Flow Sitometri – Akan Hücre Ölçer Akım Sitometrisi

Flow Sitometri – Akan Hücre Ölçer
Akım Sitometrisi
Günnur Deniz
DETAE
İmmünoloji Anabilim Dalı
[email protected]
Sitoloji
Mikroskop
Gözlemci
Morfoloji
İmmünositoloji
Membran/hücre içi
yapılar
Boya işaretli
monoklonal antikorlar
(mab)
Akan hücre ölçer prensibleri
Mikroskop
Akan hücre ölçer
Laserbeam (Argon 15 mV)
Fluidics
Flow cell
Detectors/Computer
Akan hücre ölçer nedir?
Süspansiyon halindeki hücreleri bir akış
kanalından, belli bir hızda tek tek geçerken
sınıflandıran sistem
Avantajları
•  çok sayıda hücre analizi (106 hücre)
•  kısa sürede analiz
•  „gating-kapılama“ hücre popülasyonlarının analizi
•  rare events ölçümü
•  floresan yoğunluğunun objektif ölçümü
•  her hücrede 8-10 parametrenin saptanabilmesi
Multiparametrik analizler
Simultane olarak çok sayıda
parametrenin analizi
Hücre büyüklüğü
Hücre yapıları
Boyalar
Prensipleri
•  Örnek toplayıcı ve taşıyıcı sistem
•  Akış sistemi (sheat fluid)
•  Işık kaynağı
•  Sferik ve çapraz silindirik filtreler
•  Odaklama aynaları
•  Sinyal dedektörleri
•  Bilgisayarlar
•  Ayırma mekanizması
Akan hücre ölçer - prensipleri
Amaç:
Tek hücre seviyesinde analiz
Çözüm:
Hydrodynamic focusing
Akan hücre ölçer hangi sistemlerinden oluşur?
Hidrolik sistem
Hidrolik sistem partiküllerin sistem sıvısı ile
birlikte lazer ile buluştukları nokta
flow cell - flow kabin’e taşınması
Optik sistem
Işık sinyallerinin oluşumunu ve toplanmasını sağlar
Elektronik sistem
Optik sinyalleri amplifiye ederek elektrik
sinyallerine dönüştürür. Elektrik sinyalleri
bilgisayar tarafından işlenir ve analiz edilir
Hydrodynamic Focusing
Hücre + örnek sıvısı
Kapiller
Flow kabin
Laser
düşük
flow akımı
Cell-free
Sheath fluid
yüksek
flow akımı
Akselerasyon
Dedeksiyon
Hydrodynamic focusing
Yüksek örnek basıncı
Geçen numune miktarı
60µl/dk
Düşük örnek basıncı
Geçen numune miktarı
12µl/dk
Laminar
Flow
Laminar
Flow
Sheath/Sistem Sıvısı
Sheath Sheath
Sample/Örnek
Sheath/Sistem Sıvısı
Sample/Örnek
Optik sistem (FACSCalibur)
FL1
530/30
SSC 488/10
FL2 585/42
FL4
90/10 Beam Splitter
661/16
DM 560SP
DM 640LP
670LP
Yarım Ayna
Floresans toplama lensi
FL3
Beam Combiner
488 nm
Blue Laser
FSC Diode
Flow
Cell
Red Diode Laser
~635 nm
488/10
Lazer
Lazer
Dalgaboyu
(nm)
Nominal
Güç (mW)
Yaygın Kullanılan
Florokromlar
Argon ion
488 (blue)
15.0
FITC, PE, PerCP,
PerCP-Cy 5.5, PI
Diode 647
635 (red)
3-5
APC, Alexa Fluor®
Multilaser flow sitometri
Filtreler
Dedektör
Filtre
Renk
Florokrom
FL1
530/30nm
(515-545)
yeşil
FITC/Alexaflour 488
FL2
585/42nm
(561-609)
sarı/turuncu
PE
FL3
670
koyu kırmızı
670 ve yukarısı
PerCP, PreCP-Cy5.5
PE-Cy5, PE-Cy7
FL4
661/16nm
(653-677)
APC, Alexa Flour 647
kırmızı
Elektronik sistem
Photon
In
Voltage Pulses
LIN
Signal Out Pre Amplifier
LIN
FSC
LOG
Fotodiyot parametreleri
FSC
Time
Lazer
Voltaj
Voltaj değerlerinin oluşması
Lazer
Voltaj
Zaman
Lazer
Voltaj
Zaman
Zaman
Alanı
Yüksekliği
Volts
FL2-H
Voltaj değerlerinin hesaplanması
0
Genişliği
FL2-W
FL2-A
40
Elektronik sistem
SSC
Time
LIN
Photon
In
Signal Out
LOG
FL1
Time
Voltage
In
PMT
Power Supply
LOG
FL2
Time
FL3
Time
FL4
Time
Orange
SSC
Time
Time
Time
Green
FSC
Data
Processor
boards
FSC
SSC
Green
Time
Orange
Time
Red
Hücre Sayısı
Dijital ortamda görüntüleme/Dot Plot
0
Histogram plotunda kanallara göre
hücrelerin yerleştirilmesi
500
1023
Aynı florasan yoğunluğuna sahip
olan hücreler aynı kanala
yerleştirilir
490
500
Florasan yoğunluğu artar
510
Parametreler
Side-Scatter (SSC)
= hücre içi yapılar
Laser
Forward-Scatter (FSC)
= büyüklük
Fluorescence intensity (FL)
= antijen ekspiresyonu
1000
400
600
Nötrofiller
Monositler
200
Side Scatter
800
Eosinofiller
0
Lenfosit
Bazofil
0
200
Trombosit ve
Eritrositler
400
600
800 1000
Forward Scatter
epitop
Antijen 1
Antijen 2
Antijen 3
Tanıma
Tanıma
Tanıma
antikor
Monoklonal antikorlar
CD = cluster of differentiation
İnsan lökosit antijenlerine karşı tüm antikorların
klasifikasyonu (VI. Workshop, Kobe 1997)
Bir CD-numarası aynı insan antijenini
saptayan tüm antikor klonlarını içerir
Ör: CD34 mab-klonları:Q Bend 10, 581, Immu-133
Fluorokromlar
Floresan boyamada antikorlar aracılığı
ile antijeni göstermek için kullanılan
renk maddeleri
Fluorokromlar
ışığı absorbe edebilen molekül
komponentleridir, aromatik halkalardır
dalga boyu uzun enerji düşük
dalga boyu kısa enerji yüksek
Eksitasyon kaynakları
Lambalar
Xenon
Xenon/Mercury
Laserler
Argon lon (Ar)
Krypton (Kr)
Violet 405
Helium Neon (He-Ne)
Helium Cadmium (He-Cd)
Krypton-Argon (Kr-Ar)
Işık
Farklı dalga boyları arasında
seyahet eden elektromanyetik enerji
Dalga boyunun uzunluğu (lenght)
RENK
Yüksek
enerji
UV
M
Düşük
enerji
M
Y
S
Görülebilen alan
380-700nm
P
K
İnfrared
488nm eksitasyonla sık kullanılan boyalar
LAZER
488
<390 λ
400-450 λ
450-500 λ
ultraviolet
violet
blue
FITC
520
500-570 λ
green
PE
575
ECD PI
615 620
570-590 λ 590-620 λ
yellow
orange
PC5
665
620-750 λ
>750 λ
red
infrared
FITC
= Fluorescein Isothiocyanate
PE
= Phycoerythrin (RD1)
ECD
= Energy Coupled Dye
PI
= Propidium Iodide
PC5
= Phycoerythrin Cyanin 5 (PC5)
Fluorokrom seçimi
düşük örnek
CD13
CD19
CD33
Antijen miktarı
yüksek
CD3
CD45
HLA-DR
konjuge
PE-RD1
PC5
FITC
ANTİKORUN TİTRASYONU ÖNEMLİDİR
FARKLI DİLÜSYONLARDA ANTİKOR
KULLANARAK ORTALAMA KANAL
FLORESAN DEĞERİ ‘MCF’
SAPTANMALIDIR
HER YENİ ANTİKORDA
KONTROL
Örnekler
•  Kan
•  Kemik iliği
•  BAL
•  Eklem sıvısı
•  Plevra sıvısı
•  Ascites
•  Tumor
Hücre
süspansiyonu
Boyama
Teknik
PE
FITC
Fluorokrom işaretli
antijen sipesifik mab
(FITC, PE)
HEDEF
Tek bir hücrede farklı
antijenlerin saptanması
multiparametrik-analiz
Direkt işaretleme
İŞARETLİ
ANTİKOR
İndirekt işaretleme
İŞARETLİ
İKİCİ ANTİKOR
PRİMER
ANTİKOR
İndirekt işaretlemenin avantaj ve dezavantajları
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
İkinci antikor birden fazla primer antikorun
işaretlenmesinde kullanılabilir
İşaretli olmayan antikorlar, işaretli primer
antikorlardan daha ucuzdur
Her zaman işaretli primer antikor mevcut
değildir
İndirekt işaretleme az sayıda eksprese olan
epitoplara sahip hücrelerin saptanmasında
faydalıdır
A
B
C
FITC
FITC
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
Floresan yoğunluğu
Gating-Kapılama
ZweiparameterKorrelation
FSC
= hücre Zellgröße
büyüklüğü
FSC=
SSC
= hücre
yapısı
SSC=
Zellstruktur
Morphologie
Hücre
alt gruplarının
Ziel
Analizi
MessungvonSubpopulationen
ör. Lenfositler
z.B.Lymphozyten
Sinyal analizi
İki parametrenin korelasyonu
Kapılama
Görüntülenmek istenen hücre populasyonunun
saptanması
Kadran
Negatif ve pozitif populasyonların belirlenmesi
için kullanılır
Kapılanan Bölge ve Kadran İstatistiği
UL
LL
UR
LR
Kadranlar
Tek
pozitif
Negatif
13.1
27.
1
59.5
0.4
Çift
pozitif
Tek
pozitif
10 4
250
0
50
100
150
FSC-Height
200 250
10 0
10 1
10 2
CD19 PE
10 3
200
150
100
50
0
R1
10 0
10 1
10 2
CD3 FITC
10 3
104
10 4
10 3
10 4
10 3
CD4 FITC
10 3
10 4
10 2
10 2
10
10 1
10
10 0
CD8 PE
CD4 FITC
1
10 4
0
CD3 APC
10 3
10
10 2
0
10 1
10 3
10 1
CD8 PE
10 4
10 2
10 2
CD4 FITC
10 1
10 0
10 0
10 0
10 1
10 2
CD3 APC
10 3
10 4
Nokta alan
Kontur alan
Nükleik asit asit boyası SYTO-9 ile boyanmış E. Coli
3 Boyutlu Grafik
Sayı
SSC
FL1
BOYAMA
n 
TEK
n 
İKİ
n 
ÜÇ
n 
DÖRT
n 
ON SEKİZ
CD4
CD19 CD8
CD3
CD56
Fluorescence Intensity
Fluorescein
molecule
450
488 nm
500
575 nm
550
600
PE
molecule
650
Wavelength (nm)
Overlap of FITC fluorescence in PE PMT
Overlap of PE fluorescence in FITC PMT
Emisyon sırasında farklı boyaların
spektrumlarının birbirine geçmesi durumu
Kompenzasyon
Kompenzasyon
Yapılmış
FL2
FL2
Kompenzasyon
Yapılmamış
FL1
FL1
FITC - PE
Önce
Sonra
Flurosence Minus One
(FMO)
Çok renkli boyamalarda kullanılır
Fazla photon - (hücreler daha cok parlar) ölçümlerde hata riski artar
Dogru kompanzasyon yapıldıgında tüm kanallara yayılma ile sonuclanır
fakat parlak populasyonlarda daha fazla oldugu gozlenmis
Örnekte aynı hücre tiplerinin bir fluorokrom eksigi ile boyanması
Deneyin kapılama kontrolü olarak kabul edilebilir. High-Speed Sorter
Analyzer
Bench top
İmmün sistem
Hücresel immün yanıt
M
Hümoral immün yanıt
T
B
G
Akan hücre ölçer - uygulamalar
Membran yapıları
antijenler/reseptörler
Hücreiçi yapılar
sitokinler
enzimler
•  Hücresel immün fenotipleme
•  İmmün yetmezlikler
•  Bronko alveolar lavaj
•  Transplantasyon monitoring
•  Tedavi monitoring
•  Otoimmün hastalıklar
•  HLA-tiplemesi
•  Lösemi lenfoma tiplemesi
•  Stem ve progenitör hücrelerin belirlenmesi
•  Retikülosit sayımı
•  Sepsis takibi
•  Oxidatif burst
•  Fagositoz
•  Enzim ve enzim aktivitelerinin saptanması
•  Trombosit analizi
•  DNA analizi
•  Multi-drug resistance
•  Hücre proliferasyonu
•  Apoptoziz
The Turkish Journal of Pediatrics 2004; 46: 125-130
Sağlıklı
CD45
CD16+CD56+
CD3
CD3
HLA-DR
CD8
CD19
CD4
%CD45=%CD3+%CD19+%NK
CD3
T=%CD3=%CD4+%CD8
IU, DETAE, 2012
HIV
IU, DETAE, 2012
Rituximab
IU, DETAE, 2012
İmmunfenotiplemede artefakt nedenleri
Ø 
İlaçlara Bağlı
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Zidovudine (AZT): Granülosit frajilitesi artar
Antibiyotikler (Cephalosporinler): Hücrelerin öz ışımasını
(Otofloresans) artırırlar, yanlış pozitifliklere yol açarlar
Anti kanser ilaçlar (Daunorubicin): Hücrelerin öz ışımasını
(Otofloresans) artırırlar, yanlış pozitifliklere yol açarlar
Nikotin: Lenfosit marjinasyonu nedeni ile lenfosit sayısı azlığına yol
açarlar, absolut lenfosit sayısı normalden daha düşük izlenir
Kortikosteroidler: CD4+ hücre oranını azaltırlar
Ø 
Biyolojik Faktörler
Ø 
Ø 
Ø 
Retikülositoz: Eritrosit lizisinin tam sağlanamaması lökosit
popülasyonuna eritrosit bulaşması
Aşırı eksersiz: Lenfosit marjinasyonunun artışı, absolut lenfosit
sayılarında azalma
Güniçi değişkenlik: NK düzeylerinin sabah daha düşük, akşamüzeri
daha yüksek olması vb.
Örnek alma, taşıma ve saklama koşulları
Özellikle granülosit ve trombosit gibi frajil hücrelerin çabuk
bozulması, ölü hücrelerin analiz alanında yanlış sonuçlara yol
açmasına neden olabilir.
Uygun olmayan ısıda, uygun olmayan antikoagülan içinde taşınan
hücrelerin membran yapıları değişirken yüzeydeki antijen
reseptörleri de değişime uğrar.
Geçme/Kalma kriteri
Günlük Kalite
Kontrol
Sorunun
Çözümü
Hasta Analizi
Lazer Ayarının
Kontrolü
Örneği Geçirme
Teknik
Servis
Sonuçları
Floresan
Kalibrasyonu
Sorun Giderme
KAL
Elde Etme
Renk
Kompenzasyon
Rapor Oluşturma
İşlem/Yöntem
Kontrolü
GEÇ
Klinik
Laboratuvar
Sinyal analizi
Antijen yoğunluğu ~ Fluorescence intensity = X Kanal sayısı
Hücre sinyali
% + A hücreler
Antijen yoğunluğu
Hücre sayısı
A
0
Kanal sayısı
1024
X kanal sayısı
En yüksek maximum sinyalin
saptandığı değer o antikor için
uygulanması gereken dilüsyondur