤er arginaz›n›n, dansitometreyle hesaplanan
3:1 oranl› 39,5 ve 37 kDa'luk 2 farkl› subünite içerdi¤i
gösterilmifl ve karaci¤erde sentezlenen sadece bir
fraksiyonun da s›n›rl› posttranskripsiyonel ya da
posttranslasyonel modifikasyon bulgular› saptanm›fl,
hücrelerdeki arginaz›n regülasyonunun tüm inceliklerinin
anlafl›labilmesinin farkl› molekül a¤›rl›¤›na sahip iki
subünitenin orjininin bulunmas› ve subünitelerin nas›l bir
dördüncül yap›yla nativ enzimi oluflturduklar›n›n ortaya
konulmas›yla sa¤lanabilece¤ini belirtmifllerdir (48).
‹nsan dokular›ndan karaci¤er A5 (ana form), A2;
böbrek A1 (ana form), A4; mandibular tükürük bezi A3
formlar› olmak üzere 5 izoenzim izole edilmifltir (5). Rat
ve insan böbrek A1 formu ve karaci¤er A5 formu
immunolojik uyumsuzluk gösterirken, A2, A3, A4 hem
anti-A1 hem de anti-A5 serumuyla reaksiyon vermesi
nedeniyle, böbrek için ana form olan A1 ve karaci¤er için
ana form olan A5'in farkl›, fakat tek tip subüniteden
kuruldu¤u, A2, A4 ve A3'ün bu subünitelerin her ikisini
içeren bir hibrit yap›s› sonucu 2 tip antijenik nitelikte
bölgeye sahip oldu¤u öne sürülmüfltür (5,9).
Yine insan eritrositlerinden izole edilen A2 ve A4, A1 ve
A5 antikorlar›yla direkt olarak reaksiyon verdi¤inden ana
arginaz formlar›n›n her ikisinin antijenik determinant›n›n
karakteristi¤ine sahip oldu¤u ve eritrosit arginazlar›n›n da
(A2 ve A4) iki ana arginaz formunun subünitelerine
tekabül eden subünitelerin iki tipinin bir hibridi oldu¤u
gösterilmifltir (8).
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n 2 farkl› molekül a¤›rl›kl›
subüniteden kurulmufl olmas› ve enzimin DEAE-sephacel
kromatografi davran›fl›yla, rat ba¤›rsak, böbrek, beyin
(2,3) arginaz izoenzimlerinin DEAE-celluloz kromatografi
davran›fl› karfl›laflt›r›ld›¤›nda, s›¤›r rumen doku arginaz›
anyonik A4 formuna, insan eritrositi (8), karaci¤eri ve
böbre¤i (5) ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda A2 formuna oldukça
benzerdir. A2 ve A4 formunun prolin metabolizmas›nda
görev ald›¤› bilinmektedir (3,7,13,16,17).
Bu çal›flmada kullan›lan saflaflt›rma ifllemlerinin s›¤›r
rumen doku arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›nda yeterli oldu¤u,
ancak antikorlar›n eldesi gibi daha ileri düzeyli
çal›flmalarda affinite kromatografisi gibi daha hassas
yöntemlerin kullan›lmas› gerekti¤i, rumen dokusundaki
bu tek anyonik formun hangi izoenzim oldu¤unun,
affinite kromatografisi gibi daha duyarl› saflaflt›rma
yöntemleri
ve
immunolojik
yöntemlerle
gerçeklefltirilebilece¤i söylenebilir.
Kaynaklar
1.
512
Powers G.S., Meister T.: Urea Synthesis and Ammonia
Metabolism. In: "The Liver: Biology and Pathobiology". Edited by
I. Arias, H. Popper,D. Schachter, D.A. Shafritz. Raven Press, New
York, 251-263, 1982.
2.
Konarska L., Tomaszewski L.: Studies on L-Arginase in Developing
Rat Small Intestine, Brain and Kidney. I. Ontogenic Evolution of
Arginase Isoenzymes, Biochem. Med. Met. Biol. 1986; 35: 156169.
M. ER‹fi‹R, S. TEM‹ZER OZAN
3.
Skrzypek-Osiecka I., Robin Y., Porembska Z.: Purification of Rat
Kidney Arginases A1 and A4 and Their Subcellular Distribution.
Acta Biochim. Polon. 1983; 30: 83-92.
4.
Van Elsen A.F., Leroy J.G.: Arginase Isoenzymes in Human Diploid
Fibroblasts. Biochem. Biophy. Res. Commun. 1975; 62: 191198.
5.
6.
7.
8.
20.
Kurelec B., Harmeyer J., Hill H.: Über Funktionen der Arginase,
Urease und Ornithin-transcarbamylase. 1.Mitteilung: Arginaseund Urease Funktion. Zbl. Vet. Med. 1968; Reihe A, 15: 460469.
21.
Zamecka E., Porembska Z.: Five Forms of Arginase in Human
Tissues. Biochem. Med. Met. Biol. 1988; 39: 258-266.
Geyer J.W., Dabich D.: Rapid Method for Determination of
Arginase Activity in Tissue Homogenates. Analy. Biochem.1971;
39: 412-417.
22.
Konarska L., Tomaszewski L., Colombo J.P., Terheggen H.G.:
Human Salivary Arginase and Its Deficiency in Argininaemia. J.
Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985; 23: 337-342.
Eriflir M.: S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Baz› Biyokimyasal
Özellikleri. F›rat Üniversitesi, Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü Doktora
Tezi. 1997.
23.
Jenkinson C.P., Grigor M.R.: Rat Mammary Arginase: Isolation
and Characterization. Biochem. Med. Met. Biol. 1994; 51: 156165.
Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J.: Protein
Measurements with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem.
1971; 193: 265-275.
24.
Andrews P.: Estimation of the Molecular Weights of Proteins by
Sefadex Gel-Filtration. Biochem. J. 1964; 91: 222-233.
25.
Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T, Nature. 1970; 227: 680-685.
26.
Porembska Z., Grabon W., Zelazowska E., Czeczot H., Zamecka
E.: Nonidentity of Subunits of Human Kidney Arginase A1 and
Human Liver Arginase A5. Acta Biochim. Pol. 1993; 40: 465470.
27.
Schimke R.T. Arginase (Rat liver). Methods Enzymol. A.1970;
17: 313-317.
28.
Kang J.H., Cho Y.D.: Purification and Properties of Arginase from
Soybean, Glycine max, Axes. Plant Physiol. 1990; 93,1230-1234.
29.
Berüter J., Colombo J.P., Bachmann C.: Purification and
Properties of Arginase from Human Liver and Erythrocytes.
Biochem. J. 1978; 175: 449-454.
30.
Konarska L., Tomaszewski L.: Studies on L-Arginase of the Small
Intestine. I. Topographical Distribution and Some Properties of
the Small Intestine L-Arginase in the Rat. Biochem. Med. 1975;
14: 250-262.
Luboinska M.K., Zamecka E., Porembska Z.: The Isolation and
Immunological Properties of Two Arginase Forms from Human
Erythrocytes. Biochem. Med. Met. Biol. 1988; 39: 247-257.
9.
Porembska Z., Zamecka E.: Immunological Properties of Rat
Arginases. Acta Biochim. Polon. 1984; 31: 223-227.
10.
Hirsch-Kolb H., Heine J.P., Kolb H.J., Greenberg D.M.:
Comparative Physical-Chemical Studies of Mammalian Arginases.
Comp. Biochem. Physiol. 1970; 37: 345-359.
11.
Brusdeilins M., Kühner R., Schumacher K.: Purification, Affinity
to Anti-human Arginase Immunoglobulin-Sepharose 4B and
Subunit Molecular Weights of Mammalian Arginases. Biochim.
Biophy. Acta. 1985; 840: 79-90.
12.
Aminlari M., Vaseghi T.: Arginase Distribution in Tissues of
Domestic Animals. Comp. Biochem. Physiol. 1992; 103 B: 385389.
13.
Carvajal N., Cederbaum S.D.: Kinetics of Inhibition of Rat Liver
and Kidney Arginases by Prolin and Branched-Chain Amino Acids.
Biochim. Biophy. Acta. 1986; 870: 181-184.
14.
Konarska L., Tomaszewski L., Rolczyk U.: Studies on L-arginase
in Developing Rat Small Intestine, Brain and Kidney. Biochem.
Med. Met. Biol. 1984; 35: 170-178.
31.
Türko¤lu S., Özer ‹.: Resolution of Multiple Forms of Bovine Liver
Arginase by Chromatofocusing. Int. J. Biochem. 1991; 23: 147151.
15.
Remesar X., Arola LI., Palou A., Alemany M.: Activities of Amino
Acid Metabolizing Enzymes in the Stomach and Small Intestine of
Developing Rats. Reprod. Nutr. Develop. 1985; 25: 861-866.
32.
Tarrab R., Rodriguez J., Huitron C., Palacios R., Soberon G.:
Molecular Forms of Rat-Liver Arginase. Isolation and
Characterization. Eur. J. Biochem. 1974; 49: 457-468.
16.
Yip M.C., Knox W.E.: Function of Arginase in Lactating Mammary
Gland. Biochem. J. 1972; 127: 893.
33.
Porta R., Esposito C., Martin A., Pietra G.D.: Arginase from
Human Full-Term Placenta. Biochem. J. 1976; 159: 579-583.
17.
Kaysen G., Strecker H.J.: Purification and Properties of Arginase
from Rat Kidney. Biochem. J. 1973; 133: 779-788.
34.
18.
Martincic T., Krvavica S.: Enzymatic Investigations in the Mucosa
of the Rumen. II. On the Presence of Arginase in the Ruminal
Mucosa of Cattle. Vet. Arh. Zagreb. 1964; Svezak 3-4: 90-93.
Reyero C., Dorner F.: Purification of Arginases from HumanLeukemic Lymphocytes and Granulocytes: Study of Their
Physicochemical and Kinetic Properties. Eur. J. Biochem. 1975;
56: 137-147.
35.
Nadolska-Lutyk J., Grabon W., Porembska Z.: Arginase in Bull
Testis. Acta Biochim. Pol. 1990; 37: 377-384.
36.
Penninckx M., Simon J.P., Wiame J.M.: Interaction between
Arginase and L-Ornithine Carbamoyltransferase in Saccharomyces
cerevisiae. Eur. J. Biochem. 1974; 49: 429-442.
19.
Harmeyer J., Kurelec B., Hill H.: Über Funktionen der Arginase,
Urease und Ornithin-transcarbamylase. 2. Mitteilung:
Ornithintrans-carbamylase Funktion. Zbl. Vet. Med. 1968; Reihe
A, 15: 510-516.
513
S›¤›r Rumen Doku Arginaz› ve Subünitelerinin Molekül A¤›rl›¤›
37.
Patchett M.L., Daniel R.M., Morgan H.W.: Characterisation of
Arginase from the Extreme Thermophile "Bacillus caldovelox".
Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1077: 291-298.
43.
Grol M., Schumacher K.: Purification and Biochemical
Characterization of Human Liver-Derived Inhibitory Protein (LIP).
J. Immunol. 1983; 130: 323-326.
38.
Dzikowska A., Le Caer J.P., Jonczyk P., Weglenski P.: Purification
of Arginase from Aspergillus nidulans. Acta Biochim. Pol. 1994;
41: 467-471.
44.
Harell D., Sokolovsky M.: Beef Liver Arginase. Isolation and
Molecular Properties. Eur. J. Biochem. 1972; 25: 102-108.
45.
Reddy S.R.R., Campbell J.W.: Molecular Weights of Arginase
from Different Species. Comp. Biochem. Physiol. 1970; 32: 499509.
46.
Hartenstein R.: Characteristics of Arginase from the Fresh-Water
Crayfish, Cambarus bartoni. Comp. Biochem. Physiol. 1971; 40B:
781-795.
47.
Spolarics Z., Bond J.S.: Comparison of Biochemical Properties of
Liver Arginase from Streptozocin-Induced Diabetic and Control
Mice. Archs. Biochem. Biophys. 1989; 274: 426-433.
48.
Diez A., Fuentes J.M., Prada F., Campo M.L., Soler G.:
Immunological Identity of the Two Different Molecular Mass
Constitutive of Liver Arginase. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1994;
375: 537-541.
39.
Borkovich K.A., Weiss R.L.: Purification and Characterization of
Arginase from Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 1987; 262:
7081-7086.
40.
Ikemoto M., Tabata M., Miyake T., Kono T., Mori M., Totani M.,
Murachi T.: Expression of human liver arginase in Escherichia coli.
Purification and properties of the product. Biochem. J. 1990;
270: 697-703.
41.
42.
514
Ikemoto M., Tabata M., Murachi T., Totani M.: Purification and
Properties of Human Erytrocyte Arginase. Ann. Clin. Biochem.
1989; 26; 547-553.
Campbell J.W., Reddy S.R.R.: A Low Molecular Weight Arginase
in the Earthworm. Biochim. Biophys. Acta. 1968; 159: 557-560.