DNA`nın izolasyonunda çeşitli yöntemlerden yararlanılır

DNA İZOLASYONU
DNA’nın izolasyonunda çeşitli yöntemlerden yararlanılır. Genelde
izole edilen kromozal veya plazmid DNA moleküllerinin saflığının kontrolü
ve miktarının tayini spektral yöntemlerle yapılmaktadır.
SPEKTRAL YÖNTEMLER
Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm. Dalga boyundaki ışığı
max. emme özelliği taşıdığından, bu dalga boyundaki emme derecesi
nükleik asitlerin miktarının bir ölçüsüdür. Buna göre DNA’nın miktar ve
saflığı,spektrofotometrede 260 ve 280 nm. Dalga boylarında elde edilecek
değerlerden belirlenebilir. 1 optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50
μg/ml. tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml. ve oligonükleotidler için ise
20 μg/ml’ye karşılık gelmektedir.
Örneğin, izole edilen DNA çift iplikli ise,miktarının belirlenmesi için
aşağıdaki formülden yararlanılır.
DNA(μg/ml) = 260 nm.deki OD x sulandırım oranı x katsayı (50)
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla
beraber tüm laboratuvarlarda rutin olarak yararlanılan en basit
yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı
olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA
fragmentlerinin ayrılmasını sağlamaktır.
DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel
bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı, molekülün
büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna,
iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.
Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks)
mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak
için kullanılır. Matriks nişasta, poliakrilamid, agaroz veya agaroz akrilamid
karışımı olabilir. Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentleri ve
RNA moleküllerinin ayırımında kullanılır. Ancak poliakrilamid jelleri
hazırlamak zordur ve uzun süre alır. Ayrıca uygulanacak DNA’nın yüksek
konsantrasyonda olması olması gerektiğinden bu tip jellerin kullanılması
pratik değildir. Bu nedenle rutin olarak en fazla kullanılan yöntem agaroz
jel elektroforezidir.
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal
bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman
polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu
oluşum geri dönüşümlüdür.
Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı
olabilmektedir. Bu durum DNA’nın göç hızını etkiler. Ayrıca kimyasal
yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz tipleride
geliştirilmiştir. Bu agarozların ayırım gücü çok fazladır. DNA jelden geri
kazanılacaksa bu tip agaroz uygun olur. Agaroz konsantrasyonu %0,5-1,5
arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Böylece küçük DNA
fragmentleri için yüksek büyük DNA fragmentleri için ise düşük agaroz
konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi
sağlanır. DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA
bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’de ışığı absorblaması sonucu
fluerosan etki göstermesi ile olur.
İzole edilen DNA’nın genomik yada plazmid DNA’sı olmasına göre
jeldeki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu
bandın aşağı yukarı kısmına doğru biraz yayılan bir görüntü verir. Plazmid
DNA ise genellikle DNA’nın üç farklı biçimi gözlenir. Plazmid DNA’sına ait
süper sarmal biçim (form 1), gevşek sarmal biçim (form 2), ve doğrusal
biçim (form 3). Molekül ağırlıkları aynı olmasına karşın bu üç formun
jeldeki göçleri farklıdır. Bu farklılık agaroz konsantrasyonuna bağlı
olmakla beraber uygulanan akıma, tamponun iyonik kuvvetine ve form
1’in yoğunluğuna da bağlıdır. Optimize olmuş koşullarda genellikle form1
diğerlerine göre daha hızlı hareket eder.
Jele fazla miktarda DNA yüklenmesi sonucunda kenar ve hız etkisi
ile jelde yanlış yorumlara yol açabilecek görüntüler ortaya çıkabilir.
Örneğin eğer fazla DNA yüklenirse keskin bir bant yerine yaygın bir
görünüm meydana gelebilir. Bazen de jelin tamamında elektrik akımının
aynı olmaması nedeniyle aynı DNA molekülleri jelin farklı bölgelerinde
değişik hızda göç edebilir. Bu durum, düşük voltaj uygulamasıyla bir
ölçüde ortadan kaldırılabilir. Ayrıca, örneğin içinde bulunduğu solüsyonun
tuz konsantrasyonu da DNA’nın jelde yürümesini etkilemektedir.
GEREKLİ MALZEMELER
Agaroz
Tri-asetat (TAE) tamponu pH 8,0
242 g.
57,1 ml.
100 ml.
(50x/litre)
Trizma-base
Glasiyel asetik asit
0,5 M EDTA (pH 8,0)
Tris-borat tamponu (TBE), pH 8,0 (5x/litre)
54 g.
Trizma base
27,5 g.
Borik Asit
20 ml.
0,5 M EDTA pH 8,0
Yükleme Tamponu ( bromophenol blue, BB )
4M
Üre
0,025 M
EDTA
%60
Sükroz
%0,025
BB
%0,025
Ksilen
TE Tamponu, pH 8,0
10 mM
1 mM
Tris-HCl pH 8,0
EDTA pH 8,0
Etidyum bromür (10 mg/ml )
Pulse Field Jel Elektroforezi
Yaklaşık 1 megabazdan daha büyük doğrusal çift iplikli DNA
molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç ederler. Bunun nedeni jelin por
büyüklüğünün doğrusal DNA’nın jelde göç edebilmesi için yeter
olmamasıdır. Por büyüklüğü konsantrasyonu % 0,1 olan agaroz
kullanılarak arttırılabilir. Fakat bu durumda jel çok kırılgan ve dayanıksız
olacağından kullanımı güçleşir. Bu problem 1984’de geliştirilen ve 5 Mb
boyutundaki DNA parçalarını da ayırabilen pulse field jel elektroforez
tekniği ile ortadan kaldırılmıştır. Bu yöntemle DNA molekülleri belirli
zaman aralıklarında birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde
bırakılır. DNA molekülleri bir elektriksel akıma uygun hareket ederken
kısa bir süre sonra diğer akıma uygunluk göstermek zorunda kalırlar.
Sonuçta küçük moleküller elektriksel alan değişimlerine daha çabuk
uyum sağladıkları için daha hızlı hareket ederler. Bu yöntemle
kromozomları ayrı ayrı görebilmek mümkündür.
Kapiler Elektroforez
Kapiler elektroforez oldukça yeni bir tekniktir ve geliştirme çabaları
hala devam etmektedir. Bu tip elektroforez çapı 20-100 mm olan küçük
kapiler boru içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı diğer
elektroforetik yöntemlerde oluşan ısının ortadan kaldırılmış olmasıdır.
Normal jeller için kullanılan max voltaj 15-40 V/cm iken, kapiler
elektroforezde 800 V/cm gibi yüksek bir akım uygulanabilir. Böylece
DNA’yı jelde yürütme süresi saatlerden dakikalara düşer ve oldukça
önemli bir zaman kazancı sağlanır.
Kapiler elektroforezde DNA’lar lazerle indüklenen fluoresan saptam
sistemi ile görüntülenmektedir. Bu teknikle 500-23000 baz çifti
arasındaki DNA fragmentleri ayrılabileceği gibi 3-5 Mb arasındaki
kromozomların da birbirinden ayrılması mümkün olmaktadır.
DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ
DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon endonükleazları (RE)
kullanımı ile yapılır. 1950’li yılların başlarında varlıkları saptanan RE’ler,
çift iplikli sarmal DNA’da özel nükleotid dizilerini tanıyan ve DNA’nın her
iki ipliğini kesen enzimlerdir. Bakterilerde bulunan bu tip enzimler
DNA’da özgün kısa dizileri tanırve kesme işlemini enzime göre değişmek
üzere tanıma yerinde veya bu yerin dışında başka özel bir dizide
gerçekleştirirler. Kesim sonucunda yapışkan uçlu DNA fragmentleri
oluşur.
Aynı DNA dizisini tanıyıp kesebilen farklı RE’ ler de vardır ve
bunlara izoşizomer denir.
DNA’NIN RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLARI İLE KESİLMESİ
İzole edilen DNA, RE ile kesime bırakılmadan önce jel elektroforezi
ile analiz edilmelidir. Eğer plazmid DNA’sı kesilecekse plazmidin 3 farklı
formunun jelde gözlenmesi gerekir.
20 μl reaksiyon karışımı içerisinde 0,2-1 μg DNA bulunmalıdır. DNA
konsantrasyonu fazla ise reaksiyon karışımının hacmi arttırılmalıdır.
Kesim reaksiyonunun durdurulması için çeşitli yöntemler
kullanılabilir. Yöntemin seçiminde örnekle ilgili olarak bir sonraki aşama
göz önüne alınmalıdır. Eğer örnek jel elektroforezi ile analiz edilecekse
kesim reaksiyonu sadece yükleme tamponu (loadıng buffer) ile
durdurulur. Eger örnek Klenow fragmenti veya ligaz etkisinde
bırakılacaksa, RE kesinlikle inaktif hale getirilmelidir. RE’lerin çoğu 65 ˚C
da, 10-20 dk. tutulduğunda inaktif hale geçer. Reaksiyon durdurucu
olarak EDTA da kullanılabilir. Kesimde kullanılan RE, magnezyum iyonunu
kofaktör olarak kullanır ve her bir EDTA molekülü iki Mg+2 iyonu bağlar.
Ayrıca dietilpirokarbonat(DEPC) eklenerek 65 ˚C’da 10 dakika
bekletilmesi sonucu RE inaktif duruma geçer. Yüksek sıcaklıkta DEPC,
etanol ve karbondioksite parçalanır. Diğer bir yöntem fenol
ekstraksiyonudur, fakat bu yöntemle DNA’nın bir kısmı kaybolabilir.
RE kesimi sonucu elde edilen DNA parçalarının kontrolü, boyutları
bilinen standart DNA fragmentleri kullanılarak jel elektroforezi ile
yapılmalıdır.