FİKSASYONUN NÜKLEİK ASİT VE PROTEİN İÇERİĞİNE ETKİSİ

FİKSASYONUN
NÜKLEİK ASİT VE PROTEİN
İÇERİĞİNE ETKİSİ
Dr. Zafer KÜÇÜKODACI
GATA HEH Patoloji Servisi
22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ
7 Kasım 2012
Manavgat
BAŞLANGIÇ MATERYALİ
BAŞLANGIÇ MATERYALİ
FİKSASYON
a. Anestezinin türü
b. Anestezinin süresi
c. İntraoperatif anoksik hasar
d. Prefiksasyon zamanı
1. Fiksatifin özellikleri
a. Kimyasal yapısı
b. Doku penetrasyonu
2. Fiksasyon koşulları
a. Isı
b. Süre
c. pH
d. Konsantrasyon
e. Örneğin büyüklüğü
f. Fiksatifin hacmi
1. Saklama koşulları
a. Süre
b. Isı
c. Saklama şekli
2. Hedef moleküller
a. DNA
b. RNA
c. Proteinler
AMAÇ
‘ Hücre ve hücreler arası matriksi
biyolojik koşulları koruyarak
inceleyebilmek ’
Morfolojik detayları ve moleküler yapıları korumak
• Toksik olmasın
• Ucuz olsun
KOVALENT ÇAPRAZ BAĞ OLUŞTURANLAR
Çapraz kovalent bağlar: Aminogruplar, Metilen köprüleri
Formalin, Gluteraldehit
PRESİPİTASYON OLUŞTURANLAR
Dehidrasyon, denatürasyon, konformasyon deformitesi*, koagülasyon
Etanol, Metanol, Aseton, Asetik asit
KARIŞIMLAR
Hollande, Bouin, Zenker, B5
YENİ KUŞAK (TİCARİ İSİMLERİ İLE)
HOPES, UMFIX, FineFIX, Z7
Moleküler prezervasyon
DNA, RNA ve Protein içeriği
moleküler uygulamalar için uygun mudur?
HİBRİDİZASYON
DNA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Taze doku
Dondurulmuş doku
Yeni kuşak fiksatifler
Etanol
Formalin
Diğer *
RNA
1-4, 5
PROTEİN
1-3, 4, 5
AMPLİFİKASYON
1-6
1-4, 5
ELEKTROFOREZ
1-5, 6
1-4, 5
1-3, 4, 5
DNA PREZERVASYONU
FİKSASYON ALTERNATİFLERİ
1.Etanol
2.Formalin
3.Bouin
4.B5
5.Zenker
6.Hollande
AMPLİFİKASYON
ELEKTROFOREZ
HİBRİDİZASYON
Baloglu et al, AIMM 2008
FORMALİN
ZENKER
1.FİKSATİFİN TİPİ
ETANOL ve FORMALİN
2.FİKSASYON KOŞULLARI
Isı
Süre
pH
Konsantrasyon
Örneğin büyüklüğü
Fiksatifin hacmi
• Uygun olmayan konsantrasyon
(n=5) veya pH (n=4)
• Taze doku örnekleri
– tiroid (n=10)
– kolon (n=10)
– meme (n=10)
• 3mm çaplı punch biyopsiler
• 100cc hacimde 24 saat
• Rutin parafin bloklama
• 10 µm kalınlığında 5’er kesit
Örneklerin tamamından 2-10 µg
total DNA elde edilmiştir.
14
Ekstrakte edilen DNA (µg)
12
10
tiroid
kolon
meme
8
6
4
2
0
pH
3.65
pH
4.38
pH
6.03
pH
8.88
10%
11%
12%
20%
30%
40%
Formalin fiksasyonunun DNA içeriğine etkisi
Formalin fiksasyonunun DNA içeriğine etkisi
MP uygulamaları için
ideal fiksatif arayışı
Formalin kadar iyi morfolojik detay
Canlı doku kadar iyi moleküler prezervasyon
FineFIX, etanol (%65-75), distile su,
gliserol, polivinil alkol ve monomerik
karbonhidratların karışımıdır
(European patent N. EP 1455174B1
– December 15th 2004)
FineFIX vs Formalin
Giorgio Stanta et al, Diagn Mol Pathol Volume 15, Number 2, June 2006
339 bp
1000 bp
2400 bp
RNA PREZERVASYONU
170 bp
200 bp
600 bp
PROTEİN PREZERVASYONU
Z7
Z2: (0.5% zinc chloride, 0.5% zinc acetate, 0.05% calcium
acetate in 0.1M Tris–HCl pH 6.4–6.7).
Z2’deki ‘Zinc acetate’ yerine:
(1) zinc trifluoroacetate (17.16mM) (Z7)
(2) zinc citrate (8.10mM) (Z8)
(3) zinc trifluoroacetate 17.16mM+5% (v/v) DMSO (Z16)
(4) zinc tartrate (20.05mM) (Z17)
(5) zinc tartrate (20.05mM)+5% DMSO (Z18)
(6) zinc isovalerate (18.69mM) (Z19)
DNA PREZERVASYONU
RNA PREZERVASYONU
PROTEİN PREZERVASYONU
Fresh
Z7
NBF