ARKEOLOJİK TOPLUMLARDA AKRABALIK İLİŞKİLERİ: BİR
advertisement
T. C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ ADLİ TIP ENSTİTÜSÜ FEN BİLİMLERİ ANA BİLİM DALI ARKEOLOJİK TOPLUMLARDA AKRABALIK İLİŞKİLERİ: BİR MOLEKÜLER ANTROPOLOJİK YAKLAŞIM DOKTORA TEZİ Şeyda Şebnem Özcan İstanbul - 2010 Babaannemin anısına… ii TEŞEKKÜR Tez çalışmamızın ortaya çıkışından itibaren beni destekleyen, sorumluluğunda olan iskelet koleksiyonundan örnekleri kullanmamı sağlayan Danışmanım Prof. Dr. M. Yaşar İşcan’a; bana zaman ayırarak teorik ve pratik bilgisiyle beni aydınlattığı, değerli yorum ve önerileri ile teze katkıda bulunduğu, tezin düzenlenmesine yardım ettiği için minnettarım. Yüksek lisans ve doktora eğitimim boyunca beni Adli Bilimler ve Adli Genetik konularında en iyi şekilde eğiten, akademik hayata başlamamı ve bu yolda ilerlememi sağlayan Prof. Dr. Ersi A. Kalfoğlu’na; çalışma boyunca bilgi ve deneyimleri ile bana yol gösterdiği, maddi-manevi her türlü desteği sağladığı için sonsuz teşekkür ederim. Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi laboratuvarının kapılarını çalışmam için açan Prof. Dr. Sevil Atasoy’a, yararlanmamı sağladığı imkânlar için teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmam boyunca bana umut ve dayanma gücü veren Yard. Doç. Dr. E. Hülya Yükseloğlu’na, zaman ayırarak tezimin son kontrollerini yaptığı için müteşekkirim. Aynı yolda yürürken her zorluğu beraber yaşadığımız Araş. Gör. Gavril Petridis’e, çalışmamın laboratuvar aşamalarında gösterdiği yardım ve harcadığı emek için; başımın sıkıştığı her anda arkeoloji bilgisine başvurduğum Arkeolog Bahar Mergen’e, benden esirgemediği yardımı ve anlayışı için teşekkür ederim. TÜBİTAK Bursu kapsamında üç ay birlikte çalıştığım İngiltere Manchester Üniversitesi’ne bağlı Manchester Disiplinler Arası Araştırma Merkezi’nden Prof. Terry Brown ve Dr. Abigail Bouwman’a, bana güvenerek laboratuvarlarında çalışmama fırsat verip konuyla ilgili öğrettikleri her şey ve halen süren destekleri için teşekkür borçluyum. A.B.D. Washington D.C.’de bulunan Smithsonian Institution’dan Alain Touwaide ve Emanuela Appetiti’ye, bana kazandırdıkları multidisipliner bakış açısı, sağladıkları tüm olanaklar, devam eden yardımları ve geleceğimle ilgili açtıkları yeni ufuklar için teşekkür borçluyum. Hayatım boyunca her konuda bana güvenen, destek olan, emek harcayan, hayatımı kolaylaştıran annemin hakkını ödeyemem. Ayrıca tez çalışmam boyunca bana ilgi ve anlayış gösteren babama, tezin basımındaki maddi yardımı ve manevi desteği için minnettarım. iii Bu tez çalışması, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği tarafından desteklenmiştir (Proje Numarası: 2571). iv ÖZET Yazar: Ş. Şebnem Özcan, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Kampüsü, İstanbul Tezin Başlığı ve Tarihi: Arkeolojik Toplumlarda Akrabalık İlişkileri: Bir Moleküler Antropolojik Yaklaşım, 2010 Eski ve modern insan toplumları arasındaki evrimsel bağlantıları belirlemek için yapılan genetik analizlerle popülasyonların birbirleri ile olan yakınlığı araştırılmaya başlanmıştır. Bu genetik ilişkiler; arkeolojik kazılarda elde edilen iskelet kalıntılarında moleküler incelemelerle belirlenir ve tarih öncesi toplumların sosyal yapısı, aile düzeni ve akrabalık ilişkileri ile ilgili bilgiler sağlar. İskelet kalıntılarından DNA elde edilmesi, adli bilimlerde de önem kazanmıştır. Çünkü kemik ve dişler uzun zaman boyunca korunduğu için analiz etmeye uygun tek kaynaktır. Ancak çevreden kaynaklanan inhibitörlerin varlığı kadar, çevresel, bakteriyel ve post-mortem DNA hasarlarından dolayı, eski kalıntılardan DNA eldesi zordur. Dolayısıyla laboratuvar çalışması; zaman alan ve özen isteyen bir süreç haline dönüşür. Bu çalışmanın amacı; Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–750/700) bölgesindeki arkeolojik kazıların iki farklı oda mezarından çıkarılmış kemiklerle bunların her birinin başka bir aileye ait olduğunu genetik analizlerle belirlemek ve sosyokültürel yapılarına bir ışık tutmaktır. Çalışmada materyal olarak Van-Yoncatepe kazı alanında bulunan oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insan femur kemiği kullanılmıştır. Kemik parçalarından alınan örneklerden DNA izole edilerek, mitokondriyal DNA HVRI bölgesinde 16147–16294 baz çifti arası bölge PCR ile çoğaltılmıştır. Daha sonra, Türkiye’de arkeoloji ve adli bilimlerde henüz uygulanmayan klonlama yapılmış ve hedef bölge dizinlenmiştir. Analiz sonunda, bireylerin taşıdığı genetik profil çıkarılarak v aralarındaki olası akrabalık ilişkileri değerlendirilmiştir. Akrabalık analizlerinin daha yakın kesinlik ve güvenilirlikle yapılabilmesi için daha fazla sayıda genetik özellik incelenmesi gerekmektedir. Bu sebeple bir ön çalışma niteliğinde olan bu proje, uygun yöntem ve çalışma planını ülkemize uyarlayarak ileriki araştırmalar için temel oluşturacaktır. Moleküler antropoloji araştırmalarında kullanılabilecek bu yöntemin, adli bilimlerde de kemikten DNA elde etme yöntemlerini geliştirmekte faydalı olacağı düşünülmektedir. vi SUMMARY Author: Ş. Şebnem Özcan, Institute of Forensic Sciences, Istanbul University, Cerrahpasa Campus, Istanbul Title and Date: Determination of the Genetic Relationships in Van-Yoncatepe Archaeological Population: A Molecular Anthropological Approach, 2010 Ancient and modern populations have been compared using genetical analysis carried out in order to determine the evolutional relationships between them. This analysis provides information regarding social structure, family systems and kinship relationships of prehistoric populations and is conducted with the skeletal samples obtained in archaeological excavations. DNA extraction from ancient and modern skeletal remains is also significant in forensic sciences as bones and teeth are the only samples to obtain and analyze DNA. Ideally DNA is best preserved in bones and teeth. However there has been numerous difficulties to carry out this procedure probably because the current technique is not properly applied. Some of the difficulties arise from bacterial damages, taphonomic factors and diagenesis. Thus the laboratory procedure to carry out to persue such an investigation takes a considerable time. The purpose of this study is to investigate genetic relationships in the ancient Urartu population who lived in Van-Yoncatepe (1200–750/700 BCE) and to assess the family composition in each burial chamber using 20 femura (Chamber M2) and 17 femura (Chamber M6) in order to shed light to the family structure and kinship pattern in the society. Mitochondrial DNA was extracted, 16147–16294 bp region in HVRI was amplified and cloned prior to the sequencing, a technique that has not been applied in Turkey to archaeologic and forensic cases. Genetic profiles of the individuals were evaluated for determining the probable kinships within and between the vii two burial chambers. In general, the more polymorphic characteristics are analyzed, the closer one comes to the true genetic (thus kinship) relationship. This preliminary analysis of skeletal remains obtained from a well-preserved burial chamber should result in better research for both forensic and archaeological populations. viii İÇİNDEKİLER Teşekkür iii Proje Desteği iv Özet v Summary vii İçindekiler ix Şekiller ve Tablolar Listesi xii BÖLÜM I: GİRİŞ VE AMAÇ 1 BÖLÜM II: GENEL BİLGİLER 3 Fiziksel ve Adli Antropoloji 3 Sosyokültürel Antropoloji 5 Akrabalık 6 Aile 8 Evlilik 9 Moleküler Antropoloji 11 Biyoarkeolojik Örnekler ve Genetik Materyal 14 Kemik 17 Diş 22 Yumuşak dokular 23 Diğer biyoarkeolojik örnekler 24 Geçmişe ait DNA’nın biyokimyasal özellikleri 28 Kromozomal DNA çalışmaları 35 Mitokondriyal DNA çalışmaları 41 ix DNA tipleme sistemleriyle akrabalık analizi 44 Akrabalık tayinlerinde istatistiksel hesaplar 48 Biyoarkeolojik Örneklerde DNA Çalışmaları 50 Birey düzeyinde aDNA Çalışmaları 51 Aile düzeyinde aDNA Çalışmaları 54 Toplum düzeyinde aDNA Çalışmaları 57 Tarihsel çevrenin rekonstrüksiyonu için aDNA 62 Tıbbi amaçlı çalışmalarda aDNA 63 İnsan evrimi çalışmalarında aDNA 65 Geçmişe ait DNA çalışma yöntemleri 66 DNA izolasyonu 67 DNA’nın çoğaltılması 69 DNA analizi 75 Biyoteknolojiden yararlanma 78 Geçmişe ait DNA'nın güvenilirliği 81 Geçmişe ait DNA çalışmalarında etik ve yasal konular 89 Eski DNA çalışmalarının adli bilimlere katkısı 92 Anadolu’da Demir Çağı 94 Van Coğrafyası 95 Yoncatepe ve Urartu Medeniyeti 95 Yoncatepe Nekropolü 97 BÖLÜM III: GEREÇ VE YÖNTEM 100 Kemiklerin hazırlanması 100 x DNA izolasyonu 101 DNA’nın çoğaltılması 103 Jelden DNA izolasyonu 105 DNA’nın klonlanması 106 Klonlama sonrası çoğaltma 109 PCR ürünlerinin saflaştırılması 111 Dizinleme 111 Dizinlerin değerlendirilmesi 112 BÖLÜM IV: BULGULAR 113 BÖLÜM V: TARTIŞMA 124 Yoncatepe materyali 125 Kemiklerin hazırlanması 128 DNA izolasyon yöntemi 132 Amplifikasyonda karşılaşılan sorunlar 134 Klonlamanın faydası 136 Klonlama sonrası çoğaltma 137 Dizin bulgularının genel değerlendirmesi 138 Mutasyon bulgularının değerlendirmesi 139 Mutasyonların haplogrup düzeyinde değerlendirmesi 143 BÖLÜM VI: SONUÇ 145 BÖLÜM VII: KAYNAKLAR 147 EKLER 193 ÖZGEÇMİŞ 197 xi ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1. Sudan akrabalık sınıflama sistemi 7 Şekil 2. Post-mortem DNA değişimlerinde hidrolitik hasar ile iplik kopmalarının meydana gelmesi 30 Şekil 3. Post-mortem DNA değişimlerinde oksidatif ve hidrolitik baz modifikasyonları 31 Şekil 4. Post-mortem DNA değişimlerinde çapraz bağların oluşması 33 Şekil 5. Königsfeld Kont’larının geleneksel aile mezarlığında arkeolojik ve tarihi kayıtlara göre çıkarılan soyağacı ile genetik soyağacının karşılaştırılması 48 Şekil 6. Yoncatepe’nin genel görünümü 96 Şekil 7. Yoncatepe arkeolojik kazı alanı 96 Şekil 8. Mezar 2’nin genel görünümü 97 Şekil 9. Mezar 2’deki buluntular 98 Şekil 10. Mezar 6’nın genel görünümü 98 Şekil 11. Mezar 6’daki buluntular 99 Şekil 12. Agaroz jelden DNA bantının kesilmesi 105 Şekil 13. DNA izolasyonu sırasında örneklerin üst fazında görülen renk farklılıkları 113 Şekil 14. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü 114 Şekil 15. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü 114 Şekil 16. Amplifikasyonun başarısız olduğu, sadece primer-dimer oluşumunu gösteren bir jel görüntüsü 115 Şekil 17. Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun olduğunu gösteren bir jel görüntüsü 116 Şekil 18. Amplifikasyonun doğru gerçekleştiği bir jel görüntüsü 116 xii Şekil 19. Amplifikasyon ürünlerinden klonlama yapılmadan önce M6-FD7 örneğinin saflaştırma sonrası dizinlenmesi 117 Şekil 20. Klonlamadan sonra gerçekleştirilen amplifikasyonda vektöre doğru bağlanan ve bağlanmayan ürünlerin tespit edildiği jel görüntüsü 118 Şekil 21. Klonlama yapılmış M6-FD6 amplifikasyon ürününün elde edilen kolonilerinden birinin dizinlenmesi 119 Şekil 22. M6-FD6 örneğine ait bir koloni dizininin Chromas programı ile işlenmesi 119 Şekil 23. M2FD3 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması 120 Şekil 24. M2FD7 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması 121 Şekil 25. M6FD5 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması 121 TABLOLAR LİSTESİ Tablo 1. Biyoarkeoloji uygulamaları, antropolojiye katkısı ve moleküler analiz yöntemleri 14 Tablo 2. İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon başarısı, dizinlenen koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar 122 xiii BÖLÜM 1 GİRİŞ VE AMAÇ Arkeolojik ve modern insan toplumları arasındaki evrimsel bağlantıları belirlemek için yapılan genetik analizler, moleküler antropolojinin gelişmesini sağlamış, böylece popülasyonların birbiri ile olan yakınlığı araştırılmaya başlanmıştır. Antropologlar için bu durum, toplumların nasıl oluşup zaman içinde nasıl geliştiğini anlamak, göç ve yerleşme şekillerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir (Lalueza-Fox, 1997; Kaestle and Horsburgh, 2002; Cunha et al., 2006). Tarih öncesi toplumların ekonomik, sosyal, hatta genetik özellikleri; arkeolojik kazılarda elde edilen iskelet kalıntıları incelenerek belirlenebilir. Antropolojik yöntemlerle kemiklerin ait olduğu bireylerin yaş, cinsiyet ve boyları tespit edilir, aralarındaki biyolojik yakınlık hakkında bilgi sağlanır (Krogman and İşcan, 1986; İşcan, 1988; Mergen and İşcan, 2007). Teknolojik imkânlardan faydalanarak, ileri analizler yapılabilmesi ve araştırmaların kesin ve güvenilir olarak tamamlanabilmesi ise ancak moleküler genetik analizlerle mümkündür (Pääbo et al., 2004). Arkeolojik kazılarla elde edilen tarih öncesi farklı toplumlara ait kemik örneklerinin genetik profillerinin kıyaslanması sonucu, eski toplumların birbiriyle veya modern toplumlarla aralarındaki ilgi saptanabilir (Jones, 2003; Cooper et al., 2004). Arkeolog ve antropologların kurdukları hipotezler de moleküler araştırmalarla doğrulanır veya reddedilir. Toplumların tarihinin daha iyi anlaşılması için eski biyolojik örneklerde DNA çalışmalarının bireysel genetik bilgilerin tespitinin ötesine geçerek kişiler arasındaki akrabalık bağlarının belirlenmesi gerekmektedir (Dudar et al., 2003). Eski kemik 1 örneklerindeki DNA, aynı mezarda grup halinde gömülenlerin akraba olup olmadıklarını göstererek bu değişimi açığa çıkaracak bir potansiyele sahiptir. Bu sebeple söz konusu örneklerin DNA analizi ile biyolojik ilişkilerinin belirlenmesi önem taşımaktadır. Defin alanlarında bulunan kemiklerin ait olduğu bireyler arasındaki akrabalık ilişkileri; tarih öncesi toplumların kültürü, sosyal yapısı ve aile düzeni ile ilgili veri sağlar (Gross, 1992; Haimes, 2006). Toplumların tarihlerinde güçlü etkilere sahip olan göç ve aynı soydan yapılan evlilikler hakkında bilgi verir (Finkler, 2005). İskelet kalıntılarından DNA elde edilmesi, adli bilimlerde de önem kazanmıştır. Çünkü kemik ve dişler uzun zaman boyunca korunduğu için analiz etmeye uygun tek kaynaktır. Yıllarca çeşitli çevre şartlarına maruz kalan kemik örneklerinden DNA verilerinin elde edilebilmesi, kaybolan veya bilinmeyen bireylerin idantifikasyonunda değerli ve önemli bir araçtır (İşcan and Altunçul, 2002). Ancak çevresel, bakteriyel ve post-mortem DNA hasarlarından dolayı, eski kalıntılardan DNA eldesi zordur (Prado et al., 1997; Capelli et al., 2003; Loreille et al., 2007). Geçmişe ait DNA örneklerinin degrade yapısından dolayı, tarih öncesi materyalleri genetik olarak tiplemede tercih edilen molekül, çoğunlukla yüksek kopya sayısından dolayı mitokondriyal DNA (mtDNA) olmaktadır (O'Rourke et al., 2000). Bu çalışmanın amacı; Demir Çağı’na ait Van-Yoncatepe bölgesindeki arkeolojik kazılarda iki farklı oda mezardan çıkarılmış kemiklerin ait olduğu bireylerin olası akrabalık ilişkilerini genetik analizlerle belirlemek ve bu arkeolojik toplumun sosyokültürel yapısına bir ışık tutmaktır. Bu amaca yönelik olarak, öncelikle arkeolojik iskeletlerden DNA eldesi için kullanılan yöntemlerin yerel şartlarda denenmesi, gerekli değişikliklerin yapılarak protokollerin Türkiye'ye uyarlanması hedeflenmiştir. 2 BÖLÜM 2 GENEL BİLGİLER Yunanca ‘anthropos’ (άνθρωποϛ, insan) ve ‘logos’ (λόγος, bilim) kelimelerinden oluşan antropoloji; insanın biyolojik ve kültürel çeşitliliğini inceler, zaman ve mekân içindeki benzerlik ve farklılıkları açıklamaya çalışır. Geçmiş ve şimdiki zamana, biyoloji, toplum, kültür ve dile ilgi; antropolojiyi sosyoloji, siyaset bilimi, iktisat, psikoloji ve tarih gibi birçok başka alana bağlar (Hunter and Whitten, 1993). Genel antropolojinin dört alt disiplini, sosyo-kültürel, arkeolojik, biyolojik ve linguistik antropolojidir. Kültürel antropoloji, geçmişteki ve günümüzdeki kültürel çeşitlilikle ilgilenir. Arkeolojik antropoloji ya da arkeoloji, geçmişe ait kalıntılar elde ederek tarih öncesi toplulukların sosyal, iktisadi, dinsel ve siyasal yapılarını yeniden oluşturmaya yardımcı olur. Biyolojik ya da fiziksel antropoloji; zaman ve mekân içindeki biyolojik çeşitliliği çevredeki farklılaşmalarla ilişkilendirir, fosilleri, genetiği, büyüme ve gelişmeyi, bedensel tepkileri ve primatları inceler. Linguistik antropoloji ise, çağdaş dillerin çeşitliliğini belgeler, konuşmanın farklı toplumsal koşullarda ve zaman içinde nasıl değiştiğini araştırır (Hunter and Whitten, 1993; Kottak, 2001). FİZİKSEL VE ADLİ ANTROPOLOJİ Fiziksel antropoloji; fosil kayıtlarının ortaya çıkardığı hominid evrimi (paleoantropoloji), insan genetiği, insan büyümesi ve gelişimi, insanın biyolojik esnekliği ve insan dışı hominidlerin biyoloji, davranış ve toplumsal yaşamı olmak üzere farklı ilgi alanlarına sahiptir. Bunlar, fiziksel antropolojiyi; biyoloji, zooloji, jeoloji, anatomi, 3 fizyoloji, tıp ve halk sağlığı gibi diğer alanlara bağlar (Hunter and Whitten, 1993; Kottak, 2001; Katzenberg and Saunders, 2008). Adli antropoloji ise, fiziksel antropolojinin adli amaçlı kullanımı olarak tanımlanır ve osteolojiden insan fizyonomisine kadar uzanan bir dizi konu ile ilgi kurar. Bu bilim dalı her geçen gün daha fazla disiplinler arası hale geldiğinden diğer uzmanlarla iş birliğinin önemli olduğu unutulmamalıdır (İşcan, 1988; İşcan and Loth, 1997; İşcan, 2001; Cattaneo, 2007). Adli antropoloji kavramını ilk ortaya atanlardan biri olan Thomas Dwight’tır. Bu dönemden sonraki gelişmeler 1970’lere kadar sürmüş; bu süreç içinde yapılan araştırma ve incelemelerle bazı standartlar ve osteometri teknikleri geliştirilmeye çalışılmış, bu çalışmalar için materyalin büyük bir bölümünde, bütünlüğünü koruyan insan iskeletlerinden oluşan koleksiyonlar (örneğin, Terry ve Hamann-Todd koleksiyonu) kullanılmıştır. Bu tür iskelet koleksiyonları üzerinde yapılan antropolojik incelemelerle, ölüm sırasındaki yaş, boy, fizikî yapı, cinsiyet, ırk, meslek, alışkanlıklar, ölüm nedeni, ölüm zamanı, kemik travmaları, kemiklerin kaç iskelete ait olduğu, dişlerle ilgili veriler, vb. çok sayıdaki sorunun yanıtlanabilmesi için formüller, skalalar, mikro ve makromorfolojik yöntemlerle radyolojik kriterler geliştirilmiştir. Arkeolojinin bu aşamadaki katkısı; yanma, alevin geliş yönü, iklim, fiziksel kalıntılar, makro ve mikroorganizmaların etkisi, arazi yapısı gibi çevre koşullarının tespitinde önem kazanmaktadır (Krogman and İşcan, 1986; Çöloğlu and İşcan, 1998). Adli antropoloji sadece bireysel olgularla ilgilenmez, aynı zamanda savaş kurbanları ve kitlesel felaketlerde de kullanılabilir (Mundorff and Bartelink, 2007). Antropologlar sıklıkla olmamakla birlikte insan kalıntılarının aranmasında ve elde edilmesinde görev alabilirler. Özellikle adli antropologlar gömülmüş kalıntıların doğru bir 4 şekilde aranmasını sağlayacak teknikler konusunda bilgi sahibi olmalıdır. Yıllar geçmişse ve alan ağaçlıksa, bir gömü bölgesini belirlemenin zorluğu açıktır. Alanda yürüme, fotoğraflama ve diğer arkeolojik yöntemler bilinmeli, bunun yanında ceset arama köpeklerinin, radarların veya derin olmayan mezarlarda gömülü insan kalıntılarının tespiti için kimyasal sensörler yoluyla dekompoze koku analizi yapan taşınabilir analitik aletlerin kullanımı ile ilgili yeni gelişmeler de takip edilmelidir (Stewart, 1979; Cattaneo, 2007). Fiziksel antropologlar, kısmen/tamamen iskeletleşmiş kalıntılarda, ileri derecede kömürleşmiş ve gömülmüş bedenlerin yer aldığı olgularda en önemli personeldir. Bu tip olgularda gözlem yapmak, kaydetmek ve materyali toplamak osteoloji bilgisini gerektirir (Çöloğlu and İşcan, 1998; Cattaneo, 2007). Adli osteoloji, insana ait olan veya olduğu sanılan az ya da çok iskeletleşmiş kalıntıları inceleyerek, adli veya sosyal amaçlara yönelik kimlik tespiti yapan bilim dalıdır (Çöloğlu and İşcan, 1998). Ölümden sonra geçen süre, aslında adli antropologlar tarafından cevaplandırılacak en zor sorulardan biridir. Bazen bir olgunun geçmiş toplumlardan mı, yoksa adli bir olgu mu olduğunu söylemek imkânsızdır. Eğer kuru bir kemik söz konusu ise, bir antropolog sadece kemiğin arkeolojik, eski veya yeni göründüğü ilgili bir fikir beyan edebilir, kesin bir şey söyleyemez. Burada sorun, ölüm zamanını ölçmek için kesin bir yöntem olmayışıdır. Ancak on beş yıl ile elli yıl farkını belirlemek özellikle hukuksal süreçte önemli olabilir (Krogman and İşcan, 1986; Cattaneo, 2007). SOSYOKÜLTÜREL ANTROPOLOJİ İnsan toplulukları, sadece alışılagelmiş toplumsal etkinlikler ve ilişkiler çerçevesinde değil, aynı zamanda ortak bir kültürel geleneğe açık olma yoluyla örgütlenir. 5 Öğrenme yoluyla aktarılarak paylaşılan kültür, toplumsal yaşama uyum sağlamanın temel nedenidir. Tylor’a göre kültür, bir toplumun üyesi olarak insanın kazandığı bilgi, inanç, gelenek, sanatsal faaliyet, hukuk, ahlaki değerler ve diğer yetenek ve alışkanlıkları içeren karmaşık bir bütündür (Kottak, 2001). Kültüre temel oluşturan yetenekler; öğrenebilme, simgesel düşünebilme, dili yönlendirebilme, yaşamlarını örgütlemek ve çevreye uyum sağlayabilmek için gereken alet ve diğer kültürel ürünleri kullanabilme gibi kabiliyetlerdir. Her çağdaş insan topluluğu, simgeleştirme ve böylece kendine özgü bir kültür yaratıp onu sürdürebilme yeteneğine sahiptir. Kültürel özellikler, bir gruptan diğerine yayılabilir. İki ayrı kültür; ödünç alma ve yayılma yoluyla kültürel deneyimlerini ve uyarlanma araçlarını paylaşabilir. Kültürel ödünç alma, bütün insanlık tarihi boyunca sürmüştür. Yayılma, göçler ve çok uluslu toplumlar aracılığıyla pek çok kültürel özellik, uluslar arası boyut kazanır. Aynı toplumun ya da ulusun insanları, bir kültürel geleneği paylaşsalar da, tüm kültürlerde çeşitlilik mevcuttur. Geçmişteki ve günümüzdeki bu kültürel çeşitlilik de kültürel antropolojinin konusudur. (Gross, 1992; Kottak, 2001). Akrabalık İnsanlık tarihinin büyük bir kısmında insan yaşamını düzenleyip örgütleyen akrabalık ve soydanlık sistemleri, antropolojinin önemli bir parçasıdır. Akrabalar, çoğu kez aynı yörede yaşar, birlikte çalışır, dua eder, kutlama yaparlar (Kottak, 2001). Türk kültüründe ‘akraba’ kelimesi Arapça ‘karîb’ (yakın) kelimesinin çoğul hali olan ‘akrîba’dan gelmektedir. Etimoloji sözlüğünde “kan ve evlilik yoluyla birbirine bağlı kimseler, hısım” olarak tanımlanır. ‘Hısımlık’ da Arapça’dan Türkçe’ye giren bir kelimedir 6 ve “yakınlık, evlilik bağıyla yakınlık” anlamındadır. Anadolu’nun bazı bölgelerinde akraba ve hısım aynı anlamda kullanılsa da, aralarında kan bağı olanlara ‘akraba’, olmayanların evlilikleriyle oluşan yakınlıklara ‘hısım’ dendiği bilinmektedir. İngilizce’de ise ‘akraba’, halk birliği, aile anlamına gelen ‘kin’ sözcüğü ile karşılanır (Ayan et al., 2002). Farklı kültürlerdeki insanlar, akrabalarını belirtmek için değişik bir terminoloji kullanırlar. Bu terimler, akrabalığın toplumsal yapılanmasını yansıtır. Belirli bir toplumda yaşayan insanlar tarafından kuşaklar boyunca geliştirilen yerel bir taksonomi vardır ve sınıflayıcı bir sistem olan bu terminoloji, insanların benzerlikleri ve farklılıkları nasıl algıladığına dayanır. En basit sınıflandırma, günümüzde Amerika’da kullanılan Eskimo sistemi olup, akrabalık ilişkilerinde erkek ve kadınlar eşit derecede (ikiyanlı) izlenir. Türk toplumunda kullanılan Sudan sınıflandırma sistemi ise daha karmaşıktır, her nesil ve her birey için ayrı bir terim mevcuttur (Şekil 1). Örneğin; Eskimo sisteminde annenin ve babanın erkek kardeşi ‘uncle’, kız kardeşi ‘aunt’ olarak isimlendirir. Bu terimler aynı zamanda ebeveynlerin kardeşlerinin eşleri için de kullanılır. Sudan sisteminde ise bu bireyler sırasıyla dayı, amca, teyze, hala, enişte ve yenge olarak adlandırılır (Kottak, 2001). 3 5 1 = 2 4 6 Ego Şekil 1. Sudan akrabalık sınıflama sistemi, 1: Anne (Mother), 2: Baba (Father), 3–4: DayıAmca (Uncle), 5–6: Teyze-Hala (Aunt) (Kottak, 2001). 7 Bazı antropologlar, akrabalık terimlerinin eğilim ve davranışlar için bir ipucu olduğuna inanırlar. Bazıları bu adlandırmaların kişinin toplumda taşıdığı hakları ve zorunlulukları yansıttığını düşünürken, üçüncü grup bunun eğilimden ziyade sınıflandırma yapmayı sağladığını ifade etmektedir (Gross, 1992). Akrabalık; takımlarda, kabilelerde ve şefliklerde yaşamsal önem taşır. Böyle kültürlerde akrabalık ve soydanlık, kişiler arası ilişkilerin ve siyasal örgütlenmenin düzenlenmesinde temel rol oynar (Kottak, 2001). Aile Aile, toplumdaki en küçük akrabalık birimi olarak tanımlanabilir ve toplumları karşılaştırmada kullanılır. Ancak kişiler herhangi bir biyolojik bağ olmadan da ailelere ait olabilir. Örneğin evlat edinilmiş bir çocuk veya evlilikle bir aileye girmiş kişi gibi. Dolayısıyla aile, kan bağına veya evlilik ilişkisine dayanan sosyal birimdir. Ailenin en iyi bilinen şekli; bir veya iki ebeveyn ve onların çocuklarından oluşan çekirdek ailedir. Birçok toplumda aileler, çevrelerindeki şartlar değiştiğinde yapısal ve fonksiyonel olarak farklılaşır ve ortama uyum sağlar (Gross, 1992). Aile ve diğer akrabalık bağları bireye sosyal bir kimlik verir, saygınlık kazandırır. Ailelerin sosyal durumu, bireylerin eğilimlerini ve birbiriyle ilişkilerini şekillendirir. Akrabalık bağları bireylerin sahip olacağı olanakları belirlemede önemlidir. Neredeyse her toplumda var olan miras kuralları; malların ve değerli eşyaların akrabalar arasında geçişini belirler. Hatta sadece mallar değil, rütbeler, gruplar içindeki üyelikler, siyasal liderlikler veya özel roller de miras gibi aktarılabilir (Gross, 1992). Akrabalık sistemlerinin modern toplumlardaki yeri ve önemi üzerine yapılmış 8 sosyolojik çalışmalarla, ailenin topluma değil, toplumun aileye ve akrabalık sistemlerine biçim verdiği söylenebilir (Ayan et al., 2002). Aile ve akrabalığın genetik açıdan tanımlanması ise, bireylerin aralarındaki kalıtımsal benzerliklerle belirlenen biyolojik bağlara dayanır (Finkler, 2005). Tarihi mezarlarda soy ağacı oluşturmak için yapılan akrabalık analizleri, antropolojide her zaman eksikliği duyulan bir konudur. Bireylerin veya popülasyonların ilişkilerini belirlemek için genetiği yansıtan morfolojik özellikler kullanılan birçok girişim mevcuttur. Ancak benzerlikleri göstermek fenotipik özelliklerin doğası gereğidir. İnsan genom projesine rağmen birçok fenotipik özelliğin genetik alt yapısı halen bilinmemektedir. Bu sebeple birey idantifikasyonu ile akrabalığın ortaya çıkarılmasını sağlayan, kodlama yapmayan ve yüksek polimorfizm gösteren moleküler analizler, tarihî antropolojide büyük bir adımdır (Hummel, 2003). Evlilik Yeni bir çekirdek ailenin temeli olan evlilik, genel olarak erkek ve kadın arasında kurulan birlik olarak tanımlanabilir. Ancak hiçbir evlilik tanımı, tüm toplumlara kolayca uygulanabilecek kapsamda değildir. Örneğin; eşcinsel evlilikleri kabul eden bazı uluslar olduğu gibi, çoğul evlilikleri yasal olarak gören toplumlar da vardır (Kottak, 2001). Birçok topluma uyan bir tanım, evliliğin ‘çocuğun sosyal kimliğini ve hukuksal durumunu oluşturan yazılı veya sözlü bir anlaşma’ olduğudur. Bu anlaşma, cinsel birliktelik hakkını verebilir ve malların paylaşımında düzenlemeleri de içerebilir (Gross, 1992). Evlilik kültürel olarak evrenseldir ve cinsellik, üreme-çoğalma, ekonomi ve eğitim olmak üzere dört önemli sosyal işlevi yerine getirir (Kottak, 2001). Evlilik; para, eşya, 9 emek gücü, çocuk hakkı ve sosyal gruplara katılım gibi değerleri içerir. Bazı toplumlarda damat tarafından gelinin ailesine para ödenmesi yaygındır. Bazılarında da gelinin ailesi, bir miktar para sağlamak zorundadır (Gross, 1992). Eşler ve onların akrabaları arasında sosyal olarak anlamlı bir “hısımlık ilişkisi” kuran evlilik, gruplar arasında anlaşmalarla toplumsal örgütlenmeyi dışarıya yöneltir (Dış evlilik). İç evlilik ise kişiyi ait olduğu grup içinde evlenmeye zorlar. Bu, kimi zaman aynı aile içinde bile gerçekleşebilir (Kottak, 2001). Örneğin, çapraz (dayı oğlu- hala kızı, hala oğlu- dayı kızı) veya paralel (amca kızı- amca oğlu, teyze kızı- teyze oğlu) yeğen evlilikleri (parallel-cousin or cross-cousin marriage) görülebilir (Ayan et al., 2002). Ayrıca baldız evliliği (bir adamın, ölmüş karısının kız kardeşiyle evlenmesi) ve/veya kayınbirader evliliği (bir kadının, ölmüş kocasının erkek kardeşiyle evlenmesi) de mevcuttur (Kottak, 2001). Akraba evlilikleri (consanguineous marriage) tıp alanındaki çalışmalarla bir sorun olarak kendini gösterse de, kökleri tarihin erken dönemlerine dayanır ve akraba evliliklerinin ; geleneksel, töresel ve örfî nitelikli kültürel boyutları vardır (Ayan et al., 2002). Türk kültüründe İslam öncesi dönemin akraba evliliği açısından farklı coğrafyalarda ve farklı kültür ortamları ile etkileşimde nasıl bir durum gösterdiğinin ayrıntılı olarak tespit edilmesi başlı başına bir konudur. Ancak genel olarak Arap kültür çevresinden farklılıklar gösterdiği, İslamiyet’in kabulü ile bu iki kültür çevresinin önemli düzeyde etkileşime girdiği bazı kaynaklarda belirtilmektedir. Güncel araştırma verileri, özellikle Anadolu’da dikkate değer oranda akraba evliliğine işaret etmektedir. İlk bakışta bu oranın yüksekliği, kentleşme, eğitim ve refah düzeyinin düşük olması ile açıklanabilse de, daha çok kültürel nedenli olduğu izlenimi doğmaktadır (Ayan et al., 2002). 10 Akraba evliliklerinin oranı, endüstrileşmiş Batı toplumlarında çok düşük olmasına rağmen; Türkiye bazı Asya ve İslam ülkeleri gibi akraba evliliğinin yüksek olduğu ülkeler arasındadır. Gerek etnik köken, gerekse bireylerin yetiştiği yörelere göre akraba evliliği oranlarında önemli farklılıklar bulunması, bu tip evliliklerin nedenleri arasında yöresel ve kültürel geleneklerin önemli bir yer tuttuğuna işaret etmektedir (Ayan et al., 2002). Ensestin yasaklanması ve dış evlilik kuralları, insanları eş seçmek için aile dışına yönlendirir. Bu durum, yeni hanelerin oluşumuna sebep olur. Her toplumda yeni hane oluşturmak için kurallar veya tercihler vardır. Evlilik sonrası yerleşme kuralları, evlenen çiftlerin nerede yaşayacakları hakkındaki tercihlerini veya zorunluluklarını belirler. Patrilokal (erkek tarafında) yaşam, damadın ailesi ile beraber veya onun ailesine yakın oturmaktır. Bu, geleneksel Çin toplumunda tercih edilen bir kuraldır. Matrilokal (kadın tarafında) yaşam ise, gelinin ailesiyle birlikte veya onun ailesine yakın oturmaktır. Arizona’da yaşayan Batılı Apaçi Kızılderilileri, matrilokaldir. Günümüzde neolokal (yeni bir yerde) yaşam da görülmektedir; çiftler hem gelin hem de damadın ailelerinden uzakta, bağımsız bir yerde oturmayı tercih ederler (Gross, 1992). Arkeolojik gruplar, özellikle avcı-toplayıcı toplumlar, düşük düzeyde çeşitliliğe sahiptir; çünkü az nüfusları, kendi aralarında çiftleşmeye ve yüksek genetik kaymaya sebep olur (Kaestle and Horsburgh, 2002). Bunun yanında akraba evlilikleri, alel frekanslarının Hardy-Weinberg dengesinden sapmaya neden olabilir (Gerstenberger et al., 1999). MOLEKÜLER ANTROPOLOJİ Organizmalardaki büyük moleküllerin yapı ve fonksiyonlarını inceleyen moleküler biyoloji, elde ettiği bilgilerle birçok bilimsel alana katkı sağlar veya yeni bilim dalları 11 oluşturur. Örneğin moleküler psikiyatri, beyindeki moleküllerin işlev bozukluğunu inceleyerek mental hastalıkları teşhis ve tedavi için girişimlerde bulunmayı hedefler. Moleküler analizler, eski ve modern toplumlar arasındaki evrimsel bağlantıları veya toplum içindeki yakınlık ilişkilerini belirlemeye yarayarak, antropolojiye de yardımcı olmaktadır. Genetik yapıdaki benzerlik veya farklılıklar, insan gruplarının coğrafik kökenleri hakkında bilgi verir. Böylece antropolojinin ilgi alanı olan göç ve yerleşme özelliklerinin zaman içinde gelişimi takip edilir; toplumların yaşayış düzeni, beslenme alışkanlıkları ve ölü gömme gelenekleri ile ilgili veri sağlanır (Brown, 2006). Zaman ve kültür açısından farklı olan ölü gömme, birçok sosyal, fiziksel, dini ve ekonomik faktörden etkilenir. Askeri mezarlıklar, kimsesizler mezarlığı, kilise mezarlıkları, köy mezarlıkları, aile mezarlıkları, anıtmezarlar, vb. uzun bir liste insanların kendilerini kimliklendirdikleri veya organize ettikleri çeşitli yolları (akraba grupları, din, sosyal sınıf veya meslek) yansıtır (Stodder, 2008). Sosyal bilimlerle modern biyolojinin kesişim noktası olan moleküler antropoloji, son yıllarda ortaya çıkmış bir bilimsel alandır. Protein ve nükleik asitler gibi büyük moleküller kullanıldığı için ‘moleküler’, toplumların tarih öncesindeki yapılarıyla ilgili bilgiler elde etmeye yaradığı için ‘antropoloji’ kelimeleri ile ifade edilir. Moleküler antropoloji, ilk kez 1962’deki bir antropoloji konferansında biyokimyager Emile Zuckerkandl tarafından “biyomoleküllerin yapısındaki farklılıklardan yararlanarak insan evrimini incelemek” tanımı ile kullanılmıştır. Buradaki çelişki, alanın bir çeşit antropoloji bilimi gibi durmasına karşılık, aslında antropolojik sorulara uygulanan biyokimya teknolojisi olmasıdır. Marks’a (2002) göre; moleküler antropoloji, sadece moleküler teknikleri antropolojiye uyarlamaktan çok, antropolojik bilgiyi moleküler verilerle 12 birleştirdiğinde geçerli ve kalıcı olur. Paleontoloji ve arkeolojiye dayanan geleneksel antropoloji, artık günümüzde moleküler biyolojiden de yarar sağlamaktadır. Moleküllerle ilgili bilgiler, paleontoloji ve arkeolojinin önemini değiştirmez, daha fazla veri sağlayarak bu bilim dallarıyla beraber antropolojiye katkıda bulunur (Marks, 2002; Cunha et al., 2006). Bazı olgularda sadece genetik analiz yapılması yeterli olmaz, çünkü moleküler araştırmalar, antropolojik verilere ihtiyaç duyar. Yaş veya boy gibi önemli biyolojik bilgileri sağlamak genetik analizlerle mümkün değildir. Antropolojik kimliklendirme, DNA laboratuvarları tarafından analiz edilecek örneklerin sayısını azaltır. Bu sebeple pozitif idantifikasyon yapılabilmesi için antropoloji ve genetik, arkeolojik verilerle birlikte kullanılmalıdır (Imaizumi et al., 2002; Capelli et al., 2003; Cunha et al., 2006; Christensen et al., 2007). Her türlü arkeolojik kalıntının moleküler tekniklerle analiz edildiği bu alan, çeşitli araştırmacılar tarafından “moleküler veya biyomoleküler arkeoloji”, “biyoarkeoloji” ya da “arkeogenetik” olarak da adlandırılmaktadır. Özellikle nesli tükenmiş canlıların fosillerinden elde edilen genetik özelliklerin modern örneklerle kıyaslanması için yeni bir yoldur. Biyomoleküler arkeoloji; fizik, kimya, jeoloji ve moleküler biyoloji ile disiplinler arası çalışmalar yaparak evrim, göç, beslenme, evcilleştirme gibi konularda önemli bilgiler sağlarken, paleopatoloji (hastalıkların tarihinin belirlenmesi) ile de ilgilenir (Capelli et al., 2003; Renfrew, 2003; Stone, 2008). Antropoloji ve arkeoloji bilimleri, çeşitli amaçlarla gerçekleştirilen moleküler düzeyde analizlerle daha ayrıntılı ve kesin bilgiler elde etmeyi sağlar. Örneğin; modern insanın evrimi ve göç yollarının araştırılması, tarih öncesi toplumların sosyal yapıları, kültürel özellikleri, ekonomik düzenleri, beslenme alışkanlıkları, sağlık sorunları, yaşayış 13 tarzları, geleneklerinin anlaşılması, hayvanların evrimi ve birbiriyle filogenetik yakınlıkları, evcilleştirilme zamanları, beslenme alışkanlıkları, bitkilerin evrimi ve birbiriyle filogenetik yakınlıkları, Neandertaller ve modern insanları da içeren nesli tükenmiş ve yaşayan canlıların filogenetik ilişkileri; moleküler tekniklerle araştırılır. Bunlardan her biri kendi alanında özel ve önemli veriler sağlayarak genel anlamda antropoloji ve arkeolojiye destek verir (Tablo 1) (Marks, 2002; Stone, 2008). Tablo 1. Biyoarkeoloji uygulamaları, antropolojiye katkısı ve moleküler analiz yöntemleri. Uygulama Genetik cinsiyetlendirme İnsana ait olmayan aDNA Anne/baba tarafından akrabalık Katkı Evlilik ve ölü gömme gelenekleri, cinsiyetlere göre ölüm, hastalık, beslenme ve statü oranları Avcılık, beslenme davranışları, bitki ve hayvan evcilleşmesi, çevresel rekonstrüksiyon Sosyal yapı, statü, evlilik, ölü gömme gelenekleri, göç Moleküler İşaret Cinsiyet kromozomları Mitokondriyal DNA, kloroplast DNA’sı, otozomal DNA Mitokondriyal DNA, otozomal DNA, cinsiyet kromozomları Popülasyon devamlılığı ve Tarih öncesi toplumların Mitokondriyal DNA, yer değiştirme göçü, gruplar arası ata-torun otozomal DNA, cinsiyet ilişkileri, benzer veya farklı kromozomları morfolojik ve kültürel kalıntılardan eski gruplar arası ilişkiler Filogenetik Tür evrimi, insanın kökeni Mitokondriyal DNA, rekonstrüksiyon otozomal DNA, cinsiyet kromozomları (Kaestle and Horsburgh, 2002) BİYOARKEOLOJİK ÖRNEKLER VE GENETİK MATERYAL Arkeolojik kazılarla elde edilmiş kalıntılara veya müzelerde korunan nesli tükenmiş canlılara ait her türlü biyolojik örnekte genetik materyalin halen var olduğu ilk kez 1984’te 14 tespit edilmiştir (Higuchi et al., 1984). Ardından çeşitli araştırmacılar birçok farklı tarihsel örnekle çalışmalar yaparak, hem yeni bir bilim dalının oluşumuna katkı sağlamış, hem de disiplinler arası işbirliğinin önemini ortaya çıkarmışlardır. Uzun yıllar öncesine ait biyolojik örneklerdeki DNA, ‘geçmişten kalan, geçmişe ait’ anlamında ‘ancient’ olarak ifade edilmekte ve aDNA kısaltmasıyla kullanılmaktadır (Herrmann and Hummel, 1994). Bazı Türkçe kaynaklarda aDNA için, ‘eski’ anlamı taşıyan ‘antik DNA’ kelimesi kullanılmıştır (Akkaya, 2003; Gökçümen, 2004; Güral, 2007). Ancak kelime, Orta Çağ öncesi tüm zaman anlamına gelen Antik Çağ’ı ifade ettiğinden, Türkçe’de ‘antik DNA’ teriminden bahsedilmesi, Antik Çağ’a ait DNA’nın anlaşılmasına neden olabilecektir. Bu sebeple kullanılması tercih edilmemiştir. Çalışmanın devamında biyoarkeolojik örneklerdeki DNA’yı ifade etmek amacıyla, ‘geçmişe ait DNA’, ‘eski DNA’ terimleri veya ‘aDNA’ kısaltması kullanılmıştır. Tarih boyunca çeşitli çevre şartlarına maruz kalmış biyolojik örneklerdeki nükleik asitler, post-mortem hasarlar sebebiyle bozulmuş ve parçalanmıştır. Ancak bu engelleri ortadan kaldırarak daha verimli ve güvenilir DNA analizleri yapabilmek için bilim dünyasında geliştirilen yeni tekniklerle araştırmalar devam etmektedir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Günümüzde diş, kemik, korunmuş yumuşak dokular başta olmak üzere arkeolojik kazı alanında bulunabilen veya müzelerde korunmuş olan canlılara ait deri ve kıl gibi müze örnekleri (Cooper, 1994; Wisely et al., 2004; Stuart et al., 2006), taşlaşmış gübre (Poinar et al., 1998; Reinheird et al., 2007), geçmişe ait bitkiler (Gugerli et al., 2005), polenler (Parducci et al., 2005), bitki tohumları (Poinar et al., 1993; Rollo et al., 1994a) ve fosillerden (Golenberg, 1994; Taylor and Swann, 1994) başarıyla DNA elde edilebilmesi mümkündür. aDNA çalışmaları göz önüne alınırsa, her hücredeki yüksek mitokondriyal 15 ve/veya kloroplast DNA kopya sayısı, bozulmamış ve parçalanmamış DNA kısımlarının eldesinde çekirdek DNA’sına oranla daha fazla başarı sağlar. Bu sebeple bugüne kadar çoğu aDNA çalışması da mitokondriyal DNA üzerinde yoğunlaşmıştır. Ancak geliştirilmiş tekniklerle bazı araştırıcılar eski çekirdek DNA’sı dizininde de başarı sağlamışlardır (Clisson et al., 2002; Wisely et al., 2004; Stuart et al., 2006). Bu, aDNA ile test edilebilecek potansiyel hipotezleri önemli ölçüde genişletir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Tarihsel biyolojik materyal, diyagenezin etkisiyle zaman içinde kendine özgü kimyasal ve/veya yapısal özelliklerini kaybeder. Diyagenez, gömüldükten sonra biyolojik materyalde başlayan fiziksel, kimyasal veya biyolojik her türlü değişimi ifade eder. Yüksek sıcaklık ve yeryüzündekinden düşük, oldukça sabit nem koşulları, diyagenezi hızlandırır (Bollongino et al., 2008). Bunun dışında radyasyon (esasen UV), pH ve oksidatif ajanlar da diyagenez altındaki aDNA’yı etkiler. Değişik dokular, farklı hücreler ve hücre içeriklerinden dolayı, diyagenezden farklı derecelerde etkilenir (Herrmann and Hummel, 1994). En erken dekompoze olan dokular sırasıyla sindirim sistemi organları; ardından kalp ve diğer dolaşım sistemi organları; sonra akciğerler, karaciğer ve safra; bunu takiben beyin ve sinir sistemi; kas sistemi ve en son iskelet sisteminin kolajen içeren bağ dokusudur (Stodder, 2008). Özellikle kemikte bu değişimi açığa çıkaracak belirli parametreler söz konusudur. Kemiğin kolajen içeriği, histolojik bütünlüğü, porozitesi (su alabilme kapasitesi) ve kristalliğinin araştırılması bu açıdan yarar sağlar. Kolajen içeriği ve histolojik yapı diyagenezin etkisi olarak bilinirken, porozite ve muhtemelen kristallik kemiğin çevresine cevabını değiştiren faktörlerdir (Hedges, 2002). Çevrenin, materyalin fiziksel ve kimyasal korunmasına etkisinin tespit edilmesi amacıyla yürütülen çalışmalar biyomoleküler araştırmalarda önemli bilgiler sağlar ve 16 degradasyon mekanizmalarının anlaşılması, toprak özelliklerinin bilindiği durumlarda kemiğin muhtemel korunmasının tahmin edilmesi için kullanılabilir. Ortamın pH’ı kemik diyagenezinde büyük rol oynar. Aşındırıcı (korozif) topraklardan elde edilen kemiklerde hem makroskobik hem de biyomoleküler seviyede büyük hasar görülür. Kuzey İsveç, Finlandiya ve İskoçya’nın bazı bölgelerindeki bu tip topraklarda hemen kazı yapılarak örneğin alınması önerilir (Nielsen-Marsh et al., 2007). Arkeolojik kazılarda görev alanlara göre, kumlu birikintilerden ve/veya sulu düzlüklerden elde edilen kemikler genellikle daha poröz ve kolay ufalanır durumdadır. Çok düşük sıcaklıklar ve kuru bir ortam ise mikrobiyal hasarı engeller (Hedges, 2002). Soğuk, kuru ortamlardan elde edilen örneklerde DNA hasarının az olduğu, birçok araştırmacı tarafından belirtilmektedir (Höss et al., 1996; Wayne et al., 1999; Ricaut et al., 2005; Bollongino et al., 2008). Biyoarkeolojik örneklerde DNA’nın korunması esas olarak örneğin yaşından çok, çevresel faktörler ile ilgilidir (Burger et al., 1999; Ricaut et al., 2005; Gamba et al., 2008). Pääbo ve meslektaşları (1989), örneğin yaşı ile DNA hasarı arasında bir ilgi bulamamıştır. Tuross (1994) ise örneğin yaşı ve DNA eldesi arasında ters bir ilişki bulunduğunu belirtmiştir. Kemik Genellikle en uygun aDNA kaynağı olarak bilinir. İzolasyon ve amplifikasyon başarısı doku tipinden bağımsız olmakla birlikte (Höss et al., 1996; O’Rourke et al., 1996); deneysel çalışmalar, kemikten elde edilen DNA'nın yumuşak dokulardakinden fazla olduğu düşüncesini desteklemektedir (Tuross, 1994). Vücutta kafatası, kaburga gibi yassı kemikler ve kol-bacak kemikleri gibi uzun kemikler bulunur. Uzun kemiklerde epifizlerde süngerimsi (trabeküler), diyafizde ise sıkı 17 (kompakt, kortikal) doku yer alır. Lee ve meslektaşlarına göre (1991), kaburgalar gibi süngerimsi kemikler, sıkı kemikten 10–20 kat daha fazla DNA eldesi sağlar, ancak kontaminasyona açık olması sebebiyle özgün olmadığı da tartışılmaktadır (Parsons and Weedn, 1996; Parr et al., 1996; O’Rourke et al., 1996). Bu sebeple geçmişten kalan kemiklerde daha yoğun, sert, kortikal tabaka varlığı önemlidir (Cooper, 1994). Hagelberg ve meslektaşları (1991) kemik örneklerinin mikroskobik olarak korunmuş olmasıyla DNA eldesinin arasında bir ilgi olduğunu; ancak örneğin yaşıyla bir bağlantısının bulunmadığını gözlemlemişlerdir. Amplifikasyon başarısı ile kemiğin yaşı arasında bir ilgi kurulmamıştır (von Wurmb-Schwark et al., 2003). İskelet dokularından birçok şekilde örnek alınabilir. Küçük parçalar kullanılabilir veya uzun kemiklerde delik açılarak ya da orta kısımdaki sıkı dokudan kesit alınarak incelenebilir (Motoc et al., 2009). Bu sırada lezyonlu iskelet örnekleri kontaminasyona yol açacağı için lezyonsuz olanlar seçilmelidir. O’Rourke ve meslektaşları (2000), küçük kaburga parçaları seçilmesini tavsiye etmektedir, çünkü bunlar her birey için çok sayıdadır, en az morfolojik ve paleopatolojik öneme sahiptir ve sıklıkla müze veya arkeolojik koleksiyonlarda kullanılmaz. Kemikler çok çeşitli şartlara maruz kalır ve bunlardan birçoğu kemiğin yapısını ve bileşimini önemli derecede değiştirir (Stout, 1978). Kemik degradasyonu iki olayla gerçekleşir: biri mikroorganizmalar tarafından hızlı gerçekleştirilir, diğeri ise daha yavaş olan kimyasal degradasyondur (Smith et al., 2003). Hidroksiapatit (HA) ve kolajen, kemiğin kendine özgü yapısında bulunan iki moleküldür ve DNA çalışmalarında etkili olduğu bilinmektedir. Bu sebeple kemiklerdeki DNA’nın varlığı, hidroksiapatit ve kolajenin tespitiyle belirlenebilir (Götherström et al., 18 2002). DNA’nın hidroksiapatite bağlanarak bozunmadan kaldığı belirlenmiştir, moleküler biyolojide nükleik asitlerin bağlanması için kullanılır (Sambrook and Russel, 2001). Hidroksiapatit veya hidroksilapatit [Ca10(PO4)6(OH)2], bir inorganik mineral olarak kemiğin %70’ini oluşturur. Ayrıca dişte de bulunur. %39.8 kalsiyum ve %18.5 fosfor içerir (Burton, 2008). Geçmişe ait kemiklerde DNA’nın varlığı; hidroksiapatitteki kristallik (degradasyon) artışı ile ters ilişkili, kolajen korunması ile doğru orantılıdır (Götherström et al., 2002). Kemiğin asidik ortamlarda makroskobik ve mikroskobik hasara daha fazla uğramasının sebebi, var olan mikrobiyal aktivitenin hidroksiapatitin bruşite parçalanmasına sebep olmasıdır. Hidroksiapatit ayrıca kendisi için gerekli olan 7-7.5 pH, 6-7’ye indiğinde oktakalsiyum fosfata dönüşür (Jackes et al., 2001). Hidroksiapatitin en stabil hali pH 7.8’de görülür. Ortamdaki su, apatiti parçalamada en büyük etkendir. Asidik topraklar da kemiğin yapısındaki kalsiyum fosfatı çözerek, apatiti parçalar. Kireçtaşı gibi alkali çevre ise asitin degradatif etkilerini tamponlar ve kemik apatitini korur. Diğer yandan alkali ortamlarda ve karbondioksit varlığında apatitin parçalanmasını arttıran bikarbonat oluşur. Aynı ortamdan alınan kemik örneklerinde farklı korunma durumları da görülebilir. Örneğin kemiğin yanında bulunan bir kireçtaşı veya çömleklerin varlığı, kemikteki apatiti korumuş olabilir, mağaralarda kenarlara yakın duran örnekler duvarlardaki sızıntılardan dolayı daha fazla bozulabilir ya da bakır içeren metal nesneler bakteriyel büyümeyi engellediği için, bu tip nesnelerle birlikte gömülmüş kemiklerde iyi korunma özellikleri görülebilir (Bollongino et al., 2008). Kolajen tip I, kemiğin organik fazını oluşturan ana proteindir. Bu fibriler proteinin, kemiğin hidroksiapatitine yüksek bir afinitesi vardır. Kanda çözünmüş halde bulunan hidroksiapatit minerali, organik matriks sentezlendiğinde katlanan kolajen molekülleri 19 arasındaki boşluklara yerleşir (Schweitzer et al., 2008). Bu sebeple kolajenin korunması, hidroksiapatitin korunması ile ilgilidir (Götherström et al., 2002). Kolajenin yapısal özelliği olarak aminoasit bileşimi sınırlı tutulur ve her üç aminoasitten sonra glisin yer alır. Kolajen belirteci olarak aminoasit analizleri bu sebeple %30 glisin oranı verir. Üçlü helikal peptid zincirlerinden meydana gelen molekül, belirli aralıklarla birbiri üzerine katlanarak proteine suda çözünmeme özelliği veren moleküler çapraz bağlar oluşturur. Bu yapı, elektron mikroskobunda bantlar olarak gözlenir, ancak degradasyonda inter moleküler çapraz bağlar kırıldığı için aynı görüntü alınamaz (Schweitzer et al., 2008). Kolajen çapraz bağlarla güçlü bağlandığında, hidrolitik kayba karşı stabilize olabilir (Hedges, 2002). Arkeolojik kemik örneklerinde DNA’nın varlığı ile kolajen miktarı arasında benzer bir ilgi bulunmuştur (Götherström et al., 2002). Kemikte yüksek miktardaki kolajen kaybı, mikrobiyal zararlarla ilişkilidir (Hedges, 2002). Kemiğin mikro yapısının ölüm sonrasında bozulması, mantarların geçitler açması değil, bakteriyel hasardır. En çok bilinen Clostridium histolyticum, kolajeni parçalayan bir enzim olan kolajenaz üretir ve kemikteki kolajenin yıkımına sebep olarak histolojik yapıyı bozar (Jackes et al., 2001). Mikro organizmalarla ciddi anlamda bulaşmış bir kemikte en az %80 kolajen kaybı görülür. Çok sıcak iklimlerden elde edilen çok eski kemiklerde ise, ısıya duyarlı kolajen kaybı mekanizmaları kaçınılmazdır, çünkü sıcaklık kolajenin maksimum miktarda kalmasında büyük bir faktördür. Bunlar, kemiğin histolojik yapısını da önemli ölçüde etkiler. Kolajen içeriği az olan kemiklerde zayıf, doğal değerlere yakın kolajen miktarına sahip kemiklerde ise iyi bir histolojik korunma gözlenir (Hedges, 2002). Ancak yapısal olarak çok iyi korunmuş bir kemikte kolajen kaybının hızlı olduğu örnekler de söz konusudur (Smith et al., 2002). Kemikteki ağırlık kaybı (~%20) ve porozite artışının (~%50) çoğu, kolajen 20 kaybına bağlanır (Hedges, 2002). Arkeolojik kemiklerde porozite arttıkça yoğunluk azalır, bu canlı kemik dokusundakinin tersidir, yoğunluk arttıkça porozite artar, çünkü poröz kemiğin dış yüzeyinde kalsiyum karbonat birikir (Jackes et al., 2001). Porların boyutlarında meydana gelen değişme olan porozite, diagenezle ilgili bir belirteçtir (Nielsen-Marsh and Hedges, 1999) ve DNA eldesinde başarı için yardımcıdır (Gilbert et al., 2005). Kemikteki bir başka mineral bağlayan protein olan osteokalsin de uzun süreli stabilitesinden dolayı aDNA çalışmalarında analiz edilen bir moleküldür (Nielsen-Marsh et al., 2005; Buckley et al., 2008). Arkeolojik kemiğin histolojisinin, diğer analizlerle birlikte değerli bir yöntem olduğu söylenebilir (Jans et al., 2002). İskelet kalıntılarında histolojik korunmanın amplifiye edilebilir DNA’nın en iyi belirteci olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından bildirilmiştir (Colson et al., 1997; Al-enizi et al., 2008). Bir çalışmada Yakın Doğu (Kıbrıs, Gürcistan, İsrail, Suriye, Türkiye) örneklerinin Avrupa’ya göre daha poröz ve yumuşak yapıda olduğu, DNA elde edilen bazı örneklerin amplifikasyonunun zor olduğu belirlenmiş, Avrupa için amplifikasyon başarısıyla toprak tipi arasında bir ilgi tespit edilmiştir. Kireçli topraklardaki örneklerden başarıyla DNA çoğaltılabilmiş, düşük pH’lı topraklarda DNA eldesi zorlaşmıştır (Bollongino et al., 2008). Kemikte en fazla bulunan elementler olan kalsiyum ve fosfor dışında, eser element analizleri yapılırsa paleodiet hakkında bilgi edinilir. Stronsiyum, baryum, kurşun, çinko; kolaylıkla kalsiyumun yerine geçebilir ve kemikte birikir. Analizler, antropologlara tarih öncesi canlıların herbivor veya karnivor oldukları ile ilgili bilgi verir (Burton, 2008). Paleodiet araştırmalarında stabil azot izotopları da kullanılabilir. Kemik ve dişlerin mineral kısmından karbon, oksijen izotoplarının analizi de mümkündür (Katzenberg, 2008). 21 Diş Diş örnekleri, kemiğe göre kontaminasyona daha az eğilimlidir veya kontamine olmuşsa dekontamine edilmesi daha kolaydır (Gilbert et al., 2005; 2006). Dişten nükleer DNA’nın amplifikasyon başarısı, kemiğe göre daha yüksek olarak tespit edilmiştir (Ricaut et al., 2005; Zierdt et al., 1996; Meyer et al., 2000). Nelson ve Melton (2007), yüz on altı iskelet örneğinde femurdan sonra diş örneklerinden başarıyla (%90) DNA profili elde etmiştir. Alakoç (2007) tarih öncesi Van-Yoncatepe toplumunun arkeolojik diş örneklerinden DNA analiz etmiş ve sonuçları odontometrik verilerle karşılaştırmıştır. Dişin taç ve kök olmak üzere iki temel kısmı; mine, dentin, sement ve pulpadan oluşan dört ana doku tipi vardır. Taçın görülen kısmı sert mine tabakası ile kaplıdır. Minenin %97’si inorganiktir, hidroksiapatit içerir. Bunun altında yarı sert doku olan dentin bulunur. Dentinde kemikten daha fazla kalsiyum fosfat (%75), daha az kolajen (%18) vardır. Sement ise, kök yüzeyini örten ince tabakadır. Dişin özünde kan damarları ile sinirlerden oluşan yumuşak doku, pulpa bulunur ve genetik materyal açısından dişin en önemli kısmıdır (Scott, 2008). aDNA kaynağı olarak dişi kullanmanın, her birey için çok sayıda ve bağımsız örnek olmasından dolayı avantajı vardır. O’Rourke ve meslektaşlarının (2000) belirttiğine göre, dişteki çürük DNA kontaminasyonuna izin verdiği için sağlam dişler seçilmelidir. Çıkmamış dişleri kullanmak riski arttırır. Dişten DNA izolasyonunda; dişi toz haline getirme, kesme veya diş kanalı yoluyla pulpaya girme gibi farklı hazırlama yöntemleri kullanılabilir (O’Rourke et al., 2000). Diş tozunun rengindeki farklılık amplifikasyon başarısıyla ilgili değildir (Drancourt et al., 1998). Tüm dişi toz haline getirmek; pulpa yuvasına giriş için kesilen dişe göre daha fazla 22 DNA eldesi sağlar, ancak daha fazla degrade DNA elde edilir (Smith et al., 1993). Dişi kesmek, pulpayı aldıktan sonra dişi yapıştırarak birleştirmeyi mümkün kılar, dolayısıyla daha az tahrip edicidir (Drancourt et al., 1998; Merriwether et al., 1994). Diş kanalı yoluyla pulpaya girmek ise, iç dokunun etkin bir şekilde alınmasının zor olmasından dolayı, Smith ve araştırıcıları (1993) tarafından önerilmemektedir. Sıcaklık (4–37° C), nem (%20–%98), pH (3.0–10.0), deniz suyuna maruz kalma, bahçede, toprakta veya kumda gömülme gibi çevresel faktörlerin, diş örneklerinden elde edilen DNA miktarını önemli derecede etkilemediği bildirilmiştir (Schwartz et al., 1991). Yumuşak Dokular Tarihsel biyolojik örneklerden gerçekleştirilen ilk DNA çalışmalarında yumuşak dokular tercih edilmiştir (Higuchi et al., 1984; Pääbo, 1985). Sert dokulardan tipleme yapmanın zor olduğu durumlarda, varsa yumuşak dokular kullanılarak DNA analizi gerçekleştirmek mümkün olabilir. Bir çalışmada nemli bir ortamda bulunan kafataslarından DNA elde edilememiş, kafatası içinde çürümeye başlamış beyin dokularından DNA analiz edilebilmiştir (Graw et al., 2000). Kaynak olarak yumuşak doku kullanılırsa, kontaminasyonu azaltmak amacıyla yüzey altı dokusu tercih edilmelidir. Dondurma, tek başına veya süblimasyon (kurutma) ile birlikte yumuşak dokuların korunması için idealdir (Nielsen et al., 1994). Kurutma işlemi DNA'yı hidrolitik hasarlardan koruyabildiği için (oksidatif hasarlara hala açık olduğu halde) kurutulmuş yumuşak doku, daha iyi bir aDNA kaynağıdır. Genellikle kurutulmuş dokulardan elde edilen aDNA, kemiklerden elde edilenden daha düşüktür ve inhibitörlerin de izolasyonu fazladır (O’Rourke et al., 2000). Kuru örneklerin avantajı, suyun 23 yokluğudur. Çünkü su bir reaktant/ortam olarak DNA’ya zarar verir. Suyun yokluğunda mikrobiyolojik fonksiyonlar, enzim degradasyonu, hidroliz ve diğer kimyasal zararlar çok yavaşlar (Sensabaugh, 1994). Grönland’de Qilakitsoq yerleşmesinde bulunan mumyalaşmış beden; kazı ve örnek alınması sırasında hiç korunmamış, ayrıca DNA çalışmaları başlatılmadan önce on yıldan fazla oda sıcaklığında kalmıştır. Buna rağmen uygun protokollerle deriden DNA elde edilebilmiştir (Nielsen et al., 1994). Diğer Biyoarkeolojik Örnekler Dökülen saçlar, DNA içeren kökü değil, sadece gövdeyi içerdiği halde, adli olgularda kullanılmaktadır (Wilson et al., 1995). Modern adli örneklerde saçın gövdesindeki DNA miktarının birkaç haftada 1 ng'ın -PCR tespit sınırının- altına indiği düşünüldüğünde; eski saç örneklerinden aDNA elde etme olasılığının da azaldığı söylenir (O’Rourke et al., 2000). Ancak saçlar ya da kıllar, kemiğe ve dişe göre kontaminasyona daha az yatkın olduğundan geçmişe ait DNA çalışmalarında daha güvenilir bir materyal olabilir (Willerslev and Cooper, 2005). Koprolit (fosilleşmiş dışkı), nükleik asit izolasyonu için potansiyel taşımaktadır (Chobe et al., 1997). Koprolitlerden elde edilen DNA dizinleri, tür veya birey idantifikasyonu sağladığı gibi, beslenme konusunda da bilgi verir. DNA’nın feçeste aşırı miktardaki şekere bağlanması, DNA’yı stabilize ederek degradasyonu önler, ancak bu durum aynı zamanda PCR’ı da inhibe eder (Poinar et al., 1998). Nesli tükenmiş ya da günümüze kadar gelmiş hayvanlardan ikisini de bulmak veya onlardan doku örnekleri almak sıklıkla zordur. Ancak tüm hayvanlar yabani hayatta arkalarında kolaylıkla 24 toplanabilecek fekal kalıntılar bırakır ve bunlar çoğunlukla fosil kayıtlarda belirlenir. Hayvanların boşaltım maddeleri, hem kendilerine, hem de sindirdikleri diğer hayvan ve bitkilere ait DNA içerir. Dolayısıyla yabani hayvanlardan noninvazif yöntemlerle rutin örnek almak için feçes kullanılabilir. Arkeolojik kazılarda bulunan koprolitlerden de benzer şekilde DNA analizleri yapılabilir. Moleküler koproskopi ile beslenme alışkanlıkları ve son buzul döneminden önce, dönem boyunca ve sonrasındaki çevre çalışılabilir. Araştırmalar insan koprolitlerine kadar genişletilebilir, böylece sadece sindirilen bitkiler değil, hayvanlar da belirlenebilir (Pääbo et al., 2004). Jeolojik kayıtlar, yaşamda var olmuş ancak şu anda bulunmayan her türlü bilgi için tek delildir. Hayvanlara ve bitkilere ait fosillerden moleküler veriler elde edilebilir. Fosillerdeki moleküllerin, hücrelerin ve dokuların kimyasal özellikleri; korunma kadar diyagenez ve degradasyonun kimyasal ve moleküler süreci ile ilgili bilgi sağlar. Paleontoloji kapsamında organizmaların kalıntıları, kısımları ve ürünlerini inceleyen tafonomi de yerini almıştır (Schweitzer et al., 2008). Tafonomi, ölümden sonra organizmayı değiştiren, insan, hayvan veya doğal etkenlerin sebep olduğu fiziksel ve kimyasal olaydır ve örneklerin alınmasıyla laboratuvar analizi arasında kritik bir bağ oluşturur (Stodder, 2008). Diyagenez ile ilgili faktörler tafonomi içinde incelenir (Schweitzer et al., 2008). Herbaryum örnekleri, kimyasal koruyucularla veya yüksek sıcaklık ile muamele edilmeyip, havada kurumaya bırakıldığında, daha fazla DNA içerme olasılığına sahiptir (Taylor and Swann, 1994). Bitki tohumları özel yapılardır, ana bitkinin ölümünden sonra bile uzun süre embriyolarının genetik materyalini korur. Bu sebeple bir bitki tohumunun hücreleri en kötü çevre şartlarına bile adapte olur. Eğer tohum kuru çevrede saklanırsa, dış görünüşte kayda 25 değer bir farklılık olmadan kendiliğinden mumyalaşır. Yüzyıllar sonra koyu kırmızımsı kahverengi halini alır, ancak yapısını hala korumaktadır (Rollo et al., 1994a). Tohumların arkeolojik bulguları, eski uygarlıklar hakkında özellikle ekinlerin yetiştirilmesi, tüketilmesi, ticaretinin yapılması ve yerleşim içindeki depo alanlarının belirlenmesi ile ilgili bilgiler verir (Çilingir, 2009). Moleküler genetik arkeolojide bir ileri adım da, kutuplarda tiyal tabakasında (devamlı don altında kalan toprak alt tabakası) bulunan sedimentlerin incelenmesidir. Yeryüzünün %20-25’inde (Rusya ve Kanada’nın %50’si, Alaska’nın %82’si, Çin’in %20’si ve Antarktika’nın çoğunluğu) görülen tiyal tabakası, evrimsel ve filogenetik çalışmalar için önemli bir kaynaktır (Mitchell et al., 2005). Çünkü sedimentler PCR ile çoğaltılabilen DNA içerir. Tarihi 300.000 – 400.000 yıl geriye giden sedimentten bitkinin kloroplast DNA’sı ve yarım milyon yıl öncesine ait sedimentten bakteri DNA dizinleri elde edilmiştir (Pääbo et al., 2004). Sedimentlerdeki DNA zaman içindeki fauna ve flora hakkında bilgi verir (Willerslev and Cooper, 2005). Ancak bu sedimentlerin farklı DNA dizinleri içermesi, koprolitlerin ve sedimentlerin analizinde tahmin edilemez bir karmaşıklık da yaratmıştır. Tabakalar arasında suyun süzülmesiyle ne tür bir parçacık veya molekül hareketi olduğunu bilmek imkânsızdır. Bu sebeple herhangi bir dizinin tarihlendirilmesi, sediment düzeyi tarihlendirilse bile belirsizdir. Ayrıca sedimentlerdeki DNA dizinlerinin koprolite nasıl geçtiği de bilinmemektedir. Bu yüzden, kemik ve dişlerin ilgili hayvanın sadece bir mtDNA dizinini verebilme avantajı olduğu halde, çok sayıda farklı mtDNA dizini veren koprolitler ve sedimental örnekler yorum hatası yaratır. Koprolit ve sedimentlerden DNA dizinlerine ait bir başka sınırlama da, uzun DNA dizinlerinin kısa çakışan segmentlerin amplifikasyonu ile belirlenememesidir. Çünkü 26 segmentler çok sayıda bireyden veya diğer türlerden gelmiş olabilir (Pääbo et al., 2004). Hemen hemen şeffaf, rengi açık sarıdan yakut kırmızısına kadar değişen, kolay kırılabilir, fosilleşmiş veya yarı fosilleşmiş bir reçine olan kehribara gömülü böceklerde ve bitkilerde de DNA dizinleri çalışılmıştır (Poinar et al., 1994). Miyosen bitkilerinden ve kehribara gömülü örneklerden sonuç elde edilemeyen olgular da bildirilmiştir. Miyosen bitkilerindeki lignin ve kehribara gömülü böceklerdeki kitin gibi diğer moleküllerin korunmamış olması da, bu fosillerdeki DNA’nın varlığını tartışmada kullanılmıştır (Pääbo et al., 2004). Reese ve araştırıcıları (1996) tarafından yapılan bir çalışmada, geçmişteki Teksas piktograflarında (resimyazı) pigment bağlayıcı olarak kullanılan yağın, hayvansal (çifttoynaklılar) kökenli olduğu ortaya çıkarılmıştır. Marota ve meslektaşları (2002), eski çağlarda yazma materyali olarak kullanılan papirüslerle (Cyperus papyrus) DNA bozulma oranını incelemiştir. 0–100 yaşındaki modern ve 1300–3200 yıllık tarihi Mısır papirüslerinin kloroplast DNA’ları ile yapılan bu çalışmaya göre, materyaldeki DNA’nın yarı ömrünün 19–24 yıl olduğu; son DNA parçalarının papirüsün üretilmesinden en fazla 532–672 yıl sonra ortadan kaybolacağı ifade edilmektedir. Kağıtın bulunmasından önce dört yüz yıl kullanılmış bir diğer yazma materyali olan parşömen, hayvan derisinden hazırlandığı için değerli bulunmaktadır. Ancak kırılması, parçalanması, dağılması sıklıkla söz konusudur. Tarihsel ve paleografik incelemeler için yazıların yorumlanmasından önce parçaların birbiriyle birleştirilmesi gereklidir. Bazen parçalar çok sayıdadır ve ait olduğu sayfaları belirlemek mümkün olamayabilir. Hayvan kaynaklı bu materyallerin degrade DNA’sı ile moleküler analizler durumu açıklığa kavuşturur (Hummel, 2003; Poulakakis et al., 2007). 27 Arkeolojik kazılarda kronoloji, toplumun kültürü ve üretim stratejileri gibi önemli bilgiler elde etmeyi sağlayan, çeşitli malzemelerden yapılmış gereçler ortaya çıkarılır. Bu aletlerde eser miktarda biyolojik deliller bulunabilir. Yapılacak analizler, aletleri kullanan kişileri gösterebileceği gibi, aletlerin kullanılma amaçları hakkında da fikir verebilir. Etiyopya’da rutin olarak taş aletler kullanan modern bir grup tarafından üretilmiş taşların etno-deneysel arkeolojik çalışmasında, üreticilerden değişik aşamalarda taş aletler toplanmış, başarıyla DNA çoğaltılabilmiştir. Ancak araştırmacılar şuna dikkat çekerler; hem aletin üreticisi hem de kullanıldığı türlerden DNA çoğaltılabilmiş, ancak aletin kullanımıyla ilgili olmayan DNA’nın varlığı da belirlenmiştir (Kimura et al., 2001). Wyoming (ABD) eyaletindeki bir arkeolojik alanda elde edilen 24 taş alet, üzerinde bulunabilecek DNA için analiz edilmiş ve kazıda çıkarılmış kemiklerle karşılaştırılmıştır. Dokuz alette DNA’ya rastlanmıştır. Hatta aletlerden birinde üç türe (köpek, geyik ve evcil kedi) ait DNA tespit edilmiştir. Evcil kedi bulunması ilginçtir, çünkü alana özgü bir tür değildir, dolayısıyla kazı yapanlardan birinden bulaşma ihtimalini düşündürmektedir. Köpek DNA’sı da benzer şekilde yorumlanabilirken, geyik için durum farklıdır. Diğer verilerle birlikte ahşap ve deriden yapılmış bu aletin geyiklerin postunu ayırmada kullanılmış olabileceği veya saklandığı geyik derisi kınından bulaştığı akla uygun gelmektedir (Shanks et al., 2005). Geçmişe ait DNA’nın Biyokimyasal Özellikleri Uzun yıllar farklı çevre şartlarına maruz kalan biyoarkeolojik örneklerde DNA, ölümden sonra endojen nükleazlar tarafından parçalanmaya başlar. Hızlı kurutma, düşük sıcaklıklar veya yüksek tuz derişimleri gibi durumlarda, nükleik asitlerin tamamı 28 parçalanmadan önce nükleazlar bozulur veya inaktif hale gelir. Bu durumda bile, yavaş da olsa devam eden diğer olaylar DNA’yı etkiler (Hofreiter et al., 2001). DNA iplikleri kırılır, bazsız, yanlış veya çapraz bağlanan bölgeler oluşur, deaminasyon ürünleri meydana gelir (Willerslev and Cooper, 2005). Bu moleküler degradasyon, DNA miktarını çoğaltmayı engeller. Aynı zamanda organik PCR inhibitörleri de çoğaltma sırasında DNA ile yarışır (O’Rourke et al., 2000). Arkeolojik kalıntılardan izole edilen DNA’da en belirgin hasar tipi, genellikle 100– 500 baz çifti arasında kısa parçalara degradasyondur. Boyuttaki azalma, hem ölümden kısa bir süre sonra başlayan enzimatik olay, hem de tek ipliği oluşturan fosfat-şeker iskeletinde fosfodiester bağlarının hidrolitik parçalanması sebebiyle meydana gelir. Azot bazları ile şeker arasındaki N-glikozil bağları da hidrolitik parçalanmaya maruz kalır ve bazsız bölgelerle sonuçlanır (Şekil 2). Bir nükleotid yok olduğunda, DNA yeni bir kimyasal düzenlemeye girer ve baz kaybından neredeyse daha yavaş veya onunla aynı oranda iplik kırılması meydana gelir (Pääbo et al., 2004). Hidroliz oranı suyun varlığında sıcaklık ve pH bağımlı olduğu halde, Guanin ve Adenin (depurinasyon), Timin ve Sitozine (deprimidasyon) göre yirmi kat daha dayanıklıdır. Depurinasyon, hidrate DNA’nın en önemli bozunma yoludur. Ancak DNA’nın hidroksiapatite adsorpsiyonu, depurinasyon oranında iki kat azalma ile sonuçlanır, böylece eski kemiklerden incelenebilir DNA elde etme şansı artar (Lindahl, 1993). Hidrolitik depurinasyon oranını etkileyen temel faktörler, pH, su miktarı ve sıcaklıktır. İlk ikisi kemikte daha az önemlidir, çünkü hem kemik pH=4– 9 arasında tamponlama etkisi gösterir, hem de porların dağılımı su geçişini sağlar. Derine gömmek, sıcaklık farklılıklarını yıllık bir ortalamada dengelediği için sıcaklık DNA korunmasında temel rol oynar (Smith et al., 2001; 2003). 29 Hidroliz az örnek molekül / kısa parçalar kontaminasyon / kısa PCR ürünleri Şekil 2. Post-mortem DNA değişimlerinde hidrolitik hasar ile iplik kopmalarının meydana gelmesi. (A) Fosfodiester iskeletinin doğrudan ayrılması. (B) Bazsız bölgelerde depurinasyon. (C) Şeker iskeletinin ayrılması (Willerslev and Cooper, 2005). DNA polimerazlarının uzamasını engelleyen bazı DNA modifikasyonlarında moleküllerin amplifikasyonu mümkündür, ancak PCR sırasında yanlış bazların dahil edilmesi söz konusu olabilir. Bunun en fazla görülen şekli, sırasıyla hipoksantin, urasil, timin ve ksantin oluşturan adenin, sitozin, 5-metilsitozin ve guanin bazlarından amino gruplarının hidrolitik kaybıdır. Adenin (hipoksantin), sitozin (urasil), 5-metil sitozin (timin) için deaminasyon ürünleri; DNA polimeraz tarafından sentezlenen yeni DNA ipliklerinde yanlış bazların yerleştirilmesine (G yerine A, T yerine C) sebep olduğundan, aDNA amplifikasyonlarıyla yakından ilgilidir (Şekil 3) (Willerslev and Cooper, 2005). 30 Oksidasyon / Hidroliz Bloklama 5-Hidroksi 5-Metil hidantoin 5-Hidroksi hidantoin Yanlış kodlama Adenin Sitozin Hipoksantin Urasil yanlış baz bağlanmaları kimerik dizinler dizin hataları Şekil 3. Post-mortem DNA değişimlerinde oksidatif ve hidrolitik baz modifikasyonları (i) bloke edenler (ii) yanlış kodlamaya sebep olanlar (Willerslev and Cooper, 2005). DNA dizinlerinin uzunluğu, sadece iplik kopmalarıyla değil, aynı zamanda Taq polimeraz tarafından DNA ipliklerinin uzamasını bloke eden lezyonlarla da belirlenir. Bu tip birçok zarar, radyasyondan kaynaklanan peroksit (-O2), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil (-OH) gibi serbest radikaller tarafından uyarılır (Pääbo et al., 2004). Oksidasyon adı verilen bu olay, sudan gelen hidroksilin veya süperoksit radikallerinin bazları değiştirmesi veya heliks yapıyı bozması olarak tanımlanır (O’Rourke et al., 2000). Güneş ışığı (UV), oksidasyona sebep olan serbest radikalleri arttırır (Bollongino et al., 2008). Mitokondriler oksijen metabolizmasının merkezi olduğu için, oksidasyon nükleere göre mitokondriyal DNA'yı daha çok etkiler (O’Rourke et al., 2000). Oksidatif hasarın belli başlı bölgeleri, şeker-fosfat iskeleti ve azotlu bazlar, özellikle halka parçalanmasına doğru 31 giden pirimidin ve pürinler arasındaki çift bağlardır (Hofreiter et al., 2001; Pääbo et al., 2004). Pirimidinler, özellikle Timin, oksidatif hasara pürinlerden daha duyarlıdır. Pirimidinlerin %10’u oksidatif hasar sonucu değişmektedir (Pääbo, 1989). Oksidize pirimidinler olan hidantoinler, DNA polimerazları bloke ederek PCR sırasında uzamayı engeller (Hofreiter et al., 2001). Bu sebeple hidantoinlerin varlığı, izolasyon ve amplifikasyon başarısı ile ters orantılıdır (Höss et al., 1996). Bir diğer hasar tipi de, DNA polimerazı bloke eden ve aDNA preparatlarında elektron mikroskobu ile doğrudan gözlemlenebilen çapraz bağlardır (Pääbo et al., 2004). Bunlar, protein veya nükleik asitlerdeki birincil amino grupları ile şekerler arasında yoğunlaşma reaksiyonları ile meydana gelen Maillard ürünlerinin oluşumuna sebep olur (Şekil 4). Nükleik asitleri bağlayan Maillard ürünleri, diğer inhibitörler (humik asit, fulvik asit) gibi, çoğunlukla DNA izolatlarının kahverengi olmasına sebep olur. Bu bileşikler, agaroz jelde UV ışık altında mavi floresans verir (Pääbo, 1989; Tuross, 1994; Hanni et al., 1995; Kalmar et al., 2000; Kolman and Tuross, 2000). Bunlar sülfid içerdiğinden, 600 baz çiftinden küçük DNA parçaları ile karşılaştırılabilir hızda agaroz jelde yürür (Golenberg, 1994). Maillard ürünlerini parçalayan bir ajan, örneğin N-fenilaçiltiazolyum bromid (PTB) ile muamele; amplifikasyona başka türlü cevap vermeyen bazı örneklerden DNA dizinlerini çoğaltmayı sağlar (Pääbo et al., 2004). Donmuş sedimentlerden elde edilen eski DNA dizinlerinde çapraz bağların, iplik kopmalarından daha etkili olduğu belirlenmiştir (Hansen et al., 2006). Pääbo (1989) eski DNA’da yüksek miktarda oksidatif hasar ve çapraz bağlar olduğunu göstermiştir. 32 Alkilasyon / Maillard Reaksiyonu İplikler arası çapraz bağlar Moleküller arası çapraz bağlar Amplifikasyon olmaz Kontaminasyon Şekil 4. Post-mortem DNA değişimlerinde çapraz bağların oluşması. (i) Alkilasyon ile iplikler arasında çapraz bağlar oluşması. (ii) Maillard reaksiyonu ile moleküler çapraz bağların oluşması (Willerslev and Cooper, 2005). Degradasyon olayları hücrelerin içinde sürekli olarak devam eder, ancak çekirdekteki DNA tamir mekanizmaları ile kontrol altındadır. Ölüm sonrasında bu ve diğer degradatif olaylar birikmeye başlar. Eski DNA'nın eldesi ve amplifikasyonu, mümkün olduğunda, 300–500 baz çiftinden az uzunlukta ve birkaç bin yıllık veya daha az yaşta olan örneklerle sınırlıdır (O’Rourke et al., 2000). Pääbo (1989) ise, 140 baz çiftinden daha uzun parçalarda amplifikasyonun başarısız olduğunu belirtmiştir. Ancak arkeolojik materyalin korunması için degradasyon mekanizmaları ile ilgili bilgiler arttırılmalıdır (Jans et al., 2002). Araştırıcılar, uzun süreli çevresel sıcaklıkla DNA izolasyonu ve amplifikasyon başarısı arasında ters bir ilgi kurmuşlardır (Höss et al., 1996; Pääbo, 1989; Poinar et al., 1996). Sıcaklıktaki 20° C'lik düşüş, baz degradasyonunu 10-25 kat azaltır (Höss et al., 1996). Tuross (1993, 1994) bozulmanın ölüm sonrası hemen başladığını, ancak en azından kemik örneklerinde hidroksiapatite bağlanan DNA'nın stabilizasyonundan dolayı, 33 hidrolitik depurinasyon oranının iki kat yavaşladığını öne sürmektedir. Lindahl’e (1993) göre, DNA’nın tümüyle hidrolitik hasara uğraması fizyolojik tuz konsantrasyonları, nötral pH ve 15º C sıcaklıkta 100.000 yıl alacaktır. PCR inhibitörlerinin büyük çoğunluğu taninler, humik asit, fulvik asit ve diğer tüm bilinen toprak kaynaklı degradasyon ürünleridir (Hummel et al., 1992; Tuross, 1994, O’Rourke et al., 2000). Bunlar fenol türevli oldukları için, fenol-kloroform ekstraksiyonu ile uzaklaştırılabilirler. Tuross (1994), 260–280 nm’de absorbans ölçtüğü örneklerde fulvik asitin, DNA’ya göre daha fazla emici olduğunu belirlemiştir, dolayısıyla DNA izolatlarının 240, 260 veya 280 nm’de absorbansı ölçüldüğünde fulvik asitlerin varlığı kolaylıkla görülebilir. Tuross’un (1994) belirttiğine göre; 100 ng fulvik asit, Taq polimerazın hedef aldığı kontrol Lambda DNA’nın amplifikasyonunu tamamen inhibe eder. Eski DNA'nın elde edilmesi yıkıcı bir süreç olduğu için eski DNA izolasyonu ve amplifikasyonu girişimlerinde uygun belirteçleri incelemek çok önemlidir. Nükleik asit degradasyonu birçok şekilde tespit edilebilir (O’Rourke et al., 2000). Genel olarak proteinlerin korunmuş olması, örnekte benzer düzeyde korunmuş DNA beklenebileceğini gösterir (Kolman and Tuross, 2000). Aminoasit rasemizasyonu bir başka yöntemdir. Canlı organizmalardaki tüm proteinler sadece L-aminoasitlerden oluşur, ancak L-formundan Dformuna post-mortem dönüşüm (rasemizasyon) denge oluşuncaya kadar (D/L=1) devam eder. Fosil örneklerinde ve kemiklerde proteinlerin zaman içinde degradasyonu ile hem Dhem de L- aminoasitlerin varlığı gösterilmiştir (Schwartz et al., 1991, Poinar et al., 1996). Aspartik asit (Asp) rasemizasyonu neredeyse DNA depurinasyonuna yakındır ve bu sebeple DNA'nın korunmuş olduğunun iyi bir belirtecidir. Aminoasit rasemizasyonu, DNA'nın depurinasyonu gibi, sıcaklık ve suyun varlığından etkilenir. Yüksek oranlarda 34 rasemizasyon tespit edilen örnekler, kısa DNA parçaları vermeye eğilimlidir. Bir çalışmada Asp D-formunun Asp-L formunu %8'den fazla aştığı örneklerde DNA elde edilememiş ve çoğaltılamamıştır (Poinar et al., 1996). Smith ve meslektaşları (2001), geçmişe ait örneklerde termal yaş kavramından bahseder. Sıcaklık 10ºC’de sabit tutulduğunda DNA degradasyonunun olması için geçen süre olarak tanımlanan termal yaş, çözeltide tahmin edilen DNA depurinasyonunun bilinen sıcaklık bağlılığını kullanarak farklı bölgelerin kronolojik yaşını bireysel termal geçmişine göre ayarlar. Termal yaşın kullanımı iki varsayıma dayanır: DNA depurinasyonu DNA degradasyonu için anahtar yoldur, depurinasyon için aktivasyon enerjisi sıcaklık bağımlıdır (Smith et al., 2003). DNA korunması için sınırın, 10º C’de yaklaşık 19.000 yıl olduğu tahmin edilmektedir (Chilvers et al., 2008). Hansen ve meslektaşlarına (2006) göre, aminoasit rasemizasyonu ve termal yaş gibi yöntemlerle DNA’nın uzun süreli korunmasını belirlemek imkânsız olduğundan, bakteriyel DNA’nın durumu, örneğin saklanma koşulları gibi daha gerçekçi şartlar için hasar oranlarının araştırılması gerekir. Ayrıca gaz kromatografisi / kütle spektrometrisi, önemli miktarlarda değişmiş DNA bazlarını belirlemek için kullanılabilir (Höss et al., 1996). Yüksek performanslı likit kromatografisi analizleriyle pirimidin kayıpları belirlenebilir (Mitchell et al., 2005). Kromozomal DNA Çalışmaları Nükleer DNA (nuDNA) analizlerinde 1985 yılına kadar kullanılan parçacık uzunluk polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) ile sınırlı özellikte (sadece taze ve çok miktarda) örnekten DNA çalışılabilmiştir. Kary Mullis 35 tarafından tanımlanan Polimeraz Zincir Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction, PCR), çok az miktarda olan örneklerden DNA çalışılmasını mümkün hale getirmiştir (Mullis et al., 1986; Mullis and Faloona, 1987). PCR, bir biyolojik örnekteki belirli DNA bölgesinin miktarını arttırmak için genel bir teknik olup, zaman içinde ilerleyen teknolojiyle birlikte, temeli PCR’a dayanan birçok sistem geliştirilmiştir. PCR temelli tüm sistemler, özellikle eski, sınırlı miktarda veya degrade örneklerden DNA analizinde başarıya ulaşılmasını sağlamıştır (Rudin and Inman, 2002). Alec Jeffreys tarafından 1985’te genomda varlığı keşfedilen tekrar bölgelerinin sayılarının kişileri arasında farklı olduğu ortaya çıkarılmış ve ilk kez iki cinsel saldırı cinayetinin çözülmesinde kullanılmıştır (Jeffreys et al., 1985; Saferstein, 2004). Genomda farklı çeşitlerdeki tekrar bölgelerinden biri olan basit dizin tekrarları, ‘minisatellit’ (değişken sayıda ardışık tekrarlar, Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) ve ‘mikrosatellit’ (kısa ardışık tekrarlar, Short Tandem Repeats, STR) olarak bilinir. Dinükleotid tekrarlarının, aDNA tiplemesinde güvenilir nükleer DNA dizinleri olmadığı gösterilmiştir (Ramos et al., 1995). Hummel ve meslektaşları (1999), tarihsel örneklerde aynı anda dört STR lokusundan fazlasının başarıyla çoğaltılamadığını, ancak kendi çalışmalarıyla dokuz STR lokusunu aynı anda analiz edebildiklerini bildirmiştir. Eski örneklerde degradasyondan dolayı, büyük boyutlu STR’lerin çoğaltılmasında genellikle başarı sağlanamamıştır. Ancak kromozomal DNA için 300 veya daha fazla baz çifti uzunluğunda parçaların korunabildiği de gösterilmiştir (Hummel et al., 1999). Von Wurmb-Schwark ve meslektaşlarına (2004) göre STR analizi için 100 pg eski DNA gereklidir. Degrade örneklerden STR çalışmalarında PCR döngülerine bağlı olarak örnek ve enzim konsantrasyonlarının ayarlanması, ayrıca profillerin yorumlanmasında düşük 36 düzeyde sinyaller alındığında örneğin yeniden analiz edilmesi için stratejiler içeren kılavuzların oluşturulması ve kişilerin dikkatli yorumlaması ile birlikte bilgisayar yazılımları da kullanması önerilmektedir (Schneider et al., 2004). Son yıllarda geleneksel otozomal STR primerlerinin tekrar dizinine daha yakın bölgelerden bağlanması sağlanarak boyutları küçültülmüş ve daha kısa tekrar bölgeleri elde edilerek bunlara “mini-STR” adı verilmiştir. Günümüzde standardize edilerek kullanıma sunulmuş ticari kitlerle farklı sayılarda mini-STR lokusunun aynı anda analiz edilebilmesi mümkündür. Mini-STR’ler, çok kısa olmalarından dolayı, özellikle degrade örneklerin analizinde tercih edilmektedir. Bu sebeple, mini-STR’ler özellikle kemik ve saç örneklerinden DNA analizinde sıklıkla kullanılmaktadır (Butler et al., 2003; Coble et al., 2006; Opel et al., 2006; Pizzamiglio et al., 2006; Asamura et al., 2007a, Fondevila et al., 2008). Yeni mini-STR’lerin oluşturulması çalışmaları halen devam etmektedir (Coble et al., 2006). Hatta degrade örneklerden Y-STR bölgelerinin analizi için mini Y-STR sistemleri de geliştirilmiştir (Asamura et al., 2007b). EDNAP (Avrupa DNA Profilleme Grubu) ve ENFSI (Avrupa Adli Bilimler Enstitüleri Ağı), aDNA analizlerinde başarı için STR’lerin giderek küçülmesi gerektiğini önermektedir (Dixon et al., 2006). Genomun belirli noktalarında bireyler arasındaki baz farklılıkları, tek nükleotid polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) olarak adlandırılır. Bir bireyde hem çekirdek DNA’sında, hem de mitokondriyal DNA’da milyonlarca bulunabilen SNP’ler, adli bilimler açısından kişilerin birbirinden ayırt edilmesini sağlar. SNP analizi için birçok teknik vardır, ancak günümüzde halen aynı anda çok sayıda SNP’nin aynı anda belirlenmesi için sistemler geliştirilmeye devam edilmektedir (Butler, 2005). SNP kullanımının adli bilimlerdeki temel amacı, güçlü PCR inhibitörlerinden veya 37 degrade örneklerden küçük PCR ürünleri oluşturmaktır. Analiz edilecek hedef bölge STR’lerdeki gibi 20–60 nükleotid değil, sadece bir tek nükleotid içerdiğinden, PCR ürünleri de küçük – kısa olur ve analizde başarı sağlanır (Butler, 2005). İskelet kalıntıları gibi degrade örneklerde diğer yöntemlerle birlikte SNP analizleri de kullanarak idantifikasyon yapılan olgular bulunmaktadır (Larcombe et al., 2005; Fondevilla et al., 2008). Cinsiyet Kromozomları Cinsiyetin antropolojik yöntemlerle belirlenmesi, tam bir iskeletin varlığında zor değildir, ancak çoğunlukla iskelet parçalarının bulunması söz konusudur. Örneğin uçak kazalarında kemikler birçok parçaya ayrılır ve sadece çok küçük bir parça bulunabilir (İşcan, 2001). Bebek ve çocuk iskeletlerinde antropolojik çalışmalarla cinsiyet tayini çok zordur, tek çözüm DNA analizleridir (Colson et al., 1997; Mergen and İşcan, 2007; Arslan et al., 2008). Cinsiyetin moleküler düzeyde tayini; adli örneklerde, idantifikasyon için toplumun %50’sinin dışlanmasını sağlarken, arkeolojik örneklerde antropolojik ölçümlerle elde edilen bilgilerin teyit edilmesine imkân verir. Bu amaçla önceleri Y kromozomuna özgü dizinlerin amplifikasyonu kullanılmıştır. Bu, cinsiyet tayininde ilk moleküler genetik yöntemdir (Hummel and Herrmann, 1991; 1994). Günümüzde ise insanlarda var olan cinsiyet kromozomlarının (X ve Y) her ikisinde de farklı uzunluklarda yer alan, dolayısıyla cinsiyetler arasında ayırım yapmayı sağlayan Amelogenin lokusu kullanılır. Lokus, sadece X kromozomunda 6 baz çiftlik bir delesyon gösterdiğinden, analiz sonunda kadınlarda (XX) sadece bir ürün (X), erkeklerde (XY) ise biri diğerinden altı baz daha kısa iki ürün (X 38 ve Y) görülür (Rudin and Inman, 2002). Colson ve meslektaşları (1997), tek kopya sayısından dolayı amelogenin sisteminin başarı sağlamadığını, bu sebeple sekiz yeni doğmuş, bir genç yetişkin bireyde genetik cinsiyeti belirlemek için Y kromozomundan yararlandıklarını belirtmiştir. Matheson ve Toy (2001), Amelogenin ile birlikte X ve Y kromozomlarındaki alfoid tekrarlarını kullanarak genetik cinsiyet tayini gerçekleştirmiş, Amelogenin’in çoğaltılamadığı altı olgudan beşinde alfoid tekrarlarının sonuç verdiğini belirtmiştir. Amelogenin’deki Y kopyasının delesyonu sebebiyle kadın olarak tespit edilebilecek erkeklerin, doğru cinsiyetlendirilmesi için Y kromozomunda cinsiyet belirleyici bölge (Sex-determining Region of Y-chromosome, SRY) çalışılabilir. Drobnic (2006) tarafından SRY bölgesi analizleri için yeni primerler önerilmiştir. Cinsiyet kromozomları, cinsiyet tayini dışında taşıdıkları, gonozomal STR ve SNP bölgeleriyle idantifikasyona da yarar. Ayrıca göç yolları çalışmalarına katkı sağlar (Butler, 2005). Otozomal DNA incelemeleri, her bireyin genlerinin yarısını annesinden, diğer yarısı babasından aldığı esasına göre gerçekleştirilir. Ancak Y kromozomu ve mitokondriyal DNA çalışmaları yapıldığında, bireyin bir önceki neslin özelliklerini aynen taşıdığı, dolayısıyla önceki kuşağı temsil ettiği göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca bu analizlerde genotipten değil, haplotipten bahsedilir, çünkü her birey için tek bir alel vardır (Butler, 2005). Bir bireydeki dizin çeşidi ‘haplotip’, birbiriyle bağlantılı haplotiplerin oluşturduğu gruplar ise ‘haplogrup’ olarak adlandırılır. Y kromozomu ve mitokondriyal DNA çalışmalarında incelenen özellikler, kuşaklar arasında -mutasyonlar dışında- değişmeden aktarılır. Böylece annenin soyunu mitokondriyal DNA, babanın soyunu ise Y kromozomu ile takip etmek mümkün olur. Her ne kadar bu tip analizlerle bireylerin etkili bir şekilde birbirlerinden ayırt edilmesi mümkün 39 olamasa da, hem Y kromozomunda bulunan Y-STR ve Y-SNP’ler, hem de mtDNA’da yer alan SNP’ler adli bilimlerde çok önemli bir yer tutar (Butler, 2005). Y kromozomu ve mitokondriyal DNA, modern insanların evrimsel kökeni ve dünyaya yayılmaya başladıklarında izledikleri rotaları belirlemek amacıyla arkeogenetikte geniş ölçüde kullanılır (Cavalli-Sforza and Feldman, 2003). Y kromozomu: Aynı soydan gelen tüm erkek bireylerde aynı özellikleri taşır. Adli bilimlerde özellikle failin çoğunlukla erkek olduğu cinsel suçlarda toplanan biyolojik delillerde, sadece erkeğe ait DNA’nın incelenmesi ve farklı erkeklerin birbirinden ayırt edilebilmesi gerekir. Bu durumda Y kromozomu üzerinde yer alan STR’ler veya SNP’ler çok önemli bilgiler sunar. Babanın hayatta olmadığı ve erkek çocukların söz konusu olduğu babalık olgularında, kayıp bireylerin araştırılmasında, kitlesel felaketlerde kişi idantifikasyonlarında; ailede yaşayan diğer erkek bireylerin Y kromozomlarının analizi ile sonuca gidilmesi mümkündür (Butler, 2005). Y kromozomu üzerinde incelenen işaretler, evrim sürecindeki göç yollarının anlaşılması açısından da çok önemlidir. Özellikle Y-SNP’ler bu araştırmalarda haplogruplar arasındaki farklılıkları tanımlamada daha idealdir. Y-STR’ler ise haplogruplar içerisinde yakın ilişkili verilerin ayrımında kullanılmaktadır. Y kromozomu işaretleri bölgesel bir sınırlama eğilimi göstermiş, diğer bir deyişle popülasyona özgü kalmıştır. Böylece Y kromozomu haplogruplarının belirlenmesi ile filogenetik ağaçlar oluşturulmuştur (Underhill et al., 1997, Cinnioglu et al., 2004). Özellikle modern insanın evrimi ve göç yollarının anlaşılması açısından birçok toplumun tek nükleotid polimorfizmi çalışmaları halen sürmektedir. 40 Mitokondriyal DNA Çalışmaları İnsan mitokondriyal DNA’sı (mtDNA), 16569 nükleotid çiftinden oluşan kapalı halkasal bir molekül olup ağır (Heavy, H) ve hafif (Light, L) olarak adlandırılan iki DNA iplikçiğinden meydana gelir. Bir küçük (12S) ve bir büyük (16S) rRNA, 22 tRNA ve mitokondriyal enerji oluşturma yolu olan oksidatif fosforilasyonun alt üniteleri olan on üç polipeptid kodlar (Wallace, 1994). Kodlama yapmayan 1100 baz çiftlik bölümü ise ileri değişken kontrol bölgesi (Hyper Variable Control Region, HVR) veya D-Loop (Displacement Loop) olarak adlandırılır ve iki kısım içerir: HVRI (16024–16365) ve HVRII (73–340) (Anderson et al., 1981). Bu çeşitlilik popülasyona özgüdür, hatta belirli mitokondriyal işaretlerdeki yüksek mutasyon oranları ile aile düzeyine kadar inebilir. HVR’ler bireyler arasında %3 farklılık gösterir, bir başka deyişle rastgele seçilmiş akraba olmayan iki kişide, her yüz nükleotidden üçü farklıdır (Stoneking, 2000). Karşılaştırılabilir yüksek polimorfizm düzeylerinden dolayı, HVR’ler aDNA analizleri için genellikle çok uygundur (Hummel, 2003). Ancak bu uzun bölge, aDNA çalışmalarında tek bir amplifikasyon ile başarılamayacağı için, HVR’leri çoğaltmada üst üste çakışan parçalar oluşturmak sıklıkla tercih edilen bir yöntemdir (Krings et al., 1997; Hummel, 2003; Imaizumi et al., 2005; Bouwman et al., 2006, 2008; Dissing et al., 2007; Gao et al., 2007). Bu parçaların amplifikasyonu ve dizinlenmesi ile teorik olarak büyük boyutta bir dizin yapılandırılabilir (Yao and Zhang, 2003). İnsan mitokondriyal genomunun tüm dizisi 1981'de tespit edilmiştir (Anderson et al., 1981). Bu ilk mtDNA dizisi, Anderson dizisi veya Cambridge Referans Dizisi (Cambridge Reference Sequence, CRS) olarak bilinir (Ek 1). Moleküldeki her nükleotid numaralandırılarak diğer mtDNA dizileriyle karşılaştırmada kolaylıkla kullanılması 41 sağlanmıştır. Daha sonra 1999 yılında Andrews ve meslektaşları (1999) tarafından bu dizinin yenilenmiş hali (revised Cambridge Reference Sequence, rCRS) yayınlanmıştır. Bunun orijinal Cambridge dizisinden farkı, mtDNA dizininde düzeltilmiş ve doğrulanmış on sekiz nükleotid içermesidir (Andrews et al., 1999). Oosit sitoplazması yoluyla iletildiği için, anne kalıtımlı olan mtDNA dizininin değişebilmesi için tek yol, yayılan annesel soylar boyunca mutasyonların dizinsel birikimidir. Özellikle mitokondriyal DNA'nın I ve II değişken bölgeleri, temelde mitokondrilerdeki DNA tamir mekanizmalarının eksikliğinden dolayı, değişiklikleri belli bir oranda biriktirir. Mutasyonlar rastlantısal olduğundan mtDNA’nın kodlayan / kodlamayan herhangi bir bölgesindeki baz değişebilir. Hatta vücuttaki her hücre yüzlerce mitokondri ve binlerce mtDNA içerdiği için mitokondriyal mutasyonlar, bütün dokularda vücut ve üreme hücrelerinde meydana gelebilir. Farklı tip DNA mutasyonlarının ve bunların hücre ve dokulardaki dağılımının anlamları çok farklı olabilir. Somatik dokularda artan mutasyonlar, hücresel enerji üretimini bozar ama bireysel olarak da yok edilir. Dişi üreme hücrelerinde artan mutasyonlar, yeni mitokondriyal DNA polimorfizmleri veya mtDNA bozukluğu olarak yeni nesillere aktarılır. Somatik mutasyonlar, mitokondriyal hasarın süresini belirlerken, kalıtımsal mtDNA mutasyonları klinik belirtilerin şiddetini ve yapısını etkiler (Wallace, 1994). Bir mtDNA mutasyonu arttığında “heteroplazmi” denilen mutant ve normal moleküllerden oluşan intrasellüler bir karışım meydana gelir. Bunu takiben mutant ve normal mtDNA’lar mitoz ve mayoz replikasyon sırasında yavru hücrelere rastgele dağıldığı için mutant ve normal moleküllerin yüzdesi ya saf mutant ya da saf normale doğru hücre içinde sürüklenir ki; bu da “homoplazmi” olarak adlandırılır (Wallace, 1994). 42 Heteroplazmi üç düzeyde olabilir: Bir hücre sadece homoplazmik mtDNA taşır; bir hücre farklı mtDNA haplotipleri taşır, ancak her bir mitokondri homoplazmiktir; her mitokondri farklı mtDNA tiplerini içerir (Lutz et al., 1999). Heteroplazminin insanlarda varlığı, sıklığı ve dağılımı, günümüzde kesin olarak bilinmemektedir. Dolayısıyla heteroplazmi, mtDNA tipleme sistemleriyle her zaman belirlenemese de, bütün bireylerin bir dereceye kadar heteroplazmik olduğu düşünülmektedir. Farklı dokularda (kanda en düşük, saçta en yüksek sıklıkta), hatta aynı bireyin aynı dokularında bile farklı derecelerde heteroplazmi görülür (Rudin and Inman, 2002; Bini and Pappalardo, 2005). Salas ve meslektaşları (2001) tek bir saçın farklı bölümlerinde farklı düzeylerde heteroplazmi bildirmişlerdir. İnsanlarda heteroplazmi hakkındaki birçok araştırma, hastalıklarla bağlantılı mtDNA mutasyonları ile ilgilidir, çünkü homoplazmi patojenik mutantların çoğu için öldürücüdür (Lutz et al., 1999). Yüksek mtDNA dizin çeşitliliği, coğrafik olarak ayrılmış popülasyonlar arasında belirgin olarak görülür. Bu varyasyon, ilk kez Avrupa, Asya ve Afrika’dan toplanan örneklerden HpaI sınırlandırılmış parça uzunluk polimorfizmlerinin (Restriction Fragment Length Polimorphism, RFLP) analiz edilmesi sonucu örneklerin etnik ve coğrafik kökeni ile bir korelasyon oluşturmak için gösterilmiştir. Bütün dünyadaki 62 popülasyondan 3065 mtDNA’daki AvaII, BamHI, HaeII, HpaI, HhaI ve MspI gibi yüksek polimorfik enzimlerle restriksiyon bölgesi farklılıklarının analizi, insan mtDNA’sının çeşitliliğinin evrimi hakkında birkaç temel ilkeyi açığa çıkarmıştır: (1) MtDNA mutasyonları yayılan maternal yollar boyunca dizinsel olarak birikir. (2) MtDNA varyasyonu bireyin etnik ve coğrafik kökeni ile yüksek korelasyon gösterir. (3) Bağımsız restriksiyon bölgelerindeki varyantlar ya her zaman birbirleriyle ilişkilidir ya da hiç ilişkili değildir; bu da mtDNA'ların çok az 43 rekombine olduğunu veya asla rekombinasyonun gerçekleşmediğini gösterir. (4) Homo sapiens için tek orijin vardır, insanlar için mtDNA ağacı tek koldan kıtalara yayılır. (5) Bireysel popülasyonlar içinde mtDNA dizin çeşitliliği, Afrika popülasyonlarında en yüksek, Asya ve Avrupa popülasyonlarında yüksek, Amerika yerlilerinde en düşüktür. MtDNA mutasyonlarının ve dolayısıyla dizin çeşitliliğinin oldukça sabit oranda biriktiği farz edilirse, bu H. sapiens’in Afrika’dan köken aldığı, Asya ve Avrupa’ya göç ettiği ve nihayet Amerika’ya ulaştığı anlamına gelir (Wallace, 1994). MtDNA haplogruplarının filogenetik gruplandırmasının coğrafik özelliklerle uyumlu olduğu bulunmuş; haplogrupların adlandırma ve frekansları 1993 ve 1994 yıllarında Chen, Torroni, Wallace tarafından Afrikalılara (L), Asyalılara (B), Avrupa/Batı Avrasyalılara (H, I, J, K) ve Amerikan yerlilerine (A, B, C, D) özgü olarak tespit edilmiştir. Farklı araştırmacılar etnik toplumlarda popülasyon incelemelerini sürdürmektedirler (Mitomap, 2009). DNA Tipleme Sistemleriyle Akrabalık Analizi DNA, bireylerin idantifikasyonu kadar, iki ya da daha fazla bireyin aynı aileden olup olmadıklarını belirlemek için de kullanılabilir. Bu çalışmalar, akrabalık analizi olarak adlandırılır ve günümüzde adli bilimlerde en temel uygulaması babalık testleridir. Kısmen anneden, kısmen babadan kalıtılan DNA profilinde belirli bir STR bölgesinin alelleri aile ağacına yerleştirildiğinde, aile içindeki ilişkiler ortaya çıkar (Bujdoso et al., 2003; Brown, 2006). Popülasyonda sık rastlanmayan bir alelin istatistiksel olasılığı aile içinde yüksek olsa da, çalışılan bireylerin bir lokusta dahil edildiği bilgisi, akrabalığı göstermek için yeterli değildir. Kesinliği arttırmak için daha fazla STR lokusu çalışılmalıdır, ancak analiz 44 sonsuz da olmamalı, görülen ilişkilerin kabul edilebilir bir olasılık verebildiği sayıda bölge incelenmelidir (Wenk, 2004). Bir popülasyonda düşük frekanslı alellerin varlığı arttıkça, popülasyon içindeki yakınlık olasılığı da artar (Boljuncic, 2007). Mitokondriyal DNA, bireyler arasında ilişkileri ortaya çıkarmak için kullanılan polimorfizmlere sahiptir, ancak çeşitlilik STR’lerdeki kadar fazla değildir. Ancak mtDNA sadece anneden kalıtıldığı için büyük önem taşır. Babaya ait mtDNA döllenme sırasında kaybolduğundan çocuğun DNA içeriğiyle karışmaz ve çocuklarda her zaman anne ile aynı mtDNA görülür. Bireyler uzaktan ilişkili bile olsa, bu annesel kalıtım modeli anne tarafından akrabalıkları ortaya çıkarmayı kolaylaştırır (Rudin and Inman, 2002). Genetik danışmanlıkta, ikiz çalışmalarında, bebeklerin hastanede karıştığı durumlarda, infertilite tedavisinde gamet ve embriyo birleştirilmesinde akrabalık analizleri yararlı olmaktadır. Bu tıbbi yaklaşımların ötesinde, kan akrabalığı çalışmaları adli bilimlerde, varolmayan veya sonlandırılmış resmi veya gayriresmi ilişkilerden doğan çocukların sosyal bakımlarının üstlenilmesinde, mal ve sosyal güvenlik hukukunda ve göçmenlik kararlarında çok değerlidir. Hatta insan dışı düşünüldüğünde, yabani hayatta bitki ve hayvanların soy içi çiftleştirilmesinde de akrabalık analizi önemlidir (Wenk, 2004). Günümüzde var olan teknoloji ile soy bağı araştırması mümkün olduğu gibi, bunun kökleri tarihe dayandırılarak ataların tespiti, ait olunan kökenin belirlenmesi de söz konusudur. Birçok laboratuvar, belirli ücretler karşılığında bireylerin genetik ataları hakkında ayrıntılı bilgi sağladıklarını iddia etmektedir. Bu kuruluşlar, yeryüzünde var olan belirli popülasyonlarla ilişkilendirilen haplogrupları belirleyecek DNA dizinleme tekniklerini kullanır. Bazıları bireyin etnik geçmişinin yüzde değerlerini verir (%35 45 Avrupalı, %50 Asyalı, %15 Afrikalı gibi). Ancak bu hizmetlerin güvenilirliği tartışmalıdır (Walker, 2008). DNA tiplemesinin akrabalık analizinde kullanıldığı ilginç bir örnek, 1990’larda Rus hükümdar ailesinin son bireyleri, Romanov’ların kemiklerinde gerçekleştirilen çalışmadır (Gill et al., 1994): Çar Nicholas II, Rusya Devrimi’nde tahttan indirilmişti. Eşi Çariçe Alexandra ve beş çocuğu ile birlikte hapse atılmış, 1918’de doktor ve hizmetçileri de dahil hepsi öldürülmüştü. 1991’de komünizmin düşmesinden sonra, cesetler mezarlarından çıkarıldı ve incelenmeye başlandı. Mezarlardan elde edilen çocuk ve yetişkin kemikleri birbirine karıştığı gibi, doktor ve hizmetçilere ait kemikler de ayırt edilemiyordu. Ancak çocuk kemiklerinin sadece Çar ve Çariçe’ye ait olduğu düşünülüyordu. Dolayısıyla hangi yetişkinlerin çocukların ailesi olduğundan yola çıkılarak Çar ve Çariçe’nin kemikleri belirlenebilirdi. Her bireye ait kemikten DNA çekitlendi ve beş STR lokusu PCR ile tiplendi. Sadece ikisi çocukların ebeveynleri hakkında yeterli bilgi sağlayabildi. Ancak bunlar gerçekten Romanov’ların kemikleri miydi yoksa herhangi bir ailenin iskelet kalıntıları mıydı? Bunu belirleyebilmek için kemiklerdeki DNA, Romanov’ların yaşayan akrabalarının DNA’ları ile karşılaştırıldı. Romanov’ların mtDNA çalışmaları, sonunda kemiklerin Çar Nicholas, Çariçe Alexandra ve üç kız çocuklarının olduğunu gösterdi. Romanov’ların mezarında sadece üç çocuk bulunmuştu. Tek oğlan Alexei ve dört kızdan biri kayıptı. 20.yüzyılın ortalarında birçok kadın, Romanov prensesi olduğunu iddia etmiştir, çünkü kemikler elde edilmeden önce bile, kızlardan birinin (Anastasia) Bolşeviklerden batıya kaçtığı söylentisi vardır. DNA analizi, bu iddialarda bulunanların hiçbirinin Çar ve Çariçe’nin kızı olmadığını göstermiştir. İki çocuğun yokluğu, kemiklerin 46 farklı bir yere gömülmüş olduklarını düşündürmüştür (Gill et al., 1994). Ancak son yıllarda bir erkek ve bir kız çocuğunun iskeletlerin bulunduğu, bununla birlikte Alexei’nin giydiği kıyafetlerle Maria’nın kullandığı takılara benzer kalıntılarının da bu iskeletlerin yanında bulunduğu bildirilmiştir (Brown, 2006). Arkeolojik kapsamda aile bağlarının açıklanması için bir örnek de, Almanya Bavaria’da St. Margareth’s Kilisesi kazısında görülür (Gerstenberger et al., 1999). Kilisedeki mezar taşları ve açıklamalar, Königsfeld Kontu ailesinin yedi neslinden sekiz erkek bireyin 1546–1749 arasında gömüldüğünü gösterir. Sekiz bireyde genetik testler, tarihi kaynaklarda yazılan şecere ile farklılık gösterir (Şekil 5). Bunlardan ikisi genetik olarak kadındır ve Kont değildir. Otozomal ve Y kromozomal mikrosatellitler daha ileri anomaliler olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu işaretler, iki en büyük Kont’un iskeletlerinin (55 ve 33) muhtemelen kazı sırasında karıştığını ve son erkeğin (11) önceki Kont’un (54) biyolojik oğlu olmadığını göstermiştir. Bu sebeple bu birey, ya Königsfeld ailesinin bireyi değildir, ya da babalık dışı bir olgudur. Önceden Karl Albrecht olarak bilinen kadın birey (32) otozomal haplotipi, Karl Albrecht’in kız kardeşi ve Georg Josef’in (11) kızıdır. Diğer kadın birey (1) ise bu kadının (32) annesi olarak tanımlanır (Georg Josef’in karısı). Königsfeld’lerden Georg Josef ve tüm aile grubunun varlığı, Georg’un aslında bir babalık dışı olgunun ürünü olduğunu gösterir ki; Königsfeld soyu dışında bir kişi ve onun ailesinin bu mezarda yattığı ortaya çıkar. Diğer tarihî bilgi ve belgelerle kurulan aile ilişkilerinin ise genetik analizlerle uyumlu olduğu da gösterilmiştir (Gerstenberger et al., 1999). 47 Arkeolojik ve tarihsel yapılandırma Genetik yapılandırma Karl Albrect’in kız kardeşi Belirlenemeyen kadın birey (30 yaşlarında) Şekil 5. Königsfeld Kont’larının geleneksel aile mezarlığında (1546–1749) arkeolojik ve tarihi kayıtlara göre çıkarılan soyağacı ile genetik soyağacının karşılaştırılması. Otozomal STR’lerle 33 ve 55 yer değiştirmiş, hem otozomal hem de Y-STR’lerle 11’in 54’ün biyolojik oğlu olduğu dışlanmış, ancak otozomal STR’lerle 32’nin babası olduğu belirlenmiştir. 32’nin bir kadın, muhtemelen Karl Albrecht’in kızkardeşlerinden biri olduğu belirlenmiştir. O güne kadar idantifiye edilememiş yetişkin bir kadın olan 1, 32’nin annesidir; böylece Königsfeld ailesinin bir üyesi olan Maria Anna olarak tespit edilir (Hummel, 2003). Akrabalık Tayinlerinde İstatistiksel Hesaplar İncelenen bir biyolojik örneğin idantifikasyonundan sonra, kişiye ait olup olmadığının tespiti için yapılan karşılaştırma sonunda örnek dışlanabilir veya dahil edilebilir. Bu dahil etmede rastgele uyuşma olasılığı önemlidir ve istatistiksel hesabın yapılabilmesi için, incelenen özelliklerin toplumda görülme sıklığının bilinmesi gerekir (Rudin and Inman, 2002). Adli bilimlerde olasılık, kaç kişide bir aynı DNA profilinin görülebileceğini bildiren bir indeks ve bu indeksten yararlanılarak elde edilen EssenMöller oranı (W) ile hesaplanır (Essen-Möller, 1938). Ebeveynlik testlerinin dışında, kitlesel felaketlerde karışmış, parçalanmış bireylerde veya kayıp kişilerde ters ebeveynlik 48 testleri de yapılabilir. Ancak akrabalar gibi birbiriyle genetik olarak ilişkili bireylerin DNA örnekleri arasında birçok alel paylaşıldığından, farklı istatistiksel eşitlikler uygulanmalıdır (Fung et al., 2003; Butler, 2005; Brenner, 2009). Hatta bazı olgularda, özellikle göçmenlik uygulamalarında yanlış babanın akraba olma olasılığı yüksektir. Örneğin; incelenen birey gerçek babanın erkek kardeşi olabilir (Fung et al., 2002). Aile ilişkilerinin etkisini hesaplamak için uyuşma olasılık formülleri geliştirilmiştir. Bu olasılıklar, lokusların her alelinde farklı oranlarda olmak üzere akrabalık derecesi yakınlaştıkça artar (Evett and Weir, 1998). Günümüzde araştırmacılar, babalık veya kardeşlik analizlerinde kullanılacak yazılımlar geliştirmekte veya var olanları deneyerek bilim dünyasına sunmaktadır (Blouin, 2003; Fung, 2003; Riancho and Zarrabeitia, 2003; Fung et al., 2006; Fischer, 2009; Alt et al., 2009). Genetik verileri incelemek için uygun bilgisayar programları olduğu gibi, istatistiksel hesaplar yapabilen yazılımlar da piyasada mevcuttur. Örneğin; “BioEdit” gibi programlar dizin verilerini işlemek için kullanılır ve örnekler arasında karşılaştırmalarda kolaylık sağlar (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). “Popgene” gibi çok sayıda örnekle çalışabilen istatistik programları ile alel frekanslarından, popülasyonlar arası genetik uzaklığa kadar birçok bilgi elde edilebilir (http://www.ualberta.ca/~fyeh/). “Powerstats” gibi programlar ise örneklerin rastgele uyuşma olasılıkları, sistemlerin dışlama gücü gibi hesapları yapar (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/). Bireylerin akraba olduğu durumlarda yapılacak analizlere özgü istatistiksel hesaplamalar yapan programlar da geliştirilmiştir. Örneğin, “Familias” programı DNA profilleri bilinen, ancak aile ilişkileri sorgulanan olgularda olasılıkların belirlenmesi için kullanılır (Egeland 49 et al., 2000). “GenoProof” yazılımı standart babalık testlerine ek olarak, X ve Y-STR analizleriyle akrabalık, kardeşlik ilişkilerini analiz eder (http://qualitype.de/genoproof/). BİYOARKEOLOJİK ÖRNEKLERDE DNA ÇALIŞMALARI Eski örneklerden DNA eldesi ilk kez 1984'te Higuchi ve meslektaşları tarafından gösterilmiştir. Atgillerin nesli tükenmiş bir üyesi olan Equus quagga’nın müze örneğinde (deri kalıntıları) nükleik asitlerin varlığını ortaya koymuşlar ve bunun modern zebra ile filogenetik yakınlığını belirlemişlerdir (Higuchi et al., 1984). Bir yıl sonra Pääbo (1985) Mısır Hanedanlığı’na ait 2400 yıllık mumyalaşmış bir çocuktan DNA dizisi elde etmiştir. Bu sonuç, sadece moleküler analizin mümkün olduğunun gösterilmesi açısından değil, aynı zamanda büyük bir DNA parçasının (> 3 kb) dizinlenebildiğini ortaya çıkarması açısından da önemlidir (Pääbo, 1985). Johnson ve meslektaşları (1985) mamut kalıntılarında, Rogers ve Bendich (1985) ise herbaryum örneklerinde DNA’nın varlığını ispatlamışlardır. Bu ilk çabalar eski DNA parçalarını elde etmek, bir vektöre kopyalamak ve klonlanan parçaların dizinlenmesi aşamalarını içermekteydi. Ancak bu teknik izole edilmiş çok fazla aDNA gerektiriyordu. Daha sonra PCR'ın keşfi ile birlikte (Mullis and Faloona, 1987) yapılan ilk aDNA çalışması, Hagelberg ve meslektaşlarının (1989) arkeolojik kemikten başarıyla DNA çoğaltmasıdır. Ardından çok sayıda araştırmacı farklı coğrafik bölgelerdeki çeşitli örneklerden eski DNA elde etme çalışmalarına başlamıştır. Fiziksel antropolojide eski DNA analizi çalışmaları, bireysel veya toplumsal yapılabilir. Geçmişten kalan iskelet veya doku örnekleri bulunmuş bir bireyden gerçekleştirilen DNA analizi ile cinsiyet tayin edilebilir, idantifikasyon yapılabilir. Arkeolojik kökenli iskelet koleksiyonlarının DNA incelemeleriyle tarih öncesi toplumların 50 genetik özellikleri ve göç şekilleriyle ilgili bilgi edinmek de mümkündür. Tüm bu verilerle bireyler arasındaki akrabalık ilişkileri belirlenebilir, arkeolojik ve modern toplumlar arasında çeşitli karşılaştırmalar gerçekleştirilebilir (O’Rourke et al., 2000). Birey Düzeyinde aDNA Çalışmaları Cinsiyet Tayini: aDNA, en basit düzeyde, X ve Y kromozomları üzerindeki işaretleri kullanarak bireyin cinsiyetini belirlemeye yarar. Genetik cinsiyetlendirme, standart morfolojik yöntemlerle cinsiyetinin belirlenmesi çok zor olan çocuklar ve ergin olmayan bireylerde veya parçalanmış kalıntılarda özellikle yararlıdır ve gereklidir (Stone et al., 1996; Kaestle and Horsburgh, 2002; Imaizumi et al., 2005; Arslan et al., 2008). Pompei arkeolojik alanından elde edilen kalıntıların cinsiyetleri moleküler düzeyde tayin edilmiş, antropometrik değerlendirmelerle karşılaştırılarak sunulmuştur. On üç iskelet örneğinden üçünde cinsiyetin tahmin edilenden farklı olduğu belirlenmiştir (Cipollaro et al., 1998). Meyer ve meslektaşları (2000), on iki bireye ait otuz altı diş ve kemik örneğinde Amelogenin analizi gerçekleştirmiş, bazı erkek bireylerde amplifikasyon olmamış, bazen de alel düşmesi ile cinsiyet tayini zorlaşmış ve bağımsız başka PCR’lar yapmak gerektiği belirtilmiştir. Diyarbakır, Çayönü tepesinde bulunan 9.400 yıllık on insan kafatası örneğinde X ve Y kromozomlarındaki alfoid tekrarları ve amelogenin kullanılarak genetik cinsiyet tayini gerçekleştirilmiş, dokuzunda morfolojik cinsiyet genetik cinsiyet ile doğrulanmıştır (Matheson and Toy, 2001). Hatay’ın Reyhanlı ilçesinde Amik Ovası'nın ortasındaki Kalkolitik yerleşim yeri olan Tell Kurdu’dan elde edilen kemik örneklerinde moleküler cinsiyet %64 başarıyla belirlenmiştir (Mekel-Bobrov and Lahn, 2004). 51 Rönesans döneminin en büyük bilginlerinden biri sayılan, 1304–1374 yılları arasında yaşamış İtalyan hümanist ve şair Francesco Petrarca’nın 2003’te açılan mezarından çıkarılan kemiklerin analizinde; cinsiyet moleküler düzeyde çalışılmış, kaburga kemiklerinin erkeğe, ancak diş örneklerinin kadına ait olduğu belirlenmiştir. Bulgular morfolojik analizlerle tutarlıdır. Ayrıca kafatasının kaburga kemiklerinden iki yüz yıl daha eski olduğu açığa çıkarılmıştır. Petrarca’nın iskelet kalıntılarının bir kısmının çalındığı bilinmektedir. Ancak bu bulgulardan sonra, bir kadına ait ve daha eski olan kafatasının, çalınan kemiklerin yerine konulduğu düşünülmüştür (Caramelli et al., 2007; Pilli et al., 2008). İdantifikasyon: aDNA, adli bilimcilerin kullandıklarına benzer yöntemlerle bireyleri idantifiye eder. Bu yolla, karışmış örnekler en az birey sayısına ayrılır ve gömülme sırasında veya kazıdan sonra kırılmışsa birleştirilebilir. Eğer morfolojik katkılar, bireyin genetik veya salgın bir hastalıktan etkilendiğini gösteriyorsa, aDNA hastalığın varlığını doğrulayabilir. Yaşayan ataları bilinen bireyler, aDNA yoluyla birbiriyle kıyaslanarak idantifiye edilebilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Arkeolojik kazılarda bulunan hayvan kemikleri genellikle deneyimli bir arkeozoolog tarafından kolaylıkla belirlenir. Ancak tür idantifikasyonu sadece diyafiz parçaları kalmışsa zorlaşabilir. Özellikle iki yakın tür olan koyun ile keçiyi, köpek ile kurdu ayırmak zordur. Bu türlere ait kemik örneklerinden moleküler genetik analizlerle idantifikasyon yapılarak kesin sonuca ulaşılır (Hummel, 2003). Japonya’da iki bölgeden elde edilen, bazıları birlikte gömülmüş iki grup insan kalıntısı (yirmi altı ve yirmi dokuz iskelet) VNTR kullanılarak idantifiye edilmiş, birbirleriyle karşılaştırılmış, ancak eski toplumlarda alel frekansları hakkında veri olmadığı 52 için akrabalık olasılığını tahmin etmenin güç olduğu vurgulanmıştır (Kurosaki et al., 1993). Kayıp bir kişinin İzmir’de bulunan iskeleti DNA analiziyle idantifiye edilmiş ve aile bağlarının tahmini yapılmıştır (Altunçul et al., 1999). Mart 1995’te Bolivya Hükümeti tarafından Che Guevara’nın 1960’larda ülkede bir yerlere gömülmüş gerillalarının kalıntılarını bulmak için komisyon oluşturulmuştur. Grup daha sonra uluslar arası boyut kazanmış ve Arjantin, Küba ve Bolivya’dan adli bilimciler de katılmıştır. Birkaç ay sonra iki gömü yerinde bazı iskeletler bulunmuş, STR ve mtDNA analizleriyle idantifikasyon yapılmıştır. Bireylerin çocuk ve eşleriyle karşılaştırılmaları sonucunda kimlikleri tespit edilmiş, biri dışlanmış, diğeri sadece kardeşi hayatta olduğu için kesin olarak belirlenememiştir. Çalışma hem tarihsel, hem de insani sebeplerle Bolivya’daki savaşta grubun ölen üyelerinin bulunup belirlenmesi için devam eden çabalar açısından önemlidir (Lleonart et al., 2000). Almanya, Lower Saxony’de Harz dağlarının güneybatısında bulunan Lichtenstein Mağarası’nda 1972’de varlığı tespit edilen gömüler Geç Tunç Çağı’na (1000–700 BC) tarihlendirilmiştir. Hem insan, hem hayvan orijinli iskelet materyali, 6–8º C’lik sabit düşük ısı ve alçıtaşı, kireç ve silisli tortu tabakası ile kaplanmış olması sebebiyle çok iyi korunmuştur. Sağ ve sol femur ve tibialar ile birlikte iki kalça kemiğinden STR, mtDNA ve Y kromozomu analizleri yapılmış, femurlar, tibialar ve bir kalça kemiğinin aynı bireye, ikinci kalça kemiğinin başka bir bireye ait olduğu belirlenmiştir (Schweitzer et al., 2008). Kayıp insanlar için kurulmuş olan uluslar arası komisyon (International Commission on Missing Persons, ICMP), Yugoslavya’daki kitle mezarlarından elde edilen degrade iskelet kalıntılarında on bir binin üzerinde bireyin, kayıp kişilerin aile bireylerinin profillerinden oluşan geniş bir veri tabanı ile kıyaslanması yoluyla idantifiye edildiğini, bu 53 amaçla mini-STR’leri kullandıklarını bildirmiştir (Parsons et al., 2007). Fondevila ve meslektaşları (2008), büyük bir orman yangınından elde edilen parçalanmış bir kemiği tipleyerek kızı olduğunu iddia eden kişinin profiliyle kıyaslanması için STR, SNP, miniSTR analizleri ve mtDNA dizinlemesini gerçekleştirmiştir. Aile Düzeyinde aDNA Çalışmaları (Akrabalık Tayini) Soy ağaçlarının kullanılmasının antropoloji içinde uzun bir tarihi vardır ve aDNA analizleri bu uygulamaları geçmişe doğru genişletmeyi sağlamıştır. Basit bir şekilde, sadece annelik ve babalık değil, annesel (maternal) ve babasal (paternal) yollar mtDNA ve Y kromozomu ile idantifiye edilebilir. Yüksek çeşitlilikte uzun DNA bölgeleri incelenirse, aynı arkeolojik bölgeden aynı mutasyonları paylaşan insanların yakın ilişkili olduğu belirlenir. Çünkü meydana gelen bir mutasyon yeterli nesiller boyunca ayrılmamıştır. Ancak bu yöntem yüksek güvenilirlikle annelik / babalık tayini sağlamaz. Bir birey, sadece annesiyle değil, kardeşleri, anneannesi, anne tarafından akrabaları (teyze, dayı, kuzen) ile de aynı mtDNA mutasyonlarına sahiptir. Benzer şekilde erkekler de sadece babalarıyla değil, erkek kardeşleri, baba tarafındaki akrabaları (dede, amca, erkek kuzen) ile aynı Y kromozomu mutasyonlarını paylaşır. Bireyler arasında annelik ve babalığı gerçekten belirlemek için, çok sayıda yüksek değişken otozomal işaretlerde çeşitlilik incelenmelidir. Çocuklar her ebeveynin her kromozomundan bir kopya aldığı için, otozomal mutasyonlarının yarısının her bir ebeveynle uyuşması gerekir. Aynı işaretleri kullanmak, diğer ailesel bağları da (kardeşlik gibi) ortaya çıkarır (Kaestle and Horsburgh, 2002). Arkeolojik kayıtlar çerçevesinde, annesel ve babasal yolların veya daha belirgin aile bağlarının tespiti; tarih öncesi toplumların sosyal yapı, evlilik ve gömme gelenekleri 54 ile ilgili hipotezleri test etmede büyük bir atılımdır. Akrabalık bağları, gömü modelleri ve morfolojik benzerlikler temel alınarak hipotezlenebilse de, DNA kullanmadan doğrudan belirlenemez (Kaestle and Horsburgh, 2002). Fily ve meslektaşları (1998), Fransa'nın güneyindeki Bask bölgesinden dört Tunç çağı (3700 yıl önce) iskeletinde HVRI ve HVRII dizin farklılığını bildirmişlerdir. Sonuçlar dikkat çekicidir, çünkü anne tarafından bağlantı tespit edilebilmiştir. Sonuçlar sadece HVRII dizin bilgisine dayansa da, dördünün aynı aile üyeleri olması olasıdır. Elde edilen HVRI dizinlerinin ise insan kaynaklı olmadığı, sıçangillere ait olduğu gösterilmiştir. Bu durum, özellikle pozitif kontrol örnekleri olarak insan yaşıyla karşılaştırılabilir nitelikte olan bir insan dışı materyal kullanılacaksa, aDNA araştırmalarında primer tasarımının spesifikliğinin garanti edilmesi gerektiğini gösterir. Doğu Kazakistan’da bir köyün yakınlarında taş bir tümülüs altındaki donmuş mezarda iyi korunmuş durumda bulunan iki iskelete ait kemik, beyin ve kas dokusundan elde edilen DNA’da STR ve mtDNA analiz edilmiş, diğer dokulardaki yüksek PCR inhibisyonundan dolayı, sadece kemikte başarılı sonuçlara ulaştıkları belirtilmiştir. Örneklerden biri kadına, diğeri erkeğe aittir. İlk çalışılan sistemlerle her lokusta bir alelin ortak olması, bireylerin anne-oğul, baba-kız veya kız kardeş-erkek kardeş gibi yakın akrabalığına işaret etmektedir. Lokus sayısı arttırılarak analiz yapıldığında eklenen lokuslarda farklılıklar görülmüştür, böylece anne-oğul veya baba-kız ihtimalleri dışlanmıştır. MtDNA analizleri ile tespit edilen üç mutasyon sebebiyle, bireylerin kardeş veya anne tarafından akraba olma ihtimalleri de indirgenmiştir. Böylece bu kişilerin yakın akraba olmadığı, evli bir çift olabileceği sonucuna varılmıştır. Dolayısıyla hem STR hem 55 de mtDNA gibi analiz yöntemlerini birlikte kullanarak akrabalık konusunda yorum yapmak daha güvenilir sonuçlar sağlayacaktır (Clisson et al., 2002). Kuzey Moğolistan’daki bir nekropolden elde edilmiş elli altı iskelet kalıntısında mikrosatellit çalışılmış, kırk yedisinde (%84) başarı sağlanarak bazı örneklerin birbirleriyle genetik yakınlıklarını ortaya çıkarılmıştır (Keyser-Tracqui et al., 2003). Japonya, Hokkaido’da gömü bölgesindeki bir mezarda iki iskeletin anne tarafından akraba olduğu belirlenmiş, tahmin edilen yaşlara göre bunların kardeş (birinci derece akraba), dayı/teyze, erkek/kız yeğen (ikinci derece akraba) ya da anne tarafından kuzen (üçüncü derece akraba) olabilecekleri bildirilmiştir (Adachi et al., 2003). Hindistan’ın şehir ve köylerindeki tarihi mezarlıklarda STR ile aile ilişkileri belirlenmeye çalışılmış ve veriler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Şehir mezarlarında daha fazla aile bağı tespit edilmiş, köy mezarları ise daha az genetik yakınlık göstermiştir (Sivilich, 2005). Başka bir araştırmada ise aynı gömü bölgesinde bir mezardaki iki yetişkin kadının arasında herhangi bir yakınlık olmadığı belirtilmiştir (Adachi et al., 2006). İspanya’nın bazı arkeolojik bölgelerinden elde edilen otuz dokuz kemik ve diş örneğinde mtDNA analiz edilmiş ve bireyler arasında düşük çeşitlilik gözlemlenmiştir. Bireylerin çoğu ortak Avrupa motifini göstermektedir. Bu durumda aynı mtDNA profilini taşımak, anne tarafından akrabalığı göstermeyebileceği için, ileri analizler yapılmalıdır (Fernandez et al., 2006). Danimarka kralları ve kraliçelerinin birlikte gömülü olduğu katedralde 1074’te ölen son Viking Kralı Sven Estridsen’in ve tarihçiler tarafından kimliği tartışmalı bulunan annesi Estrid’in kemiklerinden mtDNA analizi gerçekleştirilmiştir. İki birey arasında iki noktada dizin farklılığının gözlenmesi, kadının Sven’in annesi 56 olamayacağını, hatta fiziksel incelemeler bu bireyin daha genç olduğunu, Sven’in, adı Estrid olan ve Kraliçe ünvanı alan iki gelininden biri olabileceğini ortaya çıkarmıştır (Dissing et al., 2007). Çin’in kuzeybatısındaki Lajia bölgesinde seli takip eden bir depremle ölmüş tarih öncesi toplumdan elde edilen on altı bireye ait diş örnekleriyle anne tarafından akrabalığı belirlemek için mtDNA analizleri yapılmıştır. Çünkü antropometrik analizler ve iskelet pozisyonları, araştırmacılara ölenlerin yakın akraba olduklarını, hatta bazı bireylerin anneçocuk olduğunu düşündürmüştür. Analiz sonunda on dört birey başarıyla tiplenmiş, birbirleri arasındaki kardeşlik, anne-oğul ilişkileri ortaya çıkarılmıştır (Gao et al., 2007). Kuzey Hırvatistan’daki Erken Orta Çağ gömü bölgesindeki dört bireyden DNA analiz edilmiş ve akrabalık olasılıkları hesaplanmıştır (Boljuncic, 2007). Yunanistan’da Miken Uygarlığı’na ait bir mezarda bulunan ve DNA analizi gerçekleştirilen iskeletlerden iki bireyin birbirinin kardeşi olduğu belirlenmiştir. Bunlardan kadın bireyin, erkeklerin çok olduğu bu mezarda herhangi bir evlilik bağı sebebiyle değil, doğum hakkına sahip bir pozisyonda olması sebebiyle bulunduğu gösterilmiştir (Bouwman et al., 2008). Toplum Düzeyinde aDNA Çalışmaları Bazı arkeologlar, yeni popülasyonların son 10.000 yıl içinde Avrupa’ya göç etmiş olabileceğini düşünmektedir. Kıtaya tarımı bu insanlar getirmiştir. Avcılıktan ziraate geçiş, Güneybatı Asya’da 10.000 yıl önce Erken Neolitik köylüleri buğday ve arpa gibi tohumları ekmeye başladıklarında gerçekleşmiştir. Düzen kurulduktan sonra, tarım Asya, Avrupa ve Kuzey Afrika’ya yayılmıştır. Kültür bitkilerinin kalıntıları için arkeolojik alanların araştırılması ile Avrupa’ya tarımı getiren iki rotanın izi bulunmuştur. Bunlardan biri 57 Akdeniz sahilinden İspanya’ya, İngiltere’ye; diğeri ise Tuna ve Rhine vadileri boyunca Kuzey Avrupa’ya doğrudur. Tarımın yayılması, çiftçilerin bir yerden başka bir yere göç ederken buluşlarını, hayvanlarını ve tohumlarını da yanlarına alarak, o zamanlar Avrupa’daki tarım öncesi toplulukları yerlerinden etmeleriyle gerçekleşmiştir. Arkeogenetikçiler, 1990’larda Avrupa’daki popülasyonlarda 95 nükleer gen bölgesi ile yapılan geniş filogenetik çalışmalarla örtüşen bu modeli desteklemektedirler. Bu da, güneybatı Asya’dan kuzeydoğu Avrupa’ya veya tam tersi yönünde bir göçün olduğunu gösterir. Çünkü ilk göçler, arkeolojik kayıtlara göre tarımın yayılmasıyla aynı zamana rastlamaktadır (Brown, 2006). Avrupa popülasyonlarıyla ikinci çalışma mtDNA ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, Avrupalı toplumların son 20.000 yıldır sabit kaldığını göstermiştir. Bu durumda tarım Avrupa’ya ne zaman yayılmıştır? Modern Avrupa toplumlarında daha ileri mitokondriyal DNA varyasyon çalışmaları, tarımın yayılmasında başka bir modelin olduğunu işaret etmektedir. Modern Avrupalılar arasında mitokondriyal genomun 11 büyük sınıfa (haplogrup) ayrılabileceği belirlenmiştir. En eski haplogrup, Avrupa’da 50.000 yıl önce görülmüştür. Bu, arkeolojik kayıtlara göre, ilk modern insanın kıtaya gelişi ile çakışmaktadır. Tarımın başlangıcı ile ilişkili olabilecek en yeni haplogruplar, J ve T1, modern Avrupa popülasyonlarının %8.3’ü ile ifade edilir. Günümüzde tarımın Avrupa’ya önceden oraya yaşayan toplulukları yok etmeden onlarla birlikte yaşayıp üreyen küçük öncü gruplar tarafından getirildiği düşünülmektedir (Brown, 2006). Tarih öncesi popülasyonların hareketi, devamlılığı veya yer değiştirme konuları, özellikle test etmek için çok sayıda eski birey varsa, aDNA kullanılarak incelenebilir. Pompei arkeolojik alanının bu konuda bilimsel önemi çok fazladır, çünkü bilinen bir 58 tarihte aynı felaketle ölen bir insan popülasyonunun rastgele örneklemesini sunar (Cipollaro et al., 1998). Popülasyon Genetiği: Güney Almanya’da Orta Çağ’a ait bir mezarlıktaki otuz sekiz iskelet kalıntısının genetik analizlerle popülasyonlar arası ilişkileri araştırılmıştır (Scholz et al., 2001). Kuzeydoğu Sibirya’da yaşayan etnik bir grup olan Yakut toplumundan elde edilen iskelet örneklerinde STR ve mtDNA analizleriyle genetik ilişkileri incelenmiş, eski Yakut popülasyonu ile modern Sakalar arasındaki ilişkiler ortaya çıkarılmıştır (Ricaut et al., 2004, 2006). Gamba ve meslektaşları (2008), Doğu İspanya’da on yedi arkeolojik bölgeden elde edilmiş otuz altı farklı bireye ait yirmi bir kemik, on beş diş örneğinde mtDNA analizi gerçekleştirmiş ve İber yarımadasının doğusunda prehistorik Afrika genetik alt yapısının varlığını göstermiştir. Gao ve meslektaşları’nın (2007) Lajia bölgesinde yaptıkları çalışmada Lajia popülasyonunun genetik yapısı hakkında bilgi edinilmiştir. Komünite, matrilineal klan değildir, baba tarafından ilişkili çok sayıda ailenin birleşmesiyle oluşmuş geniş bir toplumdur. Modern Çin popülasyonu ile karşılaştırma yapıldığında, Kuzeybatı Çin’de yaşamış bu halkın etnik tarihi ile uyumlu olarak, modern toplumun maternal gen havuzuna katkıda bulunmuş olabileceği söylenir. Bu arkeolojik bölge, seli takip eden bir deprem gibi büyük bir felaketle yok olmuş tarih öncesi topluma ait veriler sunduğundan, aynı zamanda arkeologlar tarafından “Doğu Pompei” olarak da adlandırılmaktadır (Zhang et al., 2004). Bazı örnekler nadir de olsa iyi korunduğu için DNA’daki hasar oranları göz ardı edilebilir. Ancak özellikle popülasyon genetiği çalışmalarında DNA hasarı önemli bir faktördür ve mutlaka göz önüne alınmalı veya elimine edilmeye çalışılmalıdır (Axelsson et al., 2008). Genetik varyasyon grupların atalarından kalıtıldığı için, farklı frekanslı eski ve 59 modern grupların yakın ilişkili olmaması beklenirken, modern grupların atalarıyla benzer frekansları olması beklenir. Ayrıca belirli genetik işaretlerin sınırlı dağılımları vardır ve ilişkilerin belirteçleri olarak kullanılır. Bu yolla, birçok ölçüde ata-torun bağları ile ilgili sorular cevaplanabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Büyük gruplar (≥ 25 birey) örneklemede hatalı sonuçları önler. Ayrıca arkeolojik alan içindeki bireylerin ilişkilerini araştırmaya yarar. Bir toplumda nadir görülen bir genetik polimorfizmi veya aleli paylaşan iki birey, sık görülen bir polimorfizmi paylaşanlardan daha yakın ilişkilidir (Stone, 2008). aDNA verileri, belirli bir bölgedeki popülasyonun devamlılığı hipotezlerini test etmek için de kullanılabilir. Daha geniş açıdan bakılırsa, büyük popülasyon hareketleri ile ilgili hipotezlerde de aDNA’dan yararlanır. Örneğin linguistik ve arkeolojik deliller, şu anda aDNA çalışmalarıyla keşfedilen, Amerika’daki birçok tarih öncesi toplum hareketini desteklemektedir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Göç Yolları: Handt ve araştırıcıları (1994a), Tyrolean Alpleri’nde bulunan 5000 yıllık donmuş bir mumyayı incelenmiştir. Buzul dönemindeki bu geç Neolitik birey, Tyrolean Buz Adamı veya Ötzi olarak adlandırılmıştır. Soğuğa rağmen DNA degrade olmuş ve nükleer amplifikasyon, hatta moleküler düzeyde cinsiyet tayini yapılamamıştır. MtDNA analizleri ise sonuç vermiş ve klonlardan HVRI dizinlenmiştir. Gözlenen dizinlerin heterojenliği, modern kontaminantlarının varlığını göstermiştir, ancak çok sayıda klon dizisinin doğrulanmasıyla örneğin eski mtDNA'sı da belirlenebilmiştir. Bu bireyde gözlenen dizin varyantları, Kuzey Alpler’de yaşayan modern toplumlarda sık görülenlerle tutarlıdır. Rollo ve meslektaşları (1994b) ise Buz Adam’ın kıyafetlerini incelemiştir. Buna göre Buz Adam’ın bir paltosu ve bitki kalıntıları taşıyan ayakkabıları vardır. Hem bu çimenlerden, hem de mikroorganizmalardan elde edilen DNA analizleri, çimenlerin 60 ekildiği zaman hakkında bilgi vermektedir. Hollanda'daki kazılarda elde edilen yedi iskelet örneğinde (1100–1850 yıl önce) gözlenen heterojen HVRI dizini, Kuzey Avrupa'nın birçok büyük mtDNA haplogruplarını göstermektedir (Colson et al., 1997). Stone ve Stoneking (1993, 1998, 1999) Amerika, Batı İllionis'in Oneota arkeolojik bölgesindeki iskeletlerden DNA elde etmişler, örneklerin ait olduğu mtDNA haplogruplarını (A, B, C ve D) tespit etmişlerdir. Amerika’da Utah'ın Kuzey Fremont (Parr et al., 1996, O’Rourke et al., 1996) bölgesindeki kırk üç örnek ve güneybatıdaki Anasazi (Carlyle et al., 2000) bölgesinde kırk örnekte mtDNA varyasyonu incelenmiştir. Coğrafik olarak yakın bu iki bölgedeki örneklerin haplogrup profilleri benzerdir. Ayrıca bunlar modern güneybatı popülasyonları ile benzer mtDNA haplogrup profillerini paylaşır (O’Rourke et al., 2000). Japonya'da (Horai et al., 1989, 1991) Jomon (3000–6000 yıl önce) ve ilk modern Ainu örneklerinin (200–300 yıl önce) HVRI verileri, modern Japonlarla dizin benzerliği olduğunu ve Japonların anavatanı kabul edilen Güneydoğu Asya'daki modern nesillerle aralarında da bazı benzerliklerin bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu çıkarım ön çalışma olarak kabul edilmelidir, çünkü çalışılan eski örnek sayısı sadece altıdır ve yaş aralığı çok geniştir (O’Rourke et al., 2000). Son zamanlara kadar Çin'deki genetik çeşitliliğin tarih öncesi modellerinin sistematik araştırması yapılmamıştır. Oota ve meslektaşları (1995, 1999), Çin'deki Shandong bölgesinde Yixi alanından çıkartılan elli sekiz diş ve kemik örneğinde 2000 yıllık mtDNA HVRI ve HVRII için dizin bilgisi elde etmişlerdir. Modern Asya dizin çeşitleriyle kıyaslandığında, analizler eski Yixi örnekleriyle modern Tayvan arasında büyük benzerlikler olduğunu gösterir. Horai ve meslektaşları (1989, 1991) 61 tarafından incelenen Jomon örnekleri genetik olarak eski Yixi örneklerine, Güneydoğu Asya ve Okyanusya'daki mtDNA neslinden daha çok benzemektedir (Oota et al., 1999). Tarihsel Çevrenin Rekonstrüksiyonu için aDNA Arkeologlar, eski toplumların yaşadığı çevrenin yeniden canlandırılmasına sıklıkla ilgi duymaktadırlar. Tarih öncesi insanların var olduğu ekosistemin bilinmesi, besin elde etme davranışı gibi çevrenin gerektirdiği kültürel adaptasyonlar ve mevsimsel göçler hakkında bilgi sağlar. Ayrıca evcilleşme olayını anlamaya yarar. Çevresel rekonstrüksiyon, tipik olarak bir alandaki floral ve faunal kalıntıları belirlemek ve türlerin tercihli habitatlarından yerel çevreyi göstermekle gerçekleştirilir. Yakın ilişkili türler, geniş çeşitlilikte habitatları tercih ederler ve tür tayininde zorluklar ortaya çıkar. Bu sebeple türlerin kesin idantifikasyonu, yerel çevrenin yeniden canlandırılmasında kritik olabilir. Bu çerçevede aDNA teknikleri arkeolojik alanlarda bulunan türlerin kesin idantifikasyonunda kullanılabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Çevrede var olan bitkilerin tespit edilmesi, buğday veya mısır kültürlerinin yetiştirilmesi, sığırların evcilleştirilmesi, kullanılan boyaların veya parşömenlerin kökeninin belirlenmesi aDNA analizleriyle mümkündür. Koprolitlerde sindirilmiş hayvansal veya bitkisel besinlerin idantifikasyonu, canlıların beslenme şekilleri hakkında fikir verir (Stone, 2008). Kloroplastlarında, mitokondrilerinde ve poliploid nükleer genomlarında büyük miktarlarda DNA taşıyan bitkilerin fosil kayıtları incelendiğinde; örneğin 5000 yıllık buğday (Brown et al., 1994), mısır (Goloubinoff et al., 1993), arpa ve turp tohumu (O’Donoghue et al., 1996) örneklerinden elde edilen bilgilerle paleoekolojik çalışmaların devamı gelmektedir. 62 İnsan dışı çeşitli türlerin coğrafik dağılımı ile ilgili bilgi edinmek için yapılan ekolojik araştırmalar genetik analizlerle ilerlemektedir. Arndt ve meslektaşları (2003), Burdur Ağlasun ilçesinin 7 km kuzeyindeki antik kent olan Sagalassos'taki kazılarda günümüzde bölgede var olmayan bir balık türünün eski kalıntılarını tespit etmiş ve başarıyla DNA izole edip çoğaltarak dizinlemişlerdir. Çatalhöyük’te bulunan eski buğday örneklerinin varlığı, Türkiye’de Bilgiç ve Akkaya tarafından ilk kez moleküler düzeyde gösterilmiş ve modern örneklerle DNA düzeyinde genetik ilişki analizi ile değerlendirilmiştir (Bilgiç and Akkaya, 2000; Akkaya and Bilgiç, 2002; Bilgiç, 2002; Somel 2003). Tıbbi amaçlı çalışmalarda aDNA Tarih öncesi hastalıklarla ilgili sorular aDNA teknikleri ile yanıtlanabilir. Eski örneklerde hastalıklı bireylerde patojenlerin genomları da çok sayıda bulunur ve paleopatolojik çalışmalar açısından önem taşır (Mitchell et al., 2005). Hastalıkların varlığını göstermek için kullanılan geleneksel paleopatolojik yöntemler, tanısal iskelet lezyonlarına dayanır. Çeşitli bulaşıcı hastalıklar, insan kalıntılarında benzer iskelet patolojileri bırakabilir, bazı rahatsızlıklar ise iskelette ya iz bırakmaz ya da tanısal iz bırakmaz. Enfeksiyöz ajanların genomunu incelemek, bu zorluğu ortadan kaldırır (O’Rourke et al., 2000; Kaestle and Horsburgh, 2002). Bu amaçla kemik, diş, yumuşak doku gibi eski biyolojik örneklerde veya mumyalarda Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Clostiridium'un birkaç türü ve Trypanosoma cruzi gibi bakterilerin DNA’sı elde edilerek analiz edilmiş ve çeşitli hastalıkların varlığı tespit edilmiştir (Mitchell et al., 2005; Zink et al., 2007). Tüberküloz sebebi patojen olan Mycobacterium tuberculosis; 63 1000 yıllık Peru mumyasından başarıyla çoğaltılabilmiştir (Salo et al., 1994). Taunberger ve meslektaşları (1997) 1918’de dünyada yirmi milyon kişiyi öldüren grip salgını boyunca toplanan patolojik örnekleri incelemiş, virüs RNA’sını izole etmiş, çoğaltmış, dokuz gen parçasını dizinlemiştir. 1918 gribinin çok öldürücü olduğu belirlenmiş, bir kuş gribi olduğuna dair önceki spekülasyonların tersine, dizinlenen genler bunun domuz gribi ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. 14.yüzyıl Ortaçağ Kara Ölüm salgını boyunca 17–28 milyon kişinin ölüm sebebi olarak antraks, tifüs, tüberküloz gibi çeşitli patojenler gösterilmişti. Ancak 14.yüzyıl Fransız mezarındaki çoklu gömüde bulunan yetişkin kadın, yetişkin erkek ve çocuk olmak üzere üç bireye ait dişler analiz edildi. Çocuğa ait dişlerden birinde ve bir yetişkin dişinde, veba patojeni olan Yersinia pestis’in Pla genini çoğaltmaya yarayacak DNA elde edildi. Adı geçen diğer patojenlere özgü primerler ise örneklerden aDNA çoğaltamadı (Raoult et al., 2000). Bu teknikler İskoçya, Orkney’deki Norse mezarlığından insan kalıntılarında leprozun idantifikasyonunu doğrulamada kullanılmıştır. İki bireyin kalıntıları incelenmiş, biri leprozla uyumlu iskelet patolojisi göstermiş, diğerinde hiçbir patolojik durum görülmemiştir. Amplifikasyon, leprozun patolojik belirteci olarak iskelette leproza sebep olan bakteri Mycobacterium laprae’nin varlığını doğrulamıştır. Ancak patolojik bulgu olmayan iskelette ise çoğaltma sonuç vermemiştir. İki iskeletten hiçbirinde tüberküloz patojeni M. tuberculosis’e özgü primerler amplifiye olmamıştır (Taylor et al., 2000). İnsan bağışıklık sistemi, bireyleri çevrede bulunan enfeksiyöz ajanlara maruz kalmaktan korumak için sitokin polimorfizmleri göstererek evrimleşmiştir. Geçmişe ait diş örneklerinde, otoimmun hastalıklara yatkınlıkla ilgisi kurulan sitokin genlerindeki SNP’lerin analizi, toplum sağlığını anlamak için önemlidir (Larcombe et al., 2005). 64 Örnekler az olsa da, bu çalışmalar eski tarihte çok sayıda bildirilen salgınlardan sorumlu ajanları belirlemek, iskeletlerdeki paleopatolojik lezyonların belirlenen tanılarını doğrulamak ve eski ya da modern mikrobiyal dizileri karşılaştırma yoluyla moleküler düzeyde enfeksiyöz hastalıkların evrimleşmesi hakkında bilgi sağlamak için önemlidir (O’Rourke et al., 2000). Ancak sıklıkla kontaminasyon var olabilir. Örneğin topraktaki bakteriler M. tuberculosis’e benzer DNA dizinleri taşıyabilir. Bu sebeple, teknik konuları içeren ve güvenilirlik kriterini kuran bir dizi, iyi kontrol edilmiş ciddi çalışma gereklidir (Pääbo et al., 2004). İnsan Evrimi Çalışmalarında aDNA Neandertallerle ilgili en fazla bilinen ve önemli olan çalışma, Almanya, Düsseldorf yakınlarındaki Feldhofer Mağarası'nda bulunan iskelet örneğinden moleküler analizdir (Krings et al., 1997, 1999). Amplifiye edilen HVRI klonlanmış ve dizinlenmiştir. Buna göre, bu Neandertal örneği modern insandan, hatta modern Avrupa, Afrika ve Asya dizilerinden de farklıdır (Krings et al., 1999). Ovchinnikov ve meslektaşları (2000), Kuzey Kafkasya'da Mezmaiskaya bölgesinden çıkarılmış 29.000 yıl öncesine tarihlendirdikleri bir Neandertal bebeğinden DNA analiz etmiştir. HVRI'deki 345 baz dizisi; modern insanla arasındaki farkın, Feldhofer Neandertali ile arasında olan farktan iki katı daha fazla olduğunu göstermiştir. Bu iki Neandertal örneği arasında gözlenen farkın büyüklüğü, modern insan popülasyonları arasında görülen farka eşittir. Ancak iki Neandertal HVRI dizisi, Cambridge dizisinden farklı on dokuz nükleotid substitüsyonunu da paylaşır. Dolayısıyla filogenetik olarak, iki Neandertal dizisi modern insan HVRI dizisinden uzak olan ayrı bir 65 kol oluşturmaktadır. Hatta her iki Neandertal dizisi de tüm modern insan gruplarından farklıdır. Bu sonuçlar, Krings ve meslektaşlarının (1997) Neandertal'lerin doğrudan modern insanların atası olmasının mümkün olmadığını, dolayısıyla insanın kökeninin Afrika'dan çıkış modelini desteklediğini belirten ilk değerlendirmelerini doğrulamıştır (O’Rourke et al., 2000). Pääbo ve meslektaşları (2004), bazı Neandertallerin insanlara benzer mtDNA dizinleri taşıdığının belirlenmesi durumunda, bunun modern DNA kontaminasyonu olarak düşünüleceğini de belirtmiştir. GEÇMİŞE AİT DNA ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ İzolasyondan önce, örneklerin potansiyel yüzey kontaminasyonu giderilmelidir, çünkü kontamine DNA örneğin yüzeyinde iç taraftakine göre daha fazladır (Bouwman et al., 2006). Yüzey tabakası bistüri ile kazınabilir, örnek UV radyasyonuna, aside veya yüksek derişimde etanole maruz bırakılabilir, sodyumhipoklorit (NaOCl - çamaşır suyu) içinde tutulabilir ya da bu yöntemlerin bir kombinasyonu şeklinde uygulanabilir (Watt, 2003). Örneğin indirgenmesi; izolasyon enzimleri ve malzemelerinin yüzey alanıyla yeterince etki etmesini sağlamak için mekanik yollarla (bir öğütücü, değirmen veya havan yardımıyla) gerçekleştirilir. İskelet örneklerini toz haline getirmek, örneklerin el ile işlenmesi demektir ve kontaminasyona açık olduğundan özenle uygulanmalıdır (O’Rourke et al., 2000). Örnek, kimyasal olarak da indirgenir, sıvı azotta dondurma bu olaya yardımcı olabilir, ancak azota daldırmadan önce, sıvı azotun DNA kontaminasyon kaynağı olabilme ihtimalinden dolayı örneğin bir naylon poşete konulmuş olması gerekir (Fountain et al., 1997). 66 DNA İzolasyonu aDNA izolasyon yöntemleri, çoğunlukla adli protokollerden alınmıştır (Parsons and Weedn, 1996) ve iki yaklaşımdan biri kullanılır: proteinaz K/fenol-kloroform ekstraksiyonu veya silika temelli izolasyon. İzolasyon çözeltileri, yağları emülsiye eden ve/veya proteinlerin parçalanmasına yardımcı olan birçok farklı deterjan veya yüzey aktif maddeleri (surfaktant) içerir (Sambrook and Russel, 2001). Az bir miktar (0.5–1.0 g) örneğe 1.0–2.0 ml izolasyon çözeltisi eklenmesi, uygun sıcaklıklarda (50–60° C) birkaç saat çalkalamayla proteinlerin parçalanması için yeterlidir (O’Rourke et al., 2000). Kantitasyon çalışmaları 0.5–1 g kemik tozunun 0–5 ng DNA verdiğini göstermiştir (von Wurmb-Schwark et al., 2004). Fenol-kloroform yönteminde örnek kaybına veya PCR inhibisyonuna yol açacağı için, organik çözücülerin izolasyon ve amplifikasyon basamaklarına taşınması önlenmelidir. Son sıvı faz, 30.000 moleküler ağırlıktan küçük moleküllerin yok edilmesi için yoğunlaştırılmalıdır. Ancak bu aynı zamanda DNA ile izole edilen PCR inhibitörlerini de konsantre eder. Konsantre edilmiş örnek, etanol veya izopropanol ile çöktürülerek peletin TE çözeltisinde yeniden çözülmesini gerektirir (O’Rourke et al., 2000). Hanni ve araştırıcıları (1995) etanol yerine izopropanol önermektedir, çünkü izopropanolün DNA için seçiciliği daha yüksektir (Sambrook and Russel, 2001). Ayrıca Maillard ürünleri olduğundan şüphe edilen kahverengi PCR inhibitörlerini uzaklaştırmada izopropanolün daha etkili olduğu bildirilmiştir (Poinar et al., 1998). Altunçul (2001), kemikten DNA elde etme yöntemlerini karşılaştırmalı incelemiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonunun başarısını vurgulamıştır. Yöntem, biyolojide standarttır ve yüksek DNA eldesiyle sonuçlanır. Ancak aDNA çalışmalarında bu metodu kullanmanın bir sorunu, inhibitörlerin de ekstrakte edilmesidir ki; bu da çoğaltma ve 67 analizi zorlaştırır (O’Rourke et al., 2000; Stone, 2008). Silika yöntemi, DNA'yı yüksek konsantrasyonda guanidinyum tiyosiyanat (GuSCN) içinde izole eder (Höss and Pääbo, 1993). GuSCN, proteinaz K gibi, proteinleri parçalama yeteneğine sahiptir ve DNA'nın silika partiküllerine bağlanmasını sağlayan kaotropik bir ajan görevi yapar (Boom et al., 1990). Bu protokolün avantajı, yüksek toksik özellikteki fenol ve kloroformu kullanmadığı için kabin gerekliliğini kaldırmasıdır. Ayrıca PCR inhibitörlerini izole etme durumu da daha az rastlanır, ancak silikanın kendisi güçlü bir PCR inhibitörüdür ve yıkama esnasında tüm silikanın uzaklaştırılması gerekir. Bunun yanında, DNA'ya yüksek afinitesinden dolayı GuSCN, modern nükleik asit ile kolaylıkla kontamine olabilir. Bunu önlemek için tampon çözeltiler steril tüplerde hazırlanmalı, birkaç saat silika ile inkübe edilmeli, santrifüjden sonra üst faz alınıp kullanılmalıdır (Höss and Pääbo, 1993). Silika yönteminin tekrarlanması, PCR inhibitörlerinden korunmak için de uygulanabilir (Kemp et al., 2006). aDNA izolasyonunda avantajlarından dolayı silika temelli DNA izolasyon kitleri daha fazla kullanılmaktadır (Poinar et al., 1993; Tuross, 1994; Zierdt et al., 1996; Krings et al., 1997; Yang et al., 1998; Bouwman et al., 2006). Silika jel spin kolonları, fenol-kloroform ekstraksiyonundan sonra geriye kalan pigmentasyonu uzaklaştırarak bir konsantre edici gibi davranır, ancak bir kerede içine konulan çözelti miktarı sınırlıdır. Bu durum DNA çözeltisinin el ile muamele edilmesinin artmasından dolayı kontaminasyon veya örnek kaybı açısından sorun yaratabilir. Proteinaz K temelli izolasyon yöntemleriyle daha fazla DNA eldesi sağlanmasına rağmen, silika guanidinyum protokolleri daha yüksek oranlarda amplifikasyon başarısı ve daha az PCR inhibitörleri ile sonuçlanır (Cattaneo et al., 1997). Standart proteinaz K prosedüründe küçük değişikliklerle zor iskelet kalıntılarından elde edilen DNA miktarı arttırılabilir. 68 EDTA proteinaz aktivitesini inhibe eder ve kalsiyum bunu arttırır. Bu sebeple proteinaz K eklenmesinden önce dekalsifikasyon aşamasından kalan tüm EDTA uzaklaştırılmalıdır (O’Rourke et al., 1996). Bunun yanında EDTA’nın ve fenolün enzim inhibitörü olduğu da göz önünde bulundurulmalıdır (Sambrook and Russel, 2001). Jackes ve araştırıcıları (2001) ise zayıf asit çözeltileri ile bile dekalsifikasyonun Mezolitik kemik mineralinde büyük zarara sebep olduğunu, histolojik yapıyı bozduğunu belirtmiştir. Kemikten DNA izolasyonunda bazı araştırmacılar (Tuross, 1994; Krings et al., 1997; Yang et al., 1998) hidroksiapatiti parçalayarak, bazıları (Götherström and Liden, 1996) apatitle yarışacak iyonlar ekleyerek DNA’yı açığa çıkarmayı tercih etmektedir. İzolasyon sırasında apatitle ilgilenmeyen araştırmacılar da (Höss and Pääbo, 1993) bulunmaktadır. Kemikten tamamen demineralizasyonla DNA eldesi sağlayan etkili bir protokol önerilmiştir. Kemik tozunun tamamıyla fiziksel olarak çözülmesine dayanır. Böylece degrade iskelet örneklerinden DNA eldesi ve tipleme başarısı artar (Loreille et al., 2007). DNA’nın Çoğaltılması Hedef DNA dizisinin amplifikasyonu, günümüzde rutin bir laboratuvar tekniğidir (Ehrlich, 1989; Innis et al., 1990). Modern örneklerle kullanım için geliştirilen birçok teknik eski örneklerle çalışmasa da, yöntemler nispeten standardize edilmektedir. aDNA'yı çoğaltmak için çeşitli protokoller önerilmiştir (Pääbo, 1989, 1990; Hagelberg et al., 1991; Herrmann and Hummel, 1994; Römpler et al., 2006; Meissner et al., 2007). Pääbo (1989), 1 µg eski DNA izolatından gerçekleştirilen 84 ve 121 baz çiftlik amplifikasyonların, 1 ng modern DNA’nın verdiği miktarlarda ürün oluşturduğunu 69 gözlemiştir. O’Rourke ve meslektaşları (1996) ise eski örneklerin modern dokulardan beklenenin %1-5’i kadar DNA verdiğini belirtmektedir. aDNA'nın PCR reaksiyonlarındaki aşırı primer konsantrasyonu, primerlerin hedef dışı moleküllere yanlış bağlanmasını kolaylaştırarak, basamaklaşma (laddering) etkisi ve elektroforezde aşırı primer-dimer oluşumu ile sonuçlanır (Ariffin et al., 2007; Dissing et al., 2007). aDNA olgularında sıklıkla olduğu gibi, hedef örneğin miktarı düşük olduğu zaman, özellikle yüksek primer konsantrasyonlarında basamaklaşma etkisi fark edilir hale gelir. Primer konsantrasyonlarını önerilen standart protokollerin altına düşürmek, primerdimer oluşumunu azaltır ve hedef dışı moleküllerin yanlışlıkla çoğalmasından dolayı jel bantlarının basamak halini almasını etkili biçimde elimine eder. Bu sonuç, sıkı PCR koşulları sağlayarak kolaylaştırılır (Hummel et al., 1992). Geçmişe ait DNA çalışmalarında kullanılacak primerler pirimidin bakımından zengin olmalıdır. Bu tip primerler, pürince zengin eski DNA dizinlerine tamamlayıcı olacaktır (O’Rourke et al., 1996). PCR sırasında kontaminasyon tespiti amacıyla kullanılan negatif kontrollerde, bulaşma olmadığı durumda sadece primer-dimer oluşumu gözlenir. Eğer aynı PCR ürünü ile yeniden PCR yapılacak olursa, primer-dimerler meydana gelmez (Ariffin et al., 2007). Degrade DNA’nın amplifikasyonunda, farklı polimerazlar incelenmiş, 0.5–1.2 ng örnek olduğunda etkinlik açısından anlamlı bir farklılık bulunmamıştır (Purzycka et al., 2006). Bir polimeraz enzimi teknik anlamda düzenlenerek degrade DNA analizlerinde kullanılabilir hale getirilebilir (Shapiro, 2008). Enzim ve primerler çalışma alanındaki kontaminantlardan etkilenebilir, ancak bunların UV radyasyonu primerleri inaktive edecek ve PCR'ı yok edecektir (O’Rourke et al., 2000). aDNA PCR reaksiyonundan elde edilen ürünü arttırmanın en kolay ve ucuz yolu 70 'hot-start' prosedürdür. Hot-start PCR, primerlerin ve/veya enzimlerin örneğin ilk döngüde denatürasyon sıcaklığına ulaşmasından önce DNA örneğine bağlanmasını engeller. Bu prosedür, yanlış bağlanma ve primer oligomerlerinin oluşum oranlarını azaltarak amplifikasyon ürününü, dizinin doğruluğunu ve kesinliğini arttırır (Chou et al., 1992). Hedef dışı ürünler, sadece PCR malzemelerinin etkinliği azaltmaz, aynı zamanda hedef dizinin çoğalmasını da doğrudan engeller. Hot-start PCR; reaksiyon karışımının önceden ısıtılmış ısı döngü cihazına konulana kadar buz üstünde tutulması veya denatürasyon sıcaklığına gelene kadar inaktif kalan, yeni geliştirilmiş polimerazlar kullanılması ile sağlanmaktadır. STR çalışmalarında degradasyondan dolayı alel düşmesi görülebilir. Bu alel kaybı boyut bağlantılıdır ve herhangi bir lokusa özgü değildir (Gerstenberger et al., 1999; Meyer et al., 2000; Ricaut et al., 2004; Buckleton and Triggs, 2006; Opel et al., 2006). Degrade örnekler için standart amplifikasyon ve elektroforez koşulları, büyük STR’lerde alel düşmesinden ötürü genotiplemede %100 başarı sağlamamış, kapiler elektroforezdeki enjeksiyon süresi beş saniyeden on saniyeye çıkarılarak alellerin görüntülenmesinde %80– 88 başarı oranı elde edilmiştir. Ancak bunun kekeme (‘stutter’) veya ölçek dışı (‘offladder’) bantlar gibi artefaktlar oluşturduğu da belirtilmiştir (Swango et al., 2006). PCR sırasında enzim kayması sebebiyle kekeme bantların oluştuğunu Gerstenberger ve meslektaşları (1999) da ifade etmiştir. Analiz edilen örnek miktarının arttırılması ise tiplemede bir farklılık yaratmamıştır (Swango et al., 2006). Jel elektroforezinde uygun boyutta bantın olmamasından dolayı aDNA örneği için amplifikasyonun başarısız olduğunu varsaymak, genellikle sık rastlanır bir durumdur. Ancak konsantrasyonu düşük veya önemli enzim inhibitörleri içeren örnekler; yetersiz 71 çoğalarak jelde görüntülenemeyecek kadar az ürün oluşturabilir. Bu tip durumlarda, amplifikasyonun arttırılması 'touchdown PCR' (Don et al., 1991) ya da 'booster PCR’ (Ruano et al., 1989) ile sağlanabilir. Touchdown PCR, yüksek bağlanma sıcaklıkları ile başlar ve standart sıcaklığa ulaşılana kadar ilk döngüler boyunca azaltılır. Kalan döngülerde amplifikasyon için kullanılır. İlk döngülerde düşük hatta belki de etkisiz primer bağlanması olabilir, ancak her döngüde yüksek kalitede hedef dizi oranının artmasıyla yanlış bağlanma da en az indirgenir. Yöntem, aslında uzun modern moleküllerin amplifikasyonu için geliştirilmiştir, ancak küçük boyutlarına rağmen bazı aDNA örneklerinde de etkili olabilmektedir. Booster PCR ise, sadece birkaç döngüde hedef diziyi arttırılmış sıkı koşullarda ve azaltılmış primer konsantrasyonlarında çoğaltır. Bu şekilde oluşturulan ürünler, her zamanki PCR reaksiyonunda örnek olarak kullanılır. Booster PCR ile ilgili temel endişe, ilk döngünün ürünlerinin ikinci PCR'da örnek olarak kullanılması sebebiyle, örneklerin modern kontaminantlarla karşılaşma olasılığının artmasıdır. Örneklere, enzim inhibitörlerine bağlanarak enzim konsantrasyonunu arttırması için Bovine Serum Albumin (BSA) eklenmesi, PCR etkinliğini ve elde edilen ürünü arttırabilir. aDNA analizlerinin özelliği olan uzun PCR döngülerinde (40 döngü) ileri uygunlukta polimeraz aktivitesinin kullanılması da gereklidir. Pääbo (1989), yüksek enzim konsantrasyonunun kontrol izolatlarında bazen nonspesifik amplifikasyon ürünlerine sebep olduğunu belirtmiştir. PCR döngü sayısının yükseltilmesiyle DNA izolatında var olan az sayıda molekülün çoğalma şansı arttırılır (Dixon et al., 2006). Ancak PCR döngülerinin arttırılması, kontamine olan az miktardaki DNA’nın da artmasına sebep olabilir (Ariffin et al., 2007). Başlangıçtaki örnek moleküllerin belirlenmesi hangi PCR’ın yapılacağını 72 belirlemede yararlıdır ve kompetitif PCR (Handt et al., 1996; Nielsen and Thuelsen, 1998), son zamanlarda ise Real-Time Kantitatif PCR (Swango et al., 2006) ile başarılabilir. Ancak özgün aDNA olduğunu kesin olarak göstermeyeceği için başlangıçtaki örnek miktarını ölçmeyen araştırmacılar da vardır (Chilvers et al., 2008). DNA içeriği ve degradasyon durumunu tahmin etmek için kan, adli kemik ve arkeolojik kemiklerde mtDNA Real-Time PCR ile analiz edilmiş; tüm örneklerde başarı sağlanmıştır. Bunun yanında amplikon uzunluğu ile amplifikasyon verimi arasında ters bir ilişki gözlenmiştir (Alonso et al., 2004). Eğer PCR’a bin veya daha fazla molekülle başlanıyorsa, nükleotidlerin yanlış bağlanmasını teyit etmek için deneyin tekrarlanması gereksizdir. Daha az molekül söz konusu ise birkaç tekrara ihtiyaç olabilir. Ayrıca PCR ürününün klonlanması da sorunları belirlemek adına önemlidir (Handt et al., 1996). Analiz edilecek örneklerde kontamine DNA olduğu durumlarda, tercihli amplifikasyon (preferential amplification) görülebilir ve bu hasarsız DNA, örneğe ait parçalanmış DNA’ya göre daha iyi çoğalabilir (Pääbo, 1989). DNA dizinleri hasar gördüğünde, PCR’da primerlerle tamamlayıcı ipliği oluşturan Taq polimeraz örneğin hasarlı bölgesine Adenozin ekleyebilir, diğer örneğe atlayabilir ve uzama devam eder (O’Rourke et al., 1996). Pääbo (1990) bu etkiye atlama PCR (‘jumping PCR’) adını vermiştir. Booster PCR, atlamayı önlemektedir (Pääbo, 1990). Aynı örneğin tekrarlanan analizlerinden farklı genotiplerin oluşması için öne sürülen hipotezlerden biri, amplifikasyon sırasında primerlerin mikrosatellit lokuslarına ait dizinlere bağlanması ile kısmen parçalanmış tekrar dizinlerinin çapraz bağlanmasının beraber gerçekleşebilmesidir. Tekrar dizinlerinin içinden kopan DNA parçaları, mikrosatellit lokuslarının çoğaltılması sırasında kimerik alellerin oluşumunun en sık 73 sebebidir. Bu yanlış aleller PCR’ın ilk döngülerinde meydana gelir ve Taq polimeraz için uygun bölgeler oluşturacak şekilde birbirine bağlanır. Bu önlemek amacıyla DNA parçalarının 3’ uçlarına çoklu A kuyruğu ekleyecek bir yöntem geliştirilmiştir. Buna göre, 1µg aDNA’nın yaklaşık 6–12 pmol 3’ ucu içerdiği tahmin edilerek, uygun miktarlarda terminal transferaz, dATP, tampon ve BSA ile reaksiyona girmesi sağlanmaktadır. Böylece örnekteki 3’ uçlara çoklu Adenin kuyruğu eklenerek, 3’ uçlar kapatılır ve di- veya trinükleotid içeren tekrar dizinlerinin daha güvenilir tiplenmesi mümkün olur. Bu yöntem atlama PCR’ı da önlemektedir (Culjkovic et al., 2003). Aynı anda hem mtDNA hem de STR analizleri yapmayı sağlayan ikili PCR tekniğinin inhibitör deneylerinde ve PCR etkinliğini kontrol etmede yararlı olabileceği bildirilmiştir. Formaline gömülü, adli ve biyoarkeolojik örneklerde karşılaştırmalı olarak ikili PCR çalışmaları ile gerçekleştirilmiş, özellikle eski DNA’da başarılı sonuçlar alındığı belirtilmiştir (von Wurmb-Schwark et al., 2003, 2004). ‘Nested-PCR’ adı verilen yöntemle yanlış DNA bölgesinin çoğalma ihtimali en aza indirgenir. Bu amaçla her bir lokus için iki çift primer kullanılır. İlk çift (‘dış primer’) standart PCR temelinde lokusu çoğaltırken, ikinci set primerler (‘nested-primerler veya iç primerler’) ilk PCR ürünlerine bağlanır ve ikinci PCR ürünü ilkinden daha kısa olur. Nested-PCR bazı araştırmacılar tarafından aDNA çalışmalarında kullanılmıştır (Yang et al., 1997; Fernandez et al., 2006; Millar et al., 2008). Römpler ve araştırıcıları (2006) basit tekli PCR yerine, iki basamaklı çoklu PCR önermiştir. Meissner ve meslektaşlarının (2007) geliştirdiği kısa beşli PCR yaklaşımı, DNA tiplemesinin ticari kitlerle başarısız olduğu olgularda, özellikle degrade örneklerde mükemmel sonuçlar elde etmeyi sağlar. 74 DNA Analizi PCR ürünlerinin analizi için gerekli temel teknoloji, elektroforezdir (Sambrook and Russel, 2001). DNA parçalarını boyutlarına göre ayıran elektroforez, plaka jellerde veya kapiler aracılığıyla yapılabilir. Plaka jel kullanılacaksa, iki farklı taşıyıcı ortam söz konusudur: agaroz veya poliakrilamid. Seçilen elektroforez yöntemi, bilimsel sorunun çözümüne veya beklenen cevaba dayanan analiz çeşidine bağlıdır. En kolay yol, PCR’ın olup olmadığının tespitidir. Bu durumda agaroz jel elektroforezi genellikle yeterlidir. Agaroz jel elektroforezi, amplifikasyon ürünlerinin yeterli uzunluk polimorfizmi gösterdikleri durumlarda veya RFLP analizinde de uygundur. Ancak çoklu dizin veya kısa parça polimorfizmleri inceleniyorsa, amplifikasyon ürünlerinin yüksek çözünürlükteki elektroforez ünitelerinde analiz edilmesi gereklidir. Parçaları ayırt etmede yeterli çözünürlük elde etmek için, ayırıcı ortam olarak poliakrilamid kullanılır. Hem parça, hem de dizin analizleri uygun yazılım programlarıyla desteklenen otomatik aletler kullanılarak tamamlanabilir, böylece sonuçların yorumlanması daha hızlı ve kolay gerçekleşir (Hummel, 2003). Parça uzunluk analizi veya DNA moleküllerinin boyutlarına göre ayrılması, tüm elektroforez tekniklerinde temel yaklaşımdır, elektrik alanda tutulan yüklü moleküller boyutlarına göre katoddan anoda doğru taşıyıcı bir ortam üzerinde göç eder. Kullanılan ayırıcı ortama bağlı olarak sonuçlar çözünürlüklerine göre değişir. Agaroz jel elektroforezinde düşük yüzdeli jeller 50–500 baz çifti arası küçük moleküllerin benzer oranda hareketine sebep olur, böylece aDNA elektroforezinde parça ayrımı yetersiz kalır, sadece 500 baz çifti üzerindeki parçalar düşük konsantrasyonlu agaroz jellerde başarıyla ayrılır. Parça ayrımında moleküllerin aldığı yol ve jel kalınlığı da önemlidir. Uzun 75 mesafeler ve ince jeller kısa parçaları ayırmada başarılı olur. Jeli kaplayan tampon çözelti de kaliteyi etkileyen bir faktördür (Sambrook and Russel, 2001). Eğer aDNA agaroz jel elektroforezi ile ayrılırsa, degrade DNA’da var olan çapraz bağlar, yüksek moleküler ağırlıklı DNA ile uyumlu bir hızda göç eder (Cooper, 1994). Dizin analizi veya dizinleme (sekanslama), çoğaltılmış DNA parçası içinde bazların birbirini takip etmesinin analizidir. Nükleotid değişimleri, insersiyonlar veya baz delesyonları gibi her türlü polimorfizmi ortaya çıkarabilir. Polimorfizmin yapısına bağlı olarak alternatif teknikler de kullanılabilir. Örneğin, dizinin belirli bir bölgesinde 2-6 bazlık bir insersiyon veya delesyon bekleniyorsa ve bu baz eklenmesi veya yok olması elde edilecek tek bilgi ise, parça analizi bir çözüm yolu olabilir. Ancak çok sayıda bilinmeyen farklı polimorfizmlerin söz konusu olduğu analizlerde dizinleme yerine kullanılacak bir başka teknik yoktur (Hummel, 2003). Dizinleme farklı yollarla yapılabilir. Günümüzde otomatik dizinleme teknolojisinde Sanger-Coulson dizinlemesi kullanılır, zincir sonlandırma tepkimesi veya Taq-döngü dizinlemesi de denilir. İlkini takiben ikinci bir PCR’a gerek duyulur. İlkinin tersine, ikinci PCR asimetriktir, sadece bir primer kullanılır, böylece ürünün tek ipliğinin linear amplifikasyonu sağlanır. İkinci PCR’ın en önemli noktası, dizini meydana getiren bütün bazların çeşidine göre belirli renklerle işaretlenmesidir. Bu, sadece dinükleozittrifosfat (dNTP) eklemekle değil, dörtlü floresan dideoksinükleosittrifosfat da (ddNTP) eklemekle sağlanır. ddNTP’ler -OH grubu içermediği için, fosfodiester bağının oluşumu engellenir ve yeni nükleotidler yapıya katılmaz, zincir uzaması sonlanır. dNTP ve ddNTP’lerin uygun oranlarda bulunmasıyla zincir sonlanmaları rastgele gerçekleşir. Sonuçta tek iplikli işaretli dizinler elektroforeze tabi tutulur, parçalar uzunluklarına göre ayrılır ve araştırılan dizini 76 oluşturan bazlar farklı renklerle birbiri ardına dizilir (Sanger et al., 1977). Bazı araştırmacılar, çoğalttıkları DNA parçalarını doğrudan dizinlemiştir (Anzai et al., 1999; Ariffin et al., 2007). Oysa Hummel’in (2003) belirttiğine göre, adli veya arkeolojik örneklerde PCR sonrası doğrudan dizinleme, kontaminasyon sebebiyle güvenilir ve geçerli bir sonuç veremeyecektir. Bu durumda birden fazla bireye ait olma (kontamine olma) ihtimali yüksek olan PCR ürünlerini belirlemek için biyoteknolojiden yararlanarak dizinleme öncesi klonlama yapmak tek uygun çözümdür. Kontaminasyonun belirlenmesi için klonlama yapılması önerilmektedir (Hebsgaard et al., 2005). PCR sonrası doğrudan dizinleme, primerler tarafından amplifiye edilen her şeyin bir özetidir ve modern DNA çalışmalarında standarttır. Oysa geçmişten kalan materyalden gerçekleştirilen PCR, özgün, hasarlı ve kontamine olan her türlü DNA’yı içeren çok sayıda dizini çoğaltır. Bu sebeple dizinler sıklıkla klonlama yapılarak belirlenir (Stone, 2008). aDNA hasarı hakkında birçok istatistiksel araştırma, her örnekte mutasyon dağılımı oluşturmak için klonlamaya dayanır (Ho et al., 2007). Tek bir PCR’dan bağımsız çok sayıda klonlamanın, amplifikasyonun ilk döngülerinde düzensiz etkiler yüzünden bir haplotipte rastgele bir artış olan PCR sürüklenmesi (‘PCR drift’) sebebiyle yeterli bir delil olamayacağı da belirtilmelidir (Axelsson et al., 2008). Ho ve meslektaşları (2007), yanlış bağlanma lezyonlarını kesin olarak tahmin etmek için simülasyon kullanarak bilinen miktarda hasarlı dizinler oluşturmuş ve hazırlanan modelin hata kapasitesini belirlemiştir. Daha sonra bu model aDNA setlerinde yanlış bağlanma lezyonlarının sayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. Dizinler arasında istatistiksel yöntemlerle analiz konusunda ileri çalışmalar yapılması önerilmektedir (Axelsson et al., 2008). 77 Biyoteknolojiden Yararlanma Genetik mühendisliği veya rekombinant DNA teknolojisi ya da son yıllardaki adıyla biyoteknoloji, 1970’li yılların başında gelişmeye başlamış ve hızlı bir ilerleme kaydetmiştir. Genetikte yeni bir dönem yaratarak, temelinde gen klonlaması içeren yöntemlerle birçok bilim dalına fayda sağlamıştır (Brown, 2006). Rekombinant DNA teknolojisi, PCR gibi herhangi bir DNA parçasının çoğaltılmasını sağlar (Tefferi, 2006). Bini ve Pappalardo (2005), anne tarafından akraba olanların farklı dokularında heteroplazmik mtDNA profillerini klonlama ile tespit etmiş ve farklı dizin varyantlarının dağılımını belirlemede bu yöntemin yüksek kesinlik ve duyarlılık gösterdiğini bildirmiştir. İnsan veya insan dışı tüm eski örneklerden genetik analiz için rekombinant DNA tekniklerinden yararlanmak; kontaminasyon ihtimali çok fazla olan bu örneklerden doğru analiz yapmak için tercih edilen ve giderek daha sık kullanılan bir yöntemdir (Pääbo, 1985, 1989; Hummel et al., 1992; Poinar et al., 1998; Gilbert et al., 2005; Brown, 2006; Bouwman et al., 2006; Hatsch et al., 2006; Caramelli et al., 2007; Dissing et al., 2007). Konuyla ilgili yapılan ilk çalışmalarda da 2400 yıllık Mısır mumyasından DNA dizisi elde edilirken, hedef bölgenin bir vektöre kopyalaması ve klonlanan parçaların dizinlenmesi aşamaları gerçekleştirilmiştir (Pääbo, 1985). Gen klonlaması Gen klonlaması deneylerinde temel aşamalar şunlardır: 1. Klonlanacak geni içeren DNA parçası, “vektör” olarak adlandırılan dairesel DNA molekülünün içine yerleştirilir ve “rekombinant DNA molekülü” elde edilir. 2. Vektör, bu geni çoğunlukla bir bakteri olan konak hücreye aktarır. 3. Vektör, konak hücrede çoğalır ve sadece kendisinin değil, taşıdığı 78 genin de çok sayıda kopyasını üretir. 4. Konak hücre bölündüğünde, rekombinant DNA molekül kopyaları yeni nesillere geçer ve vektör replikasyonu devam eder. 5. Çok sayıda hücre bölünmesinden sonra, aynı konak hücrenin koloni veya klonları üretilmiş olur. Her klon, rekombinant DNA molekülünün bir veya daha fazla sayıda kopyasını taşır. Böylece rekombinant molekül tarafından taşınan gen artık klonlanmış olur (Brown, 2006). Bir başka deyişle klonlama, iki farklı organizmadan elde edilen DNA parçalarının birbirine katılımı sonucu oluşan molekülün, bakteriler tarafından alınıp çoğaltılması yoluyla çok sayıda kopyasının elde edilmesidir. Klonlama, iki temel amaca hizmet eder. Birincisi, az sayıda başlangıç materyalinden çok sayıda rekombinant DNA üretmeyi sağlar. Sadece birkaç nanogram yeterlidir, her bakteri bir plazmid alıp bir koloni oluşturmak üzere defalarca bölüneceği için, her hücre molekülün çok sayıda kopyasını içerir. Başlangıç miktarını arttıracak şekilde birkaç mikrogram rekombinant DNA genellikle tek bir bakteri kolonisinden elde edilebilir. İkincisi; purifikasyonu sağlamasıdır. Çünkü ligasyon karışımında istenen rekombinant molekül dışında; bağlanmamış vektör molekülleri, bağlanmamış DNA molekülleri, kendine bağlanmış vektörler ve yanlış DNA parçası içeren rekombinant DNA’lar da bulunur. Bağlanmamış vektörler, nadiren bir sorun yaratır, çünkü bakteri hücreleri tarafından alınmış olsalar da, sadece bazı istisnai şartlar dışında çoğalmazlar. Bakteri içindeki enzimler, bu DNA parçalarını degrade eder. Kendine bağlanmış vektörler ve yanlış rekombinant plazmidler, istenen molekül kadar verimli çoğalır. Ancak yine de istenen molekülün saflaştırması klonlamayla sağlanabilir, çünkü bir hücrenin birden fazla DNA molekülü alması mümkün değildir (Brown, 2006). 79 Klonlama sırasında her hücre bir koloni oluşturacağından kolonideki her klon aynı molekülü içerecektir. Farklı koloniler; kimi istenen rekombinant DNA molekülü, kimi farklı rekombinant DNA molekülü, kimisi de kendine bağlanmış vektörler olmak üzere farklı moleküller içerir. Bu sebeple doğru rekombinant plazmidleri içeren kolonilerin doğru tespit edilebilmesi önemlidir (Brown, 2006). Klonlama Vektörleri: Bir DNA molekülünün, gen klonlamasında vektör olarak görev yapabilmesi için birçok özelliğe sahip olması gerekir. En önemlisi, konak hücrede çoğalabilmelidir. Böylece rekombinant DNA molekülünün çok sayıda kopyası üretilir ve yavru hücrelere aktarılır. Bir klonlama vektörü ideal olarak 10kb’dan küçük olmalıdır, çünkü büyük moleküller saflaştırma sırasında kopmaya eğilimlidir ve manipüle edilmesi daha zordur. Bakteri hücrelerinde bu kriterleri sağlayan DNA molekülleri, temel olarak plazmidler ve bakteriyofaj kromozomlarıdır (Brown, 2006). Plazmidler, bakteri hücrelerinde bağımsız bir varlık gösteren, dairesel DNA molekülleridir. Plazmidler çoğunlukla bir veya iki gen taşırlar ve bu genler sıklıkla konak bakteri için yararlı bir özellikten sorumludur. Örneğin; ampisilin gibi antibiyotiklerin toksik konsantrasyonlarından korunma yeteneği, sıklıkla antibiyotik dirençli genleri taşıyan plazmidin bakteri hücresinde var olmasından ileri gelir. Birçok plazmid, ana bakteriyel kromozomdan bağımsız olarak çoğalabilir. Tek bir hücrede birbirlerine uyumlarına göre çok sayıda farklı plazmid de bulunabilir (Brown, 2006). Bakteriyofajlar, özellikle bakterileri enfekte eden virüslerdir. Bütün virüsler gibi fajlar da, protein moleküllerinden oluşmuş koruyucu bir kılıf ile kaplanmış ve bazıları faj replikasyonu için genler taşıyan bir DNA -nadiren RNA- molekülü içeren oldukça basit 80 yapıdadır. Bakteriyofajların birçok farklı çeşidi vardır, ancak bunlardan lambda (λ) ve M13, klonlama vektörü olarak önemlidir (Brown, 2006). Yirmi kilobazdan küçük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılan plazmidler ve bakteriyofajlar dışında; 300-1000kb boyutlarında büyük DNA’lar için de kozmidler (büyük plazmidler), bakteriyel yapay kromozomlar (Bacterial Artificial Chromosomes, BAC) veya maya yapay kromozomları (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) da vektör olarak kullanılabilir (Tefferi, 2006). Geçmişe ait DNA'nın Güvenilirliği Kontaminasyon: aDNA'nın güvenilirliği veya gerçek/özgün olma özelliği; önemli bir konudur ve araştırma sonuçlarının modern kontaminantlardan ziyade, kendi hedef dizilerini yansıttığını varsaymak dikkat ister (Handt et al., 1994b; Richards et al., 1995). Geçmişe ait örneklerden özgün DNA elde etmenin kesin bir teknik garantisi yoktur, bu kontamine DNA’yı özgün eski DNA’dan ayırmanın zorluğudur (Yao and Zhang, 2003). Hatta tüm kriterler karşılansa bile, özgünlük kesin olmayabilir (Cooper et al., 2004). Klonlama sonrası dizinleme özgün DNA varlığı ile ilgili fikir verir. Eğer tüm klonlar ya da çoğu birbiriyle uyumluysa, DNA’nın kontamine olmadığı kabul edilir (Stone, 2008). Yayınlanan ilk özgünlük kriteri üç noktayla sınırlıdır: 1. İzolasyon sırasında çözeltilerden gelebilecek kontaminasyonları belirlemek için örneklerle birlikte kontrol izolatlarını test etmek, 2. Her örnekten birden fazla izolasyon hazırlamak, 3.Amplifikasyon etkinliği ve amplifikasyon ürününün boyutu arasında, eski DNA örneğinde degradasyon ve hasarı gösteren bir ters ilgi beklemek. Bu kriterler, kontaminasyon ve yanlış bağlanmalar hakkında yeni bakış açıları belirgin hale geldikçe genişletilmiştir (Pääbo et al., 2004). 81 Handt ve meslektaşları (1994b), aDNA sonuçlarının güvenilirliğini değerlendirmek için altı kriter belirlemişlerdir: 1. PCR'dan önce ve sonraki aktiviteler, laboratuvarın farklı kısımlarında veya ayrı laboratuvarlarda yapılmalıdır. 2. Modern DNA bulaşmasından korunmak için sıkı laboratuvar koşulları uygulanmalıdır. 3. Kontaminasyonun tespit edilebilmesi için kontrol örnekler kullanılmalıdır. 4. Sonuçları doğrulamak için örnekler tekrar çalışılmalıdır. 5. Gözlenen aDNA dizisi, filogenetik ilişki göstermelidir. 6. Parça boyutu ile PCR etkinliği arasında ters ilişki gözlenmelidir. Pääbo ve meslektaşlarına (2004) göre neredeyse tam bir kriter listesi vardır: 1. Amplifikasyon ürünleri rutin olarak klonlanmalı ve çok sayıda klon dizinlenmelidir. 2. Kör izolasyon kontrolleri hazırlanmalıdır. Benzer şekilde, negatif PCR kontrolleri kullanılmalıdır. Her deneyde örnek eklenmemiş çok sayıda kontrolün amplifikasyonu yapılmalıdır. 3. Aynı örneğin aynı veya farklı izolatlarından tekrarlanmış amplifikasyonlar gereklidir. Çalışılan örneğin DNA içermediğine karar verilmeden önce, üç izolasyon yapılması makul bir çabadır. 4. Bir izolatta var olan çoğaltılabilir DNA moleküllerinin kantitasyonu, tutarlı değişimlerin meydana gelebileceği PCR’a ne kadar molekül ile başlanacağı hakkında bir fikir verir. 5. Amplifikasyon verimliliği ve amplikon uzunluğu arasındaki ters orantı, aDNA örneğinde var olan engelleyici lezyonların ve degradasyonun ilerlemesinin en basit belirtecidir. 82 6. Genel durumlarına göre DNA içerebilecek örnekleri belirleyecek hızlı tarama yöntemleri kullanılabilir. Aminoasit varlığının analizi, kemik histolojisinin değerlendirilmesi, DNA hasarının belirlenmesi, kemikteki porozite ve yoğunluğun ölçülmesi ve elekron mikroskopu ile değerlendirme; alternatif yöntemlerdir. 7. Hücrelerde mitokondri gibi organellerin DNA’ları da bulunur. mtDNA birçok aDNA çalışmasında temel olduğunda, çakışan dizinleri çoğaltmada farklı primer setleri kullanılabilir. 8. Önemli sonuçlar ikinci bir laboratuarda doğrulanmalıdır. Bu, bir laboratuvar kontaminasyonunu belirlemede yararlıdır. Yang ve Watt (2005) tarafından hedef DNA molekülüne benzer herhangi bir molekül ile bulaşma olarak tanımlanan kontaminasyon, araştırma konusuna bağlıdır. Örneğin; modern insan DNA’sı, geçmişe ait insan kalıntıları çalışmalarında bir kontaminant iken, hayvan kalıntıları ile yapılan araştırmalarda insana ait bir bulaşma önemli değildir (Watt, 2003). Kontaminasyon, laboratuvar kaynaklı olabilir. Laboratuvarda meydana gelen bir bulaşma, PCR ürününün taşınmasıdır. PCR ürünleri, kolaylıkla herhangi bir maddeye kendilerini yapıştırabilir ve giysi, ayakkabı veya havalandırma sistemleri yoluyla taşınabilir. Dolayısıyla laboratuvar personelinin giysileri, kullanılan kimyasallar, araçgereçler veya aletler; havada bulunan görülmeyen tanecikleri, serbest hücre ve DNA moleküllerini içerebilir, PCR tüplerine girerek ya da sıvılar transfer edilirken ortama karışabilir (Watt, 2003). PCR malzemelerinden kaynaklanan özellikle hayvan kaynaklı kontaminasyonlar bildirilmiştir (Leonard et al., 2007). Bunlarla birlikte müze örneklerini 83 birleştirmede yapıştırıcı kullanıldığı için, insan dizinleri; hatta yapıştırıcı hayvan kaynaklı bir madde ise hayvana ait dizinler de tespit edilebilir (Cooper, 1994; Nicholson et al., 2002). İnsan DNA’sı ile kontaminasyon, bulaşmış laboratuvar malzemelerinin kullanılması ile meydana gelir. Örneğin; malzemeler Avrupa kökenli bir üretici firmada Avrupa tipi dizinlerle kontamine olabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Analiz öncesinde (örneğin, kazı aşamasında) veya analiz sırasında örnekle temasta bulunan kişilerden de insan DNA’sı kontaminasyonu gerçekleşebilir (Watt, 2003). Çok yaygın olan bu durum, aynı zamanda kontaminasyonun örnek kaynaklı olması ile de açıklanabilir (Hebsgaard et al., 2005). Örnek kaynaklı kontaminasyonun bir diğer şekli de birbirine çok yakın olarak saklanan veya sergilenen örnekler arasında çapraz bulaşmadır. Bu, PCR öncesi hazırlık aşamasında herhangi bir adımda da meydana gelebilir (Watt, 2003). Kontaminasyonu önleyecek veya en aza indirgeyecek çeşitli protokoller önerilmiştir. Laboratuvar kaynaklı kontaminasyonun önlenmesi için her çalışma ayrı bir alanda yapılmalıdır. Örneğin; izolasyon, PCR'a hazırlık ve amplifikasyon aşamaları birbirinden ayrılmış farklı kısımlarda gerçekleştirilmelidir. Günümüzde izolasyon için diğer laboratuvarlardan ayrı, HEPA-filtreli, pozitif basınçlı özel alanlar düzenlenmekte; PCR hazırlığı için ise steril, HEPA-filtreli, pozitif basınçlı bir hava düzeneği ve UV ışık sistemi olan farklı bir laboratuvar kullanılmaktadır. Alanda ayrıca tüpleri, otomatik pipetleri ve bazı malzemeleri steril etmek için rutin olarak kullanılan bir UV kabini de bulunur. Çalışma alanından, aletlerden veya malzemelerden kaynaklanan kontaminasyon riskinin azaltılması için, sodyumhipoklorit veya DNAz ile rutin temizlik yapılmalı veya UV radyasyonuna tabi tutulmalıdır (O’Rourke et al., 2000). Dekontaminasyon amacıyla en 84 sık kullanılan kimyasal hipoklorittir ve oksidatif hasarla dakikalar içinde DNA’yı parçalar. Bu sebeple örneklere uygulandığında endojen DNA’yı da parçalamaması için kontrollü olarak kullanılmalıdır (Kemp and Smith, 2005; Dissing et al., 2008). Taşınma sebebiyle kontaminasyonun en aza indirilmesi için, ısı döngü cihazının ısı bloğuna da her amplifikasyondan 20–30 dakika önce UV verilmesi önerilmektedir. Tüm aDNA işlemleri eldiven (tercihen iki kat eldiven), maske ve uzun kollu özel giysiler giyen araştırmacılar tarafından yapılmalıdır (O’Rourke et al., 2000). Bunun yanında, laboratuvar personelinin aDNA çalışma alanından modern DNA laboratuvarına, PCR öncesi alandan PCR sonrası alana doğru hareket etmesi PCR ürünlerinin taşınmasının önlenmesini sağlayacaktır (Watt, 2003). Bunun yanında bir aDNA laboratuvarında modern örneklerle ilgili araştırmaların yapılmaması, en temel kontaminasyon etkeninden korunmayı sağlar (Pääbo et al., 2004). Anderung ve araştırıcılarına göre (2008), kontaminasyonun temel kaynağı laboratuvar değil, kazı ve saklama koşullarıdır. Kazı sırasında bir kontaminasyondan korunmak için, maske, eldiven, temiz bir poşet ve temiz aletler kullanılması etkilidir (Yang and Watt, 2005). Kemiklerin kazı sonrasında yıkanması ve temizlenmesi, kontaminasyon için kritik aşamalardır (Fortea et al., 2008). Örnekler arasında çapraz bulaşma riskinin azaltılması için örneklerin ayrı ayrı ele alınması, eldivenlerin örneklerle birlikte değiştirilmesi, aletlerin ve araç-gereçlerin temizlenmesi, filtreli pipet uçlarının kullanılması gereklidir (Watt, 2003). Bireysel çalışmalardaki kontaminasyonun belirlenmesi için çok sayıda kör izolasyon kontrolü ve negatif PCR kontrolü kullanılmalıdır. Kör izolasyon kontrolü, izolasyon sırasında lizis çözeltisine kemik tozu eklenmeden; negatif PCR kontrolü ise PCR karışımının içine DNA izolatı eklenmeden, tüm aşamalardan geçirilen kontrollerdir (Watt, 85 2003). Bunlarda herhangi bir ürünün varlığı, kontaminasyonun kesin kanıtıdır ve deney tekrar edilmelidir. Hatta PCR hazırlığı sırasında açık ve kapalı iki kontrolün de kullanılması önerilir. Açık kontroller; DNA'nın eklenmediği, ancak PCR'ın başlatılma aşamasına kadar kapakları açık kalan, tüm diğer örnek tüpleri kapatıldıktan sonra kapakları kapatılan tüplerdir. Kapalı tüpler ise örnek dışında tüm PCR malzemelerini içerir ve PCR hazırlama aşamasında kapakları kapalı tutulur. Bu iki kontrol çeşidi, PCR hazırlık aşamasından kaynaklanan (taşınma yoluyla) veya kontamine malzemelerden kaynaklanan bulaşma durumlarını etkin olarak ayırt etmeye yarar (O’Rourke et al., 2000). aDNA çalışmalarında pozitif kontrol kullanılması, kontaminasyon olasılığından dolayı tavsiye edilmemektedir (Willerslev and Cooper, 2005). İlk sonuçların tekrarlanması bir zorunluluktur. Hatta ideali, bu tekrarın başka bir laboratuvar tarafından yapılmasıdır (Krings et al., 1997; Hebsgaard et al., 2005). Ancak sıklıkla bu, maliyetinden ötürü mümkün olamamaktadır. Aynı laboratuvarda tekrar, farklı izolasyonlar yapılarak başlamalıdır. Mümkünse diş gibi farklı iskelet elemanları kullanılmalıdır. Tekrarlar birkaç hafta veya ay aralıkla gerçekleştirilmelidir. Bu tekrarlar olmadan aDNA sonuçları geçici olarak kalacaktır (O’Rourke et al., 2000). İki farklı laboratuvar tarafından yapılacak bağımsız analizlerin sadece laboratuvar kontaminasyonunu yok edeceği, örnek iki laboratuvara da ulaşmadan önce kontamine olmuşsa, iki analizde de aynı olan ancak özgün olmayan sonuçlar elde edileceği göz önünde tutulmalıdır (Yang et al., 1997). aDNA sonuçları, filogenetik bir ilişki göstermelidir (Handt et al., 1994b). İnsana ait örneklerde, eski örnekle onun soyundan gelen toplumların genetik benzerliği bir anlam ifade etmelidir. Tüm laboratuvar personelinin DNA örnekleri, modern, laboratuvar 86 kaynaklı kontaminantları belirlemek amacıyla, incelenen özellikler için dizinlenmeli ve tiplenmelidir. Örnekleri topraktan çıkartan arkeolog veya müze personeli gibi, örnekleri tutan kişiler de bulunabiliyorsa, tiplenmelidir. Sonuç olarak, ilk kopya örnek düşük (<100) ise, PCR hataları birikebilir ve son PCR ürününün miktarına etki edebilir (Handt et al., 1996). Bu çoğaltılmış diziler, dizi heterojenitesi olarak bilinir ve ancak kontaminasyonu da ortaya çıkaracak olan çok sayıda klonlanmış PCR ürününün dizinlenmesi ile belirlenir (Handt et al., 1996; Krings et al., 1997; Kolman and Tuross, 2000). Genellikle tüm bu kriterleri göz önüne almak olağanüstü bir önem taşır. Ancak her olguda her bir kritere bağlı kalmak gerekli değildir, çünkü tüm çalışmalarda tüm hata kaynakları meydana gelmez. İzolasyon ve PCR kontrolleri her zaman kullanılmalıysa da, bir ve aynı izolattan çok sayıda amplifikasyon, binlerce örnek molekülden başlayacağı kantitasyonla belirlenmişse tutarlı değişikliklerin olması beklenmediğinden gereksizdir. Örneklerin iyi korunmuş olduğu gözlemleniyorsa, korunmanın biyokimyasal analizine de ihtiyaç yoktur. Ancak biyolojik açıdan önem aDNA’nın belirli bir dizininin özgünlüğüne dayanıyorsa, ikinci laboratuarda tekrarlanması dahil kriterlerin çoğu ya da hepsi sağlanmalıdır (Pääbo et al., 2004; Hebsgaard et al., 2005). Schweitzer ve meslektaşları (2008) ancak fosillerin morfolojik, mikroyapısal ve kimyasal analizleri, biyomoleküler parçaların olası varlığını gösterirse, moleküler analizlere başlanması gerektiğini savunmaktadır. Örneğin Yapısı: Tek bir eski örneğin analizi, örneğin kaldığı zamandan ziyade yapısından dolayı sorunludur. Birçok örneğin bir popülasyon olarak analizi ise daha zordur. Çoğu eski toplum örneği, belirli bir bölgede değişen zaman aralıklarıyla ayrılan birçok bireyden oluşur. Bu sebeple popülasyonun standart tanımını sağlamaz ve bunun 87 geleneksel anlamda doğru bir popülasyon olmadığı bilinmelidir. Bu tip bir örnek dağılımında, standart popülasyon ve genetik analiz varsayımları üzerinde uzlaşma sağlanmalıdır. Bu, örneklerde güvenilir zaman kaynağının önemli olduğu anlamına gelir. Örnekleri tarihlendirme, aDNA analizlerinin maliyetini azaltır. Sadece aDNA analizi için kullanılan kalıntılar ile ilişkili olan arkeolojik alanların veya tabakaların tarihi, örneğin yaşı için güvenilir belirteçler olmayabilir veya en azından örneklerin kaynakları hakkında açık bir soru bırakırlar (Santure et al., 1990). aDNA araştırmalarında bir başka sorun da, tüm örneklerde genetik işaretler elde etme başarısının aynı olmamasıdır. Örneğin; Amerika yerlilerinin haplogruplarını tespit etmek için kullanılan farklı işaretlerde, bütün primer setleri her örnekte başarılı sonuç vermez. Bu durum, haplogrup frekanslarını hesaplamada karışıklık yaratır ve birbiriyle çelişkili haplogrup ve genetik işaret frekanslarına sebep olur. Degrade nükleik asitlerle çalışıldığında durum daha kötü bir hal alır ve modern-eski örnek karşılaştırması zorlaşır. Farklı bir genetik işaretten ziyade dizinlemeye güvenmek, durumu kurtarır (O’Rourke et al., 2000). Bahsedilen tüm önlemlere rağmen, herhangi bir aDNA laboratuvarında kontaminasyon kaçınılmazdır. Dekontaminasyon yöntemleri %100 etkili değildir ve aDNA çalışmalarında kontaminasyon hala ciddi bir sorundur (Gilbert et al., 2005). Değişmez bir tehlike ve beklenen bir sonuç olan bulaşma, çoğunlukla enzim inhibitörlerinden kaynaklanan PCR başarısızlıkları yüzündendir ve temiz örneklerle tekrarlar veya değişiklikler yapılarak üstesinden gelinebilir (O’Rourke et al., 2000; Hebsgaard et al., 2005). Başlangıç materyalinin az olması, PCR inhibitörlerinin varlığı, endojen DNA hasarı gibi sorunları çözmek için uygulanan ilk stratejiler, Taq-polimeraz’ın miktarını arttırmak 88 veya DNA izolatını seyreltmektir. PCR inhibitörleri de seyreltilmiş olur (Hummel et al., 1992; Eilert and Foran, 2007). Bu noktada bifazik amplifikasyon kullanılabilir, seyreltilmiş örnekle 20–30 döngü PCR yapılır ve ürünün %5-10’u aynı amplifikasyon parametrelerinde yeniden çoğaltılmaya tabi tutulur (Hummel et al., 1992). Daha sonra izolasyon ve saflaştırma prosedürlerini geliştirmek temel alınmıştır (Anderung et al., 2008). Saflaştırmanın DNA kaybına sebep olduğu konusunda, Boom ve meslektaşları (1990) sadece çok küçük (40–60 baz çiftinden az) DNA parçalarının kaybolduğunu belirtmiştir. aDNA izolatları için çok sayıda bağımsız PCR veya sonuçların istatistiksel yöntemle analizi DNA hasarının etkilerini elimine etmek için uygulanan diğer yöntemlerdir (Axelsson et al., 2008). Bunlardan bazıları diğerlerinden daha etkili olsa da, hiçbiri genel kabul görmüş değildir (Anderung et al., 2008). Bu gerçekler, sonuç elde etme ve raporlama başarısını düşürmektedir, çünkü tek bir PCR'ın başarısızlığı, doğru bir veri sağlamaz. Ancak bu zorluklar; çoğaltılabilir DNA veren örnekler dışında, bireysel araştırmalardaki veya çalışma gruplarındaki başarı veya başarısızlık oranlarını doğrulukla belirlemek için standart prosedürlerin olmadığı anlamına gelir. Yakın gelecekte de bir standardizasyon söz konusu görünmemektedir. Yine de birçok aDNA çalışması başarıyla sürdürülmekte ve fiziksel antropoloji, toplum tarihi, demografi ve evrimdeki çeşitli sorunları çözmektedir (O’Rourke et al., 2000; Hebsgaard et al., 2005). GEÇMİŞE AİT DNA ÇALIŞMALARINDA ETİK VE YASAL KONULAR Antropolojik materyalin her açıdan doğru yönetimi zorunludur. Örneğin; uzun kemiklerden en az hasarla örnek almak (Gibbon et al., 2009) veya dentin izolasyonundan sonra dişi yapıştırmak mümkün olduğu halde, aDNA yöntemleri genellikle tahrip edicidir. 89 Bu kaynaklar yerine geri konulamaz olduğundan, tahrip edici analizler sadece sonuçlar önemli tartışmalarda bilgilendirici olacaksa, ilginç hipotezleri test etmede veri sağlayacaksa veya tahribat diğer araştırma alanlarını etkilemeyecekse gerçekleştirilmelidir. Çalışma öncesinde araştırmacılar, bazı sorularla durumu değerlendirerek aDNA analizlerine başlamalıdır. Örneğin; yöntem uygulaması antropolojik bir soruya yönelik mi? Sonuç almak için tahrip etmeyen bir yöntem var mı? Kalıntıların veya diğer örneklerin durumu DNA’nın varlığına işaret ediyor mu? Kalıntıların tahrip edilmesi farklı paydaşları nasıl etkiliyor? Olası sonuçların etik, yasal ve sosyal içerikleri, varsa yaşayanlar için, nedir? Ayrıca, gelecekteki herhangi bir olası test için bir miktar örnek saklanmalıdır. Böylece ilk çalışma zamanında olmayan yeni yöntemlerin uygulanması veya sonuçların doğrulanması sağlanabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). İnsanlarla ilgili her çalışmada olduğu gibi, biyoarkeoloji alanında da etik, yasal ve sosyal konuları göz önüne almak gerekir. Geçmişe ait DNA çalışmaları, ölmüş insanların hem fiziksel kalıntıları hem de kültürleri ile ilgili olduğundan, fiziksel antropoloji ve arkeoloji arasında devamlı ve akıcı bir bağ olduğunu göstermektedir. Antropolojik aDNA çalışmalarında araştırmacıların karşılaştığı etik konuların çoğu, yüzyıllardır iskelet antropologları, hatta özellikle arkeologlar tarafından düşünülmektedir. Yaşayan insanlar ve toplumlar için arkeolojik ve fiziksel antropolojik araştırmalarda etik, yasal, sosyal konuların farkına varılması, çalışmalarda kültürel antropolojinin önemini arttırmaktadır. Bu sebeple tüm bu alanların bilgileri, birbirine fayda sağlayacak şekilde ilgili ve iç içedir (Kaestle and Horsburgh, 2002; Walker, 2008). Amerika Birleşik Devletleri, Avustralya ve İsrail’de iskeletlerin analizine kültürel, dini veya politik sebeplerle itirazlar; örnekleri araştırmak için gerekli izinleri engellemekte, 90 aDNA araştırmalarını etik, yasal ve sosyal konular açısından önemli hale getirmektedir (Lalueza-Fox, 1997; O’Rourke et al., 2000; Walker, 2008). Müze örnekleri ile ilgili çalışmalarda ise etik ve yasal sorunların yanında örneklere erişim izni de önemli bir konudur (Stodder, 2008). Geçmişe ait DNA konusunda çalışan araştırmacıların yerel yasal düzenlemelerden, sınırlamalardan haberdar olması gerekir. Dünyada bazı profesyonel kurum veya kuruluşlar; biyomedikal ve sosyal bilimler araştırmacıları tarafından kullanılmak üzere, geçmişe ait insan kalıntıları ile çalışmalarda ortaya çıkan etik sorunları çözmekle doğrudan ilgili bilgiler içeren kılavuzlar geliştirmişlerdir (Walker, 2008). Ancak araştırma materyallerini çalışmak için tek bir strateji önerilemez. Bununla birlikte, aDNA araştırma projelerinin başlatılmasından önce, tartışma ortamının yaratılması ve gerekli izinlerin elde edilmesi, tarafların sonraki anlaşmazlıklarını engelleyecek ve ileride yapılacak araştırmaları kolaylaştıracaktır. Araştırmacılar toplumun emanetinde olan bu örnekleri korumak için bilimsel ilkeleri kullanmak zorundadır. aDNA analiz sonuçları, atasal veya ata soyundan gelenlerle ilişkilerinin mantıklı bir şekilde gösterildiği veya ifade edildiği zaman kavramını genişletmeye yarayabilir. Bu konular gittikçe daha fazla önem kazanmakta veya karmaşıklaşmakta ve deneysel düzeneklerle eşit dikkat gerektirmektedir (O’Rourke et al., 2000). Günümüzde yaşayan insanlarla ilgili biyolojik çalışmalarda, yasal veya kurumsal düzenlemeler doğrultusunda katılımcıların çeşitli düzeylerde aydınlatılmış rızaları alınır. Ancak bu, ölmüş bireylerde mümkün olamayacağından, örneklerde antropolojik veya arkeolojik çalışmalar genellikle kamu kurum ve kuruluşlarının iznine bağlıdır. Ölülerin hakları ile ilgili felsefi tartışmaların geçmişi ise çok eskidir ve çoğu tartışma, gizliliğin ve 91 şerefin korunması veya ölünün isteklerine saygı duyulması gibi haklar üzerinde odaklanmıştır. Holm (2001) aDNA araştırmaları açısından bu konuları tartışmıştır. Eski DNA çalışmaları; yaşayan toplumların sosyal, siyasal ve yasal durumlarını etkileyebilir ve kendilerinin ataları veya kökenleri hakkındaki inanışlarıyla çelişebilir. Hayatta olan insanlarla yapılan çalışmalarda olduğu gibi, aDNA çalışmalarının sonuçları araştırmaya katılmamış olsalar bile grup üyeleri üzerinde etkilidir. Genetik deliller; sosyal, siyasal ve hukuksal alanda büyük önem kazanma potansiyeline sahiptir (Kaestle and Horsburgh, 2002). aDNA çalışmaları, geçmişte ve günümüzdeki bireyler ve gruplar arasında biyolojik bağların kanıtı olduğu için, bu tip deliller arazi parsellemek için hak talebinde bulunmak veya bir hakkı reddetmek amacıyla kullanılabilir. Birçok aşiret bunun için aDNA uzmanlarıyla anlaşmalar yapmaktadır (Tallbear, 2000; Lehrman, 2001). Biyoarkeolojik örneklerde DNA araştırmalarının bir başka etik, yasal ve sosyal içerik örneği; geçmişten kalan Amerika yerlisi bireylerin ülkelerine iade edilme kararları veya kültürel aidiyetin belirlenmesidir. Yerli Amerikalı mezarlarını koruma kanunu, kültürel aidiyet için hem genel anlamda biyolojik delilleri, hem de moleküler genetik analizleri kabul eder (Kaestle and Horsburgh, 2002). ESKİ DNA ÇALIŞMALARININ ADLİ BİLİMLERE KATKISI Adli bilimler, olay yerinde bulunan örneklerin analizini gerektirir. Çoğunlukla sınırlı miktarda ve bozulmuş yapıda olan biyolojik delillerden, ancak uygun yöntemler kullanıldığında sonuç alınabilir. Özellikle iskelet kalıntılarından DNA analizleri, zor ve zaman alan bir süreç haline dönüşür. Dolayısıyla yüzyıllar boyunca toprak altında çeşitli çevre şartlarına maruz kalmış arkeolojik kemikler veya dişler için başarıyla uygulanan 92 aDNA analiz yöntemleri, düşük DNA kopya sayısına sahip veya degrade durumda olan adli örneklerin incelenmesinde de bir yol gösterici olarak kullanılabilir (Capelli et al., 2003; Ballantyne et al., 2007; Fondevila et al., 2008). İskeleti bulunan bir bireyin idantifikasyonunda kemikten veya dişten elde edilen DNA profili, kaybolan kişinin eşyalarından veya akrabalarından elde edilecek olan genetik bilgilerle karşılaştırılabilir. Bulunan kemik örneklerinin, kaybolan kişiye ait olup olmadığı belirlenir. Benzer şekilde yıllar önce vefat etmiş bir kişinin anne/baba olup olmadığı; fethi kabir ile elde edilen kemiklerinin DNA profilinin çocuk/çocuklarınki ile karşılaştırılmasına dayanılarak ortaya çıkarılır. Arkeolojik kayıtlardan akrabalık sistemlerinin belirlenmesinde kullanılan istatistiksel yaklaşım, konvansiyonel akrabalık teorisinden ve adli bilimlerden alınmıştır (Dudar et al., 2003). İncelenen örnekler, bazen soy ağacı çıkarmaya uygun olmayabilir ve alel düşmesi meydana gelebilir, bu da özellikle az sayıda veri olduğunda yanlış yorumlamaya sebep olur. Böyle bir olası durumda, felaket kurbanlarının kimliklendirilmesinde, kayıp kişilerin belirlenmesinde veya diğer akrabalık analizlerinde kullanılmak üzere formüller geliştirilmiştir (Buckleton and Triggs, 2006). Moleküler antropolojide uygulanan mtDNA klonlanmasının, adli bilimlere uyarlanması mümkündür. Geçmişe ait örnekler, birer karışım olarak kabul edilir ve kontaminasyonun yokluğunun kanıtlanması gerekir. Moleküler klonlama bu farklı mtDNA karışımlarını ayırmak için iyi bir yoldur (Lutz et al., 1999; Hatsch et al., 2006). Bunun yanında tek bir dizin özellikle adli bilimlerde dışlama için yeterli değildir (Lutz et al., 1999). Ancak rutin uygulamalarda çok sayıda koloni oluşturmak da, sınırlayıcı bir faktördür. Ayrıca klonlama prosedürleri pahalı kitlerle yürütülmektedir. Bu sebeple adli 93 bilimlerde kullanılmak üzere uygun maliyetli, kısa süren ve pratik yöntemler geliştirilmiştir. Örneğin, diferansiyel izolasyonla hazırlanmış bir örnekten elde edilen karışımları analiz ederken, kadına ait olduğu düşünülen kısımda klonlama yapılabilir (Hatsch et al., 2006). Adli bilimlerde bir başka yasal konu da, belirli hayvanlara ait olduğu iddia edilen işlenmiş et ürünleri olabilir. Özellikle yasalarla korunan hayvanlardan elde edilen etlerin doğrudan veya işlenerek satılması, suç teşkil etmektedir ki; bunun da delillendirilebilmesi gereklidir. Bu amaçla söz konusu karışık et ürünlerinin içeriklerini belirlemede, örneklerden yapılacak DNA analizleriyle, hayvan türlerinin belirlenmesi mümkündür. Ancak işlenmiş et ürünlerinde var olan DNA degrade halde olduğundan, aDNA yöntemlerinden faydalanılır ve etin ait olduğu hayvan türü veya türleri moleküler düzeyde tespit edilebilir. ANADOLU’DA DEMİR ÇAĞI Demir Çağı, pekçok bölgede değişik tarihlerde başlamış ve bitmiş olsa da Anadolu'da genel olarak, M.Ö. 13. yüzyılda başladığı, M.Ö. 4. yüzyılda bittiği kabul edilen ve demirin eritilerek kullanılmasıyla karakterize olan bir dönemdir. Bu dönemde bulunan demirin bulunup işlenmesi, sanayinin gelişmesine neden olmuştur. Bakır ve tunçun yerini demirden silah ve eşyalar almıştır. Ticaret hızlanmış, toplumların birbirleriyle ilişkileri sağlanmıştır. Demir Çağı'na ait Anadolu uygarlıklarından bazıları, Geç Hititler, Urartular, Frigler, Lidyalılar ve Likyalılar'dır. 94 Van Coğrafyası Van, Doğu Anadolu Bölgesi’nin beş coğrafik bölümünden biridir ve Van Gölü’nün varlığından dolayı, bölgenin diğer bölümlerinden ayrılır. Karasal iklim görülür. Kışları soğuk ve kar yağışlı, yazları ise sıcak ve kuraktır. Ancak göllerin ve barajların varlığı, iklimin kışın komşu illere göre daha yumuşak olmasını sağlar. Gece-gündüz arası sıcaklık farkı fazladır. Toprakları verimli, akarsuları bol olduğu için tarih boyu birçok farklı medeniyet tarafından elverişli bir yerleşim merkezi olarak kullanılmıştır. Yoncatepe ve Urartu Medeniyeti Urartular, Doğu Anadolu Bölgesi’nde yaşamış, Demir Çağı (M.Ö. 1200–750/700) uygarlıklarından biridir. M.Ö. 9. yüzyılın ortalarında Van Gölü çevresinde yaşayan göçebe topluluklar birleşerek Urartu Devleti’ni kurmuşlardır. Urartu toprakları M.Ö. 8. yüzyıl ortalarında genişlemiştir. Daha sonra diğer medeniyetlerle savaşlar meydana gelmiş, toprak kaybedilerek gerileme başlamış ve M.Ö. 612 yılında Urartu Devleti’ne Medler ve İskitler tarafından son verilmiştir (Çilingiroğlu, 1984). 1995 yılında "Doğu Anadolu Bölgesi'nde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin Araştırılması" konusunda gerçekleştirilen yüzey araştırması sırasında modern Van kentinin 9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı Köyü sınırları içerisinde Yoncatepe yerleşmesi saptanmış (Şekil 6) ve arkeolojik kazı alanı (Şekil 7) olarak incelemeye alınmıştır. Yoncatepe ve yakın çevresi, Urartu Krallığı Dönemi'nde önemli bir yer tutmuştur. Bakraçlı Köyü içinde bulunan tarihi Yedikilise'nin (Varak Kilisesi) duvarlarında devşirme malzeme olarak kullanılan ve Urartu Kralı Menua'ya ait çok sayıdaki çivi yazılı yapı kitabesi bunu doğrulamaktadır (Belli, 1996). 95 Şekil 6. Yoncatepe’nin genel görünümü (Belli, 1996). Şekil 7. Yoncatepe arkeolojik kazı alanı (Belli, 1996). 96 Yoncatepe Nekropolü Yoncatepe nekropolünde kazı çalışmaları sonucunda Demir Çağı’na tarihlendirilen 6 adet mezar odası (M1, M2, M3, M4, M5 ve M6) ortaya çıkarılmıştır. Yüzeyden yaklaşık 70–100 cm derinde olan mezarların üst örtüsü çökmemiştir, yapılar ve içinde barındırdıkları korunmuştur (Belli and Kavaklı, 2001). Bu çalışma kapsamında incelenen Mezar 2 (M2) ile Mezar 6’nın (M6) genel görünümleri ve içindeki buluntular Şekil 8, 9, 10 ve 11’de görülmektedir. Mezarların tümünde çok sayıda iskelet ortaya çıkarılmıştır. Kafatası sayısına göre M2’de 40, M6’da 38 kişi olduğu düşünülmektedir. Bireyler mezarlara yaş ve cinsiyet ayrımı yapılmadan gömülmüştür. Mezarlarda bebek, çocuk, genç, yaşlı, kadın ve erkek bireylere ait kemikler bir arada bulunmuştur (Belli, 2001). Şekil 8. Mezar 2’nin genel görünümü (Belli and Konyar, 2001). 97 Şekil 9. Mezar 2’deki buluntular (Belli and Konyar, 2001). Şekil 10. Mezar 6’nın genel görünümü (Belli and Konyar, 2001). 98 Şekil 11. Mezar 6’daki buluntular (Belli and Konyar, 2001). Yoncatepe halkı, kendine özgü bir ölü gömme geleneğine sahiptir. Ölülerini taşlarla örülerek yapılan ve gömünün konulduğu odaya girişini sağlayan bir kapının bulunduğu dikdörtgen planlı oda mezarlara gömmüşlerdir. Bu yapılara normal koşullarda bu kadar kişinin konulması mümkün değildir. Erken Demir Çağı'na tarihlendirilen diğer nekropollerde olduğu gibi, burada da mezar odası dolduktan sonra, her yeni gömü yapıldığında eskisi geriye doğru itilmiş ve böylece mezarların dip kısmında bir kemik yığını oluşmuştur. Kemiklerin mezar dibine itilmesi sırasında, kafataslarının büyük bir özenle çanakların içine konulduğu gözlenmiş, bununla birlikte kemiklerin karıştığı ve parçalandığı belirlenmiştir. Mezar odalarında normal gömülerin yanında yakılarak gömülmüş kişilerin kemiklerine de rastlanmıştır. Bu mezarların iki gömü türünün aynı mezarda kullanılmış olması, aynı kabileye veya aileye ait bireylerin farklı geleneklere veya dinsel inanışlara sahip olabileceklerine işaret etmektedir (Belli and Konyar, 2001). 99 BÖLÜM 3 GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmada materyal olarak Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200– 750/700) arkeolojik kazı alanındaki mezar odalarında bulunan insan kemikleri kullanılmıştır. Yoncatepe kazı alanı, Van kentinin 9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı Köyü sınırları içinde yer almaktadır. Kazı çalışmaları sonucunda Demir Çağı’na tarihlendirilen altı adet mezar odası (M1, M2, M3, M4, M5 ve M6) ortaya çıkarılmıştır. Yüzeyden yaklaşık 70–100 cm derinde olan mezarların üst örtüsü çökmemiş, yapılar ve içinde barındırdıkları korunmuştur (Belli ve Kavaklı, 2001). Kazı alanından elde edilen insan kemiklerinin antropolojik çalışması Mergen ve İşcan (2007) tarafından tamamlanmıştır. Bu çalışma için oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insan femur kemiği parçası, Adli Tıp Enstitüsü ve Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarları’nda mtDNA HVRI 16147–16294 baz çifti arası bölge açısından analiz edilmiştir. KEMİKLERİN HAZIRLANMASI Aşama İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Adli Osteoloji Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. M2 ve M6 oda mezarlarından çıkarılan, ancak antropolojik ölçüm yapılamayan femur kemikleri seçildi. Çalışmanın yapılacağı alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi ve birkaç kat alüminyum folyo ile kaplandı. M2'deki 20, M6’daki 17 femurun sıkı kemik dokusundan 3–4 cm örnek, kıl testeresi ile kesilerek numaralandırılmış falkon tüplere alındı. Kontaminasyonun önlenmesi amacıyla; her örnek için kullanılan alüminyum folyo, kıl testeresinin ucu değiştirildi. Modern DNA 100 kontaminasyonundan korunmak amacıyla kullanılan eldiven, maske ve bone de her örnekle birlikte yenilendi. Kemiklerin toz haline getirilmesi aşamasında, çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi ve birkaç kat alüminyum folyo ile kaplandı. Örneğin dış yüzeyinin temizlenmesinde kullanılacak bistürinin her iki tarafı 10'ar dakika UV'de bekletildi. Folyo üzerine alınan örneğin dış yüzeyi, bistüri ile traşlandı. İç yüzeyindeki süngerimsi doku uzaklaştırıldı. Kemik parçasının her iki yüzeyi 5'er dakika UV'de bekletildi. Örnek, kilitli plastik poşete alındı. Bir kat kilitli poşete daha konuldu ve laboratuvar dışında, birkaç kat karton konulmuş zemin üzerinde, 2 kg’lık bir çekiç kullanılarak, poşet içindeki kemik parçasının kırılması ve toz haline gelmesi sağlandı. Toz haline getirilen örneğin bulunduğu poşetler, alüminyum folyo kaplı alan üzerinde dikkatlice açılarak, 15 ml falkon tüplere aktarıldı. Toz örnekler, 0.5 g tartılarak üç farklı 1.5 ml ependorfa bölündü. İki ependorf izolasyonda kullanılmak, bir ependorf ise ihtiyaç durumunda dış laboratuvara gönderilmek üzere hazırlandı. Geri kalan toz ise yine ependorf tüp içine alındı. Tüm örnekler her zaman derin dondurucuda (-20° C) saklandı. DNA İZOLASYONU Aşama, İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Moleküler Genetik Laboratuvarı’nın izolasyon bölümünde QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak gerçekleştirildi. 1. Çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi. 2. Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu yapılacak örnek sayısı kadar 15 ml falkon tüp, 1.5 ml ependorf tüp, ayrıca 0.5 M pH=8 EDTA çözeltisi, 10 dakika UV'de bekletildi. 101 3. Su banyosu ve termomikser, 55°C'ye gelmesi için açılarak hazırlandı. 4. 15 ml falkona 10 ml EDTA çözeltisi konuldu. 5. 50 µl 10 µg/µl Proteinaz K ve 0.05 g SDS eklendi. Karışım 5 dakika UV'de bekletildi. 6. Önceden 0.5 g tartılarak hazırlanmış ependorftaki her kemik tozu örneğine 1 ml izolasyon çözeltisi eklendi. 7. Kontaminasyonun tespiti için, her 3 örneğe karşılık 1 negatif kontrol örneği (kemik tozu içermeyen, sadece izolasyon çözeltisi içeren örnek) de hazırlandı ve izolasyon sırasında örneklerle birlikte bu tüp de aynı işlemlerden geçirildi. 8. Örnekler, bir gece 55° C 650 rpm termomikserde bırakıldı. 9. Ertesi gün, çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi. 10. Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu yapılacak örnek sayısı kadar 15 ml falkon tüp, izolasyonda kullanılacak purifikasyon kitinin kolonları, kit içindeki PE, EB ve PBI çözeltileri, UV'de 10 dakika bekletildi. 11. Termomikserden alınan örnekler, 2000 rpm'de 5 dakika santrifüj edildi. 12. Falkonlara 1 ml PBI çözeltisi konuldu. İçine santrifüjden alınan örneklerin üst (süpernatant) kısmından 0.5 ml alınıp eklendi. 13. Karışımdan 0.7 ml, kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı. 14. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 15. Kolonların atık tüpleri çıkartılarak, %4'lük NaOCl çözeltisi emdirilmiş kağıt havluya ters çevrildi ve içindeki sıvı uzaklaştırıldıktan sonra tekrar kolonların altına yerleştirildi. 102 16. Falkondaki karışım bitene kadar bu işleme devam edildi. 17. Son santrifüjden sonra temizlenen atık kabı tekrar kolonun altına yerleştirildi ve kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi. 18. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 19. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi. 20. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 50 µl EB çözeltisi eklendi. 21. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 22. Hazırlanan izolat, derin dondurucuda saklandı. DNA'NIN ÇOĞALTILMASI Aşama, Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarı’nın PCR bölümünde gerçekleştirildi. Mitokondriyal DNA'nın HVRI bölgesinde 16147–16294 baz çifti arası bölgenin çoğaltılması hedeflendi. 1. Çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi. 2. Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu yapılacak örnek sayısından (kontroller dahil) iki fazla sayıda 0.5ml ependorf tüp, karışım için bir adet 1.5 ml ependorf tüp, ayrıca 10X tampon çözeltisi, MgCl2, dNTP çözeltisi, 10 dakika UV'de bekletildi. 3. PCR karışımı hazırlandı (örnek başına): MilliQ su 31 µl 10X tamponu 5 µl dNTP 4 µl 103 MgCl2 4 µl BSA 0.5 µl Primer F+R 2 µl + 2 µl 4. Karışım 5 dakika UV'de bekletildi. 5. 0.2 ml ependorf tüplere 2.5 µl örnek, iki kontrol tüpüne de örnek yerine su konuldu. 6. PCR karışımına 0.25 µl Taq-polimeraz enzimi eklendi ve karışım her tüpe 47.5 µl olarak paylaştırıldı. 7. PCR aletinde uygun programa konuldu: ilk aşama: 95º C 7 dakika 44 döngü: 55º C 1 dakika / 72º C 1 dakika / 94º C 1 dakika 1 döngü: 55º C 1 dakika / 72º C 10 dakika / 10º C 15 dakika Çoğaltılan DNA'nın Tespiti 1. 1 g agaroz tartıldı, erlene konuldu. 2. 50 ml 1X TBE eklendi. 3. Mikrodalga fırında orta derecede 2 dakika kaynatıldı. 4. 1 µl EtBr ilave edilerek, tarak yerleştirilmiş jel kabına döküldü. 5. 15 µl PCR ürünü ve 2 µl yükleme tamponu karıştırılarak jele yüklendi. 6. Karşılaştırma için PstI ile kesime uğratılmış Lambda DNA standart olarak kullanıldı. 7. 45–60 dakika 110 V' elektroforeze tabi tutulan agaroz jel, UV altında incelendi. 104 JELDEN DNA İZOLASYONU Kesim yapılacak örnek sayısı kadar 1.5 ml ependorf tüp hazırlandı, numaralandırıldı ve boş ağırlıkları tartılarak not edildi. UV'nin zararlı etkilerinden korunmak için gözlük, maske, eldiven gibi gerekli önlemler alınarak, UV altında görüntülenen jel bantları bistüri ile kesildi (Şekil 12). Şekil 12. Agaroz jelden DNA bantının kesilmesi. Her jel bantı, ait olduğu ependorf tüpe konuldu. Ependorf tüpler tekrar tartıldı. Böylece ilk ağırlıkları ile ikinci ağırlıkları arasındaki fark, içerdikleri jel parçasının ağırlığını verdi. QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak işleme devam edildi. 1. Ependorfa jel bantının hacminin 3 katı kadar QG çözeltisi eklendi. 2. Jelin erimesi için 50º C su banyosunda 10 dakika bekletildi. 3. Jel hacmi kadar izopropanol eklendi. 4. Karışım kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı. 5. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 6. Kolonların atık tüpleri boşaltılarak, %4'lük NaOCl çözeltisi emdirilmiş kağıt havluya 105 ters çevrildi ve tekrar kolonların altına yerleştirildi. 7. Kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi. 1 dakika beklendi. 8. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 9. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi. 10. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 50 µl EB çözeltisi eklendi. 11. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 12. Kolona 30 µl EB çözeltisi eklendi. 13. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 14. PCR ürünü, jelden saflaştırılmış halde elde edildi. DNA'NIN KLONLANMASI Bu aşama, İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Adli Mikrobiyoloji Laboratuvarı’nda TOPO TA Cloning® Kit with pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen, CA) kullanılarak gerçekleştirildi. Önce besiyeri hazırlandı, ardından klonlama işlemi tamamlandı. Besiyeri Hazırlanması İki farklı yöntem takip edildi: I. 20 g hazır Luria-Bertani agara 250 ml deiyonize su eklendi ve otoklavda sterilize edildi. Daha sonra 55º C'ye soğutulan sıvı besiyerine 400 µl ampisilin eklendi ve petrilere döküldü. II. Mavi-beyaz görüntüleme için özel olarak üretilmiş hazır karışım (FastMedia™ LB Agar Amp IPTG/X-Gal, Fermentas) kullanıldı. Paket içeriği cam şişe içine 106 alındı, üzerine 200 ml deiyonize su eklendi ve mikrodalga fırında orta ısıda önce 2 dakika, daha sonra hafifçe çalkalanıp 30 saniye tutuldu, tamamen erimesi sağladı ve petrilere döküldü. Her iki yöntemde de besiyeri soğuyarak katılaşınca, petrilerin kapağı kapatıldı ve ters çevrilerek 4º C'de karanlıkta saklandı. Klonlama İşlemi 1. Petrilerdeki besiyeri 37º C etüve bırakıldı. 2. Klonlama için kullanılacak kitin önerdiği üzere, su banyosu 42º C'ye ayarlandı ve S.O.C. Medium oda sıcaklığına gelmesi için dolaptan çıkartıldı. 3. Örnekler ve negatif kontroller için yeterli sayıda 0.5 ml ependorf hazırlandı ve numaralandırıldı. 4. Kontrol tüpü içinde karışım hazırlandı (örnek başına): Tuz çözeltisi 1 µl + Vektör 1 µl 5. Karışım 2 µl olarak tüplere bölündü. 6. 1µl jelden izole edilmiş PCR ürünü eklendi. 7. 30 dakika beklendi. 8. Bu arada -80º C'den TOP10F’ hücreleri buz içine alındı. 9. 30 dakika sonunda örnek tüplerini içeren spor buza yerleştirildi. Tüplerin alt kısmının buzda kalması sağlandı. İçine 10µl TOP10F’ hücreleri ilave edildi. 10. 30 dakika beklendi. 11. 30 dakika sonunda tüpler, 42º C su banyosunda 30 saniye bırakıldı. Hemen ardından buza alındı. 107 12. Her tüpe 250 µl S.O.C. Medium ilave edildi. 13. Etüvde 37º C'de 1 saat çalkalanmaya bırakıldı. 14. Petriler etüvden alındı. 15. Karışım hazırlandı (örnek başına): X-Gal 20 µl + IPTG 20 µl 16. Karışım (40 µl), petrinin bir kenarına bırakıldı. 17. Etanolde bekletilen yayma aleti (Drigalski spatülü), önce bek alevinden geçirildi, sonra petrinin bir kenarına bırakılmış X-Gal ve IPTG karışımının besiyerine yayılması için kullanıldı. 18. Etüvde 37º C'de 30 dakika bekletildi. 19. 30 dakika sonra petriler ve tüpler etüvden alındı. 20. Ependorf içindeki tüm karışım (tuz çözeltisi, vektör, TOP10F’ hücreleri, S.O.C. Medium) petrinin bir kenarına bırakıldı. 21. Etanolde bekletilen yayma aleti, önce bek alevinden geçirildi ve karışımın besiyerine yayılması için kullanıldı. 22. Petriler etüvde 37º C'de gece boyu bekletildi. 23. Ertesi gün petriler incelendiğinde, hem mavi hem de beyaz kolonilerin oluştuğu görüldü. Kullanılan vektör, LacZ genini içeren, ampisilin dirençli bir vektördür. Lac Z geni, laktozu glukoz ve galaktoza parçalayan enzim olan β-galaktosidazı üretir. Genin çalışabilmesi ise, IPTG'nin (İzoPropil β-D-1-TiyoGalaktopiranosid) varlığına bağlıdır. Bir laktoz türevi olan IPTG, Lac represöre bağlanır ve onu inaktive ederek Lac operonunun 108 çalışabilmesini sağlar. E. coli tarafından metabolize edilemediği için, konsantrasyonun sabit kalması da önemli bir avantajdır. X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-Dgalaktopiranosid, BCIG), β-galaktosidaz enziminin substratıdır. Enzim, X-Gal'i renksiz galaktoza ve mavi renkli 4-kloro-3-brom-indigo'ya parçalar. Dolayısıyla, besiyerlerinde klonlamanın gerçekleştiği hücrelerde hedef PCR ürünü bakteri hücresindeki vektörün Lac Z gen dizisinin ortasına girip genin çalışmasını durdurmuşsa, enzim üretilemediği için XGal parçalanmamıştır (mavi renk oluşmaz), beyaz koloniler meydana gelmiştir. Eğer klonlama doğru gerçekleşmezse veya hiç meydana gelmezse, bu durumda Lac Z geni enzim üretmeye devam etmiştir ve bu enzimler, X-Gal'i parçalayarak mavi renk (mavi koloniler) oluşmasını sağlamıştır. İstenen, doğru koloniler, beyaz renkli kolonilerdir. KLONLAMA SONRASI ÇOĞALTMA Aşama, Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Beyaz renkli kolonilerin içerdikleri hedef dizinin hot-start PCR ile çoğaltılması işlemine geçildi. Böylece PCR sırasında oluşması muhtemel ve çoğalmayı olumsuz yönde etkileyecek primer-dimer oluşumlarından korunulması hedeflendi. 1. Her örnek için 3–5 koloni seçildi ve yeterli sayıda 0.5 ml ependorf tüpler etiketlendi. 2. PCR karışımı hazırlandı (örnek başına): MilliQ su 17 µl 10X tamponu 2.0 µl MgCl2 1.5 µl Primer F+R 0.5 µl + 0.5 µl 3. Karışım, 0.2 ml ependorf tüplere 21.5 µl olarak paylaştırıldı. Otomatik pipetlerin ucu 109 kullanılarak seçilen koloniler zarar vermeden alındı ve karışım içine aktarıldı. 4. PCR için ikinci karışım hazırlandı (her örnek için): dNTP 2.0 µl + Taq-polimeraz 0.5 µl 5. PCR aletinde uygun programa konuldu: ilk aşama: 94º C 10 dakika 25 döngü: 94º C 1 dakika / 55º C 1 dakika / 72º C 1 dakika son aşama: 72º C 10 dakika / 15º C 15 dakika 6. İlk aşamanın tamamlanmasına 8 dakika kala tüplere 2.5 µl dNTP-Taq karışımı eklendi ve kapağı kapatılan PCR aleti, programa devam ederek klonlanan ürünleri çoğalttı. Çoğaltılan DNA Klonlarının Tespiti 1. 1.5 g agaroz tartıldı, erlene konuldu. 2. 75 ml 1X TBE eklendi. 3. Mikrodalga fırında orta derecede 2 dakika kaynatıldı. 4. 1 µl EtBr ilave edilerek, tarak yerleştirilmiş jel kabına döküldü. 5. 5 µl PCR ürünü ve 1 µl yükleme tamponu karıştırılarak jele yüklendi. 6. Karşılaştırma için PstI ile kesime uğratılmış lambda DNA örneği standart olarak kullanıldı. 7. 30 dakika 135 V elektroforeze tabi tutulan agaroz jel UV altında incelendi. Doğru eklenmenin gerçekleştiği örneklerde, PCR ürününe geri dönülerek purifiye etme işlemine geçildi. Kısa eklenme, hiç eklenmeme veya sadece primer-dimer oluşumları tespit edilen ürünler için ise, yeniden klonlama PCR'ı yapıldı. 110 PCR ÜRÜNLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak işleme devam edildi. 1. Ependorfta hazır bulunan PCR ürünü üzerine hacminin 5 katı kadar PBI çözeltisi eklendi. 2. Karışım kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı. 3. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 4. Kolonların atık tüpleri temizlendi. 5. Kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi. 6. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 7. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi. 8. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 30 µl EB çözeltisi eklendi. 9. 1 dakika bekledikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı. 10. Saflaştırılmış PCR ürünü hazır hale getirildi. DİZİNLEME Dizinleme, Macrogen (Rockville, MD, USA) laboratuvarlarında gerçekleştirildi. Önce BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) kullanılarak çoğaltma yapıldı. 1. PCR karışımı hazırlandı (her örnek için): Hazır reaksiyon karışımı 9.5 µl Primer Karışımı 3.5 µl Örnek 8 µl 111 2. PCR aletinde uygun programa konuldu: ilk aşama: 96º C 1 dakika 25 döngü: 96º C 15 saniye / 50º C 1 saniye / 60º C 60 saniye son aşama: 15º C 10 dakika 3. Elde edilen çoğaltılmış ürünler, ABI 310 Genetik Analizör cihazına yüklenerek yürütüldü. DİZİNLERİN DEĞERLENDİRİLMESİ Elde edilen dizinler, önce Chromas yazılım programına aktarılarak işlendi. Hedef DNA dizilerinin vektörün DNA dizini ile birleştiği kısımlar, vektörün dizin haritası (Ek 2) kullanılarak belirlendi. İstenen dizin dışında kalanlar seçilerek çıkarıldıktan sonra veri, BioEdit yazılım programına aktarılarak Cambridge Referans Dizini ile karşılaştırıldı. 112 BÖLÜM 4 BULGULAR Çalışmada Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–750/700) kazı alanında bulunan oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insana ait femur parçası olası akrabalık ilişkilerini genetik analizlerle belirlemek amacıyla analiz edildi. Öncelikle kemiklerden DNA izole edildi. İzolasyon sırasında örneklerin renginde farklılıklar gözlendi (Şekil 13). Şekil 13. DNA izolasyonu sırasında örneklerin üst fazında görülen renk farklılıkları. İzolatlar agaroz jel elektroforezinde yürütüldü (Şekil 14 ve 15). Şekil 14 ve 15’te oklarla işaret edilen alanlar, izolasyon sırasında tüm işlemlerden geçirilen, ancak DNA içermeyen kontrol örneklerini göstermektedir. Daha sonra mitokondriyal DNA'nın HVRI bölgesinde 16147-16294 baz çifti arası bölge çoğaltıldı. 145 baz çiftlik PCR örnekleri, PstI ile muamele edilmiş Lambda DNA’dan oluşturulan bir marker ile karşılaştırıldığında; PstI standartının verdiği iki bandın 113 arasında bant vermiş olması beklendi. Bazen amplifikasyon başarısız oldu, sadece primerdimer oluşumu gözlendi (Şekil 16). Şekil 14. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü (Soldan sağa sırasıyla Marker, M2FD1, M2-FD2, M2-FD3, M2-FD5, M2-FD6, M2-FD7, M2-FD8, M2-FD9, M2-FD10, M2FD12, Kontrol II; M2-FD18, M2-FD19, M2-FD20, M6-FD2, M6-FD6, M6-FD10, M6FD16, M6-FD7, Kontrol I). Şekil 15. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü (Soldan sağa sırasıyla Marker, M2FD4, M2-FD11, M2-FD13, M2-FD14, M2-FD15, M2-FD16, M2-FD17, M6-FD1, M6FD3, Kontrol III; M6-FD4, M6-FD5, M6-FD8, M6-FD9, M6-FD11, M6-FD12, M6-FD13, M6-FD14, M6-FD17, Kontrol IV). 114 Şekil 16. Amplifikasyonun başarısız olduğu, sadece primer-dimer oluşumunu gösteren bir jel görüntüsü. (Sırasıyla: PCR Kontrol I, M2-FD6, M2-FD9, M2-FD10, M2-FD12, Kontrol II, M2-FD18, M2-FD19, M2-FD20, Kontrol I, PCR Kontrol II). Amplifikasyona tabi tutulan izolasyon kontrol örneklerinin ve PCR kontrollerinin bant vermemesi gerekliydi. Ancak bazen her iki kontrolde de DNA varlığına işaret eden bantlar olduğu görüldü ve kontaminasyon tespit edildi (Şekil 17). Bu sebeple, PCR aşaması tekrarlandı. Tüm bunlarla birlikte kontaminasyonun olmadığı, beklenen boyutta doğru ürünlerin oluştuğu başarılı amplifikasyonlar da yapılabildi (Şekil 18). Bu durumda jelden izolasyon aşamasına geçildi. 115 Şekil 17. Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun olduğunu gösteren bir jel görüntüsü. (Sırasıyla: PCR Kontrol I, M2-FD6, M2-FD7, Kontrol II, M6-FD2, M6-FD6, M6-FD7, M6-FD10, M6-FD16, Kontrol I, PCR Kontrol II). 805 514 468-448 339 264-247 164-150 94 Şekil 18. Amplifikasyonun doğru gerçekleştiği bir jel görüntüsü. (Sırasıyla: PCR Kontrol, Kontrol I, M2-FD6, M6-FD6, M6-FD7). 116 Klonlama aşamasına geçmeden önce üç örnek seçildi ve doğrudan dizinleme yapıldı (Şekil 19). Çok fazla farklı DNA bulunması ve primerlerin bu DNA’ların hepsini çoğaltıp dizinlemesi sebebiyle elektroforegramda karışık bir dizin görüntüsü elde edildi. Dizinleme sonuçlarının doğru olmayacağı belirlendi. Böylece doğrudan dizinlemenin güvenilir sonuçlar vermeyeceği, bu nedenle klonlamaya mutlaka ihtiyaç olduğu görüldü. Şekil 19. Amplifikasyon ürünlerinden klonlama yapılmadan önce M6-FD7 örneğinin saflaştırma sonrası dizinlenmesi. Her örnek için PCR ürünlerinin klonlaması sırasında oluşan kolonilerden 5 adet seçildi. Bazı örneklerde koloni oluşumunun zayıflığı sebebiyle, 2–3 koloni alınabildi. Ürünlerin vektöre doğru bağlanıp bağlanmadığının tespiti, amplifikasyon sonunda jel elektroforezi ile analiz edildi (Şekil 20). Görüntüde, 201 baz çiftlik klonlama parçasının arasına yerleşen 147 baz çiftlik PCR örneklerinin, sahip olduğu ağırlıktan (348 baz çifti) 117 dolayı, PstI ile oluşturulan marker’ın verdiği 339 baz çiftlik bantın biraz üzerinde bant vermiş olması beklendi. Bu ağırlıktaki DNA bantının dışında görülen her bant istenmeyen üründü. Örneğin; PstI standartının 200–240 baz çifti arasında görülen bantlar, kısa eklenmeyi; 150–200 baz çifti arası görülen bantlar eklenmenin hiç gerçekleşmediğini gösterdi. Marker’ın en alt bantı olan 97 baz çiftinin de altında görülenler ise sadece primerdimerlerdi. 339 200 Şekil 20. Klonlamadan sonra gerçekleştirilen amplifikasyonda vektöre doğru bağlanan ve bağlanmayan ürünlerin tespit edildiği jel görüntüsü. Klonlama sonunda vektöre doğru bağlandığı belirlenen ürünlerde saflaştırma yapıldı. Her örnekten seçilen beş koloninin çoğaltılıp jelde yürütülmesi sonucunda, doğru eklenme olmayan ürünler saflaştırılmadı. Diğerlerinde ise saflaştırmadan sonra her örnek için 3-5 koloni dizinlendi (Şekil 21). 118 Şekil 21. Klonlama yapılmış M6-FD6 amplifikasyon ürününün elde edilen kolonilerinden birinin dizinlenmesi. Klonlamada M13 primerleri ile çoğaltılan bölgenin dizini hem vektöre, hem de istenen PCR ürününe aitti. Vektörün arasına yerleştirilmiş olan PCR ürününün başlangıç ve bitiş noktalarının doğru belirlenebilmesi için dizinler öncelikle Chromas programı ile analiz edilerek veriler üzerinde işlem yapıldı. Vektörün dizin haritası kullanılarak (Ek 2) PCR ürününün yer aldığı bölgenin dışında kalan kısımlar işaretlenerek çıkarıldı ve dizin BioEdit programı ile analize hazır hale getirildi (Şekil 22). Şekil 22. M6-FD6 örneğine ait bir koloni dizininin Chromas programı ile işlenmesi. 119 Tüm örneklere ait dizinler karşılaştırmalı olarak analiz edildi ve aynı örneğe ait dizinler arasında görülen farklılıklar, kontaminasyon veya DNA hasarı açısından değerlendirildi. Üç örneğe ait beşer dizinin birbiriyle ve Cambridge diziniyle BioEdit programı kullanılarak karşılaştırılması Şekil 23, 24 ve 25’te görülmektedir. Şekil 23. M2FD3 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması. 120 Şekil 24. M2FD7 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması. Şekil 25. M6FD5 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması. 121 İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon başarısı, dizinlenen koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar Tablo 2’de verilmiştir. Tablo 2. İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon başarısı, dizinlenen koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar. İzolasyon Tespiti Amplifikasyon Başarısı M2-FD-1 + + Dizinlenen Koloni Sayısı 4 M2-FD-2 + + 5 M2-FD-3 + + 5 M2-FD-4 + + 4 M2-FD-5 - + 1 M2-FD-6 + + 3 M2-FD-7 + + 5 M2-FD-8 + + 4 M2-FD-9 + + 4 M2-FD-10 + + 5 M2-FD-11 + + 5 M2-FD-12 - - - Örnek Kod No M2-FD-13 + + 5 M2-FD-14 + + 5 M2-FD-15 + + 5 M2-FD-16 + + 5 Cambridge Referans Dizininden Farklılık 3 dizin: 16172C 1 dizin: 16172C + 16223T 3 dizin: 16256T 2 dizin: 16204C 2 dizin: 16193T 1 dizin: 16155G+ 16193T + 16213A 1 dizin: 16193T + 16245T 1 dizin: CRS 3 dizin: 16223T 1 dizin: 16209C 16227G + 16261T 1 dizin: 16256T 1 dizin: 16172C + 16256T 1 dizin: 16227G + 16256T 2 dizin: 16242T 1 dizin: 16172C + 16208T 1 dizin: 16155G + 16208T 1 dizin: 16208T 1 dizin: 16189C 1 dizin: 16204C 1 dizin: 16213A + 16236T 1 dizin: 16236T 2 dizin: 16193T 2 dizin: 16193T + 16245T 3 dizin: 16256T 1 dizin: 16256T + 16261T 1 dizin: 16172C 2 dizin: 16176T 1 dizin: 16162G + 16197T 1 dizin: 16162G + 16257T 1 dizin: 16162G 2 dizin: 16225T 1 dizin: 16183G + 16225T 1 dizin: 16225T + 16256T 1 dizin: 16223T 3 dizin: 16172C 1 dizin: 16172C + 16223T 1 dizin: 16172C + 16261T 2 dizin: 16205T + 16236T 1 dizin: 16205T 1 dizin: 16193T 1 dizin: 16256T 1 dizin: 16155G 2 dizin: 16204C 1 dizin: 16245T 1 dizin: CRS 122 M2-FD-17 + + 5 M2-FD-18 + + 3 M2-FD-19 + + 5 M2-FD-20 + + 4 M6-FD-1 + + 3 M6-FD-2 - - - M6-FD-3 + + 4 M6-FD-4 - - - M6-FD-5 + + 5 M6-FD-6 + + 4 M6-FD-7 - + 3 M6-FD-8 + + 5 M6-FD-9 - - - M6-FD-10 + + 5 M6-FD-11 - - - M6-FD-12 + + 4 M6-FD-13 + + 5 M6-FD-14 + + 5 M6-FD-15 + + 5 M6-FD-16 + + 4 M6-FD-17 + + 3 2 dizin: 16223T 1 dizin: 16223T + 16242T 2 dizin: 16172C 1 dizin: 16223T 1 dizin: 16176T + 16223T 1 dizin: 16176T 1 dizin: 16183G + 16204C + 16261T 1 dizin: 16183G + 16204C 2 dizin: 16183G 1 dizin: CRS 1 dizin: 16245A 1 dizin: 16155G 1 dizin: 16155G + 16242T 1 dizin: 16242T 2 dizin: 16162G 1 dizin: 16162G + 16245T 1 dizin: 16155G + 16213A 1 dizin: 16223T 1 dizin: 16256T 1 dizin: CRS 2 dizin: 16218T 1 dizin: 16172C 1 dizin: 16188T 1 dizin: 16244A 1 dizin: CRS 2 dizin: 16189C 1 dizin: 16189C + 16261T 1 dizin: 16173T 1 dizin: 16193T + 16227G 1 dizin: 16227G 3 dizin: 16172C 1 dizin: 16172C + 16205T 1 dizin: 16172C + 16242T 2 dizin: 16225T 2 dizin: 16162G 1 dizin: 16162G + 16225T 2 dizin: 16162G 1 dizin: 16162G + 16237T 1 dizin: 16162G + 16245T 2 dizin: 16189C 2 dizin: 16261T 1 dizin: 16189C + 16245T 2 dizin: 16223T 2 dizin: 16172C 1 dizin: 16172C + 16205T 1 dizin: 16208T 1 dizin: 16208T + 16256T 1 dizin: 16256T 1 dizin: 16236T 1 dizin CRS 2 dizin: 16172C 1 dizin: 16172C + 16155G 1 dizin: 16172C + 16256T 1 dizin: 16223T 1 dizin: 16189C 1 dizin: 16189C + 16261T 123 BÖLÜM 5 TARTIŞMA İskelet kalıntılarında moleküler genetik analizler, temelde aynı veya benzer teknikler içerse de, antropoloji ve adli bilimlerde zaman bakımından farklılıklar taşımaktadır. Örneğin; tarih öncesi toplumlara ait iskelet kalıntıları bin, iki bin veya üç bin yıllık iken; adli olgularda incelenen kemik veya diş örnekleri daha yakın tarihlidir. Bu sebeple biyoarkeolojik kalıntıların tanımlanmasında çok eski, eski, tarihi örnek gibi ifadeler karışabilir. Sivilich (2005), 1800’lü yılların ortalarından elde edilen kemiklerle yaptığı çalışmada, iki yüz yıllık örnekler için ‘tarihi’ DNA terimini kullanmayı tercih ettiğini belirtmiştir. Türkiye’de son on yıl içinde adli bilimlerde insan kemik veya diş örneklerinden DNA elde edilebilmekte ve birçok olgunun çözümünde kullanılmaktadır (Altunçul, 2001). Örneğin; Giresun’da bir annenin kaybolduğu olguda köyün yakınlarında bulunan iskelet kalıntılarının anneye ait olduğunun iddia edilmesi, ancak kızının bunu reddetmesi üzerine kemiklerden yapılan hem çekirdek DNA’sı hem de mtDNA analizleriyle kayıp kişinin iddia edilen anne olduğu belirlenmiştir (Altunçul et al., 2003). Ancak olguların her zaman başarıyla çözümlenemediği, dahil etme olasılığının yükseltilmesinin istendiği, farklı kurumlar tarafından farklı yöntemlerle tekrarlanmak zorunda kalındığı da bildirilmiştir (Ozcan et al., 2006, Kalfoglou et al., 2007). Türkiye’de tarih öncesi toplumlara ait iskelet kalıntılarından DNA analizi çalışmaları da başlatılmıştır. Van-Yoncatepe arkeolojik bölgesindeki kazılarla elde edilmiş iskelet kalıntılarında HLA-DQA1 geni tiplenmiştir (İşcan et al., 2007). Güral’ın (2007) 124 bildirdiğine göre; Kapadokya Aşıklı Höyük’te akdeniz anemisini araştırmak için insan iskeletlerinden DNA örnekleri alınmış, kontaminasyon sebebiyle sonuç elde edilememiş; Konya Çatalhöyük’te ise akrabalık ilişkilerini araştırmak için analizler yapılmış, ancak sonuç alınamamıştır. Burdur Ağlasun’daki Sagalassos’ta 1994–1997 kazılarında 24 iskeletin kemik ve diş örneklerinde mtDNA analizi yapılmış, akrabalık ilişkisi ve Avrupa ile filogenetik yakınlık araştırılmıştır. Hatay Amik ovası’ndaki Tell Kurdu kazılarında 14 bireyin cinsiyetinin yanında HVR1 analizi yapılmış, akrabalık bağları nedeniyle az sayıda haplotip tespit edildiği ifade edilmiştir (Mekel-Bobrov and Lahn, 2004). Çalışmada Demir Çağı’na ait Van-Yoncatepe bölgesindeki arkeolojik kazılarda iki farklı oda mezardan çıkarılmış kemiklerin ait olduğu bireylerin olası akrabalık ilişkilerini genetik analizlerle belirlemek ve bu arkeolojik toplumun sosyokültürel yapısına bir ışık tutmak amaçlandı. Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–750/700) arkeolojik kazı alanındaki mezar odasından 37 insan femur kemiği parçası, Adli Tıp Enstitüsü ve Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarları’nda mtDNA HVRI 16147–16294 baz çifti arası bölge açısından analiz edildi. Yoncatepe Materyali Van kentinin 9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı Köyü sınırları içinde yer alan Yoncatepe’de 1995 yılında "Doğu Anadolu Bölgesi'nde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin Araştırılması" amacıyla gerçekleştirilen yüzey araştırması sırasında arkeolojik kazı alanı tespit edilmiş, nekropolde bulunan altı mezar odasında farklı sayılarda iskelet kalıntılarına ulaşılmıştır (Belli, 1996). 125 Arkeolojik kazı çalışmalarında tespit edilen örneklerin, yapılabilecek olası moleküler genetik çalışmalar göz önünde bulundurularak toplanması ve saklanması oldukça önemlidir. Ancak birçok durumda çeşitli sebeplerle bu mümkün olamadığından, örnekler henüz toplanma aşamasında ya da toplandıktan sonra bir arada tutularak bilinçsizce kontamine edilmekte, kazı alanında doğrudan güneş ışınlarına maruz bırakılarak aşırı sıcakta kalmakta, ulaştırıldıkları inceleme birimlerinde doğru saklanamamaktadır. Ancak bazı çalışmalarda örneklerin derin dondurucularda saklanarak korunması veya moleküler genetik analizlerin kazıdan sonra hemen başlatılması gibi uygulamaların başarılı sonuçlar verdiği görülür. Schweitzer ve araştırıcılarının (2008) yaptığı çalışmada, kemikler kazı alanından uzaklaştırılmasını takiben yirmi dört saat içinde –20º C’ye konulmuştur. Bu saklama koşullarında DNA’nın korunduğu, başarılı analiz sonuçlarından anlaşılmaktadır (Hummel, 2003). Pruvost ve meslektaşları (2007) ise yeni kazılarak alınmış kemiklerle gerçekleştirdikleri çalışmada iki kat daha fazla özgün DNA elde ettiklerini belirtmişlerdir. Nielsen ve Thuesen (1998) de kazı alanında DNA izolasyonunu tamamladıklarında daha başarılı sonuçlar elde ettiklerini bildirmektedir. Yoncatepe kemik örnekleri bu bakımdan değerlendirilirse, 1995’te başlatılan kazılarla çıkarıldığı, daha sonra tümünün bir arada oda sıcaklığında tutulduğu belirtilmelidir. Bu durumun kontaminasyon ve DNA korunması açısından çalışmada olumsuz etkisi olduğu söylenebilir. Arkeolojik kazılarda görev alanlar, toplayacakları ve/veya saklayacakları örneklerde moleküler genetik analizler yapılma olasılığının farkında olmalıdır. Ayrıca arkeologlar kurdukları hipotezlerde bu analizlerin kendilerine daha net ve ayrıntılı veri sağlayacağı konusunda bilgi sahibi olmalı, bunu talep etme hakkını kullanmalıdır. Bir 126 çalışmada, 28. Uluslar arası Kazı, Araştırma ve Arkeometri Sempozyumu’na (29 Mayıs–2 Haziran 2006, Çanakkale) katılan yirmi dokuz kazı başkanı ve sorumlusuna anket uygulanmış; katılımcıların %86’sı kazılarında DNA analizi yapılmadığını, %4’ü yasaya aykırı olduğu için analiz yapılmasını istemediğini bildirmiştir. Anketi cevaplayanların %56’sı analizlerin nasıl yapıldığı konusunda bilgili olmadığını, %52’si ise DNA analizleri ve arkeolojide DNA’nın rolü ile ilgili yayınları takip etmediğini belirtmiştir. Ancak hepsi, arkeolojide DNA analizleri hakkında bilgi sahibi olmak istediğini de ifade etmiştir (Güral, 2007). İklim ve sıcaklığın, arkeolojik kemiklerin hem fiziksel hem de moleküler korunmasında etkili olduğu bilinir. Yoncatepe kazı alanından elde edilen kemikler bu açıdan değerlendirildiğinde; yüzeylerinde pürüz veya yapısal bozukluk bulunmamasının, kemiklerin iklim ve hava şartlarına karşı dayanıklı olduğunu gösterdiği ifade edilmektedir (Mergen, 2006). Gerek aynı materyal ile daha önce yapılan araştırmalar (İşcan et al., 2007), gerekse bu çalışma, Van ikliminin kemiklerdeki DNA korunmasında da olumlu etkileri olduğunu düşündürmektedir. Bölgede görülen karasal iklim, kışların soğuk ve kar yağışlı, yazların ise sıcak ve kurak geçmesine sebep olur. Yıllık ortalama sıcaklık ise, Devlet Meteoroloji İşleri Genel Müdürlüğü verilerine göre 8–10º C arasındadır. DNA’nın soğuk ve kuru ortam koşullarında daha iyi saklandığı çeşitli araştırmacılar tarafından da belirtilmiştir. Höss ve meslektaşları (1996), soğuk ortamlardan veya buzdan toplanan örneklerde DNA hasarının az olduğu; Wayne ve meslektaşları (1999), DNA’nın soğuk ve kuru ortam koşullarında en iyi şekilde korunduğunu, biyokimyasal çalışmalarla bu sürenin 100.000 yıldan fazla olmadığını belirtmişlerdir. Ricaut ve meslektaşlarına (2005) göre, soğuk ve kurak iklim şartlarında DNA daha iyi saklanmaktadır. Bollongino ve 127 meslektaşları (2008), tarih öncesine ait sığır kemiklerinden mtDNA analizi çalışmalarında; Türkiye’den de örnekler incelemişlerdir. Kendi sınıflandırmalarıyla, Yakın Doğu grubu içinde Çatalhöyük (Konya, Çumra), Çayönü (Diyarbakır, Ergani), Fikirtepe (İstanbul, Kadıköy) ve Mezraa-Teleilat (Şanlıurfa, Birecik); Güney Doğu Avrupa grubu içinde ise Bulgaristan, Macaristan, Romanya, Slovenya ve Slovakya ile birlikte Türkiye’den Aşağıpınar (Kırklareli) ve Hocaçeşme (Edirne, Enez) alanlarından elde edilen materyal kullanmışlardır. Araştırmacılar, bu bölgelerden aldıkları toplam yirmi üç örnekten sadece dördünde tekrarlanabilir DNA sonuçları elde ettiklerini, çalışmada incelenen 291 örnekte bu oranın %46 olduğunu bildirmişlerdir. Veriler, DNA korunmasının Orta Avrupa’dan (%67) Yakın Doğu’ya (%7) doğru düştüğünü, yüksek sıcaklık ve nemin, çalışmaya dahil edilen Yakın Doğu grubundaki örneklerde daha hızlı diyageneze sebep olduğunu göstermektedir. Bollongino ve meslektaşları (2008), bu çalışmalarında soğuk, kuru, karanlık, anaerob ve biraz alkali ortamlarda en iyi DNA korunmasının sağlandığını ifade etmişlerdir. İklim ve sıcaklık dışında, kemiklerin gömülü bulunduğu alanın denizden yüksekliğinin DNA eldesinde önemli olduğu, yüksek alanlarda bulunan kemiklerde, DNA’nın daha iyi korunduğu bildirilmiştir (Smith et al., 2001). Yoncatepe, 2.051 metre yükselti ile şimdiye kadar Türkiye’nin en yüksek rakımlı kazı alanıdır (Belli, 1996). Çalışma bulgularından anlaşılacağı üzere, Yoncatepe kemiklerindeki DNA korunmasında bu faktörün de olumlu etkisi olduğu düşünülmektedir. Kemiklerin Hazırlaması Kazı sırasında DNA analizi için örnek almak, kazı stratejisinin bir parçası olarak 128 görülmelidir (Nielsen and Thuesen, 1998). Örnekler, yapılacak her türlü inceleme için kazı sonrasında temizlenmeli, üzerindeki topraktan arındırılmalıdır. İskelet örneklerini incelemeye hazırlamak için su veya kimyasal maddelerle yıkama gibi birçok yöntem kullanılmaktadır (Rennick et al., 2005). Ancak bunlar kemiğe zarar verebilir, özellikle moleküler çalışmalarda kontaminasyona neden olabilir. Bu sebeple antropolog ve patologlar hangi kemik hazırlama tekniklerinin genetik analizleri olumsuz etkileyebileceği konusunda bilgi sahibi olmalıdır. Yoncatepe iskelet kalıntıları, kazı sonrasında muhafaza edildikleri İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Osteoloji Laboratuvarı’nda antropologlar ve arkeologlar tarafından diş fırçası ve yumuşak fırça ile yüzeylerindeki topraktan temizlenerek antropometrik ölçümlere hazırlanmıştır. Bu aşamada herhangi bir yıkama yapılmamıştır (Mergen, 2006). Böylece örneklerde var olan DNA’nın daha fazla kontamine olmasının önlendiği, moleküler genetik çalışmalara katkı sağlandığı düşünülmektedir. Çalışmada DNA analizi için Yoncatepe nekropolünün iki oda mezarından (M2 ve M6) elde edilen ve çeşitli sebeplerle ölçüm yapılamayan femur örnekleri seçilmiştir. Yaş ve boy tahmini ile cinsiyet tayini için yapılan antropometrik ölçümlerde, her kemik tek bir kişi olarak ele alınmıştır. Çünkü oda mezarlarda kemikler karışık halde bulunduğu için aynı bireye ait hem üst ve alt ekstremite hem de sağ ve sol kemikleri bulmak, dolayısıyla her bireyin tam iskeletini oluşturmak mümkün olmamıştır. Bununla birlikte bazı kemik ölçümlerinde sağ ve sol kemiğin aynı milimetre değerleri vermesine bağlı olarak tek bir kişiye ait olduğu da söylenebilmiştir (Mergen, 2006). Farklı kemiklerin aynı DNA profilini güvenilirlikle göstermesi, aynı kişiye ait olduğunu belirleyecektir. Bu güvenilirlik, çok sayıda örnekte her türlü analizin yapılması ile sağlanabilir. Eldeki iskelet kalıntılarından femurların seçilmesinin nedeni; DNA eldesinde daha 129 fazla başarı sağladığının ve sıkı dokudan örnek alındığı durumda kontaminasyonun en aza indirgendiğinin bilinmesidir. Çok sayıda araştırmacı, femur ile çalışmıştır (Tuross, 1994; Cipollaro et al., 1998; Rennick et al., 2005; Gilbert et al., 2005; Opel et al., 2006; Fondevilla et al., 2008). Nelson ve Melton (2007), yüz onaltı iskelet örneğinde femur, tibia, fibula, humerus, pelvis gibi farklı kemiklerden DNA profili elde etmede en fazla başarının (%92) femurda sağlandığı bildirmiştir. Çalışmada kemiklerin kompakt kısımdan parça alınarak analize başlanmıştır. Sıkı dokuda daha fazla kemik hücresi olduğundan, üstelik bu kısım süngerimsi doku gibi kontaminasyona açık olmadığından, DNA analizinde başarı sağlar (Yang et al., 1998; von Wurmb-Schwark et al., 2003). Kemik parçalarının hazırlanması sırasında, farklı kalınlıklar ve sertlikler gözlenmiştir. Kimi kemikler kolayca el ile kırılıp ufalanırken, kimilerinin çok sert olduğu ve zor kesilebildiği gözlenmiştir. Hedges’e (2002) göre, kemiklerin sertlik derecesi DNA eldesiyle ilgilidir. Çalışmanın sonuçları, bunu doğrulamaktadır. Kolay kırılabilen kemiklerden DNA eldesinde sorunlar görülmüş, daha sert örneklerde ise başarıyla DNA izole edilebilmiştir. DNA izolasyonundan önce, örneklerin yüzey kontaminasyonunun giderilerek (dekontaminasyon), mekanik veya kimyasal yollarla parçalanması gerekir. Kemik örneklerinin yüzey kontaminasyonunun giderilmesi amacıyla, dış kısmın kazınması en sık uygulanan yöntemdir. Bunun dışında kontaminant DNA’nın kimyasal yıkımı, yüzeyin UV ışığına maruz bırakılması veya yöntemlerin kombinasyonu da dekontaminasyon amacıyla kullanılmaktadır. Watt (2005), yüz altı aDNA yayınını incelediği araştırmasında dekontaminasyon için %18 oranında fiziksel yöntem ve hipokloritin kullanıldığını, yine aynı oranda (%18) fiziksel yöntem ve UV ile dekontaminasyon yapıldığını, %16 oranında 130 da üçünün birlikte (fiziksel yöntem, hipoklorit ve UV) uygulandığını tespit etmiştir. Kemp ve Smith’e (2005) göre, analiz edilecek örnek, dış kısmının kazınmasından sonra sodyum hipokloritte tutulur ve UV’ye bırakılır. Opel ve meslektaşları (2006), kemik örneklerini önce zımparalamış, ardından %5 çamaşır suyu ile fırçalamış, hemen distile su ve %95 etanol ile yıkayarak analize hazırlamışlardır. Kemik veya diş örneğini %6 sodyum hipokloritte 15 dakika bekletmek yüzey kontaminasyonunu gidermede yeterli, pratik ve az maliyetlidir (Kemp and Smith, 2005; Dissing et al., 2008). Ancak Rennick ve meslektaşlarının (2005) araştırmasına göre çamaşır suyu ile temizlenen kemik örneklerinden DNA eldesinde, su ve deterjan/karbonat ile temizlenmiş olanlara göre istatistiksel olarak önemli bir azalma görülmüştür. Gilbert ve meslektaşları (2005), örnekleri klorite batırmanın bulaşmış DNA’yı degrade etmediğini belirtmişlerdir. Kemik örneklerinin yıkanmadığı, ancak yeni kazılarak alındığı bir çalışmada ise yıkanmışlara göre iki kat daha fazla özgün DNA elde edilmiştir (Pruvost et al., 2007). Bu çalışmada kemik örneklerinin dış yüzeyi kazındıktan sonra, hipoklorit ile yıkama veya silme uygulanmamış, örneklerin her iki yüzeyi doğrudan 5’er dakika UV’de tutulmuştur. İskelet örnekleri, DNA izolasyonundan önce kimyasalların yüzey alanıyla yeterince etki etmesini sağlamak için, fiziksel olarak parçalanmalıdır. Kemikler, bir öğütücü, değirmen, havan veya çekiç yardımıyla toz haline getirilir. Örnekleri toz haline getirme sırasında modern DNA ile kontaminasyonun yaygın olduğu bilinir (O’Rourke et al., 2000). Bu sebeple çalışmada yüzey kontaminasyonu giderilip UV’ye maruz bırakılmış kemik örnekleri; ayrı plastik poşetler içinde, ikinci bir poşetle birlikte folyoya sarılı halde çekiç ile kırılarak toz haline getirilmiş, paketlerin her biri ayrı folyo kağıdı kaplanmış alanda ayrı eldiven ve maskelerle dikkatle açılarak, UV’de bırakılmış tüpler içine alınmıştır. 131 DNA İzolasyon Yöntemi Çalışmada kemikten DNA izolasyonunda birçok yöntem var olmasına rağmen, daha saf, temiz ve yoğun DNA verdiği için silika temelli purifikasyon kiti kullanılmıştır. Yang ve meslektaşları (1998), fenol-kloroform ekstraksiyonu ve bir çeşit silika temelli saflaştırma kitinin farklı kombinasyonlarının karşılaştırılması amacıyla gerçekleştirdikleri çalışmada; proteinaz K parçalamasından sonra tek başına silika kolon purifikasyonu kullanımının, fenol-kloroform ekstraksiyonuna göre daha iyi sonuçlar verdiği göstermiştir. Rohland ve Hofreiter (2007), farklı izolasyon yöntemlerini karşılaştırmalı olarak incelemiş, otuz iki örnekten yirmi sekizinde silika yöntemi ile başarılı sonuç aldığını belirtmiştir. Yoncatepe kemiklerinin DNA izolasyonunda da silika temelli izolasyon yöntemi uygulanmıştır. Çok sayıda araştırmacı silika jel temelli DNA izolasyon kiti ile EDTA dekalsifikasyonunu birlikte uygulamakta ve başarı sağlamaktadır (Cano and Poinar, 1993; Tuross, 1994; Zierdt et al., 1996; Krings et al., 1997; Yang et al., 1998; Bouwman et al., 2006). Bu çalışmada da silika temelli izolasyon öncesinde, EDTA dekalsifikasyonu yapılmıştır. Kalsifiye bir doku olan kemiklerde, daha iyi sonuç almak için kalsiyumun uzaklaştırılması gerektiği tartışmalıdır. Bazı araştırıcılar dekalsifikasyonu gereksiz bulmakta (Fisher, 1993), bazıları ise bu aşama tamamlanmadığı takdirde sonuç alamadığını belirtmektedir (Sivilich, 2005). Ancak sıklıkla dekalsifikasyon uygulanmakta (Hummel and Herrmann, 1991; Tuross, 1994; O’Rourke et al., 1996; Imaizumi et al., 2002) ve hem nükleer hem de mtDNA tiplemesinde belirgin bir başarı sağlandığı ifade edilmektedir (Imaizumi et al., 2005). EDTA, Mg+2 ve Ca+2 gibi bivalent katyonları kelatlaştırarak DNAz’ları inaktifleştirir. Loreille ve meslektaşları (2007) EDTA yıkamalarında DNA 132 kaybı olduğu tartışmalarına bunun söz konusu olmadığı cevabını vermekte ve her zaman güvenle kullanılabileceğini belirtmektedir. Yoncatepe kemikleri de dekalsifikasyona tabi tutulmuş, izolasyon çözeltisi EDTA ile hazırlanarak kullanılmıştır. DNA izolasyonunda silika kolonlardan geçirme aşamasına kadar izolatların renginde farklılıklar tespit edilmiştir. Bu renk farklılığının topraktan geldiği bilinmektedir (Imaizumi et al., 2005). İzolatlardaki renklenme ile her zaman değil ama sıklıkla PCR inhibitörlerinin varlığı belirlenebilir, renk genellikle hafif sarımsı veya kırmızımsı kahverengi olur (Kemp et al., 2006). Modern DNA ile kontaminasyona en açık olan, örnek hazırlama ve DNA izolasyonu aşamalarında; kontaminasyon olmadığından emin olunması, alınan veya alınacak sonuçların güvenilir olması gerekir. Bu sebeple izolasyon sırasında tüm işlemlerden geçirilen, ancak DNA içermeyen kontrol örnekler kullanılmıştır. İzolatların agaroz jel elektroforezinden sonra görüntülenmesinde, bu kontrollerde bant bulunmaması izolasyon sırasında herhangi bir kontaminasyonun olmadığını göstermiştir. Analiz sırasında örnek içermeyen kontrollerin kullanılması, aDNA'nın güvenilirliğinin veya gerçek/özgün olma özelliğinin belirlenmesi için önerilen kriterlerden biridir (Pääbo et al., 2004). İncelenen otuz yedi izolat, agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildiğinde bazı örneklerde bant görülmemesi, izolasyonun başarısız olduğunu veya DNA’nın olmadığını düşündürmektedir. Ancak bu örneklerden ikisi (M2-FD5 ve M6-FD7 izolatları) bant vermemiş olmasına rağmen, amplifikasyonda sonuç vermiştir. Bu durum, örneklerde var olan DNA’nın az miktarda olması sebebiyle kimi zaman agaroz jel ile tespit edilemeyeceğini göstermektedir (Sambrook and Russell, 2001). 133 Amplifikasyonda Karşılaşılan Sorunlar Geçmişe ait DNA çalışmalarında başlangıçtaki örnek miktarının tespit edilmesi çoğaltma stratejilerinin belirlenmesi adına yararlı olabilir (Handt et al., 1996; Swango et al., 2006). Ancak Chilvers ve meslektaşları (2008), başlangıçtaki örnek miktarını, özgün aDNA olduğunun garantisini vermediği için Real-Time PCR ile ölçmeyi tercih etmediklerini belirtmişlerdir. Bu çalışmada da başlangıç miktarının tespiti yapılmadan araştırmalar başlatılmıştır. Ancak izolatların agaroz jel elektroforezinde yürütülmesi, bazı istisnalar hariç, genel bir fikir vermiştir. Yüksek polimorfizminden dolayı mtDNA’nın ileri değişken bölgesi (HVR), aDNA çalışmaları için uygundur (Hummel, 2003). HVRI (16024–16365) 341 baz çifti, HVRII (73–340) ise 267 baz çifti uzunluğundadır ve bu iki uzun bölgenin çoğaltılması, aDNA çalışmalarında bir veya iki amplifikasyonla sağlanamaz. Ayrıca elde edilecek sonuçların birbiriyle karşılaştırılarak doğrulanabilir olması gerekir. Bu iki önemli sebeple, belirlenen bölge içinde üst üste çakışan parçalar oluşturulur (Krings et al., 1997; Imaizumi et al., 2005; Bouwman et al., 2006, 2007, 2008; Dissing et al., 2007; Gao et al., 2007). Bu parçalardan biri de HVRI içinde 147 baz çiftlik (16147–16294) kısımdır. Bu bölge, daha önce diğer araştırmacılar (Bouwman et al., 2006, 2008; Chilvers et al., 2008) tarafından da çalışılmış bir kısım olduğundan güvenle tercih edilmiştir (Ek 1). Amplifikasyon ürünleri agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildiğinde incelenen 37 örneğin tümünde bu bölgenin başarılı amplifikasyonunun sağlanamadığı görülür. DNA degradasyonundan dolayı meydana gelen kısa parçaların, çapraz bağların oluşturduğu Maillard ürünlerinin veya diğer inhibitörlerin PCR’ı engellemiş olması muhtemeldir. Pääbo (1989) 140 baz çiftinden daha uzun parçalarda amplifikasyonun başarısız olduğunu; 134 O’Rourke ve meslektaşları (2000) ise, eski DNA'nın eldesi ve amplifikasyonunun, 300– 500 baz çiftinden az uzunluktaki örneklerde mümkün olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmada başarıyla çoğaldığı gözlenen otuz iki örnekteki DNA’nın kontaminasyon değil, özgün DNA olduğunun kesin olarak belirlenmesi bu noktada mümkün değildir. Devam eden aşamalarda, özellikle klonlama sonucunda elde edilen kolonilerin dizinlenmesi, bu durumun yorumlanmasında yardımcı olmuştur. Amplifikasyon ürünlerinin elektroforezi sonunda UV ile görüntülenen agaroz jelde mavi floresans görülmüştür. Birçok araştırmacı aynı gözlemde bulunmuş, bunun nedeninin nükleik asitleri bağlayan Maillard ürünleri ve humik asit, fulvik asit gibi diğer bileşikler olduğunu belirtmiştir (Pääbo, 1989; Tuross, 1994; Hanni et al., 1995; Kalmar et al., 2000; Kolman and Tuross, 2000). Çalışmada amplifikasyon ürünlerinin elektroforezinde her zaman primer-dimerlerin oluştuğu gözlenmiştir. Geçmişe ait DNA çalışmalarında, hedef örneğin miktarı düşük olduğu zaman, özellikle yüksek primer konsantrasyonlarında çoğaltma sırasında primerler hedef dışı moleküllere yanlış bağlanabilir ve elektroforezde aşırı primer-dimer meydana gelir. Birçok araştırmada primer-dimer varlığı bildirilmiştir (Gerstenberger et al., 1999; Ariffin et al., 2007; Dissing et al., 2007; Rohland and Hofreiter, 2007). Bunun yanında PCR sırasında kontaminasyonu gösteren negatif kontrollerde bantlarla karşılaşıldığında, sorunun kaynağını tespit amacıyla yürütülen PCR malzemelerinde primerlerin kontamine olduğu belirlenmiştir. Kolman ve Tuross’un (2000) belirttiğine göre, ticari olarak satın alınan primerler sıklıkla kontamine bulunur. Araştırmacılar bu durumda rutin olarak 254nm’de 20 dakika radyasyonla primerlerin dekontamine edilebileceğini, bu uygulamanın primerlerin kullanımını bozmayacağını belirtmektedir. Çalışmada, primer 135 kontaminasyonunu gidermede bu yol tercih edilmemiş, onun yerine PCR malzemelerinden Taq DNA polimeraz ve örnek DNA dışında hazırlanan karışım, her türlü kontaminasyonu önlemek için kısa süre UV’ye tabi tutulmuş ve başarılı sonuçlar alınmıştır. Bu stratejinin dNTP’ler UV’yi absorbe ettiği için etkisiz olabileceği de bildirilmektedir (Leonard et al., 2007). Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun tespiti için birden fazla sayıda PCR kontrolü kullanılmıştır. Bu yöntem, aDNA'nın güvenilirliği veya gerçek/özgün olma özelliğinin belirlenmesi için önerilen bir kriterdir (Pääbo et al., 2004). Çalışmada kontaminasyon olasılığından dolayı pozitif kontrol kullanılmamıştır (Willerslev and Cooper, 2005). Klonlamanın faydası Geçmişe ait DNA örneklerinde çoğaltılan DNA parçalarını doğrudan dizinleyen araştırmacılar olsa da (Anzai et al., 1999; Ariffin et al., 2007), kontaminasyon sebebiyle bunun güvenilir ve geçerli bir sonuç veremeyeceği, dizinleme öncesi klonlama yapmanın tek uygun çözüm olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından ifade edilmiştir (Hummel, 2003; Hebsgaards et al., 2005; Ho et al., 2007). Yoncatepe kemiklerinin DNA analizinde amplifikasyon sonunda jelden izole edilerek saflaştırılan ürünlerden bazıları, bunu test etmek için önce doğrudan dizinlenmiş, ancak muhtemelen çok sayıda farklı DNA olması sebebiyle güvenilir ve geçerli bir dizin elde edilememiştir. Klonlama yapılarak doğru kolonilerin seçilip saflaştırıldıktan sonra dizinlenmesi ise, net bir dizin eldesi sağlamıştır. Doğru ve güvenilir sonuçlar için klonlamanın gerekli olduğu anlaşılmıştır. Çalışmada kullanılan mavi-beyaz tarama yöntemi, doğru klonlamanın olup 136 olmadığını belirlemede kolaylık sağlamıştır. Yöntem, klonlanmış PCR ürünlerini arttırmada bir ön tarama metodudur ve aDNA çalışmalarında sıklıkla tercih edilmektedir (Reese et al., 1996; Lutz et al., 1999; Bouwman et al., 2006; Caramelli et al., 2007; Dissing et al., 2007). Klonlama sonrası çoğaltma Klonlanmadan sonra meydana gelen beyaz renkli kolonilerin seçilerek PCR ile çoğaltılması, yanlış pozitif klonların dizinlenmesini önler. Ayrıca kolonilerin PCR’ı istenen ürünün dizinleme için yeterli miktarda olmasını sağlar (Capelli and Tschentscher, 2005). Çalışmada her örnek için elde edilen kolonilerden dizinleme için beş adet seçilmiştir. Dizinleme için uygun koloni sayısı konusunda araştırmacılar farklı fikirler öne sürmektedir. Bower ve meslektaşları (2005), eski örnekte %70 var olan dizini %95’in üzerinde güvenilirlikle belirlemek için en az on iki olmak üzere, ortalama yirmi, pratik açıdan en fazla otuz koloni analiz edilmesi gerektiğini belirtmiştir. Römpler ve meslektaşları (2006) en az üç klonun dizinlenmesi gerektiğini bildirmiştir. Millar ve meslektaşları (2008), binomial dağılım kullanarak ve %99 kesinlik sınırı hesaplanarak, genomun en az sekiz kere dizinlenmesi gerektiğini savunmaktadır. Koloni dizinlerinin birbiriyle kıyaslanması ve güvenilirlik aralığının belirlenmesi için web temelli bir program mevcuttur: ‘Consensus Confidence Program’ (www.mcdonald.cam.ac.uk). Araştırmacılar elde ettikleri en az on dizini, burada analiz ederek örneklerinin güvenilirlik aralığını değerlendirebilir veya kaç koloniyi daha dizinlemesi gerektiğini belirleyebilir. Program, dizinlerin özgünlüğü hakkında bir bilgi vermemekte, PCR sonrasında en fazla çoğalan dizinle ilgili veri sağlamaktadır (Bower et al., 2005). 137 Klonlamadan sonra elde edilen ürünlerin çoğaltılması için hot-start PCR yapılmıştır. Böylece hem primer-dimer oluşumu azaltılır, hem de primerlerin ve/veya enzimlerin ilk döngüde denatürasyon sıcaklığına ulaşmasından önce DNA örneğine bağlanması engellenir (Chou et al., 1992). PCR döngülerinde denatürasyon ve son uzama aşamaları 10’ar dakika tutulmuştur. Pääbo’ya (1989) göre, denatürasyon süresini (5–7 dakika) ve son uzama süresini (> 1 dakika) arttırmak elde edilen ürün miktarını ve kesinliğini arttırabilir. Dizin bulgularının genel değerlendirmesi Degrade yapısından dolayı aDNA’da değişmiş bazların varlığı, PCR ürünleri klonlandığında ve birçok klon dizisi karşılaştırıldığında aralarında çok sayıdaki farklılığın, modern DNA amplifiye edildiğinde görülenden çok daha fazla olması ile belirlenir (Pääbo et al., 2004). Çalışmada her örnek için hazırlanan klonlardan elde edilen dizinler birbiriyle ve referans dizin ile karşılaştırıldığında, bazı bazların değiştiği görülmüştür. Bu yanlış kodlama lezyonları (‘miscoding lesions’), bazların türevlerine degradasyonu sonucu ortaya çıkar (Axelsson et al., 2008). DNA’daki sübstitüsyon mutasyonları iki tiptir: Transizyonlar, iki halka pürinin (A G) veya tek halka pirimidinlerin (C T) yer değiştirmesidir. Benzer şekilde bazlar birbirinin yerini alır. Transversiyonlar ise, pürinlerin pirimidin bazlarına (C A T, A G, T G, C) değişikliğidir, bu da halkanın farklılaşmasına sebep olur. Transizyonların transversiyonlardan daha sık görülmesi beklenir. Çünkü transizyonların amino asit sübstitüsyonu ile sonuçlanması muhtemel olmadığından, dönüşümün devam etmesi söz konusudur ve sıklıkla toplumlarda tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) olarak 138 transversiyonlardan daha fazla görülür (Comas et al., 1996, Mergen et al., 2004). Bunu doğrulayacak şekilde, bu çalışmadaki dizinlerde de gözlenen transizyonlar daha fazladır. Hatta en fazla C T ve G A değişimi görülmüş, A G ve T C dönüşümüne ise daha az rastlanmıştır. Bunun sebebi, C’nin U ve T’ye hidrolitik deaminasyonunun daha yüksek oranda olmasıdır (Lindahl, 1993). G’nin A’ya değişimi ise, Taq DNA polimerazla birleşen sitozin kalıntılarına sebep olan hipoksantini üreten adenin kalıntılarının deaminasyonu ile meydana gelir (Gilbert et al., 2003). Gilbert ve meslektaşları (2003, 2005) klonlarda çok sayıda C-T ve G-A değişiminin gözlendiğini bildirmiştir. aDNA’daki bu tip hatalı kodlama lezyonları, dizinlerin doğru belirlenmesini karmaşıklaştırır. Bu olayı ortadan kaldırmak için, eski DNA örneğindeki hasarların sebep olduğu yanlış birleşimleri, herhangi bir PCR’da oluşan Taq DNA polimeraz hatalarından ayırt etmek gereklidir. Bunu yapmanın bir yolu, az sayıda örnek molekül içeren DNA izolatlarından çok sayıda amplifikasyon yapmak ve PCR ürünlerini klonlamaktır. Klonlardan elde edilen DNA dizinlerinin karşılaştırılması, aynı örnek preparatında bir amplifikasyonda meydana gelip diğerinde olmayan nükleotid farklılıklarını ortaya çıkarır (Pääbo et al., 2004). Mutasyon bulgularının değerlendirmesi Her örnek için dizinlenen 3–5 koloni, birbiriyle ve Cambridge referans diziniyle karşılaştırılmış, kontaminasyon veya DNA hasarı hakkında bilgi edinilmiştir. M2-FD3 için dizinlenen beş koloniden dördünde 16193T görülmesi, bunun muhtemelen kontaminasyon değil, örneğin taşıdığı bir mutasyon olabileceğini; diğer kolonilerde tek başına görülen 16155G, 16213A ve 16245T bulguları, DNA hasarını göstermektedir. M2-FD7 örneğinin 139 üç dizininde 16208T, diğer iki dizininde 16242T olması, belirgin bir kontaminasyonu ifade etmekte, bununla beraber 16208T içeren iki örnekte 16155G veya 16172C bulunması DNA hasarını yansıtmaktadır. Ayrıca 16242T taşıyan dizinlerde herhangi bir DNA hasarı görülmemesi, bunun modern DNA kontaminasyonu olduğu olasılığını arttırmaktadır. M6FD5 örneğinin dizinlenen beş kolonisinde de farklı değişimlerin (16172C, 16188T, 16218T, 16244A) görülmesi, kontaminasyon veya hasar hakkında bilgi vermemekte; ancak bir dizinin Cambridge referans dizini ile tamamen aynı olması, kontaminasyonu düşündürmektedir. İncelenen iki mezardan M2’de 1, 6, 9, 14 ve M6’da 1, 8, 12, 16 için dizinlenen tüm klonlarda aynı baz değişiminin (sırasıyla 16172C, 16256T, 16193T, 16172C, 16162G, 16172C, 16162G ve 16172C) görülmesi, bunun kontaminasyon olmayabileceğini, dolayısıyla mutasyon olma olasılığının yüksek olduğunu gösterir. Ancak bu örnekler için dizinler incelenirse, hasarlı bölgelerin var olduğu da anlaşılır. Mezar M2’de 2, 4, 7, 10, 11, 13, 15, 17, 19 ve M6’da 6, 10, 13, 14 numaralı örneklerde belirli baz değişiklikleri, her biri için dizinlenen kolonilerinin yarısından çoğunda (dört dizinden üçünde veya beş dizinden dördünde) görülürken, az bir kısmında (dört dizinden birinde veya beş dizinden ikisinde) yer almamakta veya farklı değişimler tespit edilmektedir. Bu durum, kontaminasyonun bir kanıtıdır. Çoğu dizinde görülen baz değişiklikleri ise, olası bir mutasyonu ifade edebilir. Ancak yine de daha fazla sayıda koloninin dizinlenmesi durumu netlikle açığa çıkaracaktır. Örneğin M2-FD2’de beş dizinden üçünde 16256T görülmüş, diğer iki dizinde ise sadece 16204C tespit edilmiştir ki; bu da belirgin bir kontaminasyonun varlığına işaret etmektedir. Örneğe ait gerçek DNA hakkında bilgi sahibi olmak için, daha fazla koloninin dizinlenmesi gerekir. Böylece hangi 140 mutasyonun örneğe ait olduğu, hangisinin kontaminant DNA olduğu anlaşılabilir. Oda mezarlardan M2’de 8, 16, 18, 20’de ve M6’da 3, 5, 7, 10, 15, 17’de aynı örneğe ait dizinlerde farklı bazlarda değişiklik görüldüğünden, örneklere ait olduğu düşünülebilecek mutasyonu belirlemek veya kontaminantı tespit edebilmek mümkün değildir. Klonlama sonrası daha fazla sayıda dizinleme yapılması bu örnekler için de faydalıdır. Yoncatepe kazı alanındaki iki farklı mezardan elde edilen kemiklerin 147 baz çiftlik mtDNA analizi, şu noktaları açığa çıkarmıştır: M2 mezarına ait 20 kemik örneğinden M2-FD1 ve M2-FD14’ün 16172C mutasyonunu taşıması sebebiyle aynı anne soyundan kişilere ait olabileceği söylenebilir. İncelenen kemik parçalarının önce aynı bireye ait olma ihtimali düşünülmüş, antropolojik incelemelere başvurulmuştur. Morfolojik özellikler (yüzey rengi, fiziksel hasar-pürüz durumu) göz önüne alındığında, iki kemik örneğinin aynı olamayacağı belirlenmiştir, çünkü M2-FD14’ün üzerinde var olan erozyon M2-FD1’de görülmemektedir. Hem M2-FD3 hem de M2-FD9, 16193T mutasyonu göstermektedir. Bu örneklerin ait olduğu bireylerin anne tarafından akraba olması mümkün olabileceği gibi, alınan örnekler aynı bireylere de ait olabilir. Morfolojik özellikler (yüzey rengi, fiziksel hasarpürüz durumu) bu noktada kesin ve yeterli bir bilgi sağlayamamıştır. M2-FD2, M2-FD6 ve M2-FD10 ise, 16256T mutasyonunu taşımaktadır. Bu örneklerden M2-FD10 erken çocukluk döneminde bir bireye aittir, bu sebeple M2-FD2 veya M2-FD6 ile aynı iskelete ait olmadığı kesindir. Her ne kadar M2-FD2 ve M2-FD6 anne tarafından akraba olabilirse de, aynı bireylere de ait olabilir. Morfolojik özellikler, bu iki kemik için yeterli bir ayırım yapmayı sağlamamıştır. Ancak M2-FD10, M2-FD2 141 ve/veya M2-FD6 ile aynı anne soyundan gelebilir. M2-FD2 ve M2-FD6’nın aynı kişiye ait olması durumunda, bu profil ile M2-FD10 arasında muhtemel bir anne-çocuk, teyze-çocuk veya dayı-çocuk ilişkisi mevcuttur. M2-FD2 ve M2-FD6 anne tarafından ilişkili iki farklı (yetişkin) birey ise, bu üç profil anne-teyze-çocuk; anne-dayı-çocuk veya teyze-dayı-çocuk olabilir. M6’dan alınmış 17 kemik örneğinden M6-FD1 ve M6-FD12, 16162G; M6-FD6, M6-FD13 ve M6-FD17, 16189C; M6FD8 ve M6-FD16 ise 16172C mutasyonlarına sahiptir. Farklı örneklerin aynı mtDNA mutasyonlarını taşıması, anne tarafından akraba olduklarını gösterir. Ancak bu çalışmadaki materyal kapsamında kesin bir veri değildir, çünkü incelenen kemik parçaları aynı bireylere ait olabilir. M6-FD1 ve M6-FD12, yüzey rengi, hasarsız-pürüzsüz dış görünüşü, örneğin korunma kalitesi ve iyi durumda olması açısından benzerdir. Bu bilgiler, iki kemik örneğinin aynı olabilme ihtimalini kuvvetlendirmektedir. Ancak tam bir uyuşma da söz konusu değildir. M6-FD6, M6-FD13 ve M6-FD17, farklı distal uçlara sahip olup, 6 ve 13’te bulunmayan kondil, 17’de mevcuttur. Bu veriler söz konusu üç örneğin aynı olmadığını gösterdiğinden, aynı anne soyundan bireyler olma olasılığı artmaktadır. M6-FD8 ve M6-FD16 ise, iki sağ femur olup aynı bireye ait olamayacağı kesinleşmektedir ki, bu da iki örneğin aynı anne soyundan olabileceğini gösterir. M2 ve M6 mezarlarından elde edilen kemiklerin mtDNA HVRI 16147–16294 bölgesi açısından analiz sonuçları birbiriyle kıyaslandığında, 16172C mutasyonu M2’den 1 ve 14’te, M6’dan 8 ve 16’da görülmüştür. İki farklı mezardaki bu bireyler arasında anne soyundan bir akrabalık bağı var olabilir. Tüm bu muhtemel sonuçlar, Yoncatepe arkeologlarının hipotezlerini büyük 142 olasılıkla desteklemektedir. Yoncatepe toplumunun ölü gömme geleneği olarak, bir mezar dolduktan sonra, ölülerin diğer mezara konulmaya başlanması; bir ailenin farklı zamanlarda ölen bireylerinin farklı mezarlarda olması anlamına gelir. Benzer şekilde aynı veya birbirine yakın zamanlarda ölen aile bireyleri ise aynı mezarda yer almış olabilir. Mutasyonların haplogrup düzeyinde değerlendirmesi Mitokondriyal DNA haplogrup çalışmaları, farklı sayıda canlı bireyden elde edilen ağız içi epitel, kan veya saç ile gerçekleştirildiği için, kontaminasyon veya degradasyon gibi örnekle ilgili sorunlar indirgenmiş olur ve var olan mutasyonlar kolaylıkla tespit edilerek grup belirlemesi yapılabilir. Ancak biyoarkeolojik materyal kullanıldığında, kontaminasyon (özellikle modern DNA kontaminasyonu) olasılığı yüksektir, ayrıca degradasyondan dolayı mutasyonların belirlenmesinde zorluklar ortaya çıkar. Bu sebeple tarih öncesi örneklerde haplogrup analizlerinin güvenilirlikle yapılması zordur ve teknik olarak zaman alıcı, zahmetli olmakla birlikte yanlış sonuçlar vermesi mümkündür. Bununla birlikte, farklı noktalarda mutasyonların bir arada görülmesinin farklı gruplara işaret edebileceği, bunların en yakın kesinlikle belirlenmesinde tüm ileri değişken bölgenin analiz edilmesi ve tespit edilen SNP’lerin bir arada değerlendirilmesi gerektiği de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu çalışmada haplogrup tespiti amaçlanmamaktadır. Sadece incelenen örneklerin analiz edilen mtDNA bölgelerinde var olması muhtemel baz değişikliklerinin haplogruplar açısından genel anlamda bir değerlendirilmesi sunulmuştur: M2-FD3, M2-FD16, M2-FD19, M6-FD3, M6-FD15 gibi örneklere ait dizinlerde hasarlar ve mutasyon olabilecek değişiklikler ile birlikte hiçbir değişiklik içermeyen, CRS ile uygunluk gösteren dizinler görülmüştür. CRS dizini, Avrupa popülasyonu için yaygın 143 bir tiptir (Torroni et al., 1996). Fernandez ve meslektaşları (2006), İspanya’nın çeşitli arkeolojik bölgelerinde otuz dokuz kemik ve diş örneği ile yaptıkları çalışmada, birçok örneğin ortak Avrupa motifi olan CRS dizini gösterdiğini ve bunun akrabalığın zayıf bir kanıtı olabileceğini bildirmişlerdir. Adli bilimlerde mtDNA için HVRI ve HVRII dizinlemelerinde bazı Avrupa toplumları için ayırım gücü bu sebeple düşük kalmaktadır ve benzer haplogruplar içinde idantifikasyon amacıyla kodlayan bölge SNP’lerinin kullanılması önerilir (Pereira et al., 2006). Çalışmada incelenen mtDNA HVRI bölgesi içinde (16147–16294) belirlenen baz değişikliklerine (16162G, 16172C, 16183G, 16261T) genel olarak bakıldığında, H haplogrubunu temsil ettikleri görülür. Ayrıca referans dizin olan CRS de H haplogrubuna aittir. Bu durumda, örneklerin H haplogrubuna ait olduğu söylenebilir. Kontaminasyon açısından incelenirse, kazı sırasında veya laboratuvar aşamasında bulaşmaya sebep olan bireylerin de yaygın H haplogrubunu göstermesi muhtemeldir. Polimorfizmlerden 16189C ve 16256T ise U haplogrubuna özgüdür. Bu haplogrubun Avrupa’da nadir görüldüğü bilinmektedir (Tambets et al., 2000; Mergen et al., 2004). Mezar 2’ye ait 1, 4, 13, 14, 17 ve 18’de; Mezar 6’ya ait 3, 14 ve 17’de bazı dizinlerde 16223T değişimi görülmüştür. Aynı örneğin çok sayıda dizininde görüldüğünde örneğe ait bir mutasyon, az sayıda tespit edildiğinde ise kontaminasyon veya hasar olarak değerlendirilmiştir. M haplogrubunu yansıtan 16223T değişimi, Asya’da yaygın olarak görülmektedir (Calafell et al., 1996; Richards et al., 1996). Çalışma materyalinde belirlenen 16223T polimorfizmi, örneklerin M haplogrubuna ait olma olasılığı ile birlikte muhtemel bir modern DNA kontaminasyonu anlamına da gelebilir. 144 BÖLÜM VI SONUÇ Farklı bilimsel alanlardaki geniş uygulama çeşitleri, biyoarkeolojik örneklerden DNA analizlerinin 1990’larda araştırma odağı olmaktan, çeşitli bilim dallarına bilgiler sunan bir araştırma aracı haline gelerek ilerlediğini göstermektedir. Arkeolojik iskelet kalıntıları için başarıyla uygulabilen aDNA analiz yöntemleri, düşük kopya sayısına sahip veya degrade durumda olan adli örneklerin incelenmesinde bir yol gösterici olarak kullanılabilir. Bu sebeple adli bilimlerin moleküler antropoloji ile işbirliği, disiplinler arası çalışmaları tercih eden bilimsel dünyasında önem kazanmaktadır. Arkeolojik kazı çalışmalarından elde edilen örneklerin moleküler incelemelere tabi tutulması arkeolojik verilere katkı sağlar. Yapılabilecek olası moleküler genetik çalışmalarda başarıya ulaşmak adına materyalin doğru toplanması ve uygun koşullarda saklanması oldukça önemlidir. Bu sebeple arkeologlar ve paleontologlar için DNA çalışmalarını göz önünde bulundurarak doğru koşullarda örnek toplama ve saklama konularında öneriler geliştirilmesi gerektiği açıktır. Kazı sırasında moleküler analizler için alınacak bir miktar örneğin soğuk koşullarda saklanarak, en kısa zamanda çalışılacak laboratuara ulaştırılması yeterli olacaktır. Örneklerin alınmasında ve saklanmasında dikkat edilmesi gereken hususlar hakkında ayrıntılı bilgi sahibi olan kazı başkanları, yürüttükleri çalışmalarda bu konudaki düzeni ve kontrolü sağlayabildiklerinde, laboratuarda doğru ve net bilgiler elde edilebilir. Bu çalışmada ulaşılan sonuçlar, anne tarafından akrabalıkları göstermede kullanılabilen bir araçtır; ancak bu yönde kesin ve güvenilir veriler elde etmek için mtDNA 145 üzerinde daha fazla bölgenin çalışılması gereklidir. Her ne kadar çalışmada kontaminasyon açısından maksimum önlem alınmış olsa da, ilk kez yapılan bu analizlere bağlı kalmamak önemlidir. Analizler öncelikle araştırmacı tarafından tekrar edilmeli, daha sonra bir dış laboratuvar tarafından gerçekleştirilmelidir. Çalışmada kemik örneklerinden elde edilerek incelenen 147 baz çiftlik (16147– 16294) mtDNA HVRI’de görülen başarı, ileriki araştırmaların geliştirilmesi için umut vericidir. Böylece hem HVRI’deki bu bölge, hem de HVRII için birbiriyle çakışan farklı bölgeler benzer şekilde analiz edilebilecektir. 146 BÖLÜM IX KAYNAKLAR Adachi N, Dodo Y, Ohshima N, Doi N, Yoneda M, Matsumura H. 2003. Morphologic and genetic evidence for the kinship of juvenile skeletal specimens from a 2000 year old double burial of the Usu-Moshiri site, Hokkaido, Japan. Anthropol Sci 111(3):347–363. Adachi N, Suzuki T, Sakaue K, Takigawa W, Ohshima N, Dodo Y. 2006. Kinship analysis of the Jomon skeletons unearthed from a double burial at the Usu-Moshiri site, Hokkaido, Japan. Anthropol Sci 114:29–34. Akkaya MS, Bilgiç H. 2002. Arkeolojik Buğday DNA’sı: Hekzaploid buğday tanısında Çatalhöyük’ten ilk örnek. 24th International Symposium of Excavation, Survey and Archaeometry. Akkaya MS. 2003. Anadolu kökenli antik buğday tohumlarından elde edilen DNA'nın karakterizasyonu Projesi, ODTÜ, AFP-BAP. Al-enizi M, Hadi S, Goodwin W. 2008. The development of visual and chemical methods for predicting the likelihood of obtaining a DNA profile from degraded bone samples, Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 1:2–3. 147 Alakoç YD. 2007. Diş dokularından DNA analizi ile cinsiyet tayini ve sonuçların odontometrik veriler ile karşılaştırılması. Doktora tezi. Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara. Alonso A, Martin P, Albarran C, Garcia P, Garcia O, Fernandez de Simon L, GarciaHirschfield J, Sancho M, de la Rua C, Fernandez-Piqueras J. 2004. Real-time PCR designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA studies. Forensic Sci Int 139:141–149. Alt KW, Pichler S, Vach W. 2009. Reconstruction of genetic kinship relations based on discrete traits in skeletal remains. http://www.biostat.sdu.dk/~wv/skeletal.html Altunçul H. 2001. Kemik dokudan DNA çekitleme ve tipleme yöntemleri. Doktora Tezi. İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul. Altunçul H, Abacı Kalfoğlu E, Eryılmaz G, Atasoy S. 1999. Identification and Family Relationship Estimation of the Skeleton of a Missing Person in Izmir, Turkey. Proceedings of 51th American Academy of Forensic Sciences Meeting, Orlando, USA, p 20. Altunçul H, Rolf B, Abacı-Kalfoğlu E, Eisenmenger W, Atasoy S. 2003. Maternity Estimation From Skeletal Remains: A Case Report. Forensic Sci Int 136:62. 148 Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC et al. 1981. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290:457– 465. Anderung C, Persson P, Bouwman A, Elburg R, Götherström A. 2008. Fishing for ancient DNA. Forensic Sci Int-Gen 2:104–107. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. 1999. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet 23:147. Anzai T, Naruse TK, Tokunaga K, Honma T, Baba H, Akazawa T, Inoko H. 1999. HLA genotyping of 5000–6000 year old ancient bones in Japan. Tissue Antigens 54:53–58. Ariffin SHZ, Wahap RMA, Zamrod Z, Sahar S, Razak MFA, Arifin EJ, Senafi AS. 2007. Molecular archaeology of ancient bone from 400 year old shipwreck. Asian-Pac J Mol Bio Biotech 15(1):27–31. Arndt A, Van Neer W, Hellemans B, Robben J, Volckaert F, Waelkens M. 2003. Roman trade relationships at Sagalassos (Turkey) elucidated by ancient DNA of fish remains, J Archaeol Sci 30(9):1095–1105. 149 Arslan S, Açıkkol A, Korkmaz M, Özgün-Başıbüyük G. 2008. Oylum Höyük Popülasyonunda Genetik Cinsiyet Tayini. 3.Ulusal Biyolojik Antropoloji Sempozyumu, 27–28 Ekim 2008, Ankara, p 24. Asamura H, Fujimori S, Ota M, Fukushima H. 2007a. MiniSTR multiplex systems based on non-CODIS loci for analysis of degraded DNA samples. Forensic Sci Int 173(1):7–15. Asamura H, Sakai H, Ota M, Fukushima H. 2007b. Mini Y-STR quadruplex systems with short amplicon lengths for analysis of degraded DNA samples. Forensic Sci Int-Gen 1:56– 61. Ayan D, Beder-Şen R, Yurtkuran S, Ünal G. 2002. Akraba Evliliğinin Kültür Birikiminde ve Toplum Hayatındaki Bazı Görünümleri: Dil, Din ve Tıp. Aile ve Toplum Eğitim Kültür ve Araştırma Dergisi, 5(2):70–77. Axelsson E, Willerslev E, Gilbert MTP, Nielsen R. 2008. The effect of ancient DNA damage on inferences of demographic histories. Mol Biol Evol 25(10):2181–2187. Ballantyne KN, van Oorschot RAH, Mitchell RJ. 2007. Comparison of two whole genome amplification methods for STR genotyping of LCN and degraded DNA samples. For Sci Int 166: 35–41. 150 Belli O. 1996. Doğu Anadolu Bölgesinde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin Araştırılması, 1995. 14. Araştırma Sonuçları Toplantısı, Anıtlar ve Müzeler Genel Müdürlüğü II, Ankara, 139–169. Belli O. 2001. Van Yoncatepe kazıları, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Yayınları No: 4285, İstanbul Üniversitesi, İstanbul. Belli O, Kavaklı E. 2001. 1999 Yılı Van-Yoncatepe kalesi ve nekropolü kazısı. Kazı Sonuçları Toplantısı 22:369–384. Belli O, Konyar E. 2001. Excavations at Van-Yoncatepe Fortress and Necropolis. Journal of the Institute of Archaeology of Tel Aviv University 28(2):169–219. Bilgiç H. 2002. Türkiye’den Yabanıl ve İlksel Buğday Türlerinin Mikrosatelit Belirteçleri ve Arkeolojik DNA Analizine Dayalı Genetik İlişkileri. Doktora tezi. Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara. Bilgiç H, Akkaya MS. 2000. Biomolecular Studies on Ancient Wheat. 32nd International Symposium of Archaeometry, 15–19 May 2000, Mexico City, Mexico, p 120. Bini C, Pappalardo G. 2005. mtDNA HVI length heteroplasmic profile in different tissues of maternally related members. Forensic Sci Int 152:35–38. 151 Blouin MS. 2003. DNA-based methods for pedigree reconstruction and kinship analysis in natural populations. Trends Ecol Evol 18:503–511. Bollongino R, Tresset A, Vigne JD. 2008. Environment and excavation: Pre-lab impacts on ancient DNA analyses. Gen Palaeontol 7:91–98. Boljuncic J. 2007. DNA analysis of early mediaeval individuals from Zvonimirovo burial site in Northern Croatia: Investigation of kinship relationships by using multiplex system amplification for short tandem repeat loci. Croat Med J 48:536–546. Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PME, van der Noordaa J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 28:495–503. Bouwman AS, Chilvers ER, Brown KA, Brown TA. 2006. Identification of the authentic ancient DNA sequence in a human bone contaminated with modern DNA. Am J Phys Anthropol 131:428–431. Bouwman AS, Brown KA, Prag JNW, Brown TA. 2008. Kinship between burials from grave circle B at Mycenae revealed by ancient DNA typing. J Archaeol Sci 35(9):2580– 2584. 152 Bower MA, Spencer M, Matsumura S, Nisbet RER, Howe CJ. 2005. How many clones need to be sequenced from a single forensic or ancient DNA sample in order to determine a reliable consensus sequence? Nucleic Acids Res 33(8):2549–2556. Brenner CH. 2009. Kinship analysis by DNA when there are many possibilities. http://dna-view.com/downloads/lattice.ppt Brown TA. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis - An Introduction. Oxford: Blackwell Publishing. Brown TA, Allaby RG, Brown KA, O’Donoghue K, Sallares R. 1994. DNA in wheat seeds from European archaeological sites. Experientia 50:571–575. Buckleton J, Triggs C. 2006. Dealing with allelic drop out when reporting the evidential value in DNA relatedness analysis. Forensic Sci Int 160:134–139. Buckley M, Anderung C, Penkman K, Raney BJ, Götherström A, Thomas-Oates J, Collins MJ. 2008. Comparing the survival of osteocalcin and mtDNA in archaeological bone from four European sites. J Archaeol Sci 35:1756–1764. Bujdoso G, Sotonyi P, Laszik A, Baur MP. 2003. Family relationship proven by chromosomal and DNA examinations. Int Congr Ser 1239:19–23. 153 Burger J, Hummel S, Herrmann B, Henke W. 1999. DNA preservation: A microsatelliteDNA study on ancient skeletal remains. Electrophoresis 20:1722–1728. Burton J. 2008. Bone chemistry and trace element analysis. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton, 2nd edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 443–460. Butler JM, Shen Y, McCord BR. 2003. The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA. J Forensic Sci 48(5):1054–1064. Butler JM. 2005. Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers. 2nd Edition. New York: Elsevier Academic Press. Calafell F, Underhill P, Tolun A, Angelicheva D, Kalaydjieva L. 1996. From Asian to Europe: mitochondrial DNA sequence variability in Bulgarians and Turks. Am J Hum Genet 60:35–49. Capelli C, Tschentscher F, Pascali VL. 2003. Ancient protocols for the crime scene? Similarities and differences between forensic genetics and ancient DNA analysis. Forensic Sci Int 131:59–64. Capelli C, Tschentscher F. 2005. Protocols for ancient DNA typing. Methods Mol Biol 297:265–278. 154 Cano RJ, Poinar HN. 1993. Rapid isolation of DNA from fossil and museum specimens suitable for PCR. BioTechniques 15:432–435. Caramelli D, Lalueza-Fox C, Capelli C, Lari M, Sampietro ML, Gigli E, Milani L, Pilli E, Guimaraes S, Chiarelli B, Marin VT, Casoli A, Stanyon R, Bertranpetit J, Barbujani G. 2007. Genetic analysis of the skeletal remains attributed to Francesco Petrarca. Forensic Sci Int 173(1):36–40. Carlyle SW, Parr RL, Hayes MG, O’Rourke DH. 2000. The context of maternal lineages in the Greater Southwest. Am J Phys Anthropol 113(1):85–101. Cattaneo C, Craig OE, James NT, Sokol RJ. 1997. Comparison of three DNA extraction methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification of three different gene sequences. J Forensic Sci 42:1126–1135. Cattaneo C. 2007. Forensic anthropology: developments of classical discipline in the new millennium. Forensic Sci Int 165:185–193. Cavalli-Sforza LL, Feldman MW. 2003. The application of molecular genetic approaches to the study of human evolution. Nat Genet 33:266–275. 155 Chilvers ER, Bouwman AS, Brown KA, Arnott RG, Prag AJ, Brown TA. 2008. Ancient DNA in human bones from Neolithic and Bronze Age sites in Greece and Crete. J Archaeol Sci 35(10):2707–2714. Chobe LP, Chadha MS, Banerjee K, Arankalle VA. 1997. Detection of HEV RNA in faeces by RT-PCR during the epidemics of Hepatitis E in India (1976–1995). J Viral Hepat 4:129–133. Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W. 1992. Prevention of pre-PCR mispriming and primer dimerization improves low copy number amplifications. Nucleic Acids Res 20(7):1717–1723. Christensen AF, Belcher WR, Bettinger S. 2007. Analysis of commingled remains using archaeology, anthropology and DNA: A case study from North Korea. Proceedings of the 59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San Antonio, TX, 377–378. Cinnioglu C, King R, Kivisild T, Kalfoglu E, Atasoy S, Cavalleri GL, Lillie AS, Roseman CC, Lin AA, Prince K, Oefner PJ, Shen P, Semino O, Cavalli-Sforza LL, Underhill P. 2004. Excavating Y chromosome haplotype strata in Anatolia. Hum Genet 114(2):127– 148. 156 Cipollaro M, Di Bernardo G, Galano G, Galderisi U, Guarino F, Angelini F, Cascino A. 1998. Ancient DNA in human bone remains from Pompeii archaeological site. Biochem Bioph Res Co 247:901–904. Clisson I, Keyser C, Francfort HP, Crubezy E, Samashev Z, Ludes B. 2002. Genetic Analysis of human remains from a double inhumation in a frozen kurgan in Kazakhstan (Berel site, Early 3d Century BC). Int J Leg Med 116:304–308. Coble MD, Hill CR, Vallone PM, Butler JM. 2006. Characterization and performance of new MiniSTR loci for typing degraded samples. Int Congr Ser 1288:504–506. Colson IB, Richards MB, Bailey JF, Sykes BC, Hedges REM. 1997. DNA analysis of seven human skeletons excavated from the Terp of Wijnaldum. J Archaeol Sci 24:911– 917. Comas D, Calafell F, Mateu E, Perez-Lezaun A, Bertranpetit J. 1996. Geographic Variation in Human Mitochondrial DNA Control Region Sequence: The Population History of Turkey and its Relationship to the European Populations. Mol Biol Evol 13(8):1067–1077. Cooper A. 1994. DNA from museum specimens. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 149–165. 157 Cooper A, Drummond AJ, Willerslev E. 2004. Ancient DNA: Would the real Neandertal Please stand up? Curr Biol 14:431–433. Culjkovic B, Savic D, Stojkovic O, Romac S. 2003. Poly (A) tailing of ancient DNA: a method for reproducible microsatellite genotyping. Anal Biochem 318:124–131. Cunha E, Pinheiro J, Vieira DN. 2006. Identification in forensic anthropology: Its relation to genetics. Int Congr Ser 1288:807–809. Çilingir C. 2009. Crop processing in the early bronze age houses of İkiztepe: Identification and analysis of archaeobotanical remains. Yüksek Lisans Tezi. Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara. Çilingiroğlu A. 1984. Urartu ve Kuzey Suriye siyasal ve kültürel ilişkiler. Ege Üniversitesi Yayınları, İzmir. Çöloğlu SA, İşcan MY. 1998. Adli Osteoloji. İstanbul Üniversitesi Rektörlük Yayınları No.4150, İstanbul. Dissing J, Binladen J, Hansen A, Sejrsen B, Willerslev E, Lynnerup N. 2007. The last Viking King: A royal maternity case solved by ancient DNA analysis. Forensic Sci Int 166:21–27. 158 Dissing J, Kristinsdottir MA, Friis C. 2008. On the elimination of extraneous DNA in fossil human teeth with hypochlorite. J Archaeol Sci 35:1445–1452. Dixon LA, Dobbins AE, Pulker HK, Butler JM, Vallone PM, Coble MD, Parson W et al. 2006. Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs—results of a collaborative European (EDNAP) exercise. Forensic Sci Int 164:33–44. Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 1991. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res 19(4):4008. Drancourt M, Aboudharam G, Signoli M, Dutour O, Raoult D. 1998. Detection of 400year-old Yersinia pestis DNA in human dental pulp: an approach to the diagnosis of ancient septicemia. Proc Natl Acad Sci USA 95:12637–12640. Drobnic K. 2006. A new primer in a SRY gene for sex identification. Int Congr Ser 1288:268–270. Dudar JC, Waye JS, Saunders SR. 2003. Determination of a kinship system using ancient DNA, mortuary practice and historic records in an Upper Canadian pioneer cemetery. Int J Osteoarchaeol 13:232–246. Egeland T, Mostad P, Mevag B, Stenersen M. 2000. Beyond traditional paternity and identification cases. Selecting the most probable pedigree, Forensic Sci Int 110(1):47–59. 159 Ehrlich HA. 1989. PCR technology, Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton. Eilert KD, Foran DR. 2007. Polymerase Resistance to PCR inhibitors in bone, Proceedings of the 59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San Antonio, TX, 135–136. Essen-Möller E. 1938. Die Beweiskraft der Ahnlichkeit im Vaterschaft nachweis theoretische Grundlagen. Mitt Anthrop Ges 68:9–53. Evett IW, Weir BS. 1998. Interpreting DNA Evidence: Statistical Genetics for Forensic Scientists, Sunderland, MA: Sinauer Associates. Fernandez E, Oliver A, Turbon D, Arroyo-Pardo E. 2006. mtDNA analysis of ancient samples from Casstellon (Spain): Diachronic variation and genetic relationships. Int Congr Ser 1288:127–129. Fily ML, Crubezy E, Courtaud P, Keyser C, Ebrard D, Ludes B. 1998. Paleogenetic analysis of the skeletons from the sepulchral cave of Elzarreko Karbia (Bronze Age, Basque Country). C R Acad Sci Paris 321:79–85. Finkler K. 2005. Family, kinship, memory and temporality in the age of the new genetics, Soc Sci Med 61:1059–1071. 160 Fisher DL. 1993. Extraction, evaluation, and amplification of DNA from decalcified and undecalcified United States Civil War bone. J Forensic Sci 38:60–68. Fischer MD. 2009. Representing anthropological knowledge: Calculating kinship http://www.era.anthropology.ac.uk/Kinship/index.html Fondevila M, Phillips C, Naveran N, Fernandez L, Cerezo M, Salas A, Carracedo A, Lareu MV. 2008. Case report: Identification of skeletal remains using short amplicon marker analysis of severely degraded DNA extracted from a decomposed and charred femur. Forensic Sci Int-Gen 2:212–218. Fortea J, de la Rasilla M, Garcia-Tabernero A, Gigli E. 2008. Excavation protocol of bone remains for Neandertal DNA analysis in El Sidron Cave (Asturias, Spain). J Hum Evol 55(2):353–357. Fountain D, Ralston M, Higgins N, Gorlin JB, Uhl L, et al. 1997. Liquid nitrogen freezers: a potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell components. Transfusion 37:585–591. Fung WK, Chung Y, Wong D. 2002. Power of exclusion revisited: probability of excluding relatives of the true father from paternity. Int J Leg Med 116:64–67. 161 Fung WK, Carracedo A, Hu YQ. 2003. Testing for kinship in a subdivided population. Forensic Sci Int 135:105–109. Fung WK. 2003. User-friendly programs for easy calculations in paternity testing and kinship determinations. Forensic Sci Int 136:22–34. Fung WK, Hu YQ, Chung Y. 2006. On statistical analysis of forensic DNA: theory, methods and computer programs. Forensic Sci Int 162:17–23. Gamba C, Fernandez E, Oliver A, Tirado M, Baeza C, Lopez-Parra AM, Arroyo-Pardo E. 2008. Population genetics and DNA preservation in ancient human remains from Eastern Spain. Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 462–464. Gao SZ, Yang YD, Xu Y, Zhang QC, Zhu H, Zhou H. 2007. Tracing the genetic history of the Chinese People: Mitochondrial DNA analysis of a Neolithic population from the Lajia site. Am J Phys Anthropol 133:1128–1136. Gerstenberger J, Hummel S, Shultes T, Hack B, Herrmann B. 1999. Reconstruction of a historical genealogy by means of STR analysis and Y haplotyping of ancient DNA. Eur J Hum Genet 7:469–477. Gibbon VE, Penny CB, Strkalj G, Ruff P. 2009. Brief Communication: Minimally Invasive Bone Sampling Method for DNA Analysis. Am J Phys Anthropol 139:596–599. 162 Gilbert MTP, Hansen AJ, Willerslev E, Rudbeck L, Barnes I, et al. 2003. Characterization of genetic miscoding lesions caused by postmortem damage. Am J Hum Genet 72:48–61. Gilbert MTP, Rudbeck L, Willerslev E, Hansen AJ, Smith CI, Penkman KEH et al. 2005. Biochemical and physical correlates of DNA contamination in archaeological human bones and teeth excavated at Matera, Italy. J Archaeol Sci 32:785–793. Gilbert MTP, Hansen AJ, Willerslev E, Turner-Walker G, Collins M. 2006. Insights into the processes behind the contamination of degraded human teeth and bone samples with exogenous sources of DNA. Int J Osteoarchael 16:156–164. Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett I, Hagelberg E, and Sullivan K. 1994. Identification of the remains at the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet 6:130–135. Golenberg EM. 1994. DNA from plant compression fossils. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 237–256. Goloubinoff P, Pääbo S, Wilson AC. 1993. Evolution of maize inferred from sequence diversity of an Adh2 gene segment from archaeological specimens. Proc Natl Acad Sci USA 90:1997–2001. 163 Gökçümen O. 2004. Popülasyon Tarihini Açıklamada Antik DNA Yaklaşımı: Anadolu’da Gerçekleştirilebilecek Çalışmalara Örnekler. 26. Uluslar arası Kazı, Araştırma ve Arkeometri Sempozyumu. 24–28 Mayıs 2004, Konya. Götherström A, Liden K. 1996. A modified DNA extraction method for bone and teeth. J Nord Archaeol Sci 9:53–56. Götherström A, Collins MJ, Angerbjörn A, Liden K. 2002. Bone preservation and DNA amplification. Archaeometry 44(3):395–404. Graw M, Weisser HJ, Lutz S. 2000. DNA typing of human remains found in damp environments. Forensic Sci Int 113:91–95. Gross DR. 1992. Discovering Anthropology. California: Mayfield Publishing Company. Gugerli F, Parducci L, Petit RJ. 2005. Ancient plant DNA: review and prospects. New Phytologist 166:409–418. Güral D. 2007. Arkeolojide Biyolojik Yöntemler: aDNA. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, İstanbul. Hagelberg E, Skyes B, Hedges R. 1989. Ancient bone DNA amplified. Nature 342:485. 164 Hagelberg E, Bell LS, Allen T, Boyde A, Jones SJ, Clegg JB, Hummel S, Brown TA, Ambler RP. 1991. Analysis of ancient bone DNA: Techniques and applications and discussion. Philos T Biol Sci 333:399–407. Haimes E. 2006. Social and ethical issues in the use of familial searching in forensic investigations: Insights from family and kinship studies. J Law Med Ethics 263-276. Handt O, Richards M, Trommsdorff M, Kilger C, Simanainen J, et al. 1994a. Molecular genetic analyses of the Tyrolean ice man. Science 264:1175–1178. Handt O, Höss M, Krings M, Pääbo S. 1994b. Ancient DNA: methodological challenges. Experientia 50:524–529. Handt O, Krings M, Ward RH, Pääbo S. 1996. The retrieval of ancient human DNA sequences. Am J Hum Genet 59:368–376. Hanni C, Brousseau T, Laudet V, Stehelin D. 1995. Isopropanol precipitation removes PCR inhibitors from ancient bone extracts. Nucleic Acids Res 23:881–882. Hansen AJ, Mitchell DL, Wiuf C, Paniker L, Brand TB, Binladen J, Gilichinsky DA, Ronn R, Willerslev E. 2006. Crosslinks rather than strand breaks determine access to ancient DNA sequences from frozen sediments. Genetics 173(2):1175–1179. 165 Hatsch D, Amory S, Keyser-Tracqui C, Hienne R, Crubezy E, Ludes B. 2006. High throughput mitochondrial DNA cloning in forensic and anthropological issues, Int Congr Ser 1288:118–120. Hebsgaard MB, Phillips MJ, Willerslev E. 2005. Geologically ancient DNA: fact of artefact? Trends Microbiol 13(5):212–220. Hedges REM. 2002. Bone diagenesis: An overview of process. Archaeometry 44(3):319– 328. Herrmann B, Hummel S. 1994. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC. 1984. DNA sequences from quagga, an extint member of the horse family. Nature 312:282–284. Ho SYW, Heupink TH, Rambaut A, Shapiro B. 2007. Bayesian estimation of sequences damage in ancient DNA. Mol Biol Evol 24(6):1416–1422. Hofreiter M, Serre D, Poinar HN, Kuch M, Pääbo S. 2001. Ancient DNA. Nature Rev Gen 2:353–359. Holm S. 2001. The privacy of Tutankhamen—utilising the genetic information in stored tissue samples. Theor Med 22:437–449. 166 Horai S, Hayasaka K, Murayama K, Wate N, Koike H, Nakai N. 1989. DNA amplification from ancient human skeletal remains and their sequence analysis. Proc Jpn Acad B 65:229–233. Horai S, Kondo R, Murayama K, Hayashi S, Koike H, Nakai N. 1991. Phylogenetic affiliation of ancient and contemporary humans inferred from mitochondrial DNA. Philos Trans R Soc London Ser B 333:409–418. Höss M, Pääbo S. 1993. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purificiation method. Nucleic Acids Res 21(16):3913–3914. Höss M, Jaruga P, Zastawny TM, Dizdaroglu M, Pääbo S. 1996. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Res 24(7):1304–1307. Hummel S. 2003. Ancient DNA Typing: Methods, Strategies and Applications. Germany: Springer-Verlag. Hummel S, Herrmann B. 1991. Y-chromosome-specific DNA amplified in ancient human bone. Naturwissenschaften 78:266–267. Hummel S, Herrmann B. 1994. Y-Chromosomal DNA from Ancient Bones. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: Springer- 167 Verlag Inc. p 205–210. Hummel S, Nordsiek G, Herrmann B. 1992. Improved Efficiency in Amplification of Ancient DNA and Its Sequence Analysis. Naturwissenschaften. 79:359–360. Hummel S, Schultes T, Bramanti B, Herrmann B. 1999. Ancient DNA profiling by megaplex amplifications. Electrophoresis 20:1717–1721. Hunter DEK, Whitten P. 1993. Finding Anthropology. In: Introduction to Anthropology. New York: Harper Collins College Publishers. p 3–8. Imaizumi K, Saitoh K, Sekiguchi K, Yoshino M. 2002. Identification of fragmented bones based on anthropological and DNA analyses: Case report. Leg Med 4:251–256. Imaizumi K, Noguchi K, Shiraishi, Sekiguchi K, Senju H, Fujii K, Yoshida K, Kasai K, Yoshino M. 2005. DNA typing of bone specimens – the potential use of the profiler test as a tool for bone identification. Leg Med 7:31–41. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic. İşcan MY. 1988. Rise of forensic anthropology. Yearb Phys Anthropol 31:203–230. 168 İşcan MY. 2001. Global forensic anthropology in the 21st century. Forensic Sci Int 117:1– 6. İşcan MY, Altunçul H. 2002. İskelet kalıntılarında kimlik tayini. İstanbul Baro Dergisi 76(3):734–749. İşcan MY, Altunçul H, Belli O, Konyar E. 2007. Eski İnsan Kalıntılarından DNA Çekitlemesi. Adli Bilimler Dergisi 6:71–78. İşcan MY, Loth SR. 1997. The scope of forensic anthropology. In: Eckert WG, editor, Introduction to forensic sciences. Second Edition, Florida. Jackes M, Sherburne R, Lubell D, Barker C, Wayman M. 2001. Destruction of microstructure in archaeological bone: a case study from Portugal. Int J Osteoarchaeol 11:415–432. Jans MME, Kars H, Nielsen-Marsh CM, Smith CI, Nord AG, Arthur P, Earl N. 2002. In situ preservation of archaeological bone: a histological study within a multidisciplinary approach. Archaeometry 44(3): 343–352. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. 1985. Hypervariable ‘Minisatellite’ regions in human DNA. Nature 314:76–79. 169 Johnson PH, Olson CB, Goodman M. 1985. Isolation and characterization of deoxyribonucleic acid from tissue of the wooly mammoth, Mammuthus primigenius. Comp Biochem Physiol 81:1045–1051. Jones M. 2003. Ancient DNA in pre-Columbian archaeology: a review. J Archaeol Sci 30:629–635. Kaestle FA, Horsburgh KA. 2002. Ancient DNA in anthropology: Methods, applications, and ethics. Yearb Phys Anthropol 45:92–130. Kalfoglou EA, Kocias Y, Ozcan SS, Petridis G, Yükseloglu EH, Atasoy S. 2007. A Decade for Searching the Father. 22nd Congress of the International Society of Forensics Genetics, 22-25 August 2007, Copenhagen, Denmark. Kalmar T, Bachrati CZ, Marcsik A, Rasko I. 2000. A simple and efficient method for PCR amplifiable DNA extraction from ancient bones. Nucleic Acids Res 28:12–67. Katzenberg MA. 2008. Stable Isotope Analysis: A tool for studying past diet, demography and life history. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. 2nd edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 413–441. Katzenberg MA, Saunders SR. 2008. Biological anthropology of the human skeleton, Second edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc. 170 Kemp BM, Monroe C, Smith DG. 2006. Repeat silica extraction: a simple technique for the removal of PCR inhibitors from DNA extracts. J Archaeol Sci 33:1680–1689. Kemp BM, Smith DG. 2005. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Sci Int. 154:53–61. Keyser-Tracqui C, Crubezy E, Clisson I, Gemmerich I, Ludes B, Giscard PH. 2003. Megaplex analysis of a Mongolian population from the Egyin Gol site (300BC–300AD). Int Congr Ser 1239:581–584. Kimura B, Brandt SA, Hardy BL, Hauswirth WW. 2001. Analysis of DNA from ethnoarchaeological stone scrapers. J Archaeol Sci 28:45–53. Kolman CJ, Tuross N. 2000. Ancient DNA analysis of human populations. Am J Phys Anthropol 111:5–23. Kottak CP. 2001. Antropoloji: İnsan çeşitliliğine bir bakış. Ankara: Ütopya Yayınevi. Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, Pääbo S. 1997. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell 90:19–30. 171 Krings M, Geisert H, Schmitz RW, Krainitzki H, Pääbo S. 1999. DNA sequence of the mitochondrial hypervariable region II from the Neandertal type specimen. Proc Natl Acad Sci USA 96:5581–5585. Krogman WM, İşcan MY. 1986. The human skeleton in forensic medicine. Springfield, IL: Charles C Thomas. Kurosaki K, Matsushita T, Ueda S. 1993. Individual DNA Identification from ancient human remains. Am J Hum Genet 53:638–643. Larcombe LA, Nickerson P, Hoppa RD, Matheson C. 2005. Detection of single nucleotide polymorphism in the IL-6 promoter region of ancient nuclear DNA, Infect Gen Evol 5:117–122. Lalueza-Fox C. 1997. Ancient DNA studies and new bioethic problems. Hum Evol 12(4):287–290. Lee HC, Pagliaro EM, Berka KM, Folk NL, Anderson DT, et al. 1991. Genetic markers in human bone I: deoxyribonucleic acid (DNA) analysis. J Forensic Sci 36:320–330. Lehrman S. 2001. Drawing DNA lines of ethnicity. Geneletter. www.geneletter.com Leonard JA, Shanks O, Hofreiter M, Kreuz E, Hodges L, Ream W, Wayne RK, Fleisher 172 RC. 2007. Animal DNA in PCR reagents plagues ancient DNA research. J Archaeol Sci 34:1361–1366. Lleonart R, Riego E, Sainz de la Pena MV, Bacallao K, Amaro F, Santiesteban M, Blanco M, Currenti H, Puentes A, Rolo F, Herrera L, de la Fuente J. 2000. Forensic identification of skeletal remains from members of Ernesto Che Guevara’s guerrillas in Bolivia based on DNA typing. Int J Leg Med 113:98–101. Lindahl T. 1993. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362:709– 715. Loreille OM, Diegoli TM, Irwin JA, Coble MD, Parsons TJ. 2007. High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization. Forensic Sci Int-Gen 1(2):191–195. Lutz S, Weisser HJ, Heizmann J, Pollak S. 1999. Mitochondrial heteroplasmy among maternally related individuals. Int J Leg Med 113:155–161. Marks J. 2002. What is molecular anthropology? What can it be? Evol Anthropol 11:131– 135. Marota I, Basile C, Ubaldi M, Rollo F. 2002. DNA Decay Rate in Papyri and Human Remains From Egyptian Archaeological Sites. Am J Phys Anthropol 117:310–318. 173 Matheson CD, Toy TH. 2001. Genetic sex determination of 9400 year old human skull samples from Çayönü Tepesi, Turkey. J Arcaheol Sci 28:569–575. Meissner C, Bruse P, Mueller E, Oehmichen M. 2007. A new sensitive short pentaplex (ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Sci Int 166:121–127. Mekel-Bobrov N, Lahn BT. 2004. Ancient DNA analysis of human remains from Tell Kurdu. In: Tell Kurdu Excavations 2001. Anatolica 30:72–74. Mergen B. 2006. Erken Demir Çağı’nda cinsiyet ve boy gelişimi. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul. Mergen B, İşcan MY. 2007. Kitle mezarlarında bulunan uzun kemiklerden cinsiyet tayini. Adli Bilimler Dergisi 6(1):7–16. Mergen H, Öner R, Öner C. 2004. Mitochondrial DNA sequence variation in the Anatolian Peninsula (Turkey). Indian Acad Sci J Genet 83(1):39–47. Merriwether DA, Rothhammer F, Ferrell RE. 1994. Genetic variation in the New World: ancient teeth, bone, and tissue as sources of DNA. Experientia 50:592–601. Meyer E, Wiese M, Bruchhaus H, Claussen M, Klein A. 2000. Extraction and amplification of authentic DNA from ancient human remains. Forensic Sci Int 113:87–90. 174 Millar CD, Huynen L, Subramanian S, Mohandesan E, Lambert DM. 2008. New developments in ancient genomics. Trends Ecol Evol 23(7):386–393. Mitchell D, Willerslev E, Hansen A. 2005. Damage and repair of ancient DNA Mutation Res 571:265–276. Mitomap. 2009. http://www.mitomap.org/cgi-bin/tbl5gen.pl Motoc M, Verdeş D, Corina S, Felicia S, Monica N. 2009. Procedures for obtaining biological samples from ancient bones for DNA analysis. http://cmpicsu.upt.ro/zat/Motoc_Samuila_Sfrijan.pdf Mullis K, Faloona E, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51:263-273. Mullis KB, Faloona FA. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalysed chain reaction. Methods Enzymol 155:335–350. Mundorff AZ, Bartelink EJ. 2007. DNA preservation of skeletal elements from the world trade center disaster: some recommendations for mass disaster management. Proceedings of the 59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San Antonio, TX, 385. 175 Nelson K, Melton T. 2007. Forensic mitochondrial DNA analysis of 116 casework skeletal samples. J Forensic Sci 52(3):557–561. Nicholson GJ, Tomiuk J, Czarnetzki A, Bachmann L, Pusch CM. 2002. Detection of bone glue treatment as a major source of contamination in ancient DNA analyses. Am J Phys Anthropol 118:117–120. Nielsen H, Engberg J, Thuesen I. 1994. DNA from arctic human burials. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag. p 122–140. Nielsen H, Thuesen I. 1998. Paleogenetics. In: Cockburn A, Cockburn E, Reyman T, editors. Mummies, Disease & Ancient Cultures. Cambridge: Cambridge University Press. P 355-363. Nielsen-Marsh CM, Hedges REM. 1999. Bone porosity and the issue of mercury intrusion porosimetry in bone diagenesis studies. Archaeometry 41(1):165–174. Nielsen-Marsh CM, Richards MP, Hauschka PV, Thomas-Oates JE, Trinkaus E, Pettitt PB, Karavanic I, Poinar H, Collins MJ. 2005. Osteocalcin protein sequences of Neanderthals and modern primates. Proc Natl Acad Sci USA 102:4409–4413. 176 Nielsen-Marsh CM, Smith CI, Jans MME, Nord A, Kars H, Collins MJ. 2007. Bone diagenesis in the European Holocene II: taphonomic and environmental considerations. J Archaeol Sci 34:1523–1531. Oota H, Saitou N, Matsushita T, Ueda S. 1995. A genetic study of 2,000-year-old human remains from Japan using mitochondrial DNA sequences. Am J Phys Anthropol 98:133– 145. Oota H, Saitou N, Matsushita T, Ueda S. 1999. Molecular genetic analysis of remains of a 2,000-year-old human population in China—and its relevance for the origin of the modern Japanese population. Am J Hum Genet 64:250–258. Opel KL, Chung DT, Drabek J, Tatarek NE, Jantz LM, McCord BR. 2006. The Application of Miniplex Primer Sets in the Analysis of Degraded DNA from Human Skeletal Remains. J Forensic Sci 51(2):351–356. O’Donoghue K, Brown TA, Carter JF, Evershed RP. 1996. Application of high performance liquid chromatography/mass spectrometry with electrospray ionization to the detection of DNA nucleosides in ancient seeds. Rapid Commun Mass Spectrom 10:495– 500. O’Rourke DH, Carlyle SW, Parr RL. 1996. Ancient DNA: methods, progress, and perspectives. Am J Hum Biol 8:557–571. 177 O’Rourke DH, Hayes MG, Carlyle SW. 2000. Ancient DNA studies in physical anthropology. Ann Rev Anthropol 29:217–242. Ovchinnikov IV, Gotherstrom A, Romanova GP, Kharitonov VM, Liden K, GoodwinW. 2000. Molecular analysis of Neanderthal DNA from the Northern Caucasus. Nature 404(6777):490–493. Ozcan SS, Petridis G, Yukseloglu EH, Kalfoglu EA, Atasoy S. 2006. Old bone material, power of exclusion and the conventional systems in identification. 4th Congress of the Balkan Academy of Forensic Sciences, 8-11 June 2006, Stara Zagora, Bulgaria. Pääbo S. 1985. Molecular cloning of ancient Egyptian mummyDNA. Nature. 314: 644– 645. Pääbo S. 1989. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification. Proc Natl Acad Sci USA 86:1939–1943. Pääbo S. 1990. Amplifying ancient DNA. J Biol Chem 265:4718. Pääbo S, Poinar H, Serre D, Jaenicke-Despres V, Hebler J, Rohland N, Kuch M, Krause J, Vigilant L, Hofreiter M. 2004. Genetic analyses from ancient DNA. Ann Rev Genet 38:645–679. 178 Parducci L, Suyama Y, Lascoux M, Bennett KD. 2005. Ancient DNA from pollen: a genetic record of population history in Scots pine. Mol Ecol 14:2873–2882. Parr RL, Carlyle SW, O’Rourke DH. 1996. Ancient DNA analysis of Fremont Amerindians of the Great Salt LakeWetlands. Am J Phys Anthropol 99:507–518. Parsons TJ, Weedn VW. 1996. Preservation and recovery of DNA in postmortem specimens and trace samples. In: Haglund WD, Sorg MH, editors. Forensic Taphonomy: The Postmortem Fate of Human Remains. Boca Raton, FL: CRC Press. p 109–138. Parsons TJ, Huel R, Davoren J, Katzmarzyk C, Milos A, Selmanovic A, Smajlovic L, Coble MD, Rizvic A. 2007. Application of novel mini-amplicon STR multiplexes to high volume casework on degraded skeletal remains. Forensic Sci Int-Gen 1(2):175–179. Pereira L, Richards M, Alonso A, Albarran C, Garcia O, Behar DM, Golge M, Hatina J, Al-Gazali L, Bradley DG, Macaulay V, Amorim A. 2006. Evaluating the forensic informativeness of mtDNA haplogroup H sub-typing on a Eurasian scale. Forensic Sci Int 159:43–50. Pilli E, Fox CL, Capelli C, Lari M, Sampietro L, Gigli E, Milani L, Guimaraes S, Chiarelli B, Marin VTW, Casoli A, Stanyon R, Barbujani G, Caramelli D. 2008. Ancient DNA and forensics genetics: The case of Francesco Petrarca. Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 1:469– 470. 179 Pizzamiglio M, Marino A, Coli A, Floris T, Garofano L. 2006. The use of mini-STRs on degraded DNA samples. Int Congr Ser 1288:498–500. Poinar HN, Cano RJ, Poinar GO. 1993. DNA from an extinct plant. Nature 363:677. Poinar GO, Poinar HN, Cano RJ. 1994. DNA from amber inclusions. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag Inc. p 205–210. Poinar HN, Höss M, Bada JL, Pääbo S. 1996. Aminoacid racemization and the preservation of ancient DNA. Science 272:864–866. Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding G, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnet G, Pääbo S. 1998. Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science 281:402–406. Poulakakis N, Tselikas A, Bitsakis I, Mylonas M, Lymberakis P. 2007. Ancient DNA and the genetic signature of ancient Greek manuscripts. J Archaeol Sci 34:675–680. Prado VF, Castro AKF, Oliveira CL, Souza KT, Pena SDJ. 1997. Extraction of DNA from human skeletal remains: practical applications in forensic sciences. Genetic Anal-Biomol E. 14:41–44. 180 Pruvost M, Schwarz R, Bessa Correia V, Champlot S, Braguier S, Morel N, FernanezJalvo Y, Grange T, Geigl E-M. 2007. Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient DNA. Proc Natl Acad Sci USA 104:739–744. Purzycka JK, Olewiecki I, Soltyszewski I. 2006. Efficiency comparison of seven different Taq polymerases used in hemogenetics. Int Congr Ser 1288:719–721. Ramos MD, Lalueza C, Girbau E, Perez-Perez A, Quevedo S, et al. 1995. Amplifying dinucleotide microsatellite loci from bone and tooth samples of up to 5000 years of age: more inconsistency than usefulness. Hum Genet 96:205–212. Raoult D, Aboudharam G, Crubezy E, Larrouy G, Ludes B, Drancourt M. 2000. Molecular identification by “suicide PCR” of Yersinia pestis as the agent of Medieval Black Death. Proc Natl Acad Sci USA 97:12800–12803. Reese RL, Hyman M, Rowe MW, Derr JN, Davis SK. 1996. Ancient DNA from Texas pictographs. J Archaeol Sci 23:269–277. Reinheird KJ, Ambler JR, Szuter CR. 2007. Hunter-Gatherer Use of Small Animal Food Resources: Coprolite Evidence. Int J Osteoarchaeol 17:416–428. 181 Renfrew C. 2003. Archaeogenetics: Towards a population prehistory of Europe. In: Renfrew C, Boyle K, editors. Archaeogenetics: DNA and the population Prehistory of Europe. Cambridge: McDonald Institute for Archaeological Research. Rennick SL, Fenton TW, Foran DR. 2005. The effects of skeletal preparation techniques on DNA from human and non-human bone. J Forensic Sci 50(5):1–4. Riancho JA, Zarrabeitia MT. 2003. A windows-based software for common paternity and sibling analyses. Forensic Sci Int 135:232–234. Ricaut FX, Kolodesnikov S, Keyser-Tracqui C, Alekseev AN, Crubezy E, Ludes B. 2004. Genetic analysis of human remains found in two eighteenth century Yakut graves at AtDabaan. Int J Leg Med 118:24–31. Ricaut FX, Keyser-Tracqui C, Crubezy E, Ludes B. 2005. STR-genotyping from human medieval tooth and bone samples. Forensic Sci Int 151:31–35. Ricaut FX, Kolodesnikov S, Keyser-Tracqui C, Alekseev AN, Crubezy E, Ludes B. 2006. Molecular genetic analysis of 400-year-old human remains found in two yakut burial sites. Am J Phys Anthropol 129:55–63. 182 Richards M, Corte-Real H, Forster P, Macaulay V, Wilkenson-Herbots H, Demaine A et al. 1996. Paleolithic and Neolithic lineages in the European mitochondrial gene pool. Am J Hum Genet 59:185–203. Richards MB, Sykes BC, Hedges REM. 1995. Authenticating DNA extracted from ancient skeletal remains. J Archaeol Sci 22:291–299. Rogers SO, Bendich AJ. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol 5:69–76. Rohland N, Hofreiter M. 2007. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. BioTechniques 42:343–352. Rollo F, Venanzi FM, Amici A. 1994a. DNA and RNA from ancient plant seeds. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA, New York: Springer-Verlag. p 218–236. Rollo F, Asci W, Antonini S, Marota I, Ubaldi M. 1994b. Molecular ecology of a Neolithic meadow: the DNA of the grass remains from the archaeological site of the Tyrolean Iceman. Experientia 50: 576–584. Römpler H, Dear PH, Krause J, Meyer M, Rohland N, Schöneberg T, Spriggs H, Stiller M, Hofreiter M. 2006. Multiplex amplification of ancient DNA. Nat Protoc 1(2):720–728. 183 Ruano G, Fenton W, Kidd KK. 1989. Biphasic amplification of very dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res 17(13):5407. Rudin N, Inman K. 2002. An introduction to forensic DNA analysis. 2nd edition, Florida: CRC Press. Saferstein R. 2004. Criminalistics: An introduction to forensic science. 8th edition, New Jersey: Pearson Prentice Hall. Salas A, Lareu MV, Carracedo A. 2001. Heteroplasmy in mtDNA and weight of evidence in forensic mtDNA analysis: a case report. Int J Leg Med 114:186–190. Salo WL, Aufderheide AC, Buikstra J, Holcomb TA. 1994. Identification of Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian Peruvian mummy. Proc Natl Acad Sci USA 91:2091–2094. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. p 5.2–6.6. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463–5467. 184 Santure SK, Harn AD, Esarey D. 1990. Archaeological Investigations at the Morton Village and Norris Farms 36 Cemetery: Reports of Investigations, No 45. Springfield: Illinois State Mus. Schneider PM, Bender K, Mayr WR, Parson W, Hoste B, Decorte R, Cordonnier J, Vanek D, Morling N, et al 2004. STR analysis of artificially degraded DNA – results of a collaborative European exercise. Forensic Sci Int 139(2-3):123–134. Scholz M, Hengst S, Broghammer M, Pusch CM. 2001. Intrapopulational relationships in ancient societies: a multidisciplinary study. Z Morphol Anthropol 83(1):5–21. Schwartz TR, Schwartz EA, Mieszerski L, McNally L, Kobilinsky L. 1991. Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obtained from teeth subjected to various environmental conditions. J Forensic Sci 36:979–90. Schweitzer MH, Avci R, Collier T, Goodwin MB. 2008. Microscopic, chemical and molecular methods for examining fossil preservation. C R Palevol 7:159–184. Scoot GR. 2008. Dental Morphology. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 265–298. 185 Sensabaugh GF. 1994. DNA typing of biological evidence material. In: Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 141–148. Shanks OC, Hodges L, Tilley L, Kornfeld M, Larson ML, Ream W. 2005. DNA from ancient stone tools and bones excavated at Bugas-Holding Wyoming. J Archaeol Sci 32:27–38. Shapiro B. 2008. Engineered polymerases amplify the potential of ancient DNA. Trends Biotechn. 26(6):285–287. Sivilich M. 2005. Determining familial relationships using historic DNA from urban and rural historic burials in Indiana. Master’s thesis. Indiana State University, USA. Smith BC, Fisher DL, Weedn VW, Warnock GR, Holland MM. 1993. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci 38:1194–209. Smith CI, Chamberlain AT, Riley MS, Cooper A, Stringer CB, Collins MJ. 2001. Not just old but old and cold? Nature 410:771–772. Smith CI, Nielsen-Marsh CM, Jans MME, Arthur P, Nord AG, Collins MJ. 2002. The strange case of Apigliano: early ‘fossilization’ of medieval bone in southern Italy. Archaeometry, 44:405–416. 186 Smith CI, Chamberlain AT, Riley MS, Stringer C, Collins MJ. 2003. The thermal history of human fossils and the likelihood of successful DNA amplification. J Hum Evol 45:203– 217. Somel M. 2003. Characterization of DNA from ancient wheat samples from the fertile crescent. Yüksek Lisans Tezi. Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara. Stewart TD. 1979. Essentials of forensic anthropology. Springfield, IL: Charles C. Thomas. Stodder ALW. 2008. Taphonomy and the nature of archaeological assemblages. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 71–114. Stone AC. 2008. DNA analysis of archaeological remains. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 461–483. Stone AC, Milner GR, Paabo S, Stoneking M. 1996. Sex Determination of Ancient Human Skeletons Using DNA. Am J Phys Anthropol 99:231–238. Stone AC, Stoneking M. 1993. Ancient DNA from a pre-Columbian Amerindian population. Am J Phys Anthropol 92:463–471. 187 Stone AC, Stoneking M. 1998. mtDNA analysis of a prehistoric Oneota population: implications for the peopling of the NewWorld. Am J Hum Genet 62:1153–1170. Stone AC, Stoneking M. 1999. Analysis of ancient DNA from a prehistoric Amerindian cemetery. Philos Trans R Soc London Ser B 354:153–159. Stoneking M. 2000. Hypervariable sites in the mtDNA control region are mutational hotspots. Am J Hum Genet 67:1029-1032. Stout SD. 1978. Histological Structure and its preservation an ancient bone. Curr Anthropol 19(3):601–604. Stuart BL, Dugan KA, Allard MW, Kearney M. 2006. Extraction of nuclear DNA from bone of skeletonized and fluid-preserved museum specimens. Syst Biodivers 4(2):133– 136. Swango KL, Timken MD, Chong MD, Buoncristiani MR. 2006. A quantitative PCR assay for the assessment of DNA degradation in forensic samples. Forensic Sci Int 158:14–26. Tallbear K. 2000. Genetics, culture and identity in Indian country. 7th International Congress on Ethnobiology, Athens, Georgia, October 23–27, 2000. http://www.iiirm.org/publications/Genetics/ISEPaper.pdf. 188 Tambets K, Kivisild T, Metspalu E, Parik J, Kaldma K, Laos S, Tolk HV, Golge M, Demirtas H, Geberhiwot T, Papiha SS, Stefano GF, Villems R. 2000. The Topology of the Maternal Lineages of the Anatolian and Trans-Caucasus Populations and the Peopling of Europe: Some Preliminary Considerations. www.ebc.ee/EVOLUTSIOON/publications/Tambets2000.pdf. Taubenberger JK, Reid AH, Frafft AE, Bijwaard KE, Fanning TG. 1997. Initial genetic characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus. Science 275:1793–1796. Taylor GM, Widdison S, Brown IN, Young D. 2000. A medieval case of lepromatous leprosy from 13–14th century Orkney, Scotland. J Archaeol Sci 27:1133–1138. Taylor JW, Swann EC. 1994. DNA from herbarium specimens. In: Hummel S, Herrmann B, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag. p 166–181. Tefferi A. 2006. Genomics Basics: DNA structure, gene expression, cloning, genetic mapping and molecular tests. Semin Cardiothorac Vasc Anesth 104:282–290. Torroni A, Huoponen K, Francalacci P, Petrozzi M, Morelli L, Scozzari R et al. 1996. Classification of European mtDNA from an analysis of three European populations. Genetics 144:1835–1850. 189 Tuross N. 1993. The other molecules in ancient bone: noncollagenous proteins and DNA. In: Lambert J, Grupe G, editors. Molecular Archaeology of Prehistoric Human Bone. Berlin: Springer. p 275–294. Tuross N. 1994. The biochemistry of ancient DNA in bone. Experientia 50: 530–535. Underhill PA, Jin L, Lin AA, Mehdi SQ, Jenkins T, Vollrath D, Davis RW, Cavalli-Sforza LL, Oefner PJ. 1997. Detection of numerous Y chromosome bilalelic polymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography. Genome Res 7: 996–1005. Von Wurmb-Schwark N, Harbeck M, Wiesbrock U, Schroeder I, Ritz-Timme S, Oehmichen M. 2003. Extraction and amplification of nuclear and mitochondrial DNA from ancient and artificially aged bones. Leg Med 5:169–172. Von Wurmb-Schwark N, Schwark T, Harbeck M, Oehmichen M. 2004. A simple duplexPCR to evaluate the DNA quality of anthropological and forensic samples prior short tandem repeat typing. Leg Med 6:80–88. Walker PL. 2008. Bioarchaeological ethics: A historical perspective on the value of human remains. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 3–40. 190 Wallace DC. 1994. Mitochondrial DNA sequence variation in human evolution and disease. Proc Natl Acad Sci USA 91:8739–8746. Watt KE. 2003. Decontamination techniques in ancient DNA analysis. Master’s Thesis. Simon Fraser University, Canada. Wayne RK, Leonard JA, Cooper A. 1999. Full of sound and fury: the recent history of ancient DNA. Ann Rev Ecol Syst 30:457–477. Wenk RE. 2004. Testing for parentage and kinship. Curr Opin Haematol 11:357–361. Willerslev E, Cooper A. 2005. Ancient DNA. Proc Biol Sci 272:3–16. Wilson MR, Polanskey D, Butler J, Dizinno JA, Replogle J, Budowle B. 1995. Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts. Biotechniques 18:662–669. Wisely SM, Maldonado JE, Fleischer RC. 2004. A technique for sampling ancient DNA that minimizes damage to museum specimens. Conserv Genet 5:105–107. Yang DY, Eng B, Waye JS, Dudar JC, Saunders SR. 1998. Technical Note: Improved DNA Extraction From Ancient Bones Using Silica-Based Spin Columns. Am J Phys Anthropol 105:539–543. 191 Yang DY, Watt K. 2005. Contamination controls when preparing archaeological remains for ancient DNA analysis. J Archaeol Sci 32:331–336. Yang H, Golenberg EM, Shoshani J. 1997. A blind testing design for authenticating ancient DNA sequences. Mol Phylogenet Evol 7(2):261–265. Yao Y, Zhang Y. 2003. Pitfalls in the analysis of ancient human mtDNA. Chinese Sci Bull 48(8):826–830. Zhang Y, Yu LJ, Qian R. 2004. The eastern Pompeii–the Lajia site. Silk Road 4:11–14. Zierdt H, Hummel S, Herrmann B. 1996. Amplification of human short tandem repeats from Medieval teeth and bone samples. Hum Biol 68:185–199. Zink AR, Molnar E, Motamedi N, Palfy G, Marcsik A, Nerlich AG. 2007. Molecular history of Tuberculosis from ancient mummies and skeletons. Int J Osteoarchaeol 17:380– 391. 192 EKLER 193 EK I Mitokondriyal DNA HVRI 16147–16294 baz çifti arasındaki CRS dizini LOCUS NC_012920 16569 bp mtDNA circular PRI 8-JUL-2009 DEFINITION: Homo sapiens mitochondrion, complete genome. ACCESSION AC_000021 VERSION AC_000021.2 GI:115315570 PROJECT GenomeProject:30353 SOURCE mitochondrion Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens 1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt … 16141 acttgaCcac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16201 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16261 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccaCccttaa cagtacatag tacataaagc … 16561 atcacgatg. (http://www.mitomap.org/bin/view/MITOMAP/HumanMitoSeq). 194 EK II TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, CA) içinde yer alan ve çalışmada kullanılan klonlama vektörünün (pCR®2.1-TOPO®) gen haritası 195 EK III Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Ticari Kitler Agaroz BIOMATIK Ampisilin BIOMATIK Borik asit BIOMATIK Etilen Diamin Tetra Asetik asit (EDTA) BIOMATIK İzopropil-β-D-tiyo-galaktosid (IPTG) BIOMATIK Lambda DNA BIOMATIK Luria-Bertani agar BIOMATIK Proteinaz K BIOMATIK PstI BIOMATIK Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) BIOMATIK Trisbaz BIOMATIK X-Gal BIOMATIK 10X Taq Buffer +(NH4)2SO4 -MgCl2 FERMENTAS BSA 100X (10 mg/mL) FERMENTAS dNTP Set (25 µmol, 100mM) FERMENTAS MgCl2 (25 mM) FERMENTAS Taq DNA polimeraz-rekombinant (5 u/µl) FERMENTAS QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN TOPO TA Cloning® Kit (with pCR®2.1-TOPO® vector) INVITROGEN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit APPLIED BIOSYSTEMS 196 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı: ŞEYDA ŞEBNEM ÖZCAN Doğum Yeri, Tarihi: Ankara, 22.11.1980 Ünvanı: Araş. Gör. Öğrenim Durumu Derece Lisans Y. Lisans Doktora Alan Biyoloji Bölümü Adli Tıp Enstitüsü Adli Tıp Enstitüsü Üniversite Marmara Üniversitesi İstanbul Üniversitesi İstanbul Üniversitesi Yıl 2002 2005 Yüksek Lisans Tezi Biyolojik Leke ve İskelet Kalıntılarının Kimliklendirilmesi: Sorunlar ve Çözüm Önerileri, 2005, Danışman: Prof. Dr. Ersi Abacı Kalfoğlu Meslek Deneyimi Temmuz 2009 Misafir Araştırmacı (Botanik Bölümü, Smithsonian Institution, Washington DC, ABD) Ocak – Nisan 2008 Misafir Araştırmacı (Biyomoleküler Arkeoloji Araştırma Birimi, Manchester Disiplinler Arası Araştırma Merkezi, Manchester Üniversitesi, İngiltere) Ocak – Mart 2005 Misafir Araştırmacı (Genetik Bölümü, Stanford Üniversitesi, CA, ABD) Temmuz 2003 – devam Araştırma Görevlisi (Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul Üniversitesi) Araştırma Alanları Adli Genetik, Biyoarkeoloji, Biyoarkeolojik Örneklerde DNA Analizi, Biyolojik Deliller, Cinsel Suçlar, Çevre Suçları, Olay Yeri İncelemeleri, Popülasyon Genetiği. 197 Yayınlar SCI, SSCI kapsamındaki uluslararası hakemli dergilerde yayınlanan makaleler: 1. S. Sebnem Ozcan, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, Yani Kocias, Ersi Abaci Kalfoglu, Sevil Atasoy (2009) A new approach in the identification of degraded paternity samples. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, Volume 2, Issue 1, 174–175. 2. Ersi Abaci Kalfoglu, Reza Dashti, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, S. Sebnem Ozcan, Mansur Beyazyürek, Sevil Atasoy (2009) The Relevance between Dopamine D3 Receptor Gene Variations and Drug Addiction. Forensic Science International: Genetics Supplement Series, Volume 2, Issue 1, 489–490. 3. S. Sebnem Ozcan, Hulki Akin, Hakan Bayram, Musa Bas, Ahmet Yildiz, Atalay Ozdemiroglu (2009) Utilization of Police Dogs: A Turkish Perspective. Policing: An International Journal of Police Strategies & Management, 32: 2, 226–237. 4. R. J. King, S. S. Ozcan, T. Carter, E. Kalfoğlu, S. Atasoy, C. Triantiphyllidis, A. Kouvatsi, A. A. Lin, C-E. T. Chow, L. A. Zhivotovsky, M. Michalodimitrakis, P. A. Underhill (2008) Differential Y-chromosome Anatolian Influences on the Greek and Cretan Neolithic. Annals of Human Genetics, 72, 205–214. 5. Rehat Faikoglu, Hülya Yükseloglu, Sebnem Özcan, Gabriel Petridis, Itır Tari, Ersi Abaci Kalfoglou (2007) The gynaecologist as an expert witness in cases of sexual abuse. Reproductive Biomedicine Online, 15: 1, 41–42. 6. Seyma Uysal, Gavril Petridis, Sebnem Ozcan, Rehat Faikoglu, Devrim Barcak, Hulya Yukseloglu, Ersi Abacı-Kalfoglou, Sevil Atasoy (2006) The Use of DNA Microsatellite Loci for "Caretta Caretta" Identification. J. Environ. Sci. Health, Part A, Vol. A 41, No.9, 1981–1987. 7. Ersi Abacı Kalfoglou, Rehat Faikoglu, Sebnem Özcan, Gabriel Petridis, Hülya Yükseloglu, Sevil Atasoy (2006) DNA analysis as a tool for breast cancer malpractice determination: An interdisciplinary approach. Oncology Reports, 16: 1, 203–206. Uluslar arası bilimsel toplantılarda sözlü veya poster olarak sunulmuş ve özeti yayınlanmış, tez konusu ile ilgili bildiriler: 1. S. Sebnem Ozcan MS, Gabriel Petridis MS, E. Hulya Yukseloglu PhD, Ersi Abaci Kalfoglu PhD, Sevil Atasoy PhD. “Old bone material, power of exclusion and the conventional systems in identification”. 4th Congress of the Balkan Academy of Forensic Sciences, 8–11 Haziran 2006, Stara Zagora, Bulgaristan. 2. E. Abaci-Kalfoglou, S. Ozcan, G. Petridis, H. Yukseloglu, Y. Kocias, S. Atasoy. “Extraction/Isolation Techniques for Ancient mtDNA Analyses”. International Congress on Biomedical Sciences in Archaeology, 24–26 Eylül 2008, Heraklion, Yunanistan. 3. S. S. Ozcan, M. Y. İşcan, E. Abaci-Kalfoglou. “Ancient DNA analysis for the kinship determination of Urartu burials”. International Congress on Biomedical Sciences in Archaeology, 24–26 Eylül 2008, Heraklion, Yunanistan. 198 4. S. S. Ozcan, M. Y. İşcan. “The intersection between forensic evidence and archaeological specimen”. 6th Meeting of Balkan Academy of Forensic Sciences, 18–21 Haziran 2008, Kavala, Yunanistan. 5. Gavril Petridis MS, S. Sebnem Ozcan MS, Ersi Abaci Kalfoglou PhD, Yani Kocias PhD, E. Hulya Yukseloglu PhD, Sevil Atasoy PhD. “The Application of mini-STRs in DNA analysis from skeletal remains of a father and son in the same grave”. 5th European Academy of Forensic Sciences Congress, 8–11 Eylül 2009, Glasgow, UK. 6. S. Sebnem Ozcan, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, Yani Kocias, Ersi Abaci Kalfoglou, Sevil Atasoy. “A new approach in the identification of degraded paternity samples”. 23rd Congress of the International Society of Forensics Genetics, 15-18 Eylül 2009, Buenos Aires, Arjantin. Projeler Proje Yürütücüsü, “Biyolojik Leke ve İskelet Kalıntılarının Kimliklendirilmesi: Sorunlar ve Çözüm Önerileri” Yüksek Lisans Tez Projesi, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği, Proje Numarası: T-658/17032005. Proje Yürütücüsü, “Arkeolojik Toplumlarda Akrabalık İlişkileri: Bir Moleküler Antropolojik Yaklaşım” Doktora Tez Projesi, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği, Proje Numarası: 2571. Yurt içi kaynaklı projede yardımcı araştırıcı “Biyomoleküler Arkeoloji ve İdantifikasyon”, İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi Bilimsel Yayın Projesi No. 3080, 13–31 Temmuz 2009, Smithsonian Institution, Washington DC, ABD. Yurt içi kaynaklı projede yardımcı araştırıcı, “Türkiye’de Ağır Ceza Mahkemelerinde görülen dava dosyalarının incelenmesi yoluyla suç analizi”, İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi Bilimsel Yayın Projesi No. 3079. Burslar TÜBİTAK 2214- Yurt Dışı Araştırma Burs Programı; “Kouphovouno, Laconia’da bulunan Orta Tunç Çağı definleri arasındaki genetik bağlantılar”, 26 Ocak – 26 Nisan 2008, Manchester Interdisciplinary Biocentre, The University of Manchester, İngiltere. 199
