DNA İzolasyon Sistemi

DNA ĐZOLASYON SĐSTEMĐ
KATALOG NUMARALARI
Mevcut olması gereken cihaz ve malzemeler:
SNPDNA-NMN (10 TEST)
•
10.000 rpm hız yapabilen mikrosantrifüj.
SNPDNA-5 (50 TEST)
•
Nükleaz free 1,5 ml tüp.
SNPDNA-10 (100 TEST)
•
42 °C ’ ye çıkabilen sıcak su banyosu ya da kuru ısıtıcılı blok.
•
% 99,5’lik Etil Alkol.
GĐRĐŞ
SNP DNA Đzolasyon Sistemi ile 250 µl örnekten hızlı ve kolay bir şekilde
Başlamadan Önce;
bakteri, virüs ya da Genomik DNA izolasyonu yapılabilmektedir. Bu metot ile
•
70 mg olan Solüsyon A’ yı 1.25 ml (1250 ul) nükleaz free steril su ile
serumdan, kandan, besiyerinden, lökositten, tükürükten, parafine gömülü
sulandırınız (sample miktarı ise 500 µl su ile sulandırmanız gerekir).
doku örneklerinden, sürüntüden ve gaitadan DNA elde edilebilir. Đşlem
Hafif
süreleri örneğe göre farklılıklar göstermektedir.
Sulandırılmış enzimi – 20 °C de saklayınız.
•
SĐSTEMĐN PRENSĐBĐ
çalkalamalar
ile
enzimin
tamamen
erimesini
sağlayınız.
Sıcak su banyosunu, inkübasyon için enzimin çalışma sıcaklığı olan 42
°C ye ayarlayınız.
SNP DNA Đzolasyon Sistemi, fenol/kloroform yöntemine dayalı bir kittir.
Parçalayıcı enzim ile inkübasyon sonrasında fenol/kloroform ile bir araya
KANDAN VE SERUMDAN DNA ĐZOLASYONU
getirilen DNA molekülleri, alkol ile proteinlerden ayrıştırılarak DNA eldesi
1. 1,5 ml nükleaz free tüp içine 500 µl Solüsyon B, 10 µl Sol A ve 50
tamamlanır.
ul kan (250 µl serum, 200 µl besiyeri pelleti vb. ) konulur.
Vortekslenir ve 42 °C ‘de 20 dk inkübe edilir (Doku örnekleri için biraz
daha uzun, inkübe edilebilir).
2. Tüpler üzerine 500 µl Solüsyon C konulur (Sol C, iki fazlı bir
solüsyondur. Alt fazından alınması gerekmektedir). Vortekslenerek süt
renginde bir sıvı oluşması beklenir. Daha sonra 12.000 rpm’de 5 dk
santrifüj edilir.
3. Oluşan 2 fazdan, üst kısımdaki berrak faz alınarak (~500 µl) temiz bir
1,5 ml nükleaz free tüpe koyulur. Üzerine 600 µl Solüsyon D konulur.
Tüp hafifçe ters düz edilerek karıştırılır. 30 dk oda sıcaklığında tercihen
1–2: Parafine gömülü biyopsi, 3–4: tükürük, 5: gaita
karanlık bir ortamda bekletilir (Örneğin özelliğine göre Solüsyon D
içerisinde bir gece bekletmek,
sağlayabilir)
SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ
Bileşen
•
Solüsyon A
•
Solüsyon B
•
Solüsyon C
•
Solüsyon D
•
Solüsyon E
•
Xylene (*)
sonuçların daha iyi çıkmasını
50 test
70 mg
30 ml
30 ml
30 ml
30 ml
100 ml
100 Test
70 mg x 2
60 ml
60 ml
60 ml
60 ml
200 ml
4. Solüsyon D içinde beklettikten sonra 12.000 rpm’de 10 dk santrifüj
edilir.
5. Süpernatant atılır ve üzerine 500 µl Solüsyon E konulur. 12.000
rpm’de 5 dk santrifüj edilir.
6. Süpernatant atılır. Tüpler 37 °C etüv veya kuru ısıtıcılı blok yardımı ile
kurutulur. Kurutma işleminden sonra 100 µl distile su ile sulandırılır.
Böylece DNA elde edilmiş olur. DNA içeriğinin yoğun olması durumunda
(*) Sadece parafine gömülü dokudan izolasyon için
daha fazla su da eklenebilir.
SAKLAMA KOŞULLARI
•
Solüsyon A, sulandırarak oluşturulduktan sonra – 20 °C de ve
BESĐYERĐNDEN DNA ĐZOLASYONU
karanlıkta saklanmalıdır.
•
•
Solüsyon C, + 2 - 8 °C de saklanmalıdır.
•
Diğer tüm bileşenler, oda sıcaklığında ve karanlıkta saklanmalıdır.
•
Solüsyonlar etiketlerindeki son kullanma tarihine kadar kullanılabilir.
Hücre kültürünün besiyeri 15 ml lik santrifüj tüplerine alınır ve 5000
rpm de 5 dk santrifüj edilir, süpernatant atılır.
Dipte bırakılan 1-2 ml’ lik pellet solüsyon vortekslenerek buradan 200 ul
alınır ve “Kandan ve Serumdan DNA izolasyonu” protokolünün 1.
adımından itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.
PARAFĐNE GÖMÜLÜ DOKUDAN DNA ĐZOLASYONU
•
Eküvyon alınır tüp içine Sol A eklenerek “Kandan ve Serumdan DNA
izolasyonu” protokolünün 1. adımından itibaren devam edilerek
Doku kesitlerinden (Kalınlık aralığı değişiklik gösterebilir ortalama 0,2
izolasyon tamamlanır.
µm) alınmış örneklerden bir veya iki tanesi 1,5 ml tüpe alınır. Alınan
kesitin doku içerdiğinden emin olunmalıdır.
•
ÖNERĐLER VE OLASI PROBLEMLER
Üzerine 1 ml Ksilen eklenir. Tüp hafifçe alt üst edilerek parafinin
çözülmesi sağlanır. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika bekletilir.
sulandırılmamalıdır. Fakat PCR için kullanılacağı zaman 200µl’ye kadar
Doku, 5000 rpm’de 1 dk santrifüj edilerek çöktürülür ve süpernatant
pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
•
sulandırılması iyi bir amplifikasyon için önerilir.
Pelet üzerine tekrar 500µl Ksilen eklenir ve tüp alt üst edilerek yine
devam
edilmelidir.
Dokular
tüp
çeperine
hafifçe
vurulduğunda parçalanmalıdır. Dokuların tamamen parçalanması için
uzaklaştırılır.
•
Dokudan izolasyon işleminde, dokular tamamen parçalanıncaya kadar
inkübasyona
santrifüj yapılır parafin iyice temizlenir. Süpernatant pipet yardımıyla
•
DNA‘ nın %2 ‘lik agaroz jelde görülebilmesi için DNA 50 µl’den fazla
inkübasyon gece boyunca sürdürülebilir.
Pelet üzerine Ksilen’i uzaklaştırmak için 1 ml % 99’luk alkol konulur
Örnekte süreden kaynaklanan bir bozulma
varsa, Solüsyon C
ve alt üst edilerek karıştırılır ve 5000 rpm ‘de 1 dk santrifüj edilerek
aşamasındaki faz oluşumunda problem yaşanabilir. Bu durumda eğer
doku çöktürülür. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
aynı örnekte 2 kez aynı problemle karşılaşılırsa örneğin değiştirilmesi
Đkinci yıkama 750 µl % 75’lik alkolle ve 3. yıkama işlemi ise 750 µl
önerilir.
dH2O ile yapılır. Her defasında tüp hafifçe çalkalanır, çöktürülür ve
süpernatant uzaklaştırılır.
öncelikle 1–2 dakika bekletilmelidir. Örnekteki bulanıklık geçmemişse
•
Bu işlemle doku parafinden arındırılmış olur.
Elde edilen örnek ile “Kandan ve Serumdan DNA izolasyonu”
protokolünün
1.
Yine Solüsyon C aşamasında berrak kısımda bulanıklık görülürse
adımından
itibaren
devam
örneğin yeniden vortekslenip santrifüj edilmesi tavsiye edilir.
edilerek
izolasyon
Daha yoğun DNA verimi için, örnekler, solüsyon D ile gece boyunca
inkübasyonda bırakılabilir.
tamamlanır.
TÜKÜRÜKDEN DNA ĐZOLASYONU
•
UYARILAR
Tükürük örnekleri bir 50 ml tüp içerisindeki ~1ml Solüsyon B içerisine
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklayınız.
alınır. Örnek, Solüsyon B içerisinde 6 ay oda sıcaklığında ve karanlıkta
•
Oda sıcaklığında unutulmuş enzim ve solüsyon C’yi kullanmayınız.
saklanabilir.
•
Solüsyonlar kullanılmadan önce gerekiyorsa tamamen eritilmeli ve
hafifçe çalkalanmalıdır.
Solüsyon içerisindeki tükürük örneği ile “Kandan ve Serumdan DNA
izolasyonu” protokolünün 1. adımından itibaren devam edilerek
izolasyon tamamlanır.
•
Belirtilenden fazla solüsyon konulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen protokolleri uygulayınız.
•
Solüsyonlar vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
örneklerden genomik DNA elde edilmesi için kullanılır.
GAĐTADAN DNA ĐZOLASYONU
•
Mercimek büyüklüğündeki gaita örneği 1,5 ml tüp içerisine alınır.
•
Đzolasyon sisteminin raf ömrü 12 aydır. Kullanmadan önce üretim veya
son kullanma tarihine dikkat edilmelidir.
Üzerine 750 µl kadar Nükleaz free steril su koyulur.
•
Yaklaşık 10 sn vortekslenerek 3000 rpm de 1 dk çevirilir.
•
Süpernatant (~750 µl)
temiz bir 1,5 ml tüpe alınır ve bu şekilde
yıkama işlemi 3 kere tekrarlanır. Her defasında pelet atılır ve
süpernatant üzerinden işlem yapılır.
En son alınan süpernatant (~500 µl) örneği ile “Kandan ve Serumdan
DNA izolasyonu” protokolünün 1. adımndan itibaren devam edilerek
izolasyon tamamlanır.
SÜRÜNTÜDEN DNA ĐZOLASYONU
Sürüntü pamuk uçlu eküvyon ile alınmışsa;
•
1,5 ml tüp içine 500 µl Sol B koyulur. Eküvyonun örnek alınmış ucu
tüp içine daldırılır ve 20 dk bekletilir.
Gerektiği durumlarda
[email protected]
Ar-Ge
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012
departmanımızdan
yardım
alabilirsiniz.