STREPTOZOTOCİNLE İNDÜKLENEN DİYABETLİ RATLAR
advertisement
STREPTOZOTOCİNLE İNDÜKLENEN DİYABETLİ RATLAR ÜZERİNDE Myrtus communis L. YAPRAĞI SU EKSTRESİ ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Hatice BAZ Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU Yüksek Lisans Tezi – 2014 T. C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ STREPTOZOTOCİNLE İNDÜKLENEN DİYABETLİ RATLAR ÜZERİNDE Myrtus communis L.YAPRAĞI SU EKSTRESİ ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Hatice BAZ Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU ERZURUM 2014 T. C. ATATURK UNi:vERSiTESi SAGLIK BiLiMLERi ENSTiTUSU ECZACR-IK BiYOKiMYA ANABiLiM DALI STREPTOZOTOCUNLEiNDVKLENENDiYABETLiRATLAR UZERiNDE Myrtus communis L. YAPRAGI SU EKSTRESi ETKiLERiNiN ARASTIRILMASI Hatice BAZ Tez Savunma Tarihi : 30.01.2014 Tez Dan~mam : Doy. Dr. Mine GOLABOGLU (Atatiirk Dniversitesi) Jiiri Uyesi : Doy. Dr. Yasin BA YIR (Atatiirk Universitesi) .j~ Onay Bu yah~ma yukandakijiiri tarafmdan Yiiksek Lisans Tezi olarak kabul Prof. D~~~:~l Enstitii Miidii.rU Yiiksek Lisans Tezi ERZURUM- 2014 edilmi~tir , İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR .................................................................................................................. IV ÖZET .............................................................................................................................. V ABSTARCT ................................................................................................................... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................. VII ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... X TABLOLAR DİZİNİ .................................................................................................... XI 1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER.................................................................................................... 3 2.1. Diabetes Mellitus’un Tanımı ..................................................................................... 3 2.2. Diabetes Mellitus’un Epidemiyolojisi ....................................................................... 3 2.3. Diabetes Mellitus’un Tanı Kriterleri......................................................................... 5 2.4.Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) .......................................................................... 5 2.5. Diabetes Mellitus’un Sınıflandırılması ...................................................................... 6 2.5.1. Tip I Diyabetes Mellitus (IDDM) ........................................................................... 7 2.5.2. Tip II Diabetes Mellitus (NIDDM) ......................................................................... 7 2.5.3. Gestasyonel Diyabet (GDM) ................................................................................ 10 2.5.4. Özel DM tipleri ..................................................................................................... 10 2.6. Diyabetes Mellitus’un Etiyolojisi ............................................................................ 11 2.6.1. Yaş ........................................................................................................................ 11 2.6.2. Cinsiyet ................................................................................................................. 11 2.6.3. Kalıtım .................................................................................................................. 12 2.6.4. Obezite .................................................................................................................. 12 2.6.5. Beslenme ............................................................................................................... 12 2.6.6. Fiziksel Aktivite.................................................................................................... 13 2.7. Diyabet Oluşumuna Etki Eden Faktörler ................................................................. 13 2.8. Diyabetin Komplikasyonları .................................................................................... 13 2.8.1.Diyabetin Akut Komplikasyonları ......................................................................... 13 2.8.2. Diyabetin Kronik Komplikasyonları .................................................................... 14 2.8.3. Diyabetin Mikrovasküler Komplikasyonları ........................................................ 14 2.8.4. Diyabetin Makrovasküler Komplikasyonları........................................................ 15 2.9. Diyabetin Tedavisi ................................................................................................... 15 I 2.9.1. Eğitim.................................................................................................................... 15 2.9.2. Diyet...................................................................................................................... 15 2.9.3. Egzersiz ................................................................................................................. 16 2.9.4. İnsülin Tedavisi..................................................................................................... 17 2.10. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar ................................................................... 19 2.10.1. Serbest Radikaller .............................................................................................. 19 2.10.2. Serbest Radikallerin Kaynakları ......................................................................... 24 2.10.3. Serbest Radikallerin Etkileri ............................................................................... 25 2.11. Oksidatif Stres........................................................................................................ 29 2.11.1. Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres ile İlişkisi ................................................ 30 2.11.2. Oksidatif Stres ve Diyabet Üzerine Etkisi .......................................................... 31 2.12. Antioksidan Savunma Mekanizmaları ................................................................... 35 2.12.1. Endojen (Doğal) Antioksidanlar ......................................................................... 36 2.12.2. Eksojen Antioksidanlar ....................................................................................... 41 2.13. Botanik Bilgiler...................................................................................................... 44 2.13.1. Myrtus comminus L.’nin Bilimsel Sınıflandırılması ve Binominal Adı ............. 44 2.13.2. Myrtus comminus L.’nin Genel Özellikleri ........................................................ 45 2.14. Myrtus comminus L.’nin Farmakolojik Özellikleri ............................................... 46 2.14.1. Myrtus comminus L.’nin Antioksidan ve Antimikrobiyal Aktivitesi ................. 46 2.14.2.Diğer Farmakolojik Özellikleri ............................................................................ 46 2.15. Myrtus comminus L.’nin Farklı Kullanım Alanları ............................................... 47 2.15. Myrtus comminus L.’nin Antidiyabetik ve Hipoglisemik Etkisi ........................... 47 3. MATERYAL VE METOT....................................................................................... 49 3.1. Deney Bitkileri ......................................................................................................... 49 3.2. Hayvanlar ................................................................................................................. 49 3.3. Mersin Yaprağı Ekstraktlarının Hazırlanması ......................................................... 49 3.4. Streptozotocin ile Diyabet Modeli ........................................................................... 50 3.4.1. Streptozotocinin Yapısı ve Etki Mekanizması...................................................... 50 3.4.2. Diyabet Oluşumu .................................................................................................. 50 3.5. İlaç Uygulaması ....................................................................................................... 51 3.6. Karaciğer Dokularının Biyokimyasal Analizi ......................................................... 52 3.6.1. Numunelerin Hazırlanması ................................................................................... 53 3.6.2. Antioksidan Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi ................................................. 53 II 3.6.3. Serumda Yapılan Analizler ................................................................................... 64 3.6.4. Kan Glukozu Ölçüm Prensibi ............................................................................... 65 3.7. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar......................................................................... 65 3.8. Deneylerde Kullanılan Cihazlar............................................................................... 66 3. 9. İstatistiksel Analiz................................................................................................... 67 4. BULGULAR .............................................................................................................. 69 5. TARTIŞMA ............................................................................................................... 76 6. SONUÇ VE ÖNERİLER.......................................................................................... 86 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 88 EKLER ........................................................................................................................ 119 EK-1. ÖZGEÇMİŞ ..................................................................................................... 119 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU ..................................................................... 120 EK-3. TEZ SAVUNMA SINAVI TUTANAĞI ........................................................ 121 EK-4. HAYVAN DENEYLERİ YEREL ETİK KURUL KARARI....................... 122 III TEŞEKKÜR Eğitimimin her aşamasında bilgilerinden ve deneyimlerinden yararlandığım, tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında yardım ve desteklerini esirgemeyen, bu çalışmanın ortaya çıkmasında büyük emeği olan, gösterdiği özveri ve anlayışdan dolayı değerli hocam, A. B. D. Başkanım ve Temel Bilimler Bölüm Başkan’ım sayın Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU’na; Yardım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen sayın Prof. Dr. Zekai HALICI’ya, sayın Prof. Dr. Zühal GÜVENALP’e, sayın Doç. Dr. Yasin BAYIR’a, sayın Doç. Dr. Mesut B. HALICI’ya, sayın Doç. Dr. Meltem ÇETİN’e, sayın Doç. Dr. Elif ÇADIRCI’ya, sayın Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU’na, sayın Yrd. Doç. Dr. Özgür KAYNAR’a, sayın Yrd. Doç. Dr.Fadime ATALAY’a, Uzm. Dr. Hilal Alkış’a, sayın Ögrt. Gör. Şule BAZ ÇİFTÇİ’ye, sayın Araş. Gör. Mustafa İLERİTÜRK’e, sayın Araş. Gör. Özlem AYDIN BERKTAŞ’a, sayın Araş. Gör. Zerrin KUTLU KOTAN’a; Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı ve Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalındaki sevgili asistan arkaşlarıma ve hiçbir zaman desteğini esirgemeyen BAZ ailesine sonsuz şükran ve teşekkürlerimi sunarım. Hatice BAZ IV ÖZET Streptozotocinle İndüklenen Diyabetli Ratlar Üzerinde Myrtus communis L. Yaprağı Su Ekstresi Etkilerinin Araştırılması Amaç: Diyabet dünyada çok sık görülen kronik bir hastalıktır. Akdeniz Bölgesinde yetişmekte olan Myrtus communis L. (Mersin bitkisi) yaprağı eskiden beri halk arasında şeker hastalığında yaygın olarak kullanılmaktadır. Mersin yaprağının, yağının ve meyvesinin diyabete etkileri üzerine birçok çalışma yapılmıştır. Fakat Mersin yaprağı su ekstresinin diyabet üzerine antioksidan etkilerini araştıran çalışmalar sınırlıdır. Bu çalışmada da normal ve streptozotocinle indüklenen diyabetik ratlarda mersin bitki yaprağının su ekstresinin antidiyabetik etkileri incelendi. Materyal ve Metot: Çalışmamızda altı gruptan oluşan 30 adet Sprague Dawley cinsi erkek rat kullanıldı. Mersin yaprağı su ekstresi 150, 300 ve 600 mg/kg (I, II ve III) dozlarında 14 gün boyunca normal ve diyabetli ratlara oral yoldan uygulandı. Çalışmanın sonunda hayvanlardan kan örnekleri alınarak glukoz seviyeleri ve AST, ALT, ALP seviyeleri ölçüldü. Daha sonra hayvanlar sakrifiye edilerek alınan karaciğer doku örneklerinde antioksidan seviyeleri belirlendi. Bulgular: Diyabetli tedavi grupların AST, ALT ve ALP seviyelerinde istatistiksel olarak önemli bir azalma gözlendi (p<0.001). Su ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden gruplardaki SOD ve GSH seviyelerinde önemli derecede diyabetik kontrol grubundaki ratlara göre yüksek bulundu (p<0.05). Bu artış özellikle III. dozda gözlendi (p<0.001). Bunun aksine su ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden gruplardaki MDA düzeyi DK grubundaki ratlara göre düşük bulundu (p<0,05). Özellikle III. dozda azalma gözlendi (p<0.001). Tek başına Mersin yaprağı ekstresinin verildiği yüksek doz kontrol grubunun antioksidan enzim seviyeleri sağlıklı kontrol grubunun enzim seviyesine yakın olduğu tespit edildi. Ayrıca III. dozunkan glukoz düzeylerinde tedaviden sonra anlamlı azalma tespit edildi (p<0.001). Sonuç: Bulgularımıza göre Myrtus communis L. yaprağının III. doz su ektresinin; diyabette oluşan serbest radikallerin oluşumunu azaltabileceği ileri sürülebilir. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, Diabetes Mellitus, Myrtus communis L. streptozotocin V ABSTARCT Investigation Effects of Aqueous Extract of Myrtus Communis L. Leaves on the Streptozotocin-Induced Diabetic Rats Aim: Diabetes mellitus is the known most common chronic disease world-wide. Leaves of a mediterrenean plant, Myrtus communis L., is traditionally used in the treatment of diabetes mellitus. The effects of leaves, oil and fruit of Myrtus communis L. on the diabetes mellitus have been investigated in many studies. There are limited number of literature about the antioxidant effect of aqueous extract from Myrtus communis L. leaves on diabetes. In this study, we investigated the antidiabetic effects of the aqueous extract of Myrtus communis L. leaves on normal and streptozotocininduced diabetic rats. Materials and methods: Thirty sprague dawley male rats, divided into six groups, were used in our study. Aqueous extract of Myrtus communis L. leaves was administered orally to the normal and diabetic rats at the doses of 150, 300 and 600 mg/kg (I, II, III) for 14 days. Blood samples were obtained from the animals at the end of the study, and glucose levels, AST, ALT and ALP levels were measured. Animals were sacrified and the antioxidant levels were determined in the liver tissue. Results: Statistically a significant decrease was observed in the AST, ALT and ALP levels of diabetic groups (p< 0.001). SOD and GSH levels in the groups that were administered different doses of aqueous extract were found to be higher than the rats in the diabetic control group (p<0.05). This increase was found to be highest with the dose of III (p<0.001). In contrast, MDA levels were found to be lower in the groups that were administered different doses of aqueous extract than in the rats of diabetic control group (p<0.05). Antioxidant enzyme levels in the high dose control group which was administered extract of Myrtus communis L. leaves alone were found to be similar to the levels in the normal control group. In addition, blood glucose levels after III. dose treatment were found significantly decreased (p<0.001). Conclusion: The results of this study suggest that III. dose of the aqueous extract of Myrtus communis L. leaves may decrease the antioxidant formation in diabetes mellitus. Key Words: Antioxidant, diabetes mellitus, Myrtus communis L., streptozotocin. VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ APG : Açlık plazma glikozu ADA : Amerikan Diyabet Birliği (American Diabetes Association) AGEs : Gelişmiş glikozillenmiş son ürünler (Advanced glycated end products) ALP : Alkalen fosfataz ALT : Alanin amino transferaz AST : Aspartat amino transferaz CAT : Katalaz CCl4 : Karbon Cu-Zn SOD : Bakır ve çinko bağlı süperoksit dismutaz DCM : Diklorometan DK : Diyabetik kontol grup DM : Diyabetes Mellitus DM+MC I : Su ekstresinin 150 mg/kg dozunu ihtiva eden diyabetli grup DM+MCII : Su ekstresinin300 mg/kg dozunu ihtiva eden diyabetli grup Tetra Klorür DM+MC III : Su ekstresinin 600 mg/kg dozunu ihtiva eden diyabetli grup DNA : Deoksribonükleik asit DTNB : 5,5’ -ditiyo- bis- 2 nitrobenzoik asit DTPA : Dietilentriaminpentaasetik asit DPPH : 1,1- difenil - 2- pikrilhidrazil DSÖ : Dünya Sağlık Örgütü E.Coli : Eschericia coli EDTA : Etilendiamintetraasetik asit EGTA : Etilenglikoltetraasetik asit ETS : Elektron Taşıma Sistemi FAD : Flavin Adenin Nükleotid GDM : Gestasyonel Diyabet GPx : Glutatyon Peroksidaz GR : Glutatyon Redüktaz GSH : Glutatyon GST : Glutatyon S-Transferaz GSSG : Okside Glutatyon G6Paz : Glukoz-6-fosfataz VII HbA1c : Hemoglobin A1C HDL : Yüksek yoğunluklu lipoprotein (High Density Lipoprotein) HOCl : Hipokloröz asit H2O2 : Hidrojen Peroksit H3O+ : IDDM : Tip I Diyabetes Mellitus (Insulin- Dependent Diabetes Mellitus) LDL : Düşük yoğunluklu lipoprotein (Low Density Lipoprotein) LPO : Lipid peoksidasyonu LR : Linearize ortalama MC : Myrtus communis (Mersin bitkisi) MCIII : Su ekstresinin 600 mg/kg dozunu ihtiva eden kontrol grubu MCY : Mersin bitkisi yaprağı MDA : Malondialdehit MES : 2-(N-morfolino) etansülfonik asit Mn-SOD : Mangan bağlı süperoksit dismutaz MODY :Gençlerin Erişkin Tip Diyabeti (Maturity Onset of Diabetes of the Hidronyum İyonu Young) MPA : Metafosforik asit MPx : Miyeloperoksidaz NADPH : Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat NIDDM : Tip II Diabetes Mellitus (Non-Insulin- Dependent Diabetes Mellitus) NO : Nitrik Oksit NO∙ : Nitrik Oksit Radikali NO2 : Azot Dioksit OAD : Oral Alınan Diyabetikler OGTT : Oral Glukoz Tolerans Testi 1 : Singlet Oksijen O2 O2∙- : Süperoksit Anyon Radikali OH∙ : Hidroksil Radikali PDX-1 : Pankreatik ve duodenal homebox1 RNA : Ribonükleik Asit ROT : Reaktif Oksijen Türleri ROH : Alkol R∙ : Organik radikaller VIII RO∙ : Alkoksi radikalleri ROO∙ : Hidroksi peroksil ROOH∙ : Organik peroksitler RS∙ : Tiyil Radikalleri SK : Sağlıklı kontrol grup SOD : Süperoksit dismutaz STZ : Streptozotocin TBA : Tiyobarbitürik Asit TBT : Tıbbi Beslenme Tedavisi TNB : 5- tiyo- 2 nitrobenzoik asit TUİK : Türkiye İstatistik Kurumu TURDEP : Türkiye Diyabet Epidemiyoloji UKPDS : United Kingdom Prospective Diabetes Study UV : Ultraviyole ışınları XO : Ksantin oksidaz IX ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. Proinsülin zincir yapısı ................................................................................... 18 Şekil 2.2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluşumu .......................................................... 20 Şekil 2.3. Serbest radikallerin etkisiyle oluşan DNA hasarı........................................... 25 Şekil 2.4. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu ........................................................ 27 Şekil 2.5. Diyabette glukoz toksisitesine ilişkin olarak gelişen oksidatif stresin beta hücrelerindeki moleküler mekanizması .......................................................................... 33 Şekil 2.6. Hiperglisemide temel oksidatif stres kaynağı olan mekanizmalar ................. 34 Şekil 2.7. Diyabetik komplikasyonların gelişiminde süperoksit ve peroksinitritin rolü 35 Şekil 2.8. Glutatyon redoks döngüsü .............................................................................. 40 Şekil 2.9. Redükte glutatyon (GSH) ............................................................................... 41 Şekil 3.1. Süpeoroksit dismutaz ölçümünün şeması....................................................... 54 Şekil 3.2. GSH’ ın geri dönüşümü.................................................................................. 58 Şekil 3.3. MDA’nın TBA ile birleşimi ........................................................................... 61 Şekil 4.1. Rat gruplarındaki ALP aktivitelerinin gösterilmesi. ...................................... 70 Şekil 4.2. Rat gruplarındaki ALT aktivitelerinin gösterilmesi. ...................................... 71 Şekil 4.3. Rat gruplarındaki AST aktivitelerinin gösterilmesi. ...................................... 72 Şekil 4.4. Rat gruplarının karaciğer dokudaki SOD enzim aktivitelerinin gösterilmesi. 73 Şekil 4.5. Rat grupların karaciğer dokudaki MDA düzeylerinin gösterilmesi. .............. 74 Şekil 4.6. Rat gruplarının karaciğer dokudaki GSH düzeylerinin gösterilmesi. ............ 75 X TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 2.1. Diyabetes Mellitus’un sınıflandırması ............................................................ 6 Tablo 2.2. Serbest radikal kaynakları ............................................................................. 24 Tablo 3.1. Deneyin çalışma planı ................................................................................... 52 Tablo 3.2. SOD standart hazırlama ................................................................................ 55 Tablo 3.3. SOD deney şeması ........................................................................................ 56 Tablo 3.4. Glutatyon standart hazırlanma ...................................................................... 59 Tablo 3.5. GSH deney şeması ........................................................................................ 60 Tablo 3.6. MDA kolorimetrik standart hazırlanma ....................................................... 63 Tablo 3.7. MDA deney şeması ....................................................................................... 63 Tablo 4.1. Gruplar ve kan glukoz ölçüm değerleri ........................................................ 69 Tablo 4.2. Gruplar ve karaciğer enzim aktiviteleri ........................................................ 69 Tablo 4.3. Gruplara göre karaciğer doku SOD enzim aktivitesi İle MDA ve GSH düzeyleri ....................................................................................................... 73 XI 1. GİRİŞ Diabetes mellitus (DM), konjenital veya immun sistemdeki patolojik değişiklikler sonucu meydana gelen hormonal bir bozukluk olarak tanımlanmaktadır.1, 2 DM, insülinin foksiyonel yetmezliği sonucu meydana gelen, oluşturduğu komplikasyonlar nedeniyle organ ve işlev kayıplarına yol açarak yaşam süresi ve kalitesini etkileyen iş gücü kayıplarıyla sosyal ve ekonomik yükü ağır olan, uzun süreli endokrin ve metabolik bir hastalıktır.3 21. Yüzyılda DM, sıklığı artan hastalıkların başında gelmekte ve sağlık otoriteleri tarafından en önemli derecede tehlikeli hastalık olarak kabul edilmektedir.4, 5 Diyabetik hastalarda serbest oksijen radikallerinin ve lipid peroksidasyonunun önemli derecede arttığı ve oksidatif stresin; diyabet etiyolojisinde ve ilerlemesinde rolü olduğu yapılan çalışmalarla bilinmektedir.6 Biyolojik sistemlerde önemli bir yer tutan serbest radikallerorganizmada normal metabolik yolların işleyişi sırasında oluşabildiği gibi, dış etkenlerin etkisiyle de oluşmaktadır. Çok kısa yaşam süreli, ancak yapılarındaki düzensizlik nedeniyle çok reaktif olan serbest radikaller, tüm hücre bileşenleri ile etkileşebilme özelliği göstermektedir ve yararlı biyomoleküllerin fonksiyonlarını yitirmesine sebep olmaktadırlar.7 Serbest radikallerden oluşan zararlı etkileri engellemek amacıyla vücutta antioksidan sistemler gelişmiştir. Fakat bu sistemler vücudun korunma görevini tamamen sağlayamadıkları için oksidatif stres kaynaklı veya etkili bazı hastalıklarda dışarıdan antioksidan ilavesi gerekebilmektedir.8 DM’nin görülme sıklığının ve tedavi masraflarının fazla olması, bunun yanında kesin tedavi yönteminin henüz geliştirilememiş olması onu popüler bir araştırma konusu haline getirmektedir. Bu sebeple bu hastalığın tedavisi için birçok araştırma yapılmakta ve yeni tedavi yöntemleri aranmaktadır. Bazı araştırmacılar bu hastalığın tedavisinde 1 cerrahi işlemler üzerinde dururken bazıları da yüksek antioksidan içerikli bitkilerin ekstrelerini denemiş ve oksidatif stresi baskılamaya çalışmışlardır.9 Akdeniz Bölgesi’nde yetişmekte olan Myrtus communis L. (Mersin bitkisi, MC) yaprağı eskiden beri şeker hastalığında geleneksel kullanılmaktadır.10 Yapılan çalışmalarda Myrtus communis L. yaprağının (MCY) su ekstreleri izole edilerek etkileri incelenmiştir.10 Direkt MC yaprağı su ektresinin diyabete etkilerini araştıran çalışmaya ulaşılamamıştır. Bundan dolayı bu çalışmada streptozotocin (STZ) kullanılarak, diyabet oluşturulan ratlarda MCY’nin su ekstresinin farklı dozları ratlara verilerek bu hasarın tedavisi üzerine etkileri biyokimyasal olarak incelenmesi amaçlanmıştır. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Diabetes Mellitus’un Tanımı DM dünyada sıklığı her geçen yıl artan küresel bir halk sağlığı sorunudur.11 DM, pankreasın insülin salgısının yetersizliği veya yokluğu nedeniyle karbonhidrat, yağ ve protein metabolizmaları ile damar yapısında bozukluklarla karakterize olan kronik bir hastalıktır.12 Bununla beraber diyabet; yaşam boyu süren, gerek akut gerekse kronik komplikasyonları ile kişinin yaşam kalitesini düşüren; maliyeti yüksek olan, sosyal ve toplumsal bir hastalıktır.13, 14 2.2. Diabetes Mellitus’un Epidemiyolojisi Toplumda sıklığı gittikçe artan bir hastalık olan DM çocukluktan ileri yaşa kadar her yaşta görülebilmekte ve yaşam boyu devam etmektedir. Her yıl 7 milyon bireyin DM hastası olacağı ve yılda 3.8 milyon ölüm sebebinin DM’ye bağlanabileceği bildirilmiştir. DM prevalansının giderek artması ve neden olduğu komplikasyonlarından dolayı Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından önemli bir sağlık sorunu olarak tanımlanmıştır. DM’nin küresel ölüm nedenleri arasında dördüncü sırada yer aldığı bildirilmektedir. Gelişmiş ülkeler arasında da DM sıklığının 2025 yılında artacağı tespit edilmiştir.15-17 DM hastalığı ile ilgili lipid bozuklukları hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalığa yol açtığı ve daha fazla sayıda ölüme neden olabildiği belirtilmektedir. 2005 yılında dünyada 1.1 milyon kişinin DM nedeniyle öldüğü tahmin edilmektedir. Her 10 saniyede iki kişinin DM tanısı aldığı ve her 10 saniyede bir kişinin DM’ ye bağlı bir sorun sebebiyle öldüğü bildirilmektedir. DM’ye bağlı ölümlerin yaklaşık % 80’i düşük ve orta gelir düzeyine sahip ülkelerde gerçekleşmektedir. DM’ye bağlı yaşamını kaybeden insanların yaklaşık % 80’i 70 yaş altı ve % 55’i de kadındır. DSÖ 3 projeksiyonunda acil önlemler alınmazsa, DM’ye bağlı ölümlerin gelecek on yıl içinde % 50’den daha fazla artacağı da vurgulanmaktadır.15 DM’si olan birey sayısının 2007 yılında en fazla olduğu beş ülke; Hindistan (40.9 milyon), Çin (39.8 milyon), ABD (19.2 milyon), Rusya (9.6 milyon), Almanya (7.4 milyon)’dır. 2007 yılında, yetişkin nüfus içinde en yüksek DM sıklığı ile beş ülke; Nauru (% 30.7), Bahreyn (% 15.2), Birleşik Arap Emirlikleri (% 19.5), Suudi Arabistan (% 16.7), Kuveyt (% 14,4) olduğu belirtilmektedir.15 Satman ve ark.’nın18 Türkiye’de yaptığı epidemiyoloji çalışmasında DM insidansı % 7.2 olarak tespit edilmiştir. Bu sayı 2008 yılı adrese dayalı nüfus kayıt sistemi sonuçlarına (Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK), 2008) uyarlandığında Türkiye’de yaklaşık 5.360.000 DM’si olan bireyin olduğu tahmin edilmektedir. DM’si olan bireylerde DM’si olmayanlara göre erken ölüm riski daha fazla ve beklenen yaşam süreleri 10-15 yıl daha kısa olmaktadır.3 Diyabetli hastaların % 90’ı Tip II, % 10’u ise Tip I DM’dir.19 Tip I DM epidemiyolojisi ile ilgili yapılan çalışmalar gün geçtikçe hız kazanmasına rağmen, dünya nüfusunun sadece % 5’i hakkında veriler mevcuttur. Avrupa ülkelerinde ve Kuzey Amerika’da yapılan çalışmalarda, DM’nin bazı etnik gruplar haricinde hemen her toplumda görülmekle birlikte, toplumdan topluma çok belirgin farklı insidansa sahip olduğu ortaya konulmuştur.20, 21 Dünya genelinde Tip II diyabet sıklığı % 4 dolaylarındadır, bu oran yetişkin nüfusta ortalama % 6 civarındadır.22 Tip II diyabet genellikle 40 yaş üstündeki bireylerde görülmekte, yaşlanma ile paralel artış göstermektedir ve iki tip arasında daha fazla yaygın olan bu tip diyabetli tüm bireylerin % 90’ını göstermektedir.23-25 Yumuk ve ark.’nın26 7000 kadın ve 5066 erkekte yaptıkları çalışmada DM prevalansının % 8.4 olduğu tespit edilmiştir. Kısa zaman aralıklarıyla yapılan bu 4 çalışma sonuçları ülkemizde diyabet prevalansının dünyada öngörülenden çok daha hızlı arttığını belirtmesi açısından çarpıcıdır. Bütün bu araştırmalara bakıldığında DM hastalığın prevalansında genetik, çevresel faktörlerin, sosyoekonomik nedenlerin etkili olduğunu görülmektedir. Ayrıca bu prevalans ülkelere, cinsiyet ve yaşa göre de farklı olarak seyretmektedir. 2.3. Diabetes Mellitus’un Tanı Kriterleri 1. Hemoglobin A1C (HbA1c) düzeyinin erişkinlerde % 6.5’nin üzerinde olması27 veya, 2. Açlık plazma glukozu (APG) ≥ 126 mg/dL (7.0 mmol/L). Açlık, en az 8 saat hiç kalori alınmamış olması demektir veya, 3. Semptomlar + rastgele plazma glukozu ≥ 200 mg/dL (11.1 mmol/L). Diyabete özgü semptomlar poliüri, polidipsi ve açıklanamayan kilo kaybıdır. Rastgele ile günün herhangi bir zamanında yapılan plazma glukoz ölçümü belirtilmektedir veya, 4. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) 2.saat değeri ≥ 200 mg/dL (11.1 mmol/L). 75 gr glukoz ile yapılan OGTT sırasında 2.saat glukoz değerinin ≥ 200 mg/dL (11.1 mmol/L) olması koşulları aranmaktadır.28 2.4.Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT) OGTT Endikasyonları 1. Gestasyonel diyabet ve glukoz intoleransının araştırılması amacıyla 2. Obezite ve ailede diyabet öyküsü bulunan kişiler 3. Ailesinde Gençlerin Erişkin Tipi Diyabeti (MODY) tipi diyabetik olan kişiler 4. İri bebek doğuran kadınlar 5. Açıklanamayan nöropati, retinopati, erken ateroskleroz, koroner damar hastalığı ve periferik damar hastalığı olanlar. 5 6. Operasyon, stres, travma, infarktüs, diyabetojenik ilaç kullanımı veya gebelik esnasında hiperglisemi ya da glukozüri saptanan vakalarda, bu olaylar geçtikten sonraki süreç. 7. Metabolik sendrom düşünülen vakalar. 8. Reaktif hipoglisemiye uyan yakınmaları olan kişiler.29, 30 Bu test üç günlük normal diyet ve normal fiziksel aktivite sonrası sabah saatlerinde uygulanmaktadır. Test için bireyin gece boyunca (10-16 saat) aç kalması gerekmektedir. Daha sonra bireyin açlık kan şekeri (plazma glukoz düzeyi) örneği alınmaktadır. Açlık kan şekeri örneği alındıktan 5 dk. sonra bireye, 250-300 ml suda eritilen 75 gr glukoz ile hazırlanan solüsyon içirilmektedir. Genellikle bu glukoz solüsyonu bireylerin içebileceği şekilde hazırlanmaktadır. Yapılan bu yükleme işleminden iki saat sonrasında bireyden kan örnekleri (plazma glukoz düzeyi) alınmaktadır. İki saat sonra alınan kan örneklerinde, venöz kanda glukoz düzeyinin 200 mg/dL’den yüksek olması DM tanısının konması için yeterli olabilmektedir.31-35 2.5. Diabetes Mellitus’un Sınıflandırılması DM için birçok sınıflandırma yapılmıştır. Ancak DM hakkındaki bilgilerin giderek artması sınıflandırmanın ve tanı kriterlerinin yeniden gözden geçirilmesini gerektirmiş ve 1997’de Amerikan Diyabet Birliği (ADA) yeni sınıflandırmayı bildirmiştir. Tablo 2.1. Diyabetes Mellitus’un sınıflandırması30 1. Tip I DM: İnsülin yetersizliği ile birlikte olan DM’dir. DM hastalarının % 15’ini oluşturur. a. Otoimmün tip DM b. İnsülin yetersizliğinin diğer nedenlerle meydana geldiği tip I DM 2. Tip II DM: İnsülin direnci ile birlikte olan DM’dir. DM hastalarının büyük kısmını (% 85) oluşturur. 3. Gestasyonel DM (GDM) 4. Özel DM tipleri 6 Bu yenilik 1998’de yayınlanmıştır. Yeni sınıflandırma etiyolojiye dayanan ve kolay anlaşılır bir sınıflandırmadır. Burada 4 ana klinik grup bulunmaktadır.36 2.5.1. Tip I Diyabetes Mellitus (IDDM) Diyabetin bu formu, endojen insülin sekresyonunun yetersizliği ya da tamamen yokluğu olarak tanımlanmaktadır.1, 2, 37 Pankreasta ilerleyen beta-hücre yıkımına yol açan bir dizi olay sonucu insüline bağımlı diyabetin ortaya çıktığı diyabet tipidir. Genellikle otoimmün kaynaklı olarak gelişen hastalığın, genellikle çocukluk çağı ve genç erişkin yaşlarda ortaya çıktığı bilinmektedir. Tip I diyabetliler tüm diyabetiklerin yaklaşık % 5-10’unu oluşturmaktadır. Hastalık 30 yaşından önce başlamaktadır. Polidipsi, poliüri, kilo kaybı gibi diyabet belirtileri şiddetlidir. Ketoasidoz koması, hipoglisemi gibi akut komlikasyonların çok sık yaşandığı diyabet tipidir.38 Tip I diyabeti olan bir annenin çocuğunda aynı tipte diyabet gelişme riski oldukça yüksektir. 25 yılda % 1-2 civarında bir artış olur, eğer babada diyabet varsa bu risk üç kat olarak artar. Eğer hem annede hem de babada hastalık varsa risk daha da artar ve bu nadir karşılaşılan çiftlere genetik danışmanlık verilmesi gerekmektedir.39 Diyabetlilerin kardeşlerinde Tip I diyabet genel popülasyona göre yaklaşık 15 kat daha sık görülür.40 Çeşitli çalışmalarda diyabetli babası olanlarda annenin diyabet olmasına nazaran riskin daha yüksek olduğu belirtilmiştir.41 2.5.2. Tip II Diabetes Mellitus (NIDDM) Tüm DM hastalarının yaklaşık % 90 gibi büyük bir kısmını oluşturur. Tip II DM prevalansı açısından etnik gruplar arasında büyük farklılıklar görülmektedir. Ülkemizde yapılan çalışmalarda değişik değerler görülmesinin yanı sıra prevalansın % 1.8-2 kadar olduğu düşünülmektedir. Hastalar orta yaşta ve büyük çoğunluğu obezdi.42 Görülme 7 sıklığı artışı kadar hastalığın başlama yaşının daha genç yaşlara; hatta çocukluk çağında görülmeye başlaması bu problemin büyümesinin başka bir boyutudur.5 Tip II DM, insülin direnci ve/veya insülin salgılanma bozukluğu ile karakterizedir.42 Tip IIDM formu, açlık hiperglisemisi ve karbonhidrat intoleransı gibi glukoz metabolizması ile ilgili bir bozukluk olarak da adlandırılmaktadır.1, 2, 43 Tip II diyabette, beta hücrelerinin kan şekerine yanıtı bozuktur. Ancak nörojenik uyarılara, oral antidiyabetiklere ve sekretine karşı insülin yanıtı bozulmamıştır. Özellikle erken insülin yanıtında bozukluk oluşur ve beta hücresi, glukozu tanımakta zorlanır.44, 45 Tip II diyabetik hastalar endojen insülin salgılayabilmesi nedeni ile ketozise karşı dirençlidirler.2, 43, 46 Diyabetin bu formu, insanlarda 40 yaşın üzerinde daha çok görüldüğü için “Adult Diabetes Mellitus” veya “Ketozise Dirençli Diabetes Mellitus” olarak da isimlendirilmektedir.2, 43 Yapılan araştırmalarda, Tip II diyabetik hastaların yaklaşık olarak % 80’inde orta dereceli bir obezite bulgusu saptanmıştır.2, 43 Bu nedenle obezliğin insülin reseptör miktarını azaltarak Tip II diyabet formunun oluşmunda ana risk faktörü olarak rol oynadığı öne sürülmektedir.2, 47 Bununla beraber Tip II diyabetin birçok formunun aktarımında, kalıtsal etkilerinin olduğu bildirilmiştir.1 Tip II diyabetli bireylerde en azından 2 ana tanımlanabilir patolojik defekt vardır. Bunlardan bir tanesi insülinin periferik dokuları etkileme yeteneğindeki azalımıdır. Bu bozukluk insülin direnci olarak adlandırılır ve bazı araştırmacılar tarafından primer patolojik olay olarak düşünülmektedir. Diğeri beta hücre disfonksiyonudur. Bu, insülin direncini kompanse etmek için, gerekli insülin üretmede pankreasın yetersizliğidir. Böylece hastalıkta önce insülinin göreceli yetersizliği oluşur ve sonra mutlak insülin eksikliği gelişir. İnsülin direnci ve insülin sekresyonundaki 8 temel moleküler defektler çevresel ve genetik faktörlerin kombinasyonundan meydana gelmektedir.39 DM, mikrovasküler, makrovasküler ve nöropatik komlikasyonları nedeniyle önemli bir morbidite ve mortalite sebebidir. Tanı öncesi dönemin genellikle uzun olması nedeniyle yeni tanı konulan Tip II diyabetiklerin % 20’sinde retinopati, % 80’inde nefropati saptanmaktadır.48 Kardiyovasküler hastalıklar tip II diyabette en sık rastlanan ölüm nedenidir. Tip II diyabetin ön aşaması olan bozulmuş glukoz toleransı evresinde bile diyabetin ortaya çıkmadan önce belirlenmesi ve ortaya çıktıktan sonra uygun tedavi edilmesi mortalite ve morbiditeyi azaltacaktır.49 2.5.2.1. Tip II Diabetes Mellitus Risk Faktörleri Risk faktörleri hem genetik hem de çevresel olanları içerir. Bu faktörlerin bilinmesi koruyucu girişimlerin uygulanacağı kitlenin belirlenmesi açısından önem taşır. Etnik gruplar: Bazı etnik gruplarda tip II diyabet sık rastlanır. Örneğin Amerika’daki Pima yerlileri ve İngiltere’deki Asya orjinli insanlarda tip II diyabet prevalansı aynı çevrede yaşayan diğer gruplara göre daha yüksektir. Ailede tip II diyabet öyküsü: Birinci derece akrabada tip II diyabet olan bir bireyin ömür boyunca herhangi bir anda tip II diyabete yakalanma riski % 40’dır. Genetik Belirleyiciler: Bugün için tip II diyabete eğilimi saptayan ve yeterince güçlü tek bir genetik lokus belirlenememiştir. Çevresel Faktörler: Toplumsal gelişme ve şehirleşmenin getirdiği farklılıklar özellikle kilo artışı ve fiziksel inaktivite tip II diyabet için güçlü belirleyicilerdir. Yaşam tarzı hızla batılaşan toplumlarda ve az gelişmiş bir ülkeden gelişmiş bir ülkeye göç eden 9 Asya’lılarda diyabet prevelansı bu toplumun genetik yapısında farklılık olmadığı halde 5 kat artmaktadır. Obezite: Tüm toplumlarda beden kitle indeksi ile tip II diyabet arasında ilişki vardır. Obezite artıkça insülin direnci de artmakta ve tip II diyabete eğilim meydana gelmektedir. Yaş: Tip II diyabet prevelansı yaşla beraber artar. Düşük Fizik Aktivite: Günlük fiziksel aktiviteleri az olan bireylerde tip II diyabet gelişme riski fazladır. Diyet: Yüksek oranla yağ, düşük kompleks karbonhidrat ve düşük lif içerikli batılı diyet obeziteye yol açarak ikincil olarak tip II diyabet prevelansını yükseltir.49 Tip II diyabetten korunmada kabul gören yöntem diyet ve egzersiz yoluyla kilo kaybı ve buna bağlı olarak insülin direncinin azalmasıdır.49 2.5.3. Gestasyonel Diyabet (GDM) İlk kez gebelikte tanısı konulan ya da gebelik sırasında ortaya çıkan, herhangi bir derecedeki glukoz intoleransıdır. Bu tanımlama, bireyin insülin veya diyet tedavisi alması ile veya glukoz intoleransının gebelik sonrası devam edip etmediği ile ilişkili değildir. Yine bu tanımlama, daha önce tespit edilememiş glukoz intoleransının gebelikten önce başlamış olabileceği olasılığını tanım dışında bırakmaz.30, 50-53 Tüm gebeliklerin yaklaşık % 7’si GDM ile komplike olmaktadır ve bu oran değişik populasyonlarda % 1 ile % 14 arasında değişmektedir.51 2.5.4. Özel DM tipleri 2.5.4.1. Malnutrisyonla İlişkili Diabetes Mellitus Bu klinik alt grup tropikal ve gelişmekte olan ülkelerde genç erişkinler arasında görülür. Farklı klinik özellikleri, seyri ve belli bölgelerde çok fazla sayıda vakaların olması sınıflandırmada diyabete ayrı bir sınıfa girmesine neden olmaktadır.54 10 2.5.4.2. Bozulmuş Glukoz Toleransı ile Beraber Seyreden Diyabet Bozulmuş glukoz toleranslı bireylerin plazma glukoz konsantrasyonları normal değerler ile diyabet için tanı koydurucu olan değerler arasında seyreder. Bu gibi kişilerin plazma glukoz konsantrasyonları belli bir zaman periyodundan sonra belirgin diyabete doğru ilerler. Ancak büyük bir bölümünde aynı kalır. Bazılarında ise glukoz konsantrasyonları normale döner.55 Bozulmuş gukoz toleransı sadece OGTT ile ölçülür. Bozulmuş glukoz toleransı, OGTT’de ikinci saatteki plazma glukoz konsantrasyonunun 126-200 mg/dL (711.1mmol/L) arasında olmasıyla belirtilir.55 2.6. Diyabetes Mellitus’un Etiyolojisi DM’nin oluşmasında çok sayıda faktör rol oynamaktadır. Bu faktörler DM tipine, kişisel ve çevresel faktörlere göre değişiklik göstermektedir. 2.6.1. Yaş Tip I DM en fazla yaşamın ilk dokuzuncu ayı ile 12-14 yaşları arasında görülmektedir. Tip I DM hastalarının, % 95’i 25 yaşın altındaki kişilerdir. Tip I DM nadiren 30 yaşın üstünde de görülebilmektedir.25, 26, 56, 57 2.6.2. Cinsiyet Dünya genelinde DM prevalansı açısından kadın ve erkek arasında bir değişiklik yokken, ülkemizde DM, kadınlarda erkeklere oranla daha fazla görülmektedir. DM’nin oluşumunda ebeveyn cinsiyetinin rolü vardır. Tip I DM’si olan bir babanın çocuğundaki risk % 6 iken, Tip I DM’si olan annenin çocuğundaki risk % 2 olarak ifade edilmiştir.58, 59 11 2.6.3. Kalıtım DM’de bilinmesi gereken önemli bir konu da ailesel geçiştir. Tip II DM’de ailevi geçiş, Tip I DM’ye göre daha belirgindir ve DM’si olan bireylerin yaklaşık % 40’ının en az bir akrabasında DM öyküsünün olduğu belirtilmiştir.31 DM’si olan ailelerin çocuklarında DM görülme ihtimali normal nüfusa göre daha yüksektir. Ancak DM tipine göre DM’nin görülme olasılığı farklılık göstermektedir. İnsüline bağımlı Tip I DM’de bu olasılık % 10-15 iken, Tip II DM’de % 40’tır.60 Sermez ve ark.’nın61 yaptığı çalışmaya göre, DM’si olan bireylerin % 23’ünün anne ve babasından birisinin, % 3.3’ünün hem anne hem de babasının, % 15.7’sinin ise birinci derece akrabalarının DM’si olduğu bildirilmiştir. Bu durum Tip I DM’nin genetik yatkınlık zemininde gelişen bir hastalık olduğu gerçeğini ortaya koymaktadır. 2.6.4. Obezite Şişmanlık DM gelişiminde önemli bir risk faktörüdür. Günümüzde şişmanlığın derecesi ve süresi arttıkça DM riski de artmaktadır.62, 63 Amerika’da obezite yaygınlığının artması nedeniyle yetişkin nüfusun % 7.4’ü DM iken, gelecek 20 yıl içinde bu sayının iki katına çıkacağı tahmin edilmektedir.64, 65 Normal kilolarının % 10-20 üstünde veya daha fazla kilo alanlarda DM gelişme riskinin şişman olmayanlara göre dört kat daha fazla olduğu bildirilmektedir.66 Obezite sadece Tip II DM gelişimi için bir olasılık faktörü yani prediyabetik bir durum olarak da kabul edilmektedir.67, 68 2.6.5. Beslenme Yaşam koşullarının iyileşmesi, aktivite azlığı ve aşırı beslenme DM için zemin oluşturmaktadır. Yaşam şartlarının iyi olmasının tam tersine ekonomik koşulların yetersizliği, yetersiz ve dengesiz beslenme, karbonhidrat ve yağ tüketiminin artması gibi faktörler ile DM gelişimi arasında da ilişki saptanmıştır.69 12 2.6.6. Fiziksel Aktivite Hareketsiz yaşamın DM gelişme riskini arttırdığı bildirilmektedir. Aktivite azaldığında, vücudun tüketeceği enerji azalacağından dolayı kilo alma riski artacaktır. Böylece oluşabilecek düzensiz kan basıncı ile kalp ve akciğer problemleri görülebileceği gibi glukozun etkin bir şekilde kullanımı da engellenecektir.70, 71 2.7. Diyabet Oluşumuna Etki Eden Faktörler a. Genetik sendromlar: Tip A ve Tip B insülin direnç sendromları, glikojen depo hastalığı, wolfram sendromu, down, klinefelter ve turner sendromları. b. Endokrin hastalıkları: Agromegali, cushing sendromu, glukagonoma, hipertiroidi, hiperparatiroidi, pankreatik kolera sendromu, büyüme hormonu yetersizliği. c. Pankreatik hastalıklar: Pankreatektomi, pankreatit, hemokromatozis. d. İlaçlar, kimyasal ajanlar, toksinler: Tiyazid grubu diüretikler, beta adrenerjik reseptör blokerleri, glukokortikosteroidler, psikoaktif ajanlar, antineoplastik ajanlar, katyonlar.72 2.8. Diyabetin Komplikasyonları 2.8.1.Diyabetin Akut Komplikasyonları 2.8.1.1. Diyabetik Ketoasidoz İnsülin ile insülin karşıtı hormonlar (glukagon, katekolaminler, kortizol ve büyüme hormonu) arasındaki dengenin, insülin aleyhine bozulması sonucu meydana gelir.73 Diyabetik ketoasidoz hiperglisemi belirti ve bulgularının erken fark edilmesi; tedaviye uyumun olması ile önlenebilir.72 2.8.1.2. Hiperglisemik Hiperozmolar Nonketotik Koma Ketoasidoz olmaksızın, aşırı hiperglisemi, artmış plazma ozmoloritesi ve dehidratasyonla seyreder.72 13 2.8.1.3. Hipoglisemi Hipoglisemi, kan glukozunun 50 mg/dL’nin altına düşmesi olarak tanımlanırsa da çoğu diyabetli, kan glukozu 50 mg/dL’nin üzerinde olduğunda bile hipoglisemi belirtilerini algılayabilir.74 2.8.2. Diyabetin Kronik Komplikasyonları Tip II diyabetiklerde yapılan United Kingdom Prospective Diyabetes Study (UKPDS) çalışmaları düzelmiş glisemi kontrolünün, diyabet hastalarında retinopati, nöropati ve nefropati gelişimini yavaşlattığını belirtmiştir.75 Diyabetin komplikasyonlarının tedavisi için yapılan sağlık harcamaları, hastalığın erken tanı ve tedavisi için yapılan harcamaların çok üzerinde bulunmuştur.68 2.8.3. Diyabetin Mikrovasküler Komplikasyonları 2.8.3.1. Retinopati Diyabetiklerin yaşam sürelerinin uzaması nedeni ile diyabetik retinopatiye bağlı görme kayıpları, körlük nedenleri arasında ön sıralarda bulunmaktadır.76 Türkiye’de diyabetik popülasyonun % 30.8’inin diyabetik retinopatinin çeşitli formlarına sahip olduğu saptanmıştır.77 İyi metabolik kontrol, diyabetik retinopati gelişim sürecini yavaşlatmaktadır.76 2.8.3.2. Nöropati Hiperglisemi veya insülin eksikliğinin doğrudan ve dolaylı metabolik sonuçları arasındaki etkileşimlerin, iyi belirlenememiş genetik ve çevresel faktörlere eklenmesi ile diyabetik nöropatiler oluşmaktadır.78 2.8.3.3. Nefropati Diyabetik nefropati diyabetik bir hastada başka bir sebep olmadanidrarla 300 mg/gün veya 200 mg/gün üzerinde albüminin atılması olarak tanımlanabilir.79 14 2.8.3.4. Diyabetik Ayak Diyabetik ayak problemlerinin sonuçlarından en önemlileri ayak ülserleri ve ampütasyonlardır. Nontravmatik ayak ampütasyonlarının % 40-60’ı diyabetiklerde yapılmaktadır. Birçok çalışma ayak ülserlerinin korunma, hasta eğitimi ve çok yönlü tedavi ile % 43-85 azaltılabileceğini belirtmiştir.54 2.8.4. Diyabetin Makrovasküler Komplikasyonları Diyabet hastaları, aterosklerotik kardiyovasküler, periferik arteriyel ve serebrovasküler hastalık sıklığının arttığı bir gruptur.80 2.9. Diyabetin Tedavisi 2.9.1. Eğitim Asıl amacı; diyabetli hastaların bilgi ve deneyimlerini arttırarak olumlu davranış değişiklikleri kazandırmak, böylece iyi ve metabolik kontrolü sağlayarak oluşabilecek komplikasyonları önlemek, devamında ise iyi olma durumunu sürdürerek yaşam kalitesini yükseltmektir. Diyabet ekip üyelerinin bakım standartlarını belirleme ve geliştirmelerine de yardımcı olur.81-83 Diyabetli hasta eğitimi; diyabetik hastanın kendini daha iyi hissetmesini sağlamak, hastalığının düzenli kontrolü ile oluşabilecek yan etkilerinden hastayı korumak, tedavi giderlerini ve tedavi hatalarını azaltmak, hastanın yeni teknolojiyi kullanabilir olmasını sağlamak amacıyla bilgi ve deneyimini arttırmak için sürdürülen çabalarının tümünü kapsamaktadır.3 2.9.2. Diyet Obezite, tip I ve tip II diyabetin tedavisinin önündeki en önemli engeldir. Dislipidemi, hipertansiyon, iskemik kalp hastalığı ve inme gibi diyabetle ilişkili durumlara bağlı komplikasyonların çoğunun, diyabetin kendisiyle olduğu kadar obezite ile de bağlantılı olduğu düşünülmelidir.84 15 Obez bir bireyde vücut ağırlığının azaltılması insülin direncini düşürmekte, glisemi kontrolünü kolaylaştırmakta, kan basıncı ve plazma lipid düzeyleri üzerinde olumlu etkiler yapmaktadır.48 Toplum genellikle fazla kilo veya obezite ile diyabet arasındaki bağlantıyı fark etmemektedir. Bu yüzden eğitimde daha büyük çabalara ihtiyaç duyulmaktadır.85 Diyet, diyabetlinin yaşına, kilosuna, boyuna, işine (fiziksel aktivite düzeyi), beslenme alışkanlıklarına, kullandığı ilaçlara (OAD veya insülin), gelir düzeyine ve fizyolojik şartlarına göre hazırlanmalıdır.68, 86 Bireyselleştirilmiş ve diyet eğitimi ile desteklenmiş diyet önerileri ile metabolik kontrolün sağlanmasında istenilen noktaya gelinebilir.86 2.9.3. Egzersiz DM’si olan bireylerde yapılan egzersizin; kan şekeri kontrolünü sağladığı, özellikle dokuların insüline hassasiyetini arttırdığı, yüksek lipid düzeyini düşürdüğü, hafif ve orta dereceli hipertansiyonda iyileşmeyi sağladığı, kilo vermeyi kolaylaştırdığı, kardiyovasküler sistem koordinasyonunu arttırdığı ve sonuç olarak metabolik kontrolü iyileştirdiği bildirilmektedir.71, 87 Egzersizin Tip I DM gelişmesini önleyebildiğine ilişkin bir sonuç olmasa da, düzenli egzersizin Tip II DM’ye karşı koruyucu olabileceği gösterilmektedir. Yapılan çalışmada glukoz toleransının hareketli bireylerde, hareketsiz olanlara göre daha iyi olduğu tespit edilmiştir.88 Üç ay boyunca yürüyüş, kürek çekme, bisiklete binme ve merdiven çıkma gibi aerobik egzersizler uygulayan tip II DM’si olan iyi kontrollü hastalarda kan basıncında anlamlı düşme belirlenmiş, vücut ağırlığı değişmeksizin vücut yağ oranı, bel/kalça oranı azalmış, trigliserit düzeylerinde % 20 düşüş, yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) % 23 artış bulunduğu tespit edilmiştir.89 Düzenli fiziksel 16 aktivitenin kilo azalmasında, insülin direncinin, periferik glukoz alımının ve endotel fonksiyonun da iyileşmesinde etkili olduğu gösterilmektedir.90 2.9.4. İnsülin Tedavisi İnsülin anabolik bir hormondur. Glukozun, yağların, proteinlerin ve nükleik asitlerin sentezi ve/veya depolanmasıyla ilgili reaksiyonları stimüle eder. Pek çok endojen maddenin hücre membranında taşınmasını, membrandaki insülin reseptörlerini aktif hale getirerek düzenler.91 İnsülin türleri ‘hızlı-etkili, kısa-etkili, orta-etkili ve uzun-etkili insülinler’ olmak üzere etki süreleri bakımından farklılık gösterirler. İnsülinler sıklıkla derialtı enjeksiyon şeklinde insülin enjektörleri veya insülin kalemleriyle uygulanırlar. Diğer bir uygulama yolu ise insülin pompası kullanımı ile devamlı deri altı infüzyondur.92 2.9.4.1. İnsülin Yapısı İnsülin, doğrudan ya da dolaylı olarak vücuttaki tüm dokuları etkileyen glukoz, amino asitler, lipidler gibi besin maddelerinin hücre içinde tutulup depolanmasına imkan veren ve hemeostazına katkıda bulunan antikatabolik bir hormondur. İlaç olarak kullanılmaya 1922 yılında başlanılmıştır. Pankreas Langerhans adacıklarında bulunan hücreler tarafından üretilir ve ada içerisinde yaklaşık olarak % 70 oranında bulunur. İnsülin A ve B polipeptid zincirinden oluşmuş 51 amino asit içeren bir yapısı vardır. A7, B7, A20 polipeptid zincirlerini B19 zincirine bağlayan, iki disülfit köprüsü sayesinde birleşmiştir. Üçüncü bir zincir içi disülfit köprüsü ile de A zincirinde bulunan 6. ve 11. amino asitleri birleştirir. A ve B zincirinde sırası ile 21 ve 30 amino asit bulunmaktadır. İnsan insülin geni ise, 11. kromozomun kısa olanında yerleşmiştir. Molekül ağırlığı 5808 daltondur. Domuz insülini insan insülininden, B zincirinin C terminalinde treonin yerine alanin geçmesiyle farklı iken, sığır insülini ise 3. amino asidin pozisyonuyla farklılık gösterir.93, 94 17 Proinsülin zincir yapısı Şekil 2.1’de gösterilmektedir.95 Şekil 2.1. Proinsülin zincir yapısı 2.9.4.2. İnsülin Metabolizması İnsülin; karaciğer, böbrek ve plasenta gibi ilişkili olduğu organlarda, plazmada ve yıkımdan sorumlu enzimleri içeren periferik dokularda yıkılmalıdır. İnsülin spesifik proteaz; iskelet kasında saflaştırılmaktadır ve fizyolojik pH’da aktif ve sülfidril bağlarına spesifiktir. Hepatik glutatyon-insülin transhidrogenaz enzimi; enzimin katalitik etkisiyle A ve B zincirleri arasında disülfür köprüleri yıkılmakta, birbirinden ayrılan zincirler ise proteolitik enzimlerce yıkılmaktadır.96, 97 18 2.10. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 2.10.1. Serbest Radikaller Dış orbitalinde tek sayıda elektron bulunduran (paylaşılmamış) atom ya da moleküle serbest radikal denir. Bu çiftleşmemiş elektron, molekülü kararsız yapar, bundan dolayı serbest radikaller kimyasal olarak çok reaktif bileşiklerdir. Aktiviteleri çok kısa süreli olmasına rağmen protein, lipit, nükleik asit gibi makro moleküllerle etkileşmeleri hücre yapı ve fonksiyonlarında önemli değişiklere sebep olmaktadır.98 Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler.98-100 1. Kovalent bağlı normal bir molekülün parçalarının her birinde ortak elektronlardan birisinin kalarak homolitik bölünmesi (homolitik ayrılma ile radikal oluşumu): X : Y → X∙+ Y∙(I) 2. Normal bir molekülden yalnız bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi (heterolitik ayrılma ile iyon oluşumu): - + X : Y → X: + Y (II) 3. Normal bir moleküle yalnız bir elektronun eklenmesi veya transferi (elektron transferi ile radikal oluşumu ): - - A + e → A∙ (III) Biyolojik sistemlerdeki en büyük radikal kaynağı oksijendir. Serbest radikaller reaktif oksijen türlerinden meydana gelmektedir. Reaktif oksijen türleri ise metabolik kaynaklı ve dış kaynaklı olabilirler. Bunlardan metabolik kaynaklı olanlar elektron transport sistemi, oksidasyon reaksiyonları ve bazı enzimatik reaksiyonlar iken dış kaynaklı olanlar ise UV ışınları, radyasyon, hava kirliliği, ilaç yan etkileri, sigara, beslenme ve kanserojen maddelerdir.101, 102 19 Metabolizmada meydana gelen ve dış kaynaklı radikal ve reaktiflerin oluşma yolları aşağıda şekil 2.2’de gösterilmiştir.103 Şekil 2.2. Serbest radikal ve reaktiflerin oluşumu Moleküler oksijen, elektron transferiyle suya kadar indirgenir. Bu yol için 4 elektron gerekir ve bu yolda reaktif ara moleküller oluşur. Bunlar; süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksi radikalleridir. Bunlar önemli oksidatif stres ajanları olup reaktif oksijen türleri (ROT) olarak isimlendirilirler.104, 105 O2+ e + H+ → HO2∙ Hidroperoksil radikali (HO2∙) HO2∙ → H++ O2∙ Süperoksit radikali (O2∙) O2∙ + 2H++ e → H2O2 Hidrojen peroksit (H2O2) H2O2+ e → OH¯+ OH∙ Hidroksil Radikali (OH∙) OH∙ + e + H+→ H2O2 Hidrojen peroksit (H2O2) 20 2.10.1.1. Süperoksit Anyon Radikali (O2∙¯) Zayıf reaktif bir serbest radikal olan süperoksit anyonu, moleküler oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. Süperoksit oluşumu özellikle mitokondri iç zarındaki solunum zincirinde elektrondan zengin aerobik ortamda spontan olarak oluşur. Süperoksit radikali ksantin oksidaz ve bir grup flovoenzimler tarafından meydana getirilmektedir. Diğer süperoksit üreten enzimler ise lipooksijenaz ve siklooksijenazdır. Fagositik hücrelerin NADPH bağımlı oksidaz enzim kompleksi fazla miktarda süperoksit radikalini meydana getirmektedir. İki molekül süperoksit molekülü süperoksit dismutaz (SOD) sayesinde hızla hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşür.105 2.10.1.2. Hidrojen Peroksit H2O2 Hidrojen peroksit iki şekilde oluşur. 1. Oksijenin iki elektronla indirgenmesi sonucu H2O2 meydana gelir. O2∙¯+ e¯+ 2H+ → H2O2 2. Biyolojik sistemlerde sıklıkla görülen süperoksidin üretimi yoluyla meydana gelir ve böylece iki süperoksit anyon radikali birbiriyle, hidrojen peroksit ve oksijeni verecek şekilde reaksiyona girerler.106 2O2∙¯+ 2H+ → H2O2+ O2 Süperoksit radikallerinin temizlendiği bu tepkimeye dismutasyon tepkimesi adı verilir. Bu reaksiyon SOD tarafından veya spontan olarak meydana gelebilir. H2O2 bir serbest radikal değildir, fakat biyolojik membranlara kolaylıkla girebilmesi nedeniyle oldukça önemlidir. Nötrofil fagozomlarında bulunan myeloperoksidaz enzimiyle çok reaktif serbest oksijen radikali olan hipokloröz asit (HOCl) oluşumuna neden olur. H+ + Cl¯ + H2O2→ HOCl + H2O 21 H2O2 geçiş metallerinin varlığında en önemli ROT olan OH∙ radikalinin oluşmasını sağlar. H2O2’ nin diğerönemli bir görevi de intraselüler sinyal molekülü olarak rol oynamasıdır. H2O2 oluştuktan sonra katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve peroksiredoksinler adındaki üç enzim sistemince uzaklaştırılır.105 2.10.1.3. Hidroksil Radikali (OH∙) Hidroksil radikali, kimyada en aktif olarak bilinmektedir. (OH∙) biyolojik sistemlere diğer ROT’lardan daha fazla zarar veren, biyomoleküllerle reaksiyona girebilen güçlü bir radikaldir.105 Oluşması için ortamda geçiş metalleri olması gerekir. 3 yolla oluşabilir. 1.Radyasyon-Su H2O → Radyasyon → H2O++ e¯ H2O++ H2O → OH∙ + H3O+ 2. Fe – katalizli - Haber Weiss reaksiyonu (Fenton Reaksiyonu) Fe+2+ H2O2→ Fe+3 + OH∙ + OH¯ Katalize olmayan Haber Weiss reaksiyonunda ise, süperoksidin doğrudan hidrojen peroksitle reaksiyona girmesidir. O2∙¯+ H2O2→ OH∙ + OH¯+ O2 3. Hidrojen peroksidin fotolizi ile, Fotoliz OH∙ radikali canlı H2O2�⎯⎯⎯�OH¯+ OH∙ hücrelerde bulunan tüm moleküler reaksiyona girebilmektedir.98 Lipit peroksidasyonunu başlatabilir, deoksiribonükleik asit (DNA) iplikçiklerinde kırılmalara sebep olabilir ve hemen hemen her organik molekülü, ayrım yapmadan okside edebilir.106 22 2.10.1.4. Singlet Oksijen (1O2) Enerji absorbsiyonu ile oksijenin paylaşılmamış dış elektronlarını değiştirerek aynı ya da farklı orbitale yerleşebilirler. Uyarılmış haldeki bu oksijene singlet oksijen adı verilir.107 Singlet oksijen eşleşmemiş elektron içermediğinden dolayı serbest radikal değildir. Bununla beraber dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenin yüksek reaktif formudur.108 Singlet oksijen, DNA, ribonükleik asit (RNA), proteinler, lipitler ve sterolleri kapsayan çok sayıda biyolojik hedeflerle reaksiyona girerek hücrede zararlı etkilere neden olur.109 2.10.1.5. Nitrik Oksit (NO∙) ve Nitrojen Dioksit (NO2.) Nitrik oksit ve nitrojen dioksit, eşleşmemiş elektronları sayesinde birer radikaldirler. Nitrojen dioksit, nitrik oksitin oksijen ile reaksiyona girmesi sonucu oluşur. NO2∙ oldukça zehirli ve çok güçlü bir oksidantdır. Oksijen redüksiyonu sırasında NO2∙’ye maruz kalmasıyla araşidonik asit metabolizmasının NO2∙ konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiği görülmektedir. Düşük miktarda NO∙’in araşidonik asit metabolizmasını büyük oranda artırdığı görülmüştür.110-112 Nitrik oksit, L-arjinin amino asitinden in vivo olarak oluşur. NO∙ renksiz, kokusuz ve az indirgenebilen oksidant bir gazdır. Son yıllarda radikal olan nitrik oksitle oldukça fazla ilgilenilmeye başlanmıştır. Nitrik oksit eşleşmemiş elektronları sayesinde süperoksit, tiyol grupları ve nitrojen dioksit ile hızlı reaksiyonlar vermektedir. Diğer radikallerle beraber DM, kalp bozuklukları, septik şok, alzheimer hastalığı ve gastrik ülserlerin oluşumunda etkili olduğu düşünülmektedir.110, 111, 113 2NO∙ + O2→ 2NO2 Nitrik oksit radikali NO∙ + O2→ NO2∙ Nitrojen dioksit radikali O2∙¯+ NO∙ → ONOO¯ Peroksinitrit ONOO¯+ H+→OH∙ + NO2∙ 23 2.10.1.6. Diğer Serbest Radikaller Reaktif oksijen türlerinin diğer bir grubu, organik peroksitler (ROOH∙) ve organik peroksitlerin hemolitik yıkım ürünleri olan alkoksi (RO∙) ve hidroksiperoksil (ROO∙) veya indirekt olarak hidro ve semikinonlar veya nitroaromatlardır. Bununla beraber karbon merkezli organik radikaller (R∙), tiyil radikalleri (RS∙) gibi önemli radikaller vardır. 2.10.2. Serbest Radikallerin Kaynakları Serbest radikaller organizmalarda normal metabolik aktivitede oluşan oksidasyon-redüksiyon reaksiyonları sırasında, organizmada yabancı maddelerin (ksenobiyotiklerin) metabolize edilmesinde veya organizmanın radyasyon gibi dış etkilere maruz kalması sonucunda meydana gelebilir.114, 115 Hücredeki serbest oksijen radikal kaynakları endojen ve eksojen kaynaklar olmak üzere ikiye ayrılır. Tablo 1.2. Serbest radikal kaynakları Endojen Kaynaklar Mitokondriyal elektron transport zinciri Kloroplast elektron transport zinciri Oksidan enzimler: Ksantin oksidaz İndolamin dioksijenaz Triptofan dioksijenez Galaktoz oksidaz Siklooksijenaz Lipooksijenaz Mono aminooksidaz Fagositik hücreler: Nötrofiller Monosit ve makrofajlar Eozinofiller Endotelyal hücreler +2 Oto-oksidasyon reaksiyonları (Fe , epinefrin) Eksojen Kaynaklar İlaç oksidasyonları (Ör. Parasetamol, CCl4) İyonize radyasyon Güneş ışığı X- ışınları UV- ışınları Isı şoku Glutatyonu okside eden maddeler Ortamın havası Sigara dumanı Ozon Kükürtdioksit Egzos gazları 24 2.10.3. Serbest Radikallerin Etkileri Serbest radikaller, genelde iç ve dış etkenlere bağlı olarak üretimindeki artış ve antioksidan sistemin yetersizliğine dayanarak başta membran lipidleri olmak üzere, proteinler, karbonhidratlar ve DNA ya önemli hasarlar verebilmektedirler. Bu hasarlar hücrenin cinsine, maruz kalınan strese ve şiddetine bağlı olarak 116, 117; toksik, mutajenik veya karsinojenik olabilir.105 Şekil 2.3. Serbest radikallerin etkisiyle oluşan DNA hasarı Süperoksit radikali ve hidroksil radikali; sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlamasını sağlar. Membranlarda lipid peroksidasyonu sonucunda membran permeabilitesinde artma olur. Serbest radikallerin etkisi altında proteinlerdeki sistein sülfidril grupları ve diğer amino asit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur. 25 Serbest oksijen radikallerinin bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı meydana gelir. Serbest oksijen radikallerinin sebep olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu öne sürülmektedir. DM, aterogenez, amfizem/bronşit, parkinson hastalığı, duchenne tipi musküler distrofi, serviks kanseri, gebelik preeklempsisi, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, akut renal yetmezlik, down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon hasarı gibi durumlarda, serbest oksijen radikallerinin sebep olduğu hücre hasarı söz konusudur.118-120 2.10.3.1. Membran Lipidleri Üzerine Etkileri Serbest radikallerin oluşturduğu zararlı etkilerden en çok etkilenen yapı membran lipidleridir.98 Hücre membranındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları serbest radikellerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyona sebep olurlar.7, 117, 121 Bunun sonucunda membran akışkanlığında bozulma ve permeabilite değişiklikleri ortaya çıkar.122 Peroksidasyon; bir metilen grubundan bir hidrojen atomunu yerinden çıkaran herhangi bir radikal ile başlatılabilir. Oksijen peroksit radikalini oluşturmak için karbon radikaline eklenir ve böylece diğer lipit molekülünden bir H atomunu çıkararak lipit hidroksili meyadana getirir. Bu yeniden düzenleme ile endoperoksitler daha ileri derecede oksidasyon sonucunda ise malondialdehit (MDA) meydana gelebilir.123, 124 MDA hücre membranlarında iyon alışverişine etki ederek bileşiklerin çapraz bağlanmasına yol açar ve iyon geçirgenliğinin ve enzim aktivitelerinin değişimi gibi olumsuz sonuçlar meydana getirir.125 26 Şekil 2.4. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu 126 Lipidlerden, araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine “enzimatik lipid peroksidasyonu”, diğer radikallerin neden olduğu lipit peroksidasyonuna ise “nonenzimatik lipid peroksidasyonu” denir.108, 127 Lipit peroksidasyonunun organizmadaki etkileri; a) Lipit peroksidasyonu ile membran akışkanlığı azalır ve normalde hücre içine geçemeyen maddelerin hücre içine girişleri artar. b) Lipit peroksitler ve alkoksil radikaller; triptofan ve sistein gibi protein kısımlarına ataklar yaparak protein yapısını bozar ve hasar oluştururlar. 27 c) Lipit peroksidasyonu sırasında aktiviteleri için sülfidril ve amino grubuna ihtiyaç duyan, özellikle hormonal uyarılara hücrenin cevap verme imkanı sağlayan yüzey reseptörlerini inhibe ederler (glukoz 6 fosfataz (G6Paz) ve Na-K ATPaz gibi). d)Hücre membranına yakın bulunan DNA molekülleri de lipit peroksidasyonundan hasar görürler ve bazen DNA’nın replikasyonu yapılamaz. e) Bazı aldehitlerin biyolojik sıvılarda kemotaktik etkisi vardır. f) MDA gibi aldehitler, düşük yoğunluklu protein’i (LDL) modifiye ederek metabolik yolda değişiklik oluşturabilirler.128 2.10.3.2. Proteinler Üzerine Etkileri Proteinlerin serbest radikal hasarlarından ne ölçüde etkileneceği proteinin aminoasit kompozisyonuna bağlıdır. Doymamış bağ ve sülfür içeren moleküllerin serbest radikallerle reaktivitesi daha yüksek olduğundan triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi aminoasitleri içeren proteinler serbest radikallerden kolay bir biçimde etkilenmektedirler.105, 129 “Hem” proteinleri de serbest radikallerin oluşturduğu hasarlardan büyük oranda etkilenirler, özellikle oksihemoglobin süperoksit ve hidrojen peroksit ile reaksiyona girerek methemoglobini meyadana getirirler.99, 130-132 Proteinlerin tiyol gruplarının oksidasyonu, enzim fonksiyonundaki kayıplara, membran iyon ve metabolit transportunda aksamalara ve kontraktil fonksiyonlarda bozulmalara sebep olmaktadır.133 Serbest radikallerin proteinler üzerinde sebep olduğu başlıca değişiklikler şunlardır123; • Amino asitlerin modifikasyonu, • Proteinlerin fragmantasyonu, • Proteinlerin agregasyonu ve çapraz bağlanmalar. 28 2.10.3.3. Karbonhidratlar Üzerine Etkileri Serbest radikallerin etkisiyle, monosakkaritlerin otooksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksit ve okzoaldehid yapısında ürünler oluşur. Okzoaldehidlerin DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz bağ oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkileri vardır. Bu nedenle kanser ve yaşlanma gibi olaylarda etkili oldukları düşünülmektedir.134 2.10.3.4. Nükleik Asitler ve DNA Üzerine Etkileri İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikallerin mutajenik etkilerinden dolayı DNA üzerinde önemli hasarlara sebep olduğu bilinmektedir.135, 136 DNA’nın yarılması, DNA-protein çapraz bağları, pürinlerin otooksidasyonu gibi bazı durumlar reaktif oksijen türlerinin; özellikle de hidroksil radikalinin sebep olduğu hasarlardır.135, 137, 138 Ayrıca aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit, membrandan geçerek hücre çekirdeğinde hasarlara neden olabilmektedir.98, 139, 140 Eğer hidroksil radikali DNA’nın yakınlarında oluşursa pürin ve primidin bazlarına etki ederek mutasyona sebep olur. Singlet oksijenin nükleik asitlerle tepkimeye girme kabiliyeti daha sınırlıdır. Süperoksit anyonu güçlü bir oksitleyici olduğundan guanin gibi yüksek elektron yoğunluklu bölgeler içeren moleküllerle daha kolay bir şekide tepkimeye girerler.141 2.11. Oksidatif Stres Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak kabul edilen bir çizgide tutmaya çalışır. Bu dengenin bozulması oksidatif strese neden olur.142 Aerobik metabolizmada denge, serbest radikal oluşumu ve bunların benzer hızla antioksidan sistemlerce uzaklaştırılmasıyla karakterizedir. Geri dönüşümsüz oksidatif 29 hasarın birikimi ile önce hücre daha sonra doku ve organ sistemlerinde yapısal ve işlevsel bozukluklar meydana gelebilir.143 2.11.1. Serbest Radikaller ve Oksidatif Stres ile İlişkisi Antioksidan; okside olabilen substrata göre ortamda daha az derişimde bulunan ve bu substratın oksidasyonunu belirgin şekilde geciktiren veya engelleyen madde olarak adlandırılabilir. Bu tanıma göre antioksidanların fizyolojik rolü, serbest radikalleri içeren kimyasal reaksiyonların sonucunda hücresel bileşenlere gelebilecek zararı önlemektir.144 Aerobik metabolizmada denge, serbest radikal oluşumu ve bunların benzer hızla antioksidan sistemler tarafından uzaklaştırılmasıyla karakterize bir durumdur. Geri dönüşümsüz oksidatif hasarın birikimi ile önce hücre daha sonra doku ve organ sistemlerinde yapısal ve işlevsel bozukluklar meydana gelebilir. Oksidatif stres ile ilgili hastalıkların bazıları aşağıda belirtilmiştir.143 Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar.143 • Astım • Ateroskleroz • Serebral vaskuler hastalıklar • Kronik obstruktif pulmoner hastalık • Konjestif kalp yetmezliği • Diyabet • Hipertansiyon • Grip • Miyokard enfarktüs • Pnömoni • Hepatit 30 • Kanser • İnflamasyon hastalıklar 2.11.2. Oksidatif Stres ve Diyabet Üzerine Etkisi Organizmada serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların giderilme hızı bir denge içerisindedir ve bu durum oksidatif denge olarak tanımlanır. Oksidatif denge olduğu sürece organizma, serbest radikallerden etkilenmemektedir. Bu radikallerin oluşum hızında artma ya da giderilme hızında bir düşme bu dengenin bozulmasına sebep olur.‘‘Oksidatif stres’’ olarak tanımlanan bu durum; serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizması arasındaki ciddi dengesizliği belirtmekte olup, sonuçta doku hasarına yol açmaktadır.145 Diyabette reaktif oksijen türlerinin rolü 1980’li yıllardan beri geniş çapta tartışılan bir konu olmuş ve son zamanlarda oksidatif stres, diyabet ve diyabetik komplikasyonlar arasındaki ilişkilerin mekanizmaları ile ilgili çalışmalar büyük ölçüde artmıştır.146, 147 Diyabette oksidatif stresin artması yüzünden serbest radikal oluşumunun arttığı ve serbest radikal oluşumunun artmasına rağmen antioksidan üretiminin azaldığı gözlenmiştir. Bu nedenle artmış olan serbest radikal derişimi, diyabetin önemli komplikasyonlarından birisi olarak kabul edilmektedir.148 SOD, CAT, GPx gibi antioksidan enzimlerin ve antioksidan kapasitenin karaciğer, böbrek, iskelet kası ve adipoz doku gibi diğer dokularla karşılaştırıldığında, pankreas adacık hücrelerinde en düşük düzeyde olduğu bilinmektedir. Bu yüzden diğer dokulara göre oksidatif strese en hassas yapılardan biriolduğu bilinen beta hücrelerinde gözlenen hasarın hipergliseminin toksik etkilerinden kaynaklandığı düşünülmektedir.149 Yapılan epidemiyolojik araştırmalar, diyabetik olguların plazma lipoproteinlerinde, eritrosit zar lipitlerinde ve çeşitli dokularda lipid peroksidasyonunun arttığını belirtmiştir.150-152 Hem Tip I hem de Tip II diyabette, lipidlere ek olarak protein 31 oksidasyonunda da artış görülmektedir.153, 154 Zar kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikaller ile reaksiyona girerek peroksidasyon oluştururlar. Lipid peroksidasyonu ile oluşan membran hasarı geri dönüşümsüz olup oldukça zararlıdır. Lipid peroksidasyon ürünlerinden MDA, zar bileşenlerinin çapraz bağlanmasına ve polimerizasyonuna neden olur. Bu da, deformasyon, iyon transportu, enzim aktivitesi ve hücre yüzey bileşenlerinin agregasyonu gibi zar özelliklerinde değişiklik yapar. Bu özellikleri sayesinde MDA, mutajenik kültür hücreleri için genotoksik ve karsinojeniktir.99, 155, 156 Oksidatif strese maruz kalan beta hücrelerinde insülin gen ekspresyonunun düştüğü gösterilmektedir. Bunun sebebi ise oluşan oksidatif stres sonucu insülin ve glikokinaz gibi karbonhidrat metabolizması için çok önemli olan enzim ve hormonların gen ekspresyonlarını uyaran transkripsiyon faktörü Pankreatic and Duodenal Homebox 1’in (PDX-1)DNA’ya bağlanma potansiyelindeki azalma olduğu gösterilmektedir. Şekil 2.5’de görüldüğü gibi PDX-1’in aktivitesinin değişmesine bağlı olarak c-Jun N-terminal kinaz yolunun aktive olması ile insülin gen ekspresyonunun baskılandığı belirtilmektedir.157 İnsülin ekspresyonunun azalmasına ilişkin olarak ortaya çıkan lipotoksisitenin ise beta hücre disfonksiyonunun birincil sebebi olabileceği bilim dünyasında halen tartışılmaktadır.158 32 Şekil 2.5. Diyabette glukoz toksisitesine ilişkin olarak gelişen oksidatif stresin beta hücrelerindeki moleküler mekanizması157 Oksidatif stresin artmasına bağlı olarak diyabetik komplikasyonlar, transkripsiyon etmenlerinin aktivasyonu, ileri düzeyde glukozile son ürünlerin (AGEs=Advanced glycated end products) oluşumu ve protein kinaz C yolundaki mekanizmaların etkilenmesi ile meydana geldiği bilinmektedir.148 Söz konusu bu mekanizmaları etkileyen serbest oksijen metabolitlerinin kaynakları arasında diyabetik komplikasyonlarla en çok ilişkisi olan kaynağın glikasyon reaksiyonları olduğu belirtilmektedir.157 Şekil 2.6’da görüldüğü gibi serbest radikaller, protein glikasyonunun dışında, elektron transport sisteminde ve hekzoamin yolunda da meydana gelebilmektedir. 33 Şekil 2.6. Hiperglisemide temel oksidatif stres kaynağı olan mekanizmalar157 Diyabetik hastalarda oksidatif stresin artmasına paralel olarak, artan O2∙ radikalleri ile birleşen nitrik oksit (NO) daha reaktif olan peroksinitrit radikalinin oluşumuna sebep olmaktadır. Şekil 2.7’den de anlaşılacağı gibi hem süperoksit hem de peroksinitrit radikallerinin diyabetin komplikasyonlarının meydana gelmesinde önemli roller üstlendikleri görülmektedir.158 34 Şekil 2.7. Diyabetik komplikasyonların gelişiminde süperoksit ve peroksinitritin rolü158 2.12. Antioksidan Savunma Mekanizmaları Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların oluşturduğu hasarı geciktirmek ya da önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinmektedir.159 Vücutta serbest radikaller oluştuğunda organizmayı oksidatif stresden korumak için antioksidan sistem devreye girer. Birinci savunma hattını, peroksidaz ve metal bağlayan proteinlerin süpresyonu ile serbest radikallerin oluşmasını önleyen antioksidanlar 35 oluşturur. İkinci savunma hattını, vitamin C ve vitamin E gibi radikal temizleyici antioksidanların zincir oksidasyonunun başlamasını inhibe etmesi ve zincirleme tepkimelerin yayılımını önlemesi oluşturmaktadır. Üçüncü savunma hattında ise hasarı onarma ve eski haline getirmeye çalışan onarıcı ve yeniden yapılandırıcı enzimler (lipazlar, proteazlar, DNA onarıcı enzimler ve transferazlar gibi) rol alırlar.160 Antioksidan savunma sistemi başlıca iki şekilde yürür: 1. Serbest radikal oluşumunun önlenmesi a) Başlatıcı reaktif türevlerini uzaklaştırıcı etki, b) Oksijeni uzaklaştırıcı ve konsantrasyonunu azaltıcı etki, c) Katalitik metal iyonlarını uzaklaştırıcı etki. 2. Oluşan serbest radikallerin etkisiz hale getirilmesi a) Toplayıcı (scavenging) etki: Reaktif oksijen türlerini (ROT) etkileyerek onları tutma veya çok daha az reaktifi başka bir moleküle çevirme. (Ör: Enzimler) b) Bastırıcı (quencher) etki: ROT’lar ile etkileşerek onlara bir proton ekleyip aktivite kaybına neden olma. c) Onarıcı (repair) etki. d) Zincir kırıcı (chain breaking) etki: ROT’larını ve zincirleme tepkimeleri başlatacak diğer maddeleri kendilerine bağlayıp zincirlerini kırarak fonksiyonlarını önleyici etki (Ör: Hemoglobin, seruloplazmin, mineraller).161-163 2.12.1. Endojen (Doğal) Antioksidanlar Endojen antioksidan sistemi, antioksidan enzimler, hasarlı molekülleri uzaklaştırıcı proteazlar ve fosfolipaz gibi enzimler, yeni bileşikleri sentezleyen sistemler, glutatyon, ürik asit ve farklı türde metal bağlayıcılarından oluşmaktadır. Enzim yapısında olan endojen antioksidanlar, radikal ve reaktifleri gidererek oluşabilecek oksidadif hasarları yok ederler.164 36 2.12.1.1. Primer Antioksidantlar Süperoksit Dismutaz (SOD) Süperoksitin hidrojen peroksite dismutasyonunu katalizleyen bir metallo enzimdir. 2O2∙¯+ 2H+→ H2O2 + O2 İki reaktif oksijen çeşidini, radikal olmayan moleküllere dönüştürmesi sebebiyle antioksidan sistemin önemli öğelerinden birisidir. Oksijen kullanımı yüksek olan dokularda SOD aktivitesi fazladır. İnsan vücudunda iki çeşit SOD enzimi vardır. Bunlar sitozolde yer alan dimerik, kofaktörleri bakır ve çinko olan izomer (Cu-Zn SOD) ile mitokondride yer alan tetramerik, kofaktörü mangan olan izomerdirler (Mn-SOD). Etki mekanizmaları aynı olan iki enzim arasındaki ana fark aktiviteleri üzerine pH’nın etkisidir. Her ikisi de pH 7’deaktiftir. Fakat Cu-Zn SOD’un aktivitesi pH 5.5-10 aralığında değişmezken, Mn-SOD, pH 7’nin üzerinde olduğunda aktivitesini kaybeder.165-167 SOD gerçekte detoksifiye edici bir enzim değildir. Çünkü ürünü olan H2O2 toksik bir ajandır. Ancak bu reaksiyon, reaktif oksijen radikallerinin detoksifikasyonuna giden yolun ilk basamağını oluşturur. İkinci basamak CAT ve GPx enzimlerince H2O2’nin suya dönüşmesini katalizler.165 Katalaz (CAT) Katalaz dört tane hem grubu içeren bir hemoproteindir. Bu enzimin görevi hidrojen peroksiti moleküler oksijen ve suya katalizlemektir. 2H2O2→ 2H2O + O2 Katalaz enzimi daha çok peroksizomlarda lokalizedir. CAT aktivitesi karaciğer, böbrek ve eritrositlerde yüksektir.168 37 Glutatyon Peroksidaz (GPx) GPx organik hidroperoksitlerin (lipit hidroperoksitler, DNA hidroperoksitler) veya hidrojen peroksitin glutatyon (GSH) tarafından indirgenmesi reaksiyonunu katalizler. 1957’de Mills tarafından keşfedilmiştir.169 GSH−Px H2O2+ 2GSH �⎯⎯⎯⎯�2 H2O+ GSSG GSH−Px ROOH + 2 GSH �⎯⎯⎯⎯�ROH + GSSG + H2O GPx enziminin iki tipi vardır. Bunlar: Selenyum bağlı ve selenyum bağlı olmayan. Selenyum bağlı grupta hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitler indirgeyen beş üye bulunmaktadır, selenyum bağımsız GPx ise H2O2 ile ihmal edilebilir bir aktifliği olup sadece organik hidroperoksitleri indirgerler.170 Selenyum bağımlı üyelerden, GSH-Px 1 veya hücresel GSH-Px tüm hücrelerde eksprese edilen, tetramerik yapıda, sitozolik bir enzimdir. Eritrosit, böbrek ve karaciğerde yüksek miktarda vardır. GSH-Px 2 veya gastrointestinal GSH-Px insanlarda karaciğer ve gastrointestinal kanalda eksprese edilir. Böbrek, kalp, akciğer, plasenta ve uterusta bulunmamaktadır. GSH-Px 3 veya plazma GSH-Px plazmanın lipit bölümünden izole edilmiş bir glikoproteindir. Akciğer, plazma ve diğer ekstrasellüler sıvılarda bulunur. GSH-Px 4 veya fosfolipit GSH-Px sitozolde, mitokondri ve hücre zarında bulunur. GSH-Px 5 veya epididimal GSH-Px’e selenyum bağlı değildir ve sadece epididimiste eksprese edilir. GSH-Px 6 hücresel GSH-Px ile homoloji belirtir, burun epiteli ve embriyolarda eksprese edilir.169, 171, 172 Glutatyon S-Transferaz (GST) Ökaryotik hücrelerin sitozollerinde yer alan dimerik yapıda bir enzimdir. GST’lerin homo ve heterodimerik çok farklı yapıları ve izoenzim formlarının olduğu bilinmektedir. İzoenzim dağılımlarıyla ilgili belirgin bireysel değişiklikler görülmektedir. Öncelikle karaciğerde olmak üzere böbrek, adrenal, akciğer, eritrosit, 38 plasenta, testis, iskelet ve kalp kasında bulunur.173, 174 Başta araşidonik asit ve lineloat hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı GST’ler selenyum bağımsız GPx aktivitesi göstererek bir savunma mekanizması meydana getirirler. GST ROOH + 2 GSH�⎯�GSSG + ROH + H2O GST enzimlerinin katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyonları vardır. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri bulunmaktadır. Katalitik olarak; yabancı maddeleri GSH’daki sisteine ait –SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik kısımlarını nötralize ederler ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini sağlarlar. Oluşan bu GSH’daki konjugatları bununla beraber organizmadan atılabilir. GSH’dan glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere çevrilir. Ksenobiyotiklerin alışılageldik atılım ürünleri olan bu merkapturik asitler, yani N-asetil sisteinin S-alkile olmuş türevleri, daha sonra safra ile atılırlar. Bu yol, GST’lerin kanserojen, mutajen ve diğer zararlı kimyasalların hücre içi detoksifikasyonunda rolleri olduğunu belirtir. Metabolize edilmeyen lipofilik-hidrofobik çoğu bileşiği bağlamaları ise bu enzimlerin hücre içinde sınırlı çözünürlüğe sahip moleküller için depo ve taşıma rolü üstlendiğini belirtir.156, 175-177 Glutatyon Redüktaz (GR) Okside glutatyon (GSSG), NADPH bağlı flavo enzim olan glutatyon redüktaz (GR) ile redükte formuna (GSH) indirgenir.105, 144, 169 GR GSSG + NADPH + H+��2GSH + NADP+ GR’nin kalıtımı otozomal dominanttır ve 8. kromozom üzerinde bulunmaktadır. GPx ile benzer doku dağılımına sahiptir. GR, flavin adenin dinükleotid (FAD) ihtiva eder, NADPH’tan bir elektronun GSSG’nin disülfid bağlarına aktarılmasını katalizler. 39 Bu sebeple NADPH serbest radikal hasarına karşı gereklidir ve başlıca kaynağı pentoz fosfat yoludur178 (Şekil 2.8). Şekil 2.8. Glutatyon redoks döngüsü Miyeloperoksidaz (MPx) Nötrofil granüllerde bol miktarda bulunan MPx enzimi H2O2’den hipoklorik asit HOCl meydana getirmek üzere etki eder. Asidik pH oluşumuna bağlı olarak MPx aktivitesi yükselmekte ve membranı kolayca geçen H2O2 bakteriye toksik etki yapmakta ya da hidroksil (OH∙) radikaline dönüşmektedir. Bu tepkimede HOCl bulunmaktadır. H2O2 ile MPX; Cl¯iyonlarını HOCl’ye dönüştürmektedir. Çok reaktif olan HOCl çoğu biyolojik molekülü oksitlemektedir.179, 180 H2O2 + Cl¯+ H+→ HOCl + H2O HOCl + O2∙¯→ O2+ OH∙ + Cl¯ 2.12.1.2. Sekonder Antioksidanlar Glutatyon (GSH) Çok önemli bir antioksidan olan glutatyon, glutamik asit, sistein ve glisinden oluşan düşük molekül ağırlıklı bir tripeptiddir.7, 99 Hücrede en fazla sitozol, mitokondri ve nükleusta yer alır. Hücre içi glutatyonun büyük bir bölümü indirgenmiş olarak (tiyol), daha az bir bölümü de GSSG formunda bulunur.7, 181, 182 40 Şekil 2.9. Redükte glutatyon (GSH).169 GSH’a antioksidan özelliğini tiyol grubu sağlar. GSH hidroksil ve singlet oksijen gibi ROT’un temizleyicisi olmakla birlikte, diğer serbest radikaller ve peroksitlerle tepimeye girerek hücreyi oksidatif hasarlara karşı korurlar. Bunun yanısıra proteinlerdeki –SH gruplarını redükte halde tutarak proteinve enzimlerin inaktivasyonunu engellerler.183, 184 Potansiyel olarak bazı zehirli ksenobiyotikler GSH ile konjuge olmadıklarında hücre proteinleriyle kovalent bağ oluşturarak DNA, RNA ve proteinlerde hasar oluşturabilirler. Bu ksenobiyotiklerin GSH ile reaksiyonları tiyoeter (merkaptürik asit ve N-asetilsistein türevleri) meydana gelişi ile sonlanır ve bu ürünler idrarla dışarı atılırlar.7, 182, 183 Ayrıca GSH, mebran geçirgenliğinin sağlanması, protein konformasyonu ve enzim aktivitesinin ayarlanması gibi görevlerde de rolleri vardır.185, 186 2.12.2. Eksojen Antioksidanlar 2.12.2.1. Lipit Fazda Bulunanlar E vitamini (Tokoferol) α, β, γ, δ olmak üzere dört farklı tokoferol formu vardır. Biyolojik olarak en yaygın ve en aktif E vitamini formu olan D-α-tokoferoldür. Yağda çözünen ama suda çözünmeyen bu bileşikler oksijen bulunmayan ortamlarda asit ve sıcaklığa dayanıklıdır.187 41 Eşleşmemiş elektronlarla tepkimeye giren ve indirgeyebilen hidroksil grubu içerir. Radikal reaksiyonları sırasında zincir kırıcı etkisi vardır. GSH ve askorbik asit ile antioksidan etkisinde artış olur.187-189 Karotenoidler ve Retinol (A Vitamini) Alkoller (retinoller), aldehitler (retinaller) ve retinoik asitler başta olmak üzere A vitamininin farklı türleri bulunur. A vitamininin en etkili ve en yaygın çeşidi βkaroten’dir. Suda çözünmeyen bu bileşik havada okside olarak inaktif ürünler meydan getirir. A vitamininin antioksidan etkisi ile beraber gerekli olduğu sistemik etkiler hücre ve intrasellüler zar dayanıklılığının sağlanması, epitel dokunun bütünlüğünün sürdürülmesi ve glikoprotein sentezidir.190 Ubikinonlar Ubikinon temel olarak mitokondride elektron transport zincirinin bir parçası olarak kullanılmaktır, bununla beraber ubikinon düşük derişimlerde plazmada ve hücre zarlarında lipit peroksidasyonuna karşı koruyucu antioksidan olarak bulunur. Ubikinonun yenilenmesi lipoamid dehidrogenaz ve kısmen tiyoredoksin redüktazı da bulunduran enzim ailesinin diğer üyeleriyle gerçekleştirilir.191, 192 Flavonoidler Flavonoidler farklı türde sebze, meyve ve otlarda bulunan polifenol grubu doğal kimyasallardır. Doğada altı binin üzerinde flavonoid bulunmaktadır. Antioksidan, antiarteriyosklerotik, antiinflamatuvar, antitümör etkileri ile birlikte antitrombojenik, antiviral, antialerjik etkileri de vardır. Flavonlar, flavonollar, flavanonlar; kateşinler, isoflavonlar, antosiyanidinler olarak altı sınıfta toplanırlar. Flavonoidlerin, önemli metal şelatörleri ve serbest radikal temizleyicisi gibi görevleri vardır. Flavonoidlerce temizlenebilen ve formasyonları inhibe edilebilen reaktif oksijen ürünleri; süperoksit anyonları, hidroksil radikali, alkol radikali, peroksil radikali ve perhidroksi radikalidir. 42 Flavonoidler, radikallerin reaktif kısımlarıyla etkileşime geçerek, reaktif oksijen ürünlerini stabilize ederler.185 Melatonin Pineal bez hormonu olan melatonin (N-asetil-5-metoksitriptamin), hidroksil radikalini bertaraf eden güçlü ajanlardan biridir. Hidroksil radikalleri ile tepkimeye girdikten sonra indolil katyon radikaline dönüşür buda ortamdaki süperoksit radikalini tutarak antioksidan aktivite gösterir.99, 193 Lipofilik olması sebebiyle hemen tüm hücre organellerine ve birçok dokuya kolaylıkla girip daha geniş bir alanda etki gösterebilir, hücre çekirdeğine girerek DNA’yı oksidatif hasarlara karşı koruyabilir, yüksek konsantrasyonlarda bile toksik etkisi yoktur ve prooksidan aktiviteye sahip değildir. Bu özelliklerinden dolayı diğer antioksidan maddelere göre daha fazla etkisi vardır.194, 195 Ayrıca GPx’i stimüle eder ve hidroksil radikali için öncül olan H2O2’nin suya dönüşmesini katalizler. Yaşa bağlı olarak üretiminde azalma olduğu belirtilmiştir.99 Bilirubin Bilirubinin büyük bir bölümü ömrünü dolduran eritrositlerin parçalanmasından kaynaklanır ve dolaşımdan karaciğer tarafından alınır ve biyotransformasyona uğrar, safra ve idrarla atılır. Antioksidan olarak peroksil radikalleri toplar.189 2.12.2.2. Sıvı Fazda Bulunanlar C Vitamini (Askorbik Asit) Askorbik asit insan plazmasında ve hücre zarında yer alan, zarı geçebilen majör antioksidanlardan biridir. Suda çözünebilir düşük molekül ağırlıklı bu antioksidan; kollojen sentezi, demir absorpsiyonu ve hücrelerin redoks durumunun korunmasında gereklidir. Tokoferoller, peroksidler ve süperoksit gibi reaktif oksijen türlerini redükleyici özellik gösterir. Askorbik asitin antioksidan olarak temel görevi lipit 43 hidroperoksitlerin oluşumunu engellemektir. Bu da aterosklerotik plak oluşumunu engellemede önemli rol üstlendiğini göstermektedir.196 Ürik Asit İnsanlarda pürin nükleozidleri olan adenozin ve guanozin katabolizmasının esas ürünü ürik asittir. Metal bağlayıcı ve serbest radikal temizleyicisi olarak rol oynar.186 Transferrin Vücutta demir taşıyan proteindir. Bağlı demir, hidroksil radikali oluşumunu veya lipit peroksidasyonunda görev almamaktadır.197, 198 Ferritin Dokuda demir bağlanmasından sorumludur. Albumin Plazmanın zincir kırıcı antioksidan etkisine neden olan plazma sülfhidril gruplarının majör bileşenidir. Hipokloröz asidin güçlü bir temizleyicisidir.7 Glutatyon(GSH) GSH, glutamik asit, sistein ve glisinden meydana gelen bir tripeptit olup antioksidan ve hücre içi indirgeyici bir ajandır. Proteinlerdeki –SH gruplarını redükte durumda tutar ve bu grupları oksidasyona karşı korur. Yabancı bileşiklerin detoksifikasyonunu ve amino asitlerin membrandan transportunu sağlar.199 2.13. Botanik Bilgiler 2.13.1. Myrtus comminus L.’nin Bilimsel Sınıflandırılması ve Binominal Adı Alem: Plantae Bölüm: Magnoliphyta Sınıf: Magnoliopsida Takım: Myrtales Familya: Myrtaceae 44 Cins: Myrtus L. Tür: Myrtus communis L. 2.13.2. Myrtus comminus L.’nin Genel Özellikleri Myrtaceae familyasından olan MC Akdeniz ülkelerinin büyük çoğunluğu, Kuzey Amerika’nın sıcak bölgeleri ve Avustralya’da çok geniş alana yayılan en önemli bitki türlerinden biridir. Tunus, Fas, Türkiye, Fransa sahillerinde yabani olarak yetişmektedir. İran, İspanya, İtalya, Korsika ve Yugoslavya’da kültüre alınmıştır.200-211 Türkiye’de MC çam ormanında ve nehir kıyılarında, özellikle deniz seviyesinden 500-600 metre yükseklikte Toros dağlarında yetiştiği bildirilmiştir. Bitki yöresel olarak “hambeles”, “mersin” veya “murt” olarak da bilinmektedir.212 Myrtus communis L. bitkisi myrtaceae familyasından olup 1-3 m yüksekliğinde, kışın yapraklarını dökmeyen ve beyaz çiçekli bir ağaç olup; yapraklar 1-3 cm uzunluğunda, 0.5-1 cm genişliğinde, sivri uçlu, tüysüz ve derimsi, meyveleri ise nohut büyüklüğünde, siyahımsı mor renklidir. Akdenize özgü bir bitki olup Güney ve Batı Anadolu’da da yaygın biçimde yetişmektedir.213 Yapraklarının yanında daha az oranda meyve ve çiçeklerinden de elde edilebilen uçucu yağlar; parfümeride, kolonya sanayinde koku verici olarak, çeşitli içeceklerde, şekerlemelerde, çeşni karışımlarında, soslarda, dondurmalarda ve fırıncılık ürünlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Yapraklarından elde edilen uçucu yağların bileşimi, orjinine göre farklılıklar göstermekle beraber, Akdeniz çevresindeki ülkelerden toplanan örneklerden elde edilen uçucu yağların bileşimindeki başlıca maddelerin; mirtenol, limonen, mirtenil asetat, α-terpinol, α-pinen, 1,8-cineol (okaliptol) ve linalol olduğu bildirilmiştir.214 MC’nin uçucu yağının ana bileşenini 1,8-cineol olduğu bildirilmiştir.215, 216 Yadegarinia ve arkadaşları217 İran’ da, Jamoussi ve arkadaşları218 ve Messaoud ve 45 arkadaşları219 Tunus’ ta, Curini ve arkadaşları220 ise Fransa’da yaptıkları çalışmalarında uçucu yağının temel bileşenini α-pinen olarak belirlemişlerdir. Çok yıllık bir bitki olan MC, eski zamanlardan beri tıp, gıda ve baharat amaçlı kullanılmıştır. Yaprakları uçucu yağı ile beraber tanen, flavonoid (kesretin, kateşin, myrsetin türevleri gibi) içermektedir.213, 221 Meyveleri ise çoğunlukla uçucu yağ, tanen, şeker, flavonoid ile sitrik ve malik asit gibi organikasitler içermektedir.213, 222, 223 2.14. Myrtus comminus L.’nin Farmakolojik Özellikleri 2.14.1. Myrtus comminus L.’nin Antioksidan ve Antimikrobiyal Aktivitesi MCY’den elde edilen ekstrelerde antioksidan etki gösteren polifenolce çok zengin olduğu tespit edilmiştir.224 Başka bir çalışmada da MC antioksidant aktivitesi ölçülmüş ve bu antioksidant etkinin üç ay korunduğu bildirilmiştir.225 MCY’den elde edilen yağların Escherichia coli (E.Coli) karşı mükemmel bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir.217 MCY’nin metanol ile yapılan ekstresinin peptik ülserli hastalarda etkileri araştırılmış ve helikobakter piloriyi tedavi ettiği bildirilmiştir.226 2.14.2.Diğer Farmakolojik Özellikleri MC’nin çeşitli ekstraktlarının bazı bakteri ve mantarlara karşı etkili olduğu bilinmektedir. İçerdiği betatriketon türevlerinin antibakteriyel etkisi saptanmıştır.227 Tanen, myrsetin, gallik asit türevleri ve ellajik asit türevlerinin hem gram negatif (-) hem de gram pozitif (+) bakterilere karşı etkili olduğu tespit edildi. Diğer bir çalışmada da uçucu yağının E. coli, P. aeruginosa ve Candida lipolytica’ya karşı belirgin bir antibakteriyel aktivite gösterdiği gözlenmiştir. Alkolik ekstraktında da antimikrobik aktivite tespit edildi. Ayrıca MC yağının antifungal etkisinin de olduğu bulunmuştur.228 MC, Akdeniz bitki örtüsünde büyük ölçüde yayılmış çok yıllık uzun ömürlübir bitki olup halk ilacı olarak yaprakları gargara şeklinde ağız yaralarının tedavisinde kullanılır. Yapraklarından elde edilen uçucu yağların genel olarak akciğer hastalıkları 46 için kullanıldığı bildirildi.229 MC geleneksel olarak antiseptik ve dezenfektan ilaç olarak yaygın şekilde kullanılan bir bitkidir.230 Türk halk hekimliğinde, bitkinin yaprakları ve meyveleri yaraların iyileştirilmesinde antiseptik olarak ve idrar yolları rahatsızlıklarının tedavisinde çok kullanılır.213 Ayrıca, bu baharat halk ilacı olarak kanamayı durdurucu ve balsamik özelliklerinden dolayı da çok kullanılmaktadır.231-233 Bununla beraber Myrtus communis ekstrelerinin romotoid artrit gibi hastalıklara karşı analjezik ve antienflamatuar potansiyelinin olduğu bilinmektedir.234 2.15. Myrtus comminus L.’nin Farklı Kullanım Alanları MC suyu ter kokularını önlemede iyi bir deodorant etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir.235 Ayrıca antiseptik özelliği belirlenmiştir. MC dalları gölgelik yapımında, süslemede, kesme çiçek tanziminde kullanılmaktadır. Gıda ve parfümeri sanayisinde kullanılan önemli bir hammaddedir.223 Endüstride MC temel olarak gıda, eczacılık, parfümeri ve kozmetik alanında kullanılmaktadır. Ayrıca yüksek oranda içerdiği tanen ile tanenin kullanıldığı tüm alanlarda kullanılabilmektedir. Bilindiği gibi tanenli bileşikler tıpta astrenjan, antidiyareik, antibakteriyel, antienflamatuar olarak, dericilikte tabaklama işlemi için, fotoğrafçılıkta ve lastik sanayisinde kullanılmaktadır.236 Yapraklarından, çiçeklerinden ve meyvelerinden elde edilen MC yağı Yunanistan’da gıdalarda, kozmetik sanayisinde ve likör yapımında kullanılmaktadır.237 2.15. Myrtus comminus L.’nin Antidiyabetik ve Hipoglisemik Etkisi Ivorra ve ark.238, MC hidroalkolik özütünün, STZ ile ratlarda meydana getirilen hipergliseminin akut fazını önlediğini göstermişlerdir. Bununla beraber STZ’den 48 saat sonra verildiğinde hiperglisemiyi azaltmış ve bu etkisi doz tekrarlandığı sürece devam ettiğini belirlemişlerdir. Kan şekeri normal olan deney hayvanlarına karşı her hangi bir etkisi görülmemiştir. Bitki özütünün antikanserojen ve antigenotoksik özellik gösterdiği 47 belirtilmiştir.239, 240 Antioksidan özelliği ise 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) inhibisyonu ile izah edilmiştir.240 Geçmişten günümüze kadar halk arasında şeker hastalığında kullanılan MC’nin bu etkisi deneysel olarak da ispatlanmıştır. Sepici ve ark.10 tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada Myrtus comminus L. yaprağından elde edilen myrtil yağının ekstresi alloxan ile diyabet oluşturulan tavşanlara uygulandıktan 4 saat sonra glukoz seviyelerini düşürdüğünü tespit etmişlerdir. Bu ekstrenin kontrol grubunda ve diyabetli tavşanların serumlarında insülin konsantrasyonunu etkilemediği, fakat diyabetli tavşanların serumlarında trigliserid konsantrasyonunu düşürdüğünü belirlemişlerdir. Bunula beraber Sepici-Dincel ve ark.241 alloksanla diyabet oluşturulmuş tavşanlarla yapılan çalışmada Myrtus comminus L. elde edilen myrtil yağının monoterpenler (1,8-cineol, linalol ve myrtneyl asetat) içermesinden dolayı antioksidan ve antitümör aktivite gösterdiğini bildirmişlerdir. 48 3. MATERYAL VE METOT Bu çalışma, Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Laboratuvarı ve Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Moleküler Farmakoloji Araştırma Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. 3.1. Deney Bitkileri Akdeniz Bölgesi Finike Yöresi’den temin edilen Myrtus communis L. Atatürk Üniversitesi Eğitim Fakültesi’nde görevli Prof. Dr. Ali Aslan tarafından uluslararası teşhis yöntemleri kullanılarak tür teşhisi yapıldı. 3.2. Hayvanlar Çalışmamızda Atatürk Üniversitesi Tıbbi Uygulama ve Araştırma Merkezi (ATADEM)’den temin edilen ve ağırlıkları 118-226 gram arasında değişen toplam 30 adet Sprague Dawley erkek rat kullanıldı. Hayvan deneyleri ve bakımı ATADEM’de yapıldı. Hayvanlar deney öncesi gruplar halinde laboratuvarda oda sıcaklığında (22 ºC) pellet yemi ve musluk suyu ile beslendi. Çalışmalarımızın tüm aşamaları Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından 20.10.2009 tarih ve B.30.2.ATA.0.23.85-128 sayılı yazısı ile etik kurallara uygun olduğu onaylandı. 3.3. Mersin Yaprağı Ekstraktlarının Hazırlanması Toplanan Myrtus communis L. yaprakları (MCY) temizlenip 25ºC’de kurutuldu. Yapraklar sıvı azot ile toz haline getirildikten sonra 50ºC’de geri soğutucu altında ekstrakte edilerek, 12 saatte bir süzülerek toplam 72 saat saf suda bekletildi ve evaporatörde buharlaştırıldı. Daha sonra -80’de muhafaza edildikten sonra liyofilizatörde ekstrat içinde kalan su buharı uzaklaştırıldı. Liyofilizasyonla elde edilen kuru ekstrakttan uygun dozlamalar yapıldı. Hayvanlara MCY’nin su ekstreleri 150, 300, 600 mg/kg dozlarda hazırlandı.242 49 3.4. Streptozotocin ile Diyabet Modeli 3.4.1. Streptozotocinin Yapısı ve Etki Mekanizması Kapalı formülü C8H15N3O olan Streptozotocin’nin (STZ) molekül ağırlığı 265.2 dalton olup, STZ olarak da adlandırılır. Beyaz ve açık sarı arasında değişen sarı renkli bir tozdur. Anhidre olarak 115ºC’de bozunur. Maddenin potansiyel kanserojen, mutajen ve toksik özelliği olduğu bilinmektedir. Donmuş olarak hava ve nemden korunarak muhafaza edilirse aynı anomerik oranı ve saflık derecesini aylarca koruyabilir. STZ; suda, alkollerde ve ketonlarda çözünür. Çözeltideki çözünenler kararsız olduğundan dolayı kullanım sırasında hazırlanmalıdır.243 Bir streptomyces türünden veya sentetik yollardan elde edilen bir antibiyotik olan STZ, pankreasın beta (ß) hücrelerini selektif bir şekilde ve irreversibl olarak tahrip eder. İnsülinoma tedavisinde kullanılabilir. Belirgin hepatotoksik ve nefrotoksik etkisi nedeniyle yaygın kullanılmamaktadır. Laboratuvar çalışmalarında intravenöz verilerek deneysel diyabet modeli oluşturmak için kullanılabilir. Pankreas üzerinde STZ benzeri etki gösteren alloxan da deneysel diyabet modeli oluşturmak için kullanılabilir.243 Deney hayvanlarında STZ’nin veya alloxan’ın kullanılması, β hücrelerinin tahribine, insülin üretiminin veya salgılanmasının durmasına yol açar. Çeşitli hayvan türlerinin alloxana karşı duyarlılıkları farklıdır. Mesela, ratlar çok duyarlı oldukları halde kobaylar nispeten duyarsızdırlar. STZ ise genelde bütün türler için etkindir.244 3.4.2. Diyabet Oluşumu Ratlarda 40 mg/kg tek doz STZ çözeltisi intraperitoneal olarak uygulandı ve diyabet modeli oluşturuldu. Bu amaçla taze hazırlanan STZ’nin pH’sı 4.5 olan sitrat tamponu içindeki çözeltisi bir gece aç bırakılan ratların peritonuna enjekte edildi. Diyabet oluşturulmayan kontrol grubuna ise aynı miktarda sitrat tamponu çözeltisi ratların peritonuna enjekte edildi. STZ uygulamasına bağlı olarak pankreastan yoğun 50 insülin salgılanmaktadır. Bundan dolayı öldürücü hipoglisemi gelişmesi olasılığı vardır. Bunu önlemek için ratlara STZ uygulanmasından hemen sonra tek seferlik olmak üzere içme suyu olarak % 10’luk dekstroz çözeltisi verildi. 72 saat sonra kuyruk veninden alınan kan örnekleri Accu-Check Active kan glukoz monitörü ile değerlendirilerek ratların açlık kan şekerleri ölçüldü. 3. günün sonunda serum glukoz seviyeleri 200 mg/dL’nin üzerinde olan ratlar diyabetik olarak kabul edilip deneye alındı.245 3.5. İlaç Uygulaması Ratlar 6 gruba ayıldı. Bunlar tablo 3.1’de gösterilmektedir. Sağlıklı (grup I) ve STZ ile diyabet oluşturulan (grup II) kontrol gruplarına sadece su ve yem verilirken, diğer kontrol grubuna (grup V) 600 mg/kg su ekstresi verildi. Ratlarda diyabet modeli oluşturulduktan sonra ekstre uygulamasına geçildi. MCY su ekstresi 14 gün boyunca intragastrik gavaj yardımıyla günde tek sefer uygulandı. Grup IV, grup V ve grup VI’ya sırasıyla 150 mg/kg su ekstresi, 300 mg/kg su ekstresi, 600 mg/kg su ekstresi oral yoldan gavajla uygulandı. Ekstre uygulamasının 14. gününden sonra ratlardan intrakardiak kan örnekleri toplanarak, yüksek doz tiopental uygulaması sonucu ötanazi edilen tüm rat gruplarından karaciğer doku örnekleri alındı. Kan örnekleri vakumlu normal biyokimya tüplerine alındı. Oda sıcaklığında 5-10 dakika bekletildikten sonra 3500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Elde edilen serum örnekleri temiz plastik tüplere aktarılarak biyokimyasal parametreler çalışılmak üzere -80ºC’de saklandı. 51 Tablo 2.1. Deneyin çalışma planı Gruplar Grup-I SK grup Grup-II DK grup Deneyin 1. günü Aç bırakıldı Aç bırakıldı Deneyin 2. günü Sitrat Tamponu Sitrat tamponunda çözünen streptozotocin (40 mg) Grup-III MC III Aç bırakıldı Tedavi yok Grup-IV DM+MC I Aç bırakıldı Sitrat tamponunda çözünen streptozotocin (40 mg) Grup-V DM+MC II Grup-VI DM+MC III Aç bırakıldı Aç bırakıldı Sitrat tamponunda çözünen streptozotocin (40 mg) Sitrat tamponunda çözünen streptozotocin (40 mg) Deneyin Deneyin 18. 5. günü günü Tedavi yok Su + yem Tedavi yok Su + yem Mersin yaprağı su ekstresi (600 mg/kg) Su + yem Mersin yaprağı su ekstresi (150 mg/kg) Su + yem Mersin yaprağı su ekstresi (300 mg/kg) Su + yem Mersin yaprağı su ekstresi (600 mg/kg) Su + yem SK: Sağlıklı kontrol grubu, DK: Diyabetik kontrol grubu, DM+MCI: Mersin bitkisi yaprağı su ekstresinin 150 mg dozunu ihtiva eden diyabetik grup, DM+MCII: Mersin bitkisi yaprağı su ekstresinin 300 mg dozunu ihtiva eden diyabetik grup, DM+MCIII: Mersin bitkisi yaprağı su ekstresinin 600 mg dozunu ihtiva eden grup, MCIII: Mersin bitkisi yaprağı su ekstresinin 600 mg dozunu ihtiva eden kontrol grubu 3.6. Karaciğer Dokularının Biyokimyasal Analizi Karaciğer dokularındaki süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon (GSH) ve malondialdehit (MDA) düzeylerini ölçmek için, bu dokulardan homojenatlar hazırlandı. 52 Bu homojenatlardan elde edilen süpernatantlar kullanılarak SOD, GSH ve MDA düzeyleri “Elisa EPOCH” okuyucu ile spektrofotometrik olarak analiz edildi. 3.6.1. Numunelerin Hazırlanması Ratların sıvı azotla öğütülmüş karaciğer dokularından 0.75 g örnekler alındı. Alınan karaciğer dokularını kan hücreleri ve pıhtılardan uzaklaştırmak için pH’sı 7.4 olan fosfat tamponu (PBS) ile yıkanarak temizlendi. SOD tayini için doku örneğine HEPES tamponundan 750 µl ilave edilerek buzlu ortamda 1 dakika homojenize edildi. +4 °C’de, 1500 g’de, 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant kısımları analiz numunesi olarak kullanıldı. GSH tayini için doku örneğine fosfat tamponundan 750 µl ilave edilerek buzlu ortamda, 1 dakika homojenize edildi. +4°C’de, 10000 g’de, 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatant kısımları analiz numunesi olarak kullanıldı. MDA tayini için doku örneğine RIPA tamponundan 750 µl ilave edilerek buzlu ortamda homojenize edildi. +4°C’de, 15 saniye 40 V’de sonikatör ile homojenize edildi. +4°C’de, 1600 g’de, 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant analiz numunesi olarak kullanıldı. 3.6.2. Antioksidan Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.6.2.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Tayini Deneyin prensibi: Süperoksit dismutazlar, moleküler oksijen ve hidrojen perokside süperoksidin dismutazını katalizleyen metaloenzimlerdir ve böylece hücresel antioksidan savunma mekanizma parçasının çok önemli bir formudur.246 CAYMAN SOD Ölçüm Kiti; hipoksantin ve ksantin oksidaz tarafından üretilen süperoksit radikallerinin tespiti için bir tetrazolium tuzu kullanılması prensibine dayanmaktadır. SOD’un bir ünitesi, süperoksit radikalinin % 50 dismutasyonunun oluşması için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır. SOD ölçümünde, SOD’un üç tipi de (Cu/Zn, Mn ve FeSOD) ölçülmektedir. Bu metod SOD aktivitesinin plazmada, serumda, eritrosit lizatlarında, doku homojenatlarında ve hücre lizatlarında ölçülmesi 53 için basit, tekrarlanabilir ve hızlı bir ölçümdür. Mitokondriyal MnSOD aşağıdaki özetlenen prosedür ile tek başına ölçülebilir. Şekil 3.1. Süpeoroksit dismutaz ölçümünün şeması SOD Homojenat Tamponu (20 mM, pH 7.2, 100 ml HEPES tamponu): 90 ml distile suda 70 mM (2.396 gr) sükroz, 210 mM (3.824 gr) mannitol ve 1mM (0.038 gr) etilenglikoltetraasetik asit (EGTA) alınarak çözüldü ve pH 7.2’ye ayarlandı ve hacmi su ile 100 ml’ye tamamlandı. Kullanılan Reaktifler (96 well için): Ölçüm Tamponu (10X): Örnekleri ölçmek için 3 ml konsantre ölçüm tamponu, 27 ml distile su ile seyreltildi. Bu son ölçüm tamponu (0.1 mM dietilentriaminpentaasetik asit (DTPA) ve 0.1 mM hipoksantin içeren 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) radikal dedektörü seyreltmek için kullanıldı. Bu çözelti +4oC’de iki ay stabildir. Örnek Tamponu (10X): Örnekleri ölçmek için 2 ml konsantre örnek tamponu, 18 ml distile su ile seyreltildi. Bu örnek tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0) SOD numunelerini ve Ksantin oksidazı seyreltmek ve SOD standartlarını hazırlamak için kullanıldı. Bu tampon çözelti +4oC’de altı ay stabildir. 54 Radikal Detektör: Kullanmadan önce, şişedeki çözeltiden 50 µl diğer bir küçük şişeye aktarıldı ve 19.95 ml ölçüm tamponu ile seyreltildi. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplandı. Seyreltik radikal dedektörü iki saat stabildir. SOD Standardı: 100 µl bovine eritrosit SOD (Cu/Zn) kullanıldı. Kullanılmayan enzim -20oC’de muhafaza edildi. Bu enzim en fazla iki kere çözünüp kullanılabilir. Ksantin Oksidaz: Kullanmadan önce, çözünen 150 µl Ksantin oksidazdan 50 µl alınarak başka bir şişeye aktarıldıktan sonra ve 1.95 ml örnek tampon ile seyreltildi. Bu seyreltik Ksantin oksidaz çözeltisi buzda saklandı. Çözelti bir saat stabildir. Bunun tekrar dondurulup çözülmemesi gerekir. Deneyin yapılışı: SOD standart solüsyonunun hazırlanması: SOD stok solüsyonunu hazırlamak için, 20 µl SOD standart 1.98 ml örnek tampon ile seyreltildi. 7 tane deney tüpü alındı ve A’dan G’ye kadar işaretlendi. Her tüpe tablo 3.2’de belirtilen oranlarda SOD stok çözeltisi ve örnek tamponu ilave edildi. Tablo 3.2. SOD standart hazırlama Tüp SOD Stok (µl) Örnek Tamponu (µl) Son SOD Aktivitesi (U/ml) A 0 1000 0 B 20 980 0.025 C 40 960 0.05 D 80 920 0.1 E 120 880 0.15 F 160 840 0.2 G 200 800 0.25 55 SOD Ölçümü: Aşağıdaki deney şemasına uygun olarak karaciğer dokusunda SOD tayini yapıldı. Tablo 3.3. SOD deney şeması Kör Numune Standart Standart - - 20µl Süpernatant - 20µl - 220µl 200µl 200µl 20µl 20µl Radikal Dedektör 10 dk. çalkalayıcıda bekletildi. Reaksiyonu başlatmak için ksantin oksidaz eklendi. Ksantin Oksidaz 20µl Birkaç saniye plate’nin üstü kapalı şekilde çalkalayıcıda bekletildi. Oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildikten sonra maximum absorbansın 460 nm olduğu dalga boyunda Eliza cihazında okutuldu. SOD Miktarının Hesaplanması: 1. Her standart ve örnek için ortalama absorbans hesaplandı. 2. Lineer doğru (LD) elde etmek için A’nın absorbansı kendine ve diğer tüm standart ve örneklere bölündü (Std Aiçin LR= Abs Std A/ Abs Std A; Std Biçin LR= Abs Std A/ Abs Std B). 3. Lineer SOD standart doğrusu (LD) son SOD aktivitesinin (U/ml) bir fonksiyonu olarak kullanıldı. Tipik bir standart eğri çizildi. 4. Her örnek için lineer doğrunun (LD) yerine kullanılan standart eğrinin lineer regresyonundan elde edilen eşitliği kullanarak örneklerin SOD aktivitesi hesaplandı. Bir ünite süperoksit radikalinin % 50 dismutasyonunu göstermek için gerekli olan enzimin 56 miktarı olarak tanımlandı. SOD aktivitesi, sitokrom c ve ksantin oksidazın birkaç ölçümü kullanılarak standardize edildi. örnek LR − y − girişim 0.23ml SOD(U/mg doku) = [� �∗ ] eğim 0.01ml 3.6.2.2. Glutatyon (GSH) Aktivitesinin Tayini Deneyin Prensibi: GSH, hayvanlar ve bitkilerde yaygın olarak bulunan bir tripeptitdir (L-γ-glutamilsisteinilglisin).247, 248 GSH, ksenobiyotiklerin detoksifikas- yonunda glutatyon transferaz için nükleofilik bir ko-substrat olarak hizmet verir ve hidroperoksitlerin redüksiyonunda glutatyon peroksidazlar için gerekli bir elektron vericisidir.248, 249 CAYMAN GSH Ölçüm kiti, GSH miktarının belirlenmesi için glutatyon redüktaz vasıtasıyla optimize edilmiş enzimatik geri dönüşümlü bir metot olarak kullanılır.250-252 GSH’ın sülfidril grupları 5,5’-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB, Ellman reaktifi) ile reaksiyona girer ve sarı renkli 5-tiyo-2-nitrobenzoik asit (TNB) üretilir. Eş zamanlı üretilen disülfit karışımı (GSH ve TNB arasında), GSH’ı geri dönüştürmek için glutatyon redüktaz (GR) tarafından azaltılır ve daha fazla TNB üretilir. TNB üretiminin hızı, örnekteki GSH’ın konsantrasyonuna doğrudan bağlı olan bu geri dönüşümlü reaksiyonla direkt olarak orantılıdır. 405-414 nm’de TNB absorbansını ölçümü örnekteki GSH için doğru bir değerlendirme sağlamaktadır. 57 Şekil 3.2. GSH’ ın geri dönüşümü GSH Homojenat Tamponu ( 50mM, pH 6-7, 100 ml fosfat tamponu): 0.68 gr KH2PO4 ve 0.871 gr K2HPO4 alınarak 90 ml distile suda çözüldü ve 1 mM ( 0.029 gr ) EDTA eklendi, daha sonra pH 6-7 ayarlandı ve 100 ml’ye distile su ile tamamlandı. Reaktiflerin Hazırlanışı (96 well için): GSH MES Tamponu (2X): Tampon 0.4 M 2-(N-morfolino) etansülfonik asit, 0.1 M fosfat ve 2 mM pH 6.0 EDTA içermektedir. 60 ml MES tamponu kullanmadan önce 60 ml distile su ile seyreltildi. GSSG Standart: 2 ml 25 µM GSSG standartlar kitde kullanıma hazır olarak bulunmaktadır. NOT: GSSG, GSH yerine bir standart olarak kullanılır. Ölçüm koşulları altında GSSG hızlı bir şekilde GSH’a indirgenir. Böylece gerekli standardı sağlar. Bu standart 0-4 oC’de bir yıl stabildir. GSH Co-faktör Karışımı: Glukoz-6-fosfat ve NADP+’nın liyofilize tozunu içeren bu karışım 0.5 ml distile su ile seyreltildi. Seyreltilmiş bu reaktif 0-4oC’de 2 hafta stabildir. 58 GSH Enzim Karışımı: Karışım 0.2 ml glutatayon redüktaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz ihtiva eder. Bu karışıma 2 ml MES tamponu eklendi ve karıştırıldı. Bu karışım 0-4oC’de 2 hafta stabildir. GSH-DTNB: DTNB’nin (5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoik asit), Ellman reaktifi) liyofilize tozunu içeren GSH-DTNB 0.5 ml distile su ile seyreltildi ( Kullanmadan hemen önce hazırlanıp 10 dk içinde tüketilmelidir). GSH Ölçüm Tamponu (Assay Cocktail): 11.25 ml seyreltilmiş MES tamponu, 0.45 ml seyreltilmiş Co-faktör karışımı, 2.1 ml seyreltilmiş enzim karışımı, 2.3 ml distile su ve 0.45 ml seyreltilmiş DTNB alınıp karıştırılarak Assay Cocktail hazırlandı. (Bu karışım deney sırasında hazırlanmalıdır.) Deneyin Yapılışı: Standart Hazırlama: 8 tane temiz deney tüpü alındı ve A’dan H’ye kadar işaretlendi. Her tüpe aşağıdaki Tablo 3.4’de gösterildiği gibi MES tamponu ve GSSG standardı eklendi. Tablo 3.4. Glutatyon standart hazırlanma Tüp GSSG Standart (µl) A B C D E F G H 0 5 10 20 40 80 120 160 MES Tamponu (µl) 500 495 490 480 460 420 380 340 Final Konsantrasyonu (µM GSSG ) 0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 *Ölçüm koşulları altınnda GSSG, 2 mol eşdeğer GSH üretmek üzere indirgenir. Eşdeğer Total GSH (µM )* 0 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 12.0 16.0 59 Aşağıdaki Tablo 3.5’deki deney şemasına uygun olarak karaciğer dokusunda GSH tayini yapıldı. Tablo 3.5. GSH deney şeması Kör Numune Standart Standart - - 50 µl Süpernatant - 50 µl - Platenin üzeri plate koruyucu ile kapatıldı (10 dak.). Assay Cocktail 200 µl 150 µl 150 µl Yaklaşık 1 dk kadar karanlık bir ortamda çalkalayıcıda karıştırıldı. Max. Absorbansın 405 nm olduğu dalga boyunda 30 dk boyunca 5 dk aralıklarla kinetik ölçüm yapıldı. Kinetik Metodun Hesaplanması: 1. Her standart ve örneğin ortalama absorbans değerleri zamana bağlı bir fonksiyon olarak kullanıldı ve her eğri için i-eğim hesaplandı. 2. Her standardın i-eğimi total GSH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak kullanıldı. Bu eğrinin eğimine f-eğimi denir. 3. GSH standart eğrisine karşı eğri kullanarak onların kendi eğimlerinden her bir örnek için toplam GSH değerleri hesaplandı. [Total GSH] (µM/mg doku) = � (örnek için i − eğimi) − (Y − girişim) � x 2 x örnek dilüsyonu f − eğimi NOT: Eğer örneklerinizin deproteinasyona ihtiyacı varsa, ek MPA reaktifini hesaplamak için ikiyle çarpmamız gerekmektedir. 60 3.6.2.3. Malondialdehit (MDA) Enzim Aktivitesinin Tayini Deneyin Prensibi: Malondialdehit (MDA) lipid peroksidasyonun doğal olarak oluşan bir ürünüdür. Tiyobarbütirik asit reaktif substanslarının (TBARS) ölçümü lipid peroksidasyonun tarama ve görüntülenmesi için geliştirilmiş bir metot olarak kullanılır.253, 254 CAYMAN TBARS Ölçüm Kiti plazma, serum, idrar, doku homojenatları ve hücre lizatlarında; lipid peroksidasyon ölçümü için basit, tekrarlanabilir ve standardize edilmiş bir ölçümdür. Asidik koşullarda ve yüksek sıcaklık altında (90-100oC) MDA ve TBA’nın reaksiyonu ile oluşan katılma ürünü MDA-TBA, florometrik olarak 530 nm uyarma dalga boyunda ve 550 nm emisyon dalga boyunda veya kolorimetrik olarak 530-540 nm’de ölçülür. Florometrik olarak ölçüldüğünde daha iyi bir hassasiyet göstermesine rağmen, iki metot için de protokoller üretilmiştir. Şekil 3.3. MDA’ nın TBA ile birleşimi MDA Homojenat ve Ölçüm Tamponu ( pH 8.0, 500 ml RIPA tamponu): 150 mM 15 ml NaCl, % 1’lik Triton X-100’den 5 ml, % 0.5 Na Deoxycholate’dan 2.5 g, % 0.5 SDS’den 2.5 g, 50 mM Tris-HCl’den 25 ml; alınıp bir miktar distile suda çözündükten sonra pH 8.0 olacak şekilde ayarlanıp 500 ml’ye tamamlandı. 50:1 oranında proteaz inhibitörü eklendi. ( +4ºC’ de 1 sene stabildir.) 61 Reaktiflerin Hazırlanması (96 well için): 1. Thiobarbitürik Asit (TBA): 2 g hazır olarak bulunan TBA, renk reaktifinin hazırlanmasında kullanıldı. 2. TBA Asetik Asit: 40 ml TBA Asetik Asit alınarak 160 ml distile su ile seyreltildi. Seyreltilen asetik asit solüsyonu renk reaktifinin hazırlanmasında kullanıldı (Oda sıcaklığında 3 ay stabildir). 3. TBA-Sodyum Hidroksit (10X): 20 ml TBA-NaOH, 180 ml distile su ile seyreltildi. Seyreltilen NaOH solüsyonu renk reaktifinin hazırlanmasında kullanıldı (Oda sıcaklığında 3 ay stabildir). 4. TBA-MDA Standart: 500 µM MDA ihtiva eden bu çözelti standart eğri oluşturmak için kullanıma hazır olarak bulunmaktadır. 5. TBA SDS Solüsyonu: Kullanıma hazır olarak bulunmaktadır. 6. MDA renk reaktifi: 530 mg TBA tartıldı üzerine seyreltilmiş TBA Asetik asitten 50 ml ilave edildi ve bunun üzerine seyreltilmiş TBA-NaOH dan 50 ml ilave edilerek çözününceye kadar karıştırıldı. Not: Tüm reaktifler deneyden önce oda sıcaklığına getirilmelidir. SDS solüsyonu 1 saat öncesinden oda sıcaklığına getirilmelidir. Deneyin Yapılışı: Standart Hazırlama: 125 µM MDA stok solüsyonu elde etmek için; 250 µl MDA standardı 750 µl distile su ile seyreltildi. Daha sonra 8 tane temiz deney tüpü alındı ve A’dan H’ye kadar işaretlendi. Her tüpe 125 µM MDA stok solüsyonundan ve tabloda gösterildiği gibi su miktarlarından eklendi. 62 Tablo 3.6. MDA kolorimetrik standart hazırlanma Tüp A B C D E F G H MDA (µL) 0 5 10 20 40 80 200 400 Distile su (µL) 1.000 995 990 980 960 920 800 600 MDA Konsantrasyonu (µM) 0 0.625 1.25 2.5 5 10 25 50 Tablo 3.7. MDA deney şeması Kör olarak homojenat tamponu kullanıldı. Kör Numune Standart 100µl Standart 100 µl Süpernatant 100 µl 100 µl SDS 200 µl RIPA Tamponu 4ml 4 ml 4 ml Renk Reaktifi Her tüpün alt kısmına 4 ml renk reaktifi eklendikten sonra yavaşça ters düz edildi. Tüpler 1 saat su banyosunda kaynatıldı. Tüpler su banyosundan alındıktan sonra su altında soğutuldu ve 10 dk. buzun içinde bekletildi. 10 dk. 1600 G‘de, +4ºC’desantrifüj edildi. Oda sıcaklığında 30 dk. bekletilerek renklenme oluşması sağlandı. Tüm numune ve standartlardan 150 µl alındı ve plate’e yüklendi. Max. absorbansın 530 nm olduğu dalga boyunda ölçüm yapılarak kolorimetrik hesaplama yapıldı. Kolorimetrik Hesaplamalar: 1. Her standart ve örnek için ortalama absorbans hesaplandı. 2. Hem standartdan, hem de örneklerden Standart A’nın ( 0 µM ) absorbans değeri çıkarılarak doğrulanmış absorbans değeri tespit edildi. 63 3. Her standardın doğrulanmış absorbans değerleri (2. adımdan itibaren) MDA konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak kullanıldı. 4. Standart eğriden her örnek için MDA değerleri hesaplandı. (doğrulanmış absorbans) − (y − girişim) ] eğim MDA (µM/mg doku) = [ 3.6.3. Serumda Yapılan Analizler 3.6.3. 1. ALP, ALT ve AST Ölçümü İçin Serum Elde Edilmesi 14 günlük ilaç uygulamasının ardından yüksek doz tiopental ile ötanazi yapılan ratlardan kan örnekleri vakumlu normal biyokimya tüplerine alındı. 3500 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Elde edilen serum örnekleri deney yapılana kadar –80oC’ de muhafaza edildi. 3.6.3.2. Alanin Aminotransferaz (ALT) Ölçümü (Item no: B0387ABENSRL MİLANO/ ITALYA) Deney Prensibi: Transaminaz ALT, ketoglutamik asit ve pürivik asit vermek üzere α-ketoglutarat ve L-alanin arasındaki reaksiyonu katalizler. Laktat dehidrogenazın varlığında pirüvik asit NADH ile birlikte reaksiyona girerek aynı miktarda NAD ve laktik asit oluşturur. NADH'ın absorbansındaki azalış, örnekteki ALT’nin aktivitesi ile orantılıdır. Serum örneklerinde, ChemWell biyokimya cihazı kullanılarak ALT ölçümü yapıldı. 3.6.3.3. Alkalin Fosfataz (ALP) Ölçümü (Item no: B0796A- BENSRL MİLANO/ ITALYA) Deney Prensibi: Alkalen fosfataz (ALP), p-nitrofenol ve fosfatta pnitrofenilfosfatın hidrolizini katalizler. 405 nm’deki ünitede absorbansın yükselişi dikkate alınırsa örnekteki ALP’nin aktivitesi hesaplanır. Serum örneklerinde, ChemWell biyokimya cihazı kullanılarak ALP ölçümü yapıldı. 64 3.6.3.4. Aspartat Aminotransferaz (AST) Ölçümü (Item no: B0388A BENSRL MİLANO/ ITALYA) Deney Prensibi: Transaminaz AST, ketoglutamik asit ve okzaloasetik asit vermek için α-ketoglutartat ve L-aspartik asit arasındaki reaksiyonu katalizler. Malat dehidrogenaz varlığında, okzaloasetik asit NADH ile reaksiyona girerek aynı miktarda NAD ve malik asit oluşturur. Oksidayon için NADH’ın absorbansının düşüşü örnekteki AST’nin aktivitesi ile orantılıdır. Serum örneklerinde ChemWell biyokimya cihazı kullanılarak AST ölçümü yapıldı. 3.6.4. Kan Glukozu Ölçüm Prensibi Accu-Check Active Kan Glukoz Monitörü kandaki glukoz seviyesini elektrokimyasal tespit tekniği ile ölçmek için geliştirilmiştir. Accu-Check Active Kan Glukoz Monitörübu ölçümleri yapabilmek için glukoz oksidaz tekniği ile uyumlu tek kullanımlık kuru ayıraç stribini kullanmaktadır. Her bir strip glukoz oksidaz enzimi ihtiva edecek şekilde üretilmiştir. Stribin ucundaki kan toplama haznesine kan örneği dokundurulur ve glukonik asit üretmek için glukozun oksidasyonunu katalize edecek olan glukoz oksidazın bulunduğu yere otomatik olarak emdirilir. Reaksiyon sırasında iletken madde elektronları elektroda iletir ve akım oluşturur. Akımın miktarı kandaki glukoz miktarı ile paraleldir. Glukoz yoğunluğu Accu-Check Active Kan Glukoz Monitörü tarafından 5 saniyede ölçülür ve ekrana yansıtılır.255 3.7.Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan tüm kimyasal malzemelerin adları, kapalı formülleri ve temin edildikleri firmaların isimleri aşağıda verilmiştir. Streptozotocin (C8H15N3O7) Sigma Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) Sigma Dipotasyum hidrojen fosfat (K2HPO4) Sigma 65 Triton X-100 [C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10)] Sigma Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) Sigma Nitrobluetetrazolium (C40H30Cl2N10O6) Sigma Xanthin oksidaz (C5H4N4O2) Cayman (Item No. 706002) Sodyum dodesil sülfat (SDS) Sigma Asetik asit (CH3COOH) Sigma Tiyobarbitürik asit (TBA) (C4H4O2N2S) Merck Commassie Brillant Blue G-250 (C45H44N3NaO7S2) Sigma Sodyum hidroksit (NaOH) Sigma Sodyum klorür (NaCl) Sigma Trizma (NH2C(CH2OH)3) Sigma Dietilentriaminpentaasetik asit (DTPA) Cayman (Item No. 706002) Bovin eritrosit SOD (Cu/Zn) Cayman (Item No. 706002) Sükroz (C12H22O11) Sigma Mannitol (C6H14O6) Sigma Fosfat Tampon Tuzu (PBS) Sigma Etilenglikoltetraasetik asit (EGTA) Sigma GSH Co-faktör karışımı Cayman (Item No. 703002) GSH Enzim karışımı Cayman (Item No. 703002) 5,5'-Ditiyobis-(2-Nitrobenzoic Acid) (DTNB) Cayman (Item No. 703002) Sodyumdeoksikolat (C₂₄H₃₉NaO₄) Sigma Proteaz inhibütörü Sigma Hidroklorik asit (HCl) Sigma 3.8. Deneylerde Kullanılan Cihazlar pH metre : Schott CG 842 66 Hassas Terazi : Scaltec SPB 42 Derin Dondurucu : Sanyo MDF–235 Homojenizatör :OMNI TH İnternational, QIAGEN GERMANY. Magnetik Karıştırıcılar : Boeco MSH 300 Otomatik Pipetler :Eppendorf, Microlit, Socorex, Transferpette -8 BRAND multipipet Buzdolabı : Profilo Saf Su Cihazı : GFL 2004 Çalkalayıcılı Su Banyosu : Memmert Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör) : BSI Vortex : Vortex Genie-Model K-550-GE Santrifüj : Hettich UNIVERSAL 32 R Liyofilizatör : Alpha 1-2 LD Sonikatör Cihazı :BANDELIN SONOPULS Elisa Spektrofotometrik Okuyucu :EPOCH Biotek /USA. Kan Şekeri Ölçümü Cihazı :Accu- Check Active Kan Glukoz Monitörü Biyokimya Cihazı Spekrofotometrik Okuyucu: ChemWell 2900 AWARENESS Tecnology 3. 9. İstatistiksel Analiz Çalışmamızın sonucunda elde edilen sonuçlar istatistiki olarak değerlendirildi. Sonuçların ortalama değerleri ( X ) ve standart sapmaları (SD) bulundu. İstatistiksel değerlendirilmeleri bilgisayarda SPSS 20.0 software programında anlamlılık sınırı 0.05 alınarak yapıldı. SOD, GSH, MDA, AST, ALT, ALP ölçümlerindeki istatiksel farklılıklar ve önem seviyeleri tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi ve çoklu 67 karşılaştırmalarda LSD testi kullanıldı. Deney başlangıcı ve deney sonu şeker seviyeleri ölçümlerindeki istatistiksel farklılıklar ve önem seviyeleri ise Paired T-Test ile belirlendi. 68 4. BULGULAR Bu çalışmada, sağlıklı kontrol (SK), diyabetik konrol (DK), su yüksek doz kontrol (MCIII), su I. doz (DM+MC I), su II. doz (DM+MC II), su III.doz (DM+MC III) gruplarının kan glukoz düzeyleri tablo 4.1’de verilmiştir. Tablo 4.1. Gruplar ve kan glukoz ölçüm değerleri Gruplar Deney başlangıcı kan glukozu ölçümü (mg/dL) Deney sonu kan glukozu ölçümü (mg/dL) SK DK MC III DM+MC I DM+MC II DM+MC III Ortalama ± std. sapma 80.200 ± 4.438 262.600 ± 10.358 89.200 ± 9.284 250.000 ± 8.860 260.400 ± 9.813 264.200 ± 11.344 Ortalama ± std. sapma 81.000 ± 4.795 459.400 ± 17.812 88.400 ± 8.294 232.800 ± 9.338 217.400 ± 8.876 161.000 ± 8.916 Sonuçlar, rat gruplarının ölçümdeki ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir Bu çalışmada, sağlıklı kontrol (SK), diyabetik kontrol (DK), su yüksek doz kontrol (MCIII), su I. doz (DM+MC I), su II. doz (DM+MC II), su III.doz (DM+MC III) gruplarının ALT, AST, ALP değerleri enzim aktiviteleri tablo 4.2 ve şekil 4.1, 4.2 ve 4.3’de verilmiştir. Tablo 4.2. Gruplar ve karaciğer enzim aktiviteleri Doz Rat (mg/kg) Gruplar Sayısı 5 SK 5 DK 5 MC III 150 5 DM+MC I 300 5 DM+MC II 600 5 DM+MC III ALT (IU/L) 28,43 44,75 25,74 42,18 36,41 29,21 ± ± ± ± ± ± 1,554** 0,482 0,922** 1,906* 2,146** 1,571** AST (IU/L) 69,86 98,85 45,03 88,16 82,84 72,42 ± ± ± ± ± ± 5,859** 8,312 6,434** 0,914* 4,596* 15,108** ALP (IU/L) 93,73 151,31 80,10 141,53 132,38 106,23 ± ± ± ± ± ± 6,558** 10,107 4,440** 5,995* 7,435** 5,450** Sonuçlar, rat gruplarının ölçümdeki ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ٭٭diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde oldukça anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı 69 160 * 140 ** 120 ALP (IU/L) 100 ** ** ** 80 60 40 20 (mg/kg) 0 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) DM+MC III (600 mg/kg) Şekil 4.1. Rat gruplarındaki alkalen fosfataz (ALP) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin I. dozunu içeren tedavi grubunun ALP aktivitesi, diyabetik kontrol (DK) gruba göre düşük bulunurken (p<0.05), sağlıklı kontrol (SK), su yüksek doz kontrol (MCIII), su ekstresinin II. dozunu içeren ve III. dozunu içeren grupların ALP aktivitesi diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (p<0.001). Sağlıklı kontrol (SK) grubun ALP aktivitesi, su ekstresinin I., II. ve III. dozunu içeren gruplara oranla istatistiksel olarak oldukça düşük bulunurken (p<0.001). Özellikle III. doz, sağlıklı kontrol (SK) grubuyla kıyaslandığında daha etkiliydi. Ayrıca sağlıklı kontrol (SK) grubun ALP aktivitesi ile su yüksek doz kontrol (MCIII) grubun ALP aktivitesinin istatistiki değerlendirmesinde verileri birbirine istatistiksel olarak yakın bulundu (p<0.001). 70 50 45 * 40 ** 35 ALT (IU/L) 30 ** ** ** 25 20 15 10 5 (mg/kg) 0 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) DM+MC III (600 mg/kg) Şekil 4.2. Rat gruplarındaki alanin aminotransferaz (ALT) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin I. dozunu içeren tedavi grubunun ALT aktivitesi, diyabetik kontrol (DK) gruba göre düşük bulunurken (p<0.05), sağlıklı kontrol (SK), su yüksek doz kontrol (MCIII), su ekstresinin II. dozunu içeren ve III. dozunu içeren grupların ALT aktivitesi diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (p<0.001). Sağlıklı kontrol (SK) grubun ALT aktivitesi, su ekstresinin I., II. ve III. dozunu içeren gruplara oranla istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (p<0.001). Özellikle III. doz, sağlıklı kontrol (SK) grubuyla kıyaslandığında daha etkiliydi. Ayrıca sağlıklı kontrol (SK) grubun ALT aktivitesi ile su yüksek doz kontrol (MCIII) grubun ALT aktivitesinin istatistiki değerlendirmesinde verileri birbirine istatistiksel olarak yakın bulundu (p<0.001). 71 100 * AST (IU/L) 80 * ** ** 60 ** 40 20 (mg/kg) 0 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) DM+MC III (600 mg/kg) Şekil 4.3. Rat gruplarındaki aspartat aminotransferaz (AST) aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin I. ve II. dozunu içeren tedavi grubunun AST aktivitesi, diyabetik kontrol (DK) gruba göre düşük bulunurken (p<0.05), sağlıklı kontrol (SK), su yüksek doz kontrol (MCIII), su ekstresinin III. dozunu içeren grupların AST aktivitesi diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (p<0.001). Sağlıklı kontrol (SK) grubun AST aktivitesi, su ekstresinin I., II. ve III. dozunu içeren gruplara oranla istatistiksel olarak oldukça düşük bulunurken (p<0.001). Çalışmamızda grupların süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitesi ve malondialdehit (MDA) ve glutatyon (GSH) düzeyleri tablo 4.3’de ve şekil 4.4, 4.5 ve 4.6’da sunulmuştur. 72 Tablo 4.3. Gruplara göre karaciğer doku SOD enzim aktivitesi İle MDA ve GSH düzeyleri GRUPLAR DOZ (mg/kg) Rat Sayısı SOD (U /mg doku) MDA (µM/mg doku) SK 5 0.248 ± 0.015 ** 6.115 ± 1.168 DK 5 0.132 ± 0.005 11.119 ± 1.133 MC III 5 GSH (µM / mg doku) ** 115.303 84.964 ± 7.501 ** ± 6.832 0.250 ± 0.016 ** 7.123 ± 1.525 ** 116.782 ± 5.439 ** DM+MC I 150 5 0.121 ± 0.012 9.579 ± 0.737 * 94.440 ± 8.756 * DM+MC II 300 5 0.176 ± 0.009 ** 9.149 ± 0.685 * 120.166 ± 5.519 ** DM+MC III 600 5 0.204 ± 0.012 ** 8.294 ± 1.267 ** 126.613 ± 7.175 ** Sonuçlar, rat gruplarının ölçümdeki ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ٭٭diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde oldukça anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. 0,3 SOD aktivitesi (U /mg doku) 0,25 ** ** ** 0,2 ** 0,15 0,1 (mg/kg) 0,05 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) DM+MC III (600 mg/kg) Şekil 4.4. Rat gruplarının karaciğer dokudaki süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitelerinin gösterilmesi. Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, ** diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin II. ve III. dozunu içeren tedavi gruplarının, sağlıklı kontrol (SK) ve su yüksek doz kontrol (MCIII) gruplarının SOD enzim aktiviteleri, diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça yüksek bulundu (0.176 ± 0.009 U/mg doku,0.204 ± 0.012 U/mg doku, 0.248 ± 0.015 U/mg doku, 0.250 ± 0.016 U/mg doku, 0.132 ± 0.005 U/mg doku, p<0.001). Bununla beraber tedavi grupları arasında SOD enzim aktivitesini en fazla arttıran grup III. doz olarak bulundu. Sağlıklı kontrol (SK) 73 grubun SOD enzim aktivitesi, su yüksek doz kontrol (MCIII) grubun SOD enzim aktivitesine göre istatistiksel olarak oldukça yakın bulundu (p<0.001). 12 * MDA aktivitesi (µM/mg doku) 10 8 6 * ** ** ** 4 2 (mg/kg) 0 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) DM+MC III (600 mg/kg) Şekil 4.5. Rat grupların karaciğer dokudaki malondialdehit (MDA) düzeylerinin gösterilmesi. Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, **diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin I. ve II. dozunu içeren tedavi grubunun MDA düzeyi, diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak düşük bulundu (9.579 ± 0.737 µM/mg doku, 6.115 ± 1.168 µM/mg doku, 11.119 ± 1.133 µM/mg doku p<0.05). Sağlıklı kontrol (SK), su yüksek doz kontrol (MCIII) ve su ekstresinin III. dozunu içeren grupların MDA düzeyleri diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (6.115 ± 1.168 µM/mg doku,7.123 ± 1.525 µM/mg doku, 8.294 ± 1.267 µM/mg doku (p<0.001). Sağlıklı kontrol (SK) grubun MDA düzeyi, su ekstresinin I. ve II. dozunu içeren tedavi gruplara oranla istatistiksel olarak oldukça düşük bulundu (p<0.001). Su ekstresinin III. dozu ve su yüksek doz kontrol (MCIII) gruplarının MDA düzeyi sağlıklı kontrol (SK) gruba oranla istatistiksel olarak oldukça yüksek bulundu (p<0.001). Ayrıca sağlıklı kontrol (SK) grup MDA düzeyi ile su yüksek doz kontrol (MCIII) grubun MDA düzeyleri birbirine istatistiksel olarak yakın bulundu (p<0.001). 74 140 120 ** * 100 GSH aktivitesi (µM / mg doku) ** ** ** 80 60 40 20 (mg/kg) 0 SK DK MC III DM+MC I (150 mg/kg) DM+MC II (300 mg/kg) Şekil 4.6. Rat gruplarının karaciğer dokudaki glutatyon gösterilmesi. DM+MC III (600 mg/kg) (GSH) düzeylerinin Sonuçlar, gruplardaki ölçümün ortalaması (ortalama ± SD) olarak gösterilmiştir. *diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.05 seviyesinde anlamlı, **diyabetik kontrol (DK) gruba göre p<0.001 seviyesinde anlamlı kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda LSD testi uygulandı. Su ekstresinin II. ve III. dozunu içeren tedavi gruplarının, sağlıklı kontrol (SK) ve su yüksek doz kontrol (MCIII) kontrol gruplarının GSH enzim aktiviteleri, diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak oldukça yüksek bulundu (120.166 ± 5.519 µM/mg doku, 126.613 ± 7.175 µM/mg doku, 115.303 ± 7.501 µM/mg doku, 116.782 ± 5.439 µM/mg doku, 84.964 ± 6.832 µM/mg doku, p<0.001). Su ekstresinin I. dozunu içeren tedavi grubunun GSH enzim aktivitesi, diyabetik kontrol (DK) gruba göre istatistiksel olarak yüksek bulundu (94.440 ± 8.756 µM/mg doku, p<0.05). Sağlıklı kontrol (SK) grup ile su yüksek doz kontrol (MCIII) grup GSH enzim aktiviteleri kıyaslandığında istatistiksel olarak birbirine yakın değerler bulundu (p<0.001). Su ekstresinin II. ve III. dozunu içeren grupların GSH enzim aktiviteleri sağlıklı kontrol (SK) ve su yüksek doz kontrol (MCIII) gruplarınınkine göre istatistiksel olarak yüksek bulundu (p<0.001). 75 5. TARTIŞMA Diabetes Mellitus (DM), karbonhidrat ve buna bağlı olan lipit ve protein metabolizmalarındaki bozukluklara yol açan kronik bir hastalıktır. DM’nin patogenezinde pankreasın ß hücrelerinin yetersiz insülin salgılaması veya dokuların insüline karşı gösterdiği direnç rol oynamaktadır. Sonuçta kandaki şeker, hücrelerin içine giremez ve ilerleyen zamanlarda anjiopati, kardiyomiyopati, nöropati, nefropati ve retinopati gibi bozukluklara sebep olmaktadır.256, 257 DM özellikle karbonhidrat metabolizmasında bozukluklara yol açan ve hücrelerin, glukozu oksijenli solunumda kullanamayışından dolayı ortamda bir veya daha çok eşlenmemiş elektron içeren serbest radikallerin miktarı artar. Serbest radikallerin oluşumu sonucunda da membran lipitlerinin peroksidasyonu, permeabilitesinin artması, enzimlerin ve proteinlerin sülfhidril gruplarının oksitlenmesi ve çapraz bağlanması meydana gelmektedir, bu da DNA yapısında mutasyonlara ve sonuçta hücre ölümlerine neden olmaktadır.258 Diyabetin tedavisi için birçok araştırmalar yapılmış ve devam etmektedir. Bu amaçla çeşitli ilaçlar ve farklı tedavi yöntemleri incelenmekte hatta bazı çalışmalarda ameliyat teknikleri bile geliştirilmiştir. Son yıllarda kimyasal ilaçların hem pahalı hem de yan etkilerinin fazla oluşu, alternatif tedavi veya günümüzdeki ismiyle tamamlayıcı tıp (Complementary Medicine) yaklaşımlarına yönelimi arttırmaktadır. Bu amaçla araştırmacılar; etnofarmakolojik ve fitoterapik çalışmalara yönelmişler ve bunun sonucunda bitkilerden ilaç elde etme üzerine çalışmalar yapmışlardır.259 Myrtus communis L. bitkisi myrtaceae familyasından ve Akdenize özgü bir bitki olup Güney ve Batı Anadolu’da da yaygın biçimde yetişmektedir. Yaprakları uçucu yağ ile beraber tanen ve flavonoidler (kesretin, kateşin, myrsetin türevleri gibi) içermektedir.213, 221 Eskiden beri halk arasında şeker hastalığında kullanılan mersin 76 bitkisinin şeker hastalığına etkisi deneysel olarak ispatlanmıştır.238 Literatürde, Myrtus communis L. yapraklarının sulu ekstresinin diyabetik ratlar üzerine etkilerini araştıran çalışmalar bulunmaktadır. Fakat bu bitkinin diyabet üzerine antioksidan etkilerini araştıran çalışmalar sınırlıdır. Bundan dolayı çalışmamızda streptozotocin (STZ) kullanılarak ratlarda diyabet modeli oluşturulduktan sonra MC yaprağının su ekstresinin farklı dozları ratlara oral yoldan verilerek diyabet ve komlikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine etkileri incelendi. MC yaprağı su ekstresi 14 gün boyunca intragastrik gavaj yardımıyla günde tek sefer uygulandı. Ekstre uygulamalarına başlanıldıktan 14 gün sonra ratların kuyruk veninden alınan kan örneklerinde kan glukoz, AST, ALT ve ALP düzeyleri tespit edildi. Hayvanlar sakrifiye edildikten sonrada, karaciğer dokusunda SOD enzim aktivitesi, GSH ve MDA seviyelerindeki değişiklikler incelenmesi bu çalışmada amaçlanmıştır. Dünya çapında diyabetle ilgili bitkilerle yapılan çalışmaların çoğunda ratlar kullanılmıştır. Bu çalışmalarda önce pankreastaki insülin üreten β-hücreleri selektif olarak tahrip edilmiştir.260 Deneysel diyabet oluşturmak amacıyla STZ veya alloksan yaygın olarak kullanılmaktadır. STZ metabolize olurken metil katyonları ve metil radikalleri gibi alkali ajanların yanı sıra reaktif oksijen türevlerini de ürettiği ileri sürülmektedir. Bu ürünlerin pankreas Langerhans adacıklarında deformasyona neden olduklarına ve diyabetin patogenezinde rol oynadıklarına dair birçok çalışma bulunmaktadır. Pankreastaki β hücrelerinin antioksidatif kapasiteleri düşük olduğundan dolayı oksidatif değişikliklere karşı oldukça hassas oldukları ileri sürülmektedir.260 Bu oksidatif değişikliklerden dolayı DM’nin meydana geldiği ileri sürülmektedir.261 Goragawa ve ark.262 oksidatif stresin mitokondriyal elektron transport zincirinde değişime neden olduğunu ve hücre içi hasarını özellikle bu şekilde indüklendiğini bildirmişlerdir. 77 Sepici ve ark.10 alloksanla diyabet oluşturulmuş tavşanlar üzerinde Myrtus communis L.’nin yapraklarından elde edilen uçucu yağının (Myrtii oleum: MO) tekli ve çoklu dozların oral hipoglisemik aktivitesini araştırmışlardır. Myrtii oleum, sağlıklı tavşanlarda ne tekli ne de çoklu doz uygulamalarında etki göstermemiştir. Fakat alloksanla diyabet yapılmış tavşanlar üzerinde kan glukoz konsantrasyonunda anlamlı bir azalma olduğunu tespit etmişlerdir (p<0.001). Bununda ince barsak mukozasında bulunan α-glikozidaz enzimini geri dönüşümlü olarak inhibe etmesine bağlı olduğunu ileri sürmüşlerdir. Diğer taraftan MO, alloksanla diyabet oluşturulmuş tavşanlarda serum insülin konsantrasyonuna etki etmediğini bildirmişlerdir. Diğer bir çalışmada da Myrtus communis L.’nin α-glikozidaz enzimini güçlü bir şekilde inhibe ettiğini desteklenmektedir.263 Bir diğer çalışmada alloksanla diyabet yapılmış tavşanların karaciğer ve kan glukozu üzerine Myrtus communis L. bitkisinden hazırlanan sulu ekstraktrlarının etkileri incelenmiştir. Bu çalışmada 0., 1., 2., 3., 4. ve 8. saat ve 1., 2., 3., 4., 5., 6. ve 7. günlerde hayvanlara beşer ve onar damla MC ekstraktları verilerek kan glukozu düzeyleri ölçülmüştür. Sonuçta kontrol ve ilaçla kıyaslandığında; bu bitkinin, kan glukoz seviyesini düşürdüğü görülmüştür. Aynı çalışmada karaciğer glikojen miktarı tayinleri yapılmış, MC ekstraktı uygulanan diyabetik tavşanların karaciğerlerindeki glikojen miktarı diyabetik olmayan kontrole göre daha düşük olduğu görülmüştür.95 Ivorra ve ark.238 çalışmasında farelerde mersin bitkisinin alkol ekstraktının, streptozotocinle oluşturulan hipergliseminin akut fazını önlediğini ileri sürmüşlerdir. Bu çalışmada, ekstrat streptozotocinden 30 dakika önce 2 mg/kg dozda ve karın içine uygulanmıştır. Ayrıca streptozotocinden 48 saat sonra uygulandığında hiperglisemiyi azaltmış ve bu etkisi doz tekrarlandığı sürece devam etmiştir. Ayrıca MC bitkisinin 78 alkolik ekstratının kan şeker düzeyi normal olan deney hayvanlarına karşı herhangi bir etki göstermediği bildirilmiştir (p>0.05). Malekpour ve ark.242 yapmış olduğu bir çalışmada Myrtus communis L. yapraklarının etanol ekstresini 300 mg/kg dozda olacak şekilde diyabetli ratlara oral yoldan uyguladıklarında yüksek serum glukoz düzeyini üç günden sonra normale getirmeye başladığını ve daha sonra normal değere çektiğini (p<0.05) ve MCL yapraklarının antihipoglisemik etkisi olduğunu tespit etmişlerdir. Böylece MCL’nin DM tedavisinde ve onun komplikasyonlarının azaltılmasında geleneksel kullanım desteklenmiştir. Yine başka bir çalışmada Sepici-Dincel ve ark.241 alloksanla diyabet yapılmış tavşanlar üzerinde; Mytrus communis L. bitkisinden elde edilen uçucu yağ dil altına bir enjektör yardımıyla damlatılarak etkileşimi araştırmışlardır. Myrtl uçucu yağı ile tedavi edilen diyabetik grubun serum glukoz konsantrasyonlarında önemli bir azalma olduğunu belirtmişlerdir (p<0.001). Elfellah ve ark.264 bir çalışmasında Myrtus communis L. (M.C.) bitkisinin etanol sulu ekstraktlarının STZ ile diyabet oluşturulan fareler üzerindeki hipoglisemik etkisini incelemişlerdir. MC bitkisinin hiperglisemiyi önemli ölçüde azalttığı (p<0.001) ve bu etkinin tekrarlayan dozlarla korunduğunu gözlemlemişlerdir. Ozcan ve ark.265 50 mg/kg STZ ile diyabet yapılmış ratlar üzerinde Myrtus communis L. bitkisinden elde edilen myricetin ile tedavide; tedavinin 10. gününde kan glukoz seviyelerini önemli ölçüde düşürdüğünü belirlemişlerdir (p<0.001). Bu çalışmaları destekler şekilde bizim çalışmamızda da 40 mg/kg STZ ile diyabet yapılmış ratlarda MC yaprağı sulu ekstresinin I., II. ve III. dozunu içeren tedavi gruplarının tedaviden önce ve tedavi tamamlandıktan sonraki kan glukoz seviyeleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlenmiştir (p<0.001) (Tablo 79 4.1). Bu azalış özellikle tedavi grubunun III. dozunda istatistiksel olarak daha belirgin bir şekilde tespit edildi (p<0.001). Sağlıklı kontrol grup ve yüksek doz kontrol grupları karşılaştırıldığında deney başlangıcı ve sonunda kan glukoz seviyelerinde istatistiksel olarak bir değişme olmadığı belirlendi (p<0.05). Ayrıca diyabetik kontrol grubun deney başı ve sonu kan glukoz düzeyleri karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlemlendi (p<0.001). Sonuçlarımıza görepankreasın Langerhans adacıklarında insülin üreten β hücreleri üzerine STZ’nin yapmış olduğu olumsuz etkiyi, MC yapraklarından hazırlamış olduğumuz antioksidant etkili ekstre vasıtasıyla tedavi ettiğini ileri sürmekteyiz. Sepici ve ark.10 uçucu yağın diyabetik hayvanlarda önemli derecede karaciğer fonksiyonlarını iyileştirmediğini, diyabetik durumu karakterize eden metabolik lezyonlar gösterdiğini ve bunun paralelinde diyabetik tavşanların serumlarında AST ve ALT enzim aktivitelerinde artışlar olduğunu saptamışlardır (p<0.01). Benkhayal ve ark.266 STZ ile diyabet oluşturulmuş ratlara MCL’nin yapraklarının izolasyonundan elde edilen fenolik içerikleri ihtiva eden ekstreyi verdiklerinde, diabetik grubun düşük dozunda rejeneratif değişiklikler görüldüğünü bildirmişlerdir. Yüksek doz grupta ise çalışma sonuna kadar rejeneratif değişiklikler, karaciğer ve böbreklerde çalışmanın sonuna kadar hidropik değişiklikler oluştuğunu bildirmişlerdir. Malekpour ve ark.242 alloksanla indüklenmiş ratlara Myrtus communis L. yapraklarının alkol ekstresinin 300 mg/kg dozunu uygulayarak araştırma yapmışlardır. Tedavi edilen ratların histopatolojik olarak pankreasın β hücrelerinde ve karaciğer dokularında önemli ölçüde iyileşmeler tespit etmişlerdir. Başka bir çalışmada ratlara 45 mg/kg STZ intraperitoneal uygulanarak diyabet oluşturulmuş ve diyabetik ratların 80 karaciğerde AST, ALT ve ALP enzim aktivitelerinin anlamlı derecede yükseldiğini tespit etmişlerdir (p<0.04, p<0.055).267 Bizim çalışmamızda önceden yapılan çalışmaları destekler şekilde benzerlik gösterdi. MC yaprağı su ekstresinin I., II. ve III. dozunu içeren tedavi gruplarının, sağlıklı kontrol grubu ve yüksek doz kontrol gruplarının AST, ALT ve ALP aktiviteleri diyabetik kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir azalış gözlendi ( p<0.001) (Tablo 11). Bu azalış özellikle III. dozda istatistiksel olarak daha belirgindi (p<0.001). Sadece bitki ekstremizin verildiği yüksek doz kontrol grubunun AST, ALT ve ALP enzim aktivitelerinin sağlıklı kontrol grubuna istatistiksel olarak yakın bir değerde olduğu belirlendi (p<0.001). Bu da bitkimizin toksik etki göstermediğinin bir kanıtı olarak kabul edilebilir. Bu sonuçlarda MC yaprak su ekstresinin antioksidan özellik gösterdiğini ve buna bağlı olarak karaciğer enzim aktivitelerini düzenlemede rol oynadığını ileri sürmekteyiz. SOD, süperoksitin oksijen ve hidrojen perokside dismutasyonunu katalizleyen bir enzim ailesidir. Bu nedenle oksijene maruz kalan neredeyse tüm hücrelerde önemli bir antioksidan savunma mekanizmasıdır. SOD gibi antioksidan enzimler; lipit peroksidazlar ya da reaktif oksijenürünleri tarafından kolayca inaktive olurlar.268 Diyabet oluşması nedeniyle serbest oksijen radikallerinin dismutasyonu SOD enzimi tarafından yapılırken, bir taraftan da bu radikaller SOD enziminin protein yapısı üzerinde birtakım hasarlar oluşturmaktadır. Zamanla oluşan bu hasarlar enzimin üç boyutlu yapısında değişimlere neden olabilir ve enzimi aktivite kaybına uğratabilirler. SOD enzimin aktivite kaybı da organizma tarafından gen düzeyinde up–regulasyon mekanizması ile karşılanabilir.269, 270 Messaoud ve ark.271 Myrtus communis L. bitkisi yaprağından 1,8-cineol ve myrtenyl asetat fenolik bileşiklerini izole etmişlerdir. Bu bileşiklerin antioksidan 81 faaliyetlerde 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürücü etkiye sahip olduğunu ileri sürmektedirler. Tumen ve ark.272 Myrtus communis L.’nin meyve ve yapraklarının diklorometan (DCM), aseton, etil asetat ve metanol ekstrelerini hazırlamışlar. Yaptıkları buçalışmada Myrtus communis L. yaprak ve meyvelerinin güçlü bir antioksidan etkiye sahip olmasında; flavanoidler, açilfloroglikokinonlar ve tannenler’in rol aldığını saptamışlardır. Yapılan başka bir çalışmada alloksanla diyabet oluşturulmuş tavşanları Myrtus communis L. bitkisinden elde edilen uçucu yağ ile tedavi ettiklerinde SOD enzim aktivitesinde önemli bir artış olduğunu belirlemişlerdir (p<0.001). Bu artışın MC. yaprağından elde edilen uçucu yağın, serbest radikal temizleyici özelliği ile diyabetin sebep olduğu oksidatif strese karşı koruyucu olduğunu bildirmişlerdir.241 Bizim çalışmamızda önceden yapılan çalışmalara benzer şekilde, MC yaprağı su ekstresinin II. ve III. dozunu içeren tedavi grupları, sağlıklı kontrol grubu ve yüksek doz kontrol gruplarının SOD enzim aktiviteleri diyabetik kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.001) (Tablo 4.3). Bu artış özellikle tedavi grubunun 600 mg/kg’da daha belirgindi (p<0.001). Sadece bitki ekstremizinverildiği yüksek doz kontrol grubunun SOD enzim aktivitesinin, sağlıklı kontrol grubuna istatistiksel olarak yakın bir değerde olduğunu belirledik (p<0.001). Buda MC yaprağı su ekstresinin diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine olumlu etkisinin olduğunu ve MC yaprağının antioksidan özellik gösterdiğini desteklemektedir. Lipit peroksidasyonu, serbest radikallerin çoklu doymamış yağ asitlerine etkisi sonucu başlar. Lipit peroksidasyonunun oksidatif stres altında bulunan dokulardaki hücre fonksiyon kaybında majör bir rolü olduğu rapor edilmiştir.273 MDA lipit peroksidasyonunun son ürünüdür ve oksidatif stresin değerlendirilmesinde çok sık 82 olarak kullanılan önemli markırlandandır. Oksidatif stresin neden olduğu lipid peroksidasyonu sonucu MDA düzeylerini arttıracağını destekleyen literatürde birçok çalışmaya rastlanabilir.274-277 Yapılan bir çalışmada alloksanla diyabet yapılmış tavşanlar üzerinde Myrtus communis L. bitkisinden elde edilen uçucu yağ ile tedavi edilen diyabetli grubun lipid peroksidasyon düzeyinde, dolayısıyla MDA düzeyinde önemli bir düşüş olduğunu bildirmişlerdir (p<0.001). MDA düzeyindeki bu önemli düşüşün, Myrtus communis L. bitkisinden elde edilen uçucu yağın serbest radikal oluşumunu azaltmasından dolayı olduğunu belirtmişlerdir. Böylelikle bu uçucu yağın diyabetteki lipit peroksidasyonunu inhibe etme kabiliyetinin olduğunu bildirmişlerdir. Bununla beraber trigliserid seviyesinde de önemli bir düşüş olduğunu tespit etmişlerdir.241 Yapılan başka bir çalışmada Myrtus communis L. yapraklarının etil alkol, etil asetat ve sulu rezidül ekstrelerini, bakır iyonlarına maruz bırakılmış insan LDL’si üzerindeki antioksidan etkilerini incelemişlerdir. Sonuçta bu bitki yaprağının farklı ekstrelerininlipit peroksidasyonunu inhibe ettiğini, hatta MDA üzerindeki etkisinin çok düşük konsantrasyonlarda bile doza bağlı olarak azaldığını bildirmişlerdir (p<0.001). MDA düzeyindeki bu azalışı MCL bitkisinin yaprak ekstrelerinin fenolik bileşiklerce zengin olmasından dolayı olduğunu ileri sürmektedirler.224 Başka bir çalışmada STZ ile indüklenmiş diyabetli ratlar Myrtus communis L. bitkisinden saflaştırılan myricetinle tedavi edildikten sonra diyabetli ratların lipit peroksidasyonunda azalma olduğunu gözlemlemişlerdir (p<0.05).265 Bu çalışmaları destekler şekilde bizim çalışmamızda, MC yaprağı su ekstresinin I.ve II. dozunu içeren tedavi gruplarının MDA düzeyi diyabetik kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir azalış gözlendi (p<0.05) (Tablo 4.3). MC yaprağı su ekstresinin III. dozunu içeren tedavi grubu, sağlıklı kontrol grubu ve 83 yüksek doz kontrol grubunun MDA düzeyi diyabetik kontrol grubu ile kıyaslandığında da istatistiksel olarak anlamlı bir azalış gözlendi (p<0.001). Bu azalış özellikle tedavi grubunun III. dozunda daha belirgindi (p<0.001). Sadece bitki ekstremizin verildiği yüksek doz kontrol grubunun MDA düzeyinin, sağlıklı kontrol grubuna istatistiksel olarak yakın bir değerde olduğu belirlendi (p<0.001). MDA düzeyindeki bu önemli düşüşün, bitkimizin diyabete bağlı gelişen oksidatif hasara karşı savunmada lipid peroksidasyonunu önleyerek etkili olabileceğini savunmaktayız. GSH, kimyasal olarak reaktif toksik bileşikler ya da oksidatif strese karşı hücresel savunmada rol oynayan en önemli moleküllerden biridir. Glutatyon redükte ve okside formlarda bulunur. Redükte formunda, sisteinin thiol grubu reaktifoksijen ürünleri gibi stabil olmayan moleküllere, indirgeyici ekuvalanları verebilme yeteneğindedir. Bu formu ile glutatyon, koruyucu etki mekanizmasına sahiptir.278 Garg ve ark.279 tarafından yapılan bir çalışmada STZ ile diyabet oluşturulmuş ratlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında GSH düzeyinin düştüğü, vitamin E uygulandıktan sonra ise GSH düzeyinin arttığı bildirilmiştir. Bu çalışmada da gözlendiği gibi GSH, serbest radikaller ve peroksitlerle reaksiyona girerek oksidatif hasarın oluşmasını engellemektedir. STZ varlığında ise oksidatif etkinin artmasıyla bu dengeyi bozarak, GSH konsantrasyonu azalmasına neden olmaktadır. Başka bir çalışmada da alloksanla indüklenmiş diyabetli, yumurtalığı alınmış ratlarda menopoz dönemindeki karaciğer hasarı incelenmiştir. Sonuçta diyabetli grupta GSH seviyesinde önemli bir azalış gözlemlenirken (p<0.05), ovariektomi ve ovariektomili diyabetli gruplar kontol grubu ile kıyaslandığında önemli derecede bir artış gözlemlenmiştir (p<0.05). Bu bulgular diyabetin toksik etkilerine karşı organizmanın kendi savunma sisteminin yetersiz kaldığının bir göstergesi olduğunu savunmuşlardır.280 84 Çeşitli kimyasallar GSH ve GSH-bağlı enzimlerin konsantrasyonunu artırarak etki yaparlar.281-283 Diğer yandan bazı kemopreventif ajanların çeşitli dokularda GSH ve GSH-bağlı enzimleri uyardığı belirlenmiştir.284 Ozcan ve ark.265 50 mg/kg STZ ile indüklenerek diyabet oluşturulmuş ratlar üzerinde Myrtus communnis L. bitkisinden elde edilen myricetinin diyabet üzerine etkilerini incelemişlerdir. Myricetin ile tedavi edilen diyabet gruplar kontrol grubuyla karşılaştırıldığında GPx aktivitesinin arttığını belirlemişlerdir. Myricetinin terapötik potansiyeli ile hiperglisemi üzerine iyileştirici etkisinin olduğunu göstermişlerdir (p<0.001). Bu çalışmaları destekler şekilde bizim çalışmamızda MC yaprağı su ekstresinin I. dozunu içeren tedavi grubunun GSH düzeyi, diyabet kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05) (Tablo 4.3). MC yaprağı su ekstresinin II. ve III. dozlarını içeren tedavi gruplarının, sağlıklı kontrol grubunun ve yüksek doz kontrol grubunun GSH düzeyleri, diyabet kontrol grubuyla karşılaştırıldığında da istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.001). Bu artış özellikle tedavi grubunun III. dozunda daha belirgindi (p<0.001). Sadece bitki ekstremizin verildiği yüksek doz kontrol grubunun GSH düzeyinin, sağlıklı kontrol grubuna istatistiksel olarak yakın bir değerde olduğunu belirledik (p<0.001). Buda MC yaprağı su ekstresinin diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine olumlu etkisinin olduğunu ve MC. yaprağının antioksidan özellik gösterdiğini desteklemektedir. 85 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Sonuç olarak; streptozotocin ile diyabet oluşturulan ratlara Akdeniz Bölgesin’den temin edilen Myrtus communis L. yaprağı su ekstresi uygulandığında kan glukoz düzeyinin önemli ölçüde azaldığı tespit edildi. Bu azalışın ince barsak mukozasında bulunan α-glikozidaz enzimini geri dönüşümlü olarak inhibe etmesine bağlı olduğu düşünülmektedir. Bu da hiperglisemiyi engelleyerek kandaki şeker seviyesinin normale yakın değere dönmesini sağlamıştır. Buna paralel olarak glukozun kandaki azalışı karaciğerdeki nekrozu önleyerek ALP, ALT ve AST enzim aktivitelerinin karaciğerdeki değerlerini düzenlediği bulundu. Diyabetle oluşan oksidatif stresten kaynaklanan lipid peroksidasyonunun son ürünü olan MDA düzeyinin çalışmamızda azaldığı görüldü. Ayrıca SOD enzim aktivitesinin arttığı gözlendi. Bu artış ile serbest radikal süpürücü etkisine sahip olan SOD’nin daha etkili bir şekilde ortamdaki serbest radikalleri süpürdüğünü düşünmekteyiz. Bunun yanı sıra GSH düzeyininde arttığı tespit edildi. Bu artışın nedeni ise GSH ile tepkimeye giren peroksit miktarındaki azalışından dolayı olduğunu ileri sürmekteyiz. Bu sonuçlarımız uyguladığımız ekstrenin çok güçlü bir antioksidan etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Myrtus communis L. yaprağı su ekstresinin antidiyabetik etkisinin araştırıldığı bu çalışmada artan bitki ekstresinin doza bağlı şekilde antihiperglisemik etkisinin olduğu bulundu. Bu etkinin özellikle bitki ekstresinin 600 mg/kg dozu verilen grupta en belirgin şekilde olduğu gözlendi. Bu nedenle Myrtus communis L. yaprağı su ekstresinin, diyabet ve komplikasyonlarının neden olduğu oksidatif stresin azalması ve tedavisi üzerine olumlu etkisinin olması sebebiyle klinik olarak yararlı olabileceğini savunmaktayız. Böylelikle Myrtus communis L. yaprağı vücudumuzun oksidatif stres ile ilişkili tüm olaylara olumlu yönde etkisinin olduğunu öne sürmekteyiz. Bundan sonraki 86 çalışmalarda da Myrtus communis L. yaprağından izole edilen fenolik bileşiklerin, diyabet üzerine etkileri incelenebilir. Teşekkürler; Bu çalışma Atatürk Üniversitesi’nin Araştırma Fonu tarafından 2009/314 nolu proje kapsamında desteklenmiştir. 87 KAYNAKLAR 1. Büyükdevrim AS. Diabetes Mellitus I. Baskı. İstanbul, T.C. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yayınları, No:3, 1989. 2. Garber AJ. Diabetes Mellitus In Internal Medicine. 2 Baskı. Boston & Toronto, Little Brown Company, 1987: 1997-2024. 3. Akalın S, Aslan M, Başkal N. Diyabetes Mellitus Tedavisinde Hasta Eğitiminin Önemi. İçinde:Yılmaz C (editör). Diabetes Mellitus, İstanbul, Gri Tasarım, 2000: 47-52. 4. Bağrıaçık N, İpbüker A, Görpe U. Post-Prandial Hipergliseminin Önemi ve Tedavisi. İçinde:Bağrıaçık N (editör). Diabet ve Obezite Eğitim Kursu Notları, İstanbul, 2003: 25-28. 5. Dinççağ N. Diyabet Önlenebilir mi? Galenos Tıp Dergisi,2004, 7: 37-43. 6. Pitkanen OM, Martin JM, Halman M, Akerblom HK, Sariola H, Anderson SM. Free Radical Activity During Development of İnsulin Dependent Diabetes Mellitus in the Rat. Life Science,1992, 50: 335-339. 7. Halliwell B, Gutteridge JM. Free Radicals in Biology and Medicine. 3. Baskı. New York, Oxford University Pres, 1999: 73-122. 8. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? Lancet,1994, 344: 721-724. 9. Wang HX, Ng TB. Natural products with hypoglycemic, hypotensive, hypocholesterolemic, antiatherosclerotic and antithrombotic activities. Life sciences,1999, 65: 2663-2677. 10. Sepici A, Gurbuz I, Cevik C, Yesilada E. Hypoglycaemic effects of myrtle oil in normal and alloxan-diabetic rabbits. Journal of Ethnopharmacolgy,2004, 93: 311-318. 88 11. Can S. Geriatrik Toplulukta Yüksek Diyabet Prevelansı. Türk Diyabet Yıllığı,2000-2001, 16: 103-106. 12. Çetinalp Ş, Yılmaz C. Diyabetes Mellitus İçin Genel Güncel Bilgiler. İçinde:Yılmaz C (editör). Diyabet Hemşiresi El Kitabı, İzmir, AsyaTıp Yayıncılık, 2002: 13-43. 13. Çetinalp Ş, Kabalak T. Portabl İnsülin Pompaları. Aktüel Tıp Diyabet Forumu,2003, 8: 19-25. 14. Yılmaz C. Oral Antidiyabetiklerin Gelişimi ve Günümüzdeki Yeri. Aktüel Tıp Diyabet Forumu,2002, 8: 6-15. 15. Organization WH. Prevelance of Diabetes. http://www.who.int/diabetes/facts/world_figures/en/. 18 Ağustos 2010. 16. Satman İ. Diabetes Mellitus’un Epidemiyolojisi. İçinde:Yenigün M (editör). Her Yönüyle Diabetes Mellitus, 2 Baskı. İstanbul, Nobel Tıp Kitabevi, 2001: 78-80. 17. Boyle JP, Honeycutt AA, Narayan KM, Hoerger TJ, Geiss LS, Chen H, Thompson TJ. Projection of diabetes burden through 2050: impact of changing demography and disease prevalence in the U.S. Diabetes Care,2001, 24: 19361940. 18. Satman I, Yilmaz T, Sengul A, Salman S, Salman F, Uygur S, Bastar I, Tutuncu Y, Sargin M, Dinccag N, Karsidag K, Kalaca S, Ozcan C, King H. Populationbased study of diabetes and risk characteristics in Turkey: results of the turkish diabetes epidemiology study (TURDEP). Diabetes Care,2002, 25: 1551-1556. 19. Özata M, Yönem A. Endokrinoloji Metabolizma ve Diyabet. Baskı. İstanbul, İstanbul Medikal Yayıncılık, 2006. 20. Satman İ. Diabetes mellitus epidemiyolojisi. İçinde:İmamoğlu S (editör). Diabetes Mellitus, İstanbul, Deomed Medikal Yayıncılık, 2006: 27-52. 89 21. Sargın H, Özışık M, Öztaş D, Orbay E, Gözü H, Sargın M, Yayla A. Tip 1 Diabetlilerin Glisemik Kontrol Açısından Değerlendirilmesi: Üç Yıllık İzlem Sonuçları. Endokrinolojide Yönelişler,2004, 13: 120-122. 22. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas. http://www.diabetesatlas.org/content/diabetes. 24 Şubat 2010. 23. Olgun N, Eti Aslan F, Çoğansu G, Çelik S. Diyabetes Mellitus. İçinde:Karadakovan A, Eti Aslan F (editörler). Dahili ve Cerrahi Hastalıklarda Bakım, Nobel Tıp Kitapevi, 2010: 829-864. 24. Williams G, Pickup JC. Tip 2 diyabetin epidemiyoloji ve etyolojisi. Çeviri: Karsıdağ K. İçinde:Diyabet El Kitabı, Massachusetts, Blackwell Publishing Ltd, 2004: 55-71. 25. Diabetes UK. Diabetes in the UK 2009: Key Statistics on Diabetes. http://www.nationalschool.gov.uk/policyhub/news_item/diabetes_uk09.asp. 22 Temmuz 2010. 26. Yumuk VD, Hatemi H, Tarakci T, Uyar N, Turan N, Bagriacik N, Ipbuker A. High prevalence of obesity and diabetes mellitus in Konya, a central Anatolian city in Turkey. Diabetes research and clinical practice,2005, 70: 151-8. 27. American Diabetes Association. Diabetes management in correctional institutions. Diabetes Care,2005, 28: 53-S60. 28. American Diabetes Association. Clinical practice recommendations standarts of medical care 2008, Position statement. Diabetes Care,2008, 31: 12-54. 29. National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of Diabetes mellitus and categories of glocose tolerance. Diabetes Care,1999, 28: 1039-1057. 90 30. The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care,1997, 20: 1183-1197. 31. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care,2006, 29: 43-48. 32. İmamoğlu S. Diabetes Mellitus. İçinde:Dolar E (editör). İç Hastalıkları, İstanbul, Nobel & Günes Tıp Kitabevi, 2005: 692-719. 33. Altuntaş Y. Diabetes Mellitusta Laboratuar, Tanı Gözleme Testleri ve Metodları. İçinde:Yenigün M (editör). Her Yönüyle Diabetes Mellitus, İstanbul, Nobel Tıp Kitabevi, 2001: 63-67. 34. American Diabetes Association. Summary of Revisions Forth Clinical Pratice Recommendations. Diabetes Care,2009, 32. 35. Powers AC. Diabetes Mellitus. İçinde:Hamser K, Lango B, Jameson F (editörler). Prıncıples of İnternal Medicine, 16. Baskı. 2005. 36. Başkal N. Diabetes Mellitus Tanım, Klasifikasyon, Tanı, Klinik, Laboratuar ve Patogenez. Baskı. Ankara, Antıp A.Ş, 2003. 37. Feldman EC. Diseases of Endocrin Pancreas. İçinde:Ettinger SJ (editör). Textbook of Veterinary Internal Medicine, Disease of The Dog and Cat, 2 Baskı. Philadelphia, W.B. Sounders Company, 1983: 1615-1650. 38. Durna Z. Diyabetin Sınıflandırılması ve anı Kriterleri. İçinde:Erdoğan S (editör). Diyabet Hemşireliği Temel Bilgiler, İstanbul, Tavaslı Matbacılık, 2002: 11-21. 39. Sacks D. Carbohydrates. İçinde:Burtis CA, Ashwood ER (editörler). Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 5 Baskı. 2005: 427-462. 40. Risch N. Assessing the role of HLA-linked and unlinked determinants of disease. The American Journal of Human Genetics,1987, 40: 1-14. 91 41. Gedik VT, Çetinkalp Ş, Kabalak T, Yılmaz MT, İmamoğlu Ş, Çorakçı A, Tüzün M, Yeşil S. Diabetes Mellitus. İçinde:Erol Ç (editör). İç Hastalıkları, 1 Baskı. Ankara, Nobel Tıp Kitabevi, 2008: 3797-3822. 42. Orhan Y. Diabetes mellitus. İçinde:Sencer E (editör). Endokrinoloji, metabolizma ve beslenme hastalıkları, 1 Baskı. İstanbul, Nobel Tıp Kitabevi, 2001: 246-251. 43. Kirk RW, Bistner SI. Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 4 Baskı. Philadelphia, W. B. Saunders Company, 1985: 138-146, 664-670. 44. Goldman L. Cecil’s Text Book of Medicine. Baskı. 2006. 45. Ronald A, Codario MD. Tip 2 Diyabet, Pre-Diyabet, ve Metabolik Sendrom. Baskı. 2007. 46. Belfiore F, Galton DJ, Reaven GM. Etiopatogenesis and Metabolic Aspects. İçinde:Karger AG (editör). Frontiers in Diaebetes, Basel, Switzerland, 1984: 1168. 47. Schnatz JD, Formaniak JM, Chlouverakis C. The origin of hypertriglyceridemia in streptozotocin diabetic rats. Diabetologia,1972, 8: 125-130. 48. Gündoğdu S, Açbay Ö. Tip 2 Diyabetin Evreleri ve Takip Kriterleri. Aktüel Tıp Diyabet Forumu,2003, 8: 10-13. 49. Damcı T. Tip 2 Diyabette Primer ve Sekonder Koruma. Türk Diyabet Yıllığı,1999-2000: 171-174. 50. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care,2005, 28: 37-42. 51. American Diabetes Association. Gestational diabetes mellitus. Diabetes Care,2003, 26: 103-105. 92 52. Metzger BE, Couston DR. Proceedings of the Fourth İnternational WorkshopConference on Gestational Diabetes Mellitus. Diabetes Care,1998, 21: 167-167. 53. Metin A, Goksun A. Diabetes Mellitusta tanı ve sınıflama. İç Hastalıkları. 2 Baskı. Guneş Kitabevi, 2003: 2279-2331. 54. Acker K, Apelgvist J, Bakker K. Diyabetik Ayağın Epidemiyolojisi. Çeviri: Yeşil S. İçinde:Acker K (editör). Diyabetik Ayakta Uluslararası Konsensus, İstanbul, Medikal Yayıncılık, 1999: 20-27. 55. Huysal K. Tip II Diabetlilerde Eritrosit Glutatyon Redüktaz, Glutatyon Peroksidaz, Süperoksit Dismutaz, Katalaz Aktiviteleri, Hemoglobin Glikozilasyonu ve Lipid Peroksidasyonunun Incelenmesi. Biyokimya Anabilim Dalı. Uzmanlık Tezi, Erzurum: Atatürk Üniversitesi, 1999. 56. Goday A. Epidemiology of diabetes and its non-coronary complications. Rev Esp Cardiol,2002, 55: 657-670. 57. Guisasola FA, Mavros P, Nocea G, Alemao E, Alexander CM, Yin D. Glycaemic control among patients with type 2 diabetes mellitus in seven European countries: findings from the Real-Life Effectiveness and Care Patterns of Diabetes Management (RECAP-DM) study. Diabetes, Obesity and Metabolism,2008, 10: 8-15. 58. Lebovitz H. Glisemik kontrol ve diyabetin kronik komplikasyonları. Çeviri: Sağlam H. İçinde:Satman D (editör). Diabetes Mellitus ve ilgili sorunların tedavisi, Sigma Publishing, 2004. 59. Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. Global prevalence of diabetes Estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care,2004, 27: 1047-1053. 93 60. Daniel M, Messer LC. Perceptions of disease severity and barriers to self-care predict glycemic control in Aboriginal persons with type 2 diabetes mellitus. Chronic Diseases and Injuries in Canada,2002, 23: 130-138. 61. Sermez Y, Cankurtaran C, Özgen Gva. Tip 2 diyabetes mellitus ile obesite ve heredite arasındaki iliskinin istatistiksel olarak değerlendirilmesi. Türk Diabet Yıllığı,1995, 11: 13-16. 62. Genuth S. Implications of the United Kingdom prospective diabetes study for patients with obesity and type 2 diabetes. Obesity research,2000, 8: 198-201. 63. Mokdad AH, Ford ES, Bowman BA, Dietz WH, Vinicor F, Bales VS, Marks JS. Prevalence of obesity, diabetes, and obesity-related health risk factors, 2001. The Journal of the American Medical Association,2003, 289: 76-79. 64. Vileikyte L, Rubin RR, Leventhal H. Psychological aspects of diabetic neuropathic foot complications: an overview. Diabetes/metabolism research and reviews,2004, 20: 13-18. 65. Strine TW, Okoro CA, Chapman DP, Beckles GL, Balluz L, Mokdad AH. The impact of formal diabetes education on the preventive health practices and behaviors of persons with type 2 diabetes. Preventive medicine,2005, 41: 79-84. 66. American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care,2010, 33: 62-69. 67. Gönen SMva. Konya metropolünde’ki alısveris merkezlerinde diabet ve ilgili risk faktörlerinin toplum tabanlı taranması. Endokrinolojide Yönelisler Dergisi,2004, 13: 93-97. 68. Arslan P. Diyabetin Kronik Komplikasyonlarında ve Önlenmesinde Tıbbi Beslenme Tedavisi. Türk Diyabet Yıllığı,2002-2003, 16: 89-97. 94 69. American Diabetes Association. Nutrition principles and recommendations in diabetes. Diabetes Care,2004, 27: 36-46. 70. American Diabetes Association. Physical activity/exercise and diabetes. Diabetes Care,2004, 27: 58-62. 71. Gleeson-Kreig JM. Self-monitoring of physical activity: effects on self-efficacy and behavior in people with type 2 diabetes. Diabetes Educator,2006, 32: 69-77. 72. Olgun N. Diyabet Hemşiresinin Diyabette Akut Komlikasyonlara Yaklaşımı. Diyabet Forumu,2005, 1: 70-75. 73. Çetinalp Ş, Tüzün M. Diyabetes Mellitus Cep ve El Klavuzu. 1 Baskı. İzmir, Ermat Matbacılık, 2005: 35-45. 74. Olgun N. Hipoglisemi ve Hiperglisemi. İçinde:Erdoğan S (editör). Diyabet Hemşireliği Temel Bilgiler, İstanbul, Tavaslı Matbaacılık, 2002: 105-106. 75. İmamoğlu Ş, Ersoy C. Diyabette İnsülin Uygulamasının Önemi Ve Yeni İnsülinler. Galenos Tıp Dergisi,2004, 7: 62-65. 76. Erşanlı D. Diyabetik Retinopati Ve Tedavisi. Türk Diyabet Yıllığı,2002-2003: 97-103. 77. Menteş J. Diyabetik Retinopati Ve Değerlendirilmesi. Galenos Tıp Dergisi,2004, 7: 123-126. 78. Efe B. Diyabetik Nöropati Patogenezi. Türk Diyabet Yıllığı,2002-2003: 119-128. 79. Yetkin İ, Törüner F. Diyabetik Nefropati ve Değerlendirilmesi. Galenos Tıp Dergisi,2004: 108-110. 80. Bayraktar F. Diabetes Mellitus: Sınıflandırma ve Tanı Kriterleri. Galenos Tıp Dergisi,2004, 7: 8-20. 95 81. Beaser RS, Richardson DL, Holleroth HJ. Education in treatment of diabetes. İçinde:Kahn CR, Weir GC (editörler). Joslin’ s Diabetes Mellitus, 13 Baskı. Philadelphia, A Waverly Company, 1994: 404-412. 82. Özcan Ş. Etkili diabet eğitimi. Baskı. İstanbul, Türk Diyabet Yıllığı, 1994: 155158. 83. Federation ID. Diabetes education. The International Diabetes Federation Bulletin,1994, 39: 26-27. 84. Wilding J. Tip 2 Diyabette Obezite Gerçekten Tedavi Edilebilir mi? Çeviri: Uslan İ. İçinde:Gill G, Pickup J, Williams G (editörler). Diyabet ve Zorlukları, 1 Baskı. Roche Firması, 2002: 73-85. 85. Coşkun M. Diyet, Yaşam Tarzı Ve Kadınlarda Tip 2 Diyabet Riski. Literatür,2001, 35: 822-828. 86. Özer E. Diyabetik Hastada Güncel Diyet Planlaması. Galenos Tıp Dergisi,1997, 1: 74-79. 87. Kim CJ, Hwang AR, Yoo JS. The impact of a stage-matched intervention to promote exercise behavior in participants with type 2 diabetes. International journal of nursing studies,2004, 41: 833-841. 88. Sigal RJ, Kenny GP, Boule NG, Wells GA, Prud'homme D, Fortier M, Reid RD, Tulloch H, Coyle D, Phillips P, Jennings A, Jaffey J. Effects of aerobic training, resistance training, or both on glycemic control in type 2 diabetes: a randomized trial. Ann Intern Med,2007, 147: 357-369. 89. Hu FB, Stampfer MJ, Solomon C, Liu S, Colditz GA, Speizer FE, Willett WC, Manson JE. Physical activity and risk for cardiovascular events in diabetic women. Ann Intern Med,2001, 134: 96-105. 96 90. Tuğrul A. Tip 2 Diabetes mellitus ve tedavisi. Galenos Tıp Dergisi,2003, 7: 3845. 91. Nathan DM, Buse JB, Davidson MB, Heine RJ, Holman RR, Sherwin R, Zinman B. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes: A consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy: a consensus statement from the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes. Diabetes Care,2006, 29: 1963-1972. 92. Bohannon NJ. Treating dual defects in diabetes: insulin resistance and insulin secretion. American Journal of Health-System Pharmacy,2002, 59: 9-13. 93. Groner PK. Hormones of the Pancreas & Gastrointestral Tarect İçinde:Harper’s Biochemistry 1996: 581-598. 94. Larner J. Insulin and oral hiperglycemic drugs, glucagon. İçinde:Brunton LL (editör). Goodman and Gilmans the pharmacological basis therapeutics, 7 Baskı. New York 1985: 1490-1516. 95. Sepici A. Türkiye’de Halk Arasında Diabetes Mellitus Hastalığının Tedavisinde Kullanılan Mersin Uçucu Yağı (Myrtıı oleum) Üzerine Biyokimyasal Çalışmalar. Sağlık Bilimleri Enstitüsü. Doktora Tezi, Ankara: Gazi Üniversitesi, 2000. 96. Karam JH, Greenspan FS. Basic and Clinical Endocrinolojy. Pancreatic Hormones and Diabetes Mellitus. Baskı. Stamford, 1997. 97. Simonson DC. Effects of glyburide on in vivo insulin-mediated glucose disposal. Am J Med,1990, 89: 44S-50S; discussion 51S-53S. 98. Cheeseman KH, Slater TF. An introduction to free radical biochemistry. British medical bulletin,1993, 49: 481-493. 97 99. Akkuş İ. Serbest Radikaller ve Fizyopatolojik Etkileri. Baskı. Konya, Mimoza Yayınları, 38, Kuzucular Ofset, 1995. 100. Bast A, Haenen GR, Doelman CJ. Oxidants and antioxidants: state of the art. Am J Med,1991, 91: 2-13. 101. Aksoy Y. Antioksidan Mekanizmada Glutatyonun Rolü. Klinik Tıp Bilimleri,2002, 22: 442-448. 102. Gulcin I, Oktay M, Kirecci E, Kufrevioglu OI. Screening of antioxidant and antimicrobial activities of anise (Pimpinella anisum L.) seed extracts. Food chemistry,2003, 83: 371-382. 103. Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. Baskı. New York, W.H. Freeman and Company, 2004. 104. Fridovich I. Oxidative Stres. Encyclopedia of Life Sciences. Baskı. Nature Publishing Group, 2001. 105. Nordberg J, Arner ES. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free radical biology & medicine,2001, 31: 1287-1312. 106. McCord JM. The evolution of free radicals and oxidative stress. Am J Med,2000, 108: 652-659. 107. Slater TF. Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochemical Journal,1984, 222: 1-15. 108. Gutteridge JM. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chem,1995, 41: 1819-1828. 109. Davies MJ. Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences. Biochem Bioph Res Co,2003, 305: 761-770. 98 110. Malo C, Wilson JX. Glucose modulates vitamin C transport in adult human small intestinal brush border membrane vesicles. Journal of Nutrition,2000, 130: 63-69. 111. Pardue SL, Thaxton JP, Brake J. Role of ascorbic acid in chicks exposed to high environmental temperature. Journal of applied physiology,1985, 58: 1511-1516. 112. Wu CC, Dorairajan T, Lin TL. Effect of ascorbic acid supplementation on the immune response of chickens vaccinated and challenged with infectious bursal disease virus. Veterinary immunology and immunopathology,2000, 74: 145-152. 113. Iqbal K, Khan A, Kahttak MAK. Biological Significance of Ascorbic Acid (Vitamin C) in Human Health – A Review. Pakistan Journal of Nutrition,2004, 3: 5-13. 114. Kehrer JP. Free-Radicals as Mediators of Tissue-Injury and Disease. Crit Rev Toxicol,1993, 23: 21-48. 115. Wickens AP. Ageing and the free radical theory. Resp Physiol,2001, 128: 379391. 116. Vaca CE, Wilhelm J, Harms-Ringdahl M. Interaction of lipid peroxidation products with DNA. A review. Mutation research,1988, 195: 137-149. 117. Freeman BA, Crapo JD. Biology of disease: free radicals and tissue injury. Lab Invest,1982, 47: 412-426. 118. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Baskı. Philadelphia, Pennsylvania, W.B. Saunders Company, 1999. 119. Dawn BM, Allan DM, Colleen MS. Basic Medical Biochemistry a Clinical Approach. Baskı. Baltimore, Maryland Lippincott Williams & Wilkins, 1996. 120. Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests. Baskı. Philadelphia, Pennsylvania, W.B. Saunders Company, 1995. 99 121. Weiss SJ, LoBuglio AF. Phagocyte-generated oxygen metabolites and cellular injury. Lab Invest,1982, 47: 5-18. 122. Kavas GÖ. Serbest Radikaller ve Organizma Üzerine Etkileri. Türkiye Klinikleri,1989, 9: 1-8. 123. Erenel G, Erbaş D, Arıcıoğlu A. Serbest Radikaller ve Antioksidan Sistemler. Gazi Tıp Dergisi,1992, 3: 243-250. 124. Sinclair AJ, Barnett AH, Lunec J. Free radicals and antioxidant systems in health and disease. Brit J Hosp Med,1990, 43: 334-344. 125. Moslen MT. Reactive Oxygen Species in Normal Physiology, Cell Injury and Phagocytosis. İçinde:Amstrong D (editör). Free Radicals in Diagnostic Medicine. A systems Approach to Laboratory Technology, Clinical Correlations, and Antioxidant Therapy, New York, Plenum Pres, 1994: 17-27. 126. Murray RK, Granner DK, Mayes RA, Rodwell VW. Fizyolojik öneme sahip lipidler. İçinde:Dikmen N, Özgünen T (editörler). Harper’ın Biyokimyası, 24 Baskı. İstanbul, Barış Kitabevi, 1996. 127. Thomas CE, Aust SD. Free-Radicals and Environmental Toxins. Annals of emergency medicine,1986, 15: 1075-1083. 128. Baykal Y, Kocabalkan F. Serbest radikalleri ve hücre hasarı. Sendrom,2000, 9: 31-36. 129. Netto LES, Kowaltowski AJ, Castilho RF, Vercesi AE. Thiol enzymes protecting mitochondria against oxidative damage. Methods in enzymology,2002, 348: 260-270. 130. Rice Evans CA, Diplock AT, Symons MCR. Tecniques in Free Radicals Research. Elsevier, Amsterdam,1991, 22: 1-278. 100 131. Brantley RE, Smerdon SJ, Wilkinson AJ, Singleton EW, Olson JS. The Mechanism of Autooxidation of Myoglobin. Journal of Biological Chemistry,1993, 268: 6995-7010. 132. Domigan NM, Charlton TS, Duncan MW, Winterbourn CC, Kettle AJ. Chlorination of Tyrosyl Residues in Peptides by Myeloperoxidase and Human Neutrophils. Journal of Biological Chemistry,1995, 270: 16542-16548. 133. Shacter E. Protein oxidative damage. Methods in enzymology,2000, 319: 428436. 134. Thornalley PJ, Vasak M. Possible role for metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress. Kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals. Biochimica et biophysica acta,1985, 827: 3644. 135. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: a personal view. Nutrition reviews,1994, 52: 253-265. 136. Marnett LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis,2000, 21: 361-370. 137. Gümrükçüoğlu A. Serbest Radikaller. www.genetikbilimi.com/gen/serbest_radikaller 28 Ocak 2009. 138. Mates JM, Perez-Gomez C, Nunez de Castro I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem,1999, 32: 595-603. 139. Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. P Natl Acad Sci USA,1993, 90: 7915-7922. 140. Lunec J, Blake D. Oxygen Free Radicals: Their Relevance to Disease Processes. İçinde:Cohen RD, Lewis B, Albert KGMM (editörler). The Metabolic and Moleculer Basis of Acquired Disease, London, Balliere Tindall, 1990: 189-212. 101 141. Halliwell B, Gutteridge JM. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochemical Journal,1984, 219: 1-14. 142. Dündar Y, Aslan R. Oksidan-Antioksidan Denge ve Korunmasında Vitaminlerin Rolü. Hayvancılık Araştırma Dergisi,1999, 9: 32-39. 143. Clarkson PM, Thompson HS. Antioxidants: what role do they play in physical activity and health? American Journal of Clinical Nutrition,2000, 72: 637-646. 144. Young IS, Woodside JV. Antioxidants in health and disease. J Clin Pathol,2001, 54: 176-186. 145. Gumieniczek A, Hopkala H, Wojtowicz Z, Nikolajuk J. Changes in antioxidant status of heart muscle tissue in experimental diabetes in rabbits. Acta biochimica Polonica,2002, 49: 529-535. 146. Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stressactivated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocrine reviews,2002, 23: 599-622. 147. Pop-Busui R, Sima A, Stevens M. Diabetic neuropathy and oxidative stress. Diabetes/metabolism research and reviews,2006, 22: 257-273. 148. Maritim AC, Sanders RA, Watkins JB. Diabetes, oxidative stress, and antioxidants: A review. Journal of biochemical and molecular toxicology,2003, 17: 24-38. 149. Beppu H, Koike T, Shimpo K, Chihara T, Hoshino M, Ida C, Kuzuya H. Radical-scavenging effects of Aloe arborescens Miller on prevention of pancreatic islet B-cell destruction in rats. Journal of Ethnopharmacolgy,2003, 89: 37-45. 102 150. Mahboob M, Rahman MF, Grover P. Serum lipid peroxidation and antioxidant enzyme levels in male and female diabetic patients. Singapore medical journal,2005, 46: 322-324. 151. Peerapatdit T, Likidlilid A, Patchanans N, Somkasetrin A. Antioxidant status and lipid peroxidation end products in patients of type 1 diabetes mellitus. Journal of the Medical Association of Thailand,2006a, 89: 141-146. 152. Peerapatdit T, Patchanans N, Likidlilid A, Poldee S, Sriratanasathavorn C. Plasma lipid peroxidation and antioxidiant nutrients in type 2 diabetic patients. Journal of the Medical Association of Thailand,2006b, 89: 147-155. 153. Cakatay U, Telci A, Salman S, Satman L, Sivas A. Oxidative protein damage in type I diabetic patients with and without complications. Endocr Res,2000, 26: 365-379. 154. Telci A, Cakatay U, Kayali R, Erdogan C, Orhan Y, Sivas A, Akcay T. Oxidative protein damage in plasma of type 2 diabetic patients. Hormone and Metabolic Research,2000, 32: 40-3. 155. Köse K, Doğan P. Lipid Peroksidasyonu. Erciyes Tıp dergisi,1992: 340-350. 156. Onat T, Emerk K. Temel Biyokimya, Radikal Kavramı ve Oksijen Radikalleri. 2 Baskı. İzmir, Saray Medikal Yayıncılık, 1998: 520-528. 157. Kajimoto Y, Kaneto H. Role of Oxidative Stress in Pancreatic-Cell Dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences,2004, 1011: 168-176. 158. Ceriello A. New insights on oxidative stress and diabetic complications may lead to a "causal" antioxidant therapy. Diabetes Care,2003, 26: 1589-1596. 159. Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. Free radical research communications,1990, 9: 1-32. 103 160. Willcox JK, Ash SL, Catignani GL. Antioxidants and prevention of chronic disease. Critical reviews in food science and nutrition,2004, 44: 275-295. 161. Hermes-Lima M, Storey JM, Storey KB. Antioxidant defenses and metabolic depression. The hypothesis of preparation for oxidative stress in land snails. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology,1998, 120: 437-448. 162. Murray RK, Mayes PA, Granner DK, Radwell VW. Harper’s Biochemistry. 22 Baskı. Prentice-Hall International Inc, 1993: 183-183. 163. Winston GW. Oxidants and antioxidants in aquatic animals. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C,1991, 100: 173-176. 164. Fridovich I. In free radical in biology. Baskı. New York, Academic Press, 1976. 165. Harris ED. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,1992, 6: 2675-2683. 166. Marklund SL. Extracellular superoxide dismutase in human tissues and human cell lines. Journal of Clinical Investigation,1984, 74: 1398-1403. 167. McCord JM, Fridovich I. The biology and pathology of oxygen radicals. Ann Intern Med,1978, 89: 122-127. 168. Guemouri L, Artur Y, Herbeth B, Jeandel C, Cuny G, Siest G. Biological variability of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and catalase in blood. Clin Chem,1991, 37: 1932-1937. 169. Knapen MFCM, Zusterzeel PLM, Peters WHM, Steegers EAP. Glutathione and glutathione-related enzymes in reproduction - A review. European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology,1999, 82: 171-184. 104 170. Cnubben NHP, Rietjens IMCM, Wortelboer H, van Zanden J, van Bladeren PJ. The interplay of glutathione-related processes in antioxidant defense. Environmental toxicology and pharmacology,2001, 10: 141-152. 171. Hall L, Williams K, Perry AC, Frayne J, Jury JA. The majority of human glutathione peroxidase type 5 (GPX5) transcripts are incorrectly spliced: implications for the role of GPX5 in the male reproductive tract. Biochemical Journal,1998, 333 ( Pt 1): 5-9. 172. de Haan JB, Bladier C, Griffiths P, Kelner M, O'Shea RD, Cheung NS, Bronson RT, Silvestro MJ, Wild S, Zheng SS, Beart PM, Hertzog PJ, Kola I. Mice with a homozygous null mutation for the most abundant glutathione peroxidase, Gpx1, show increased susceptibility to the oxidative stress-inducing agents paraquat and hydrogen peroxide. Journal of Biological Chemistry,1998, 273: 2252822536. 173. Adachi Y, Honi K, Takahashi Y. Serum GST activity in liver disease. Clinica Chimica Acta,1990, 106: 243-255. 174. Sacks D. Carbohydrates. İçinde:Burtis CA, Ashwood ER (editörler). Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Philadelphia, USA, WB Saunders, 1994: 9281001. 175. Canuto RA, Muzio G, Maggiora M, Biocca ME, Dianzani MU. Glutathione-STransferase, Alcohol-Dehydrogenase and Aldehyde Reductase Activities during Diethylnitrosamine-Carcinogenesis in Rat-Liver. Cancer letters,1993, 68: 177183. 176. Listowsky I, Abramovitz M, Homma H, Niitsu Y. Intracellular binding and transport of hormones and xenobiotics by glutathione-S-transferases. Drug metabolism reviews,1988, 19: 305-318. 105 177. Thomas H, Schladt L, Knehr M, Oesch F. Effect of diabetes and starvation on the activity of rat liver epoxide hydrolases, glutathione S-transferases and peroxisomal beta-oxidation. Biochemical pharmacology,1989, 38: 4291-4297. 178. Özkan A, Fışkın K. Serbest Oksijen Radikalleri, Karsinogenez ve Antioksidant Enzimler. Türk Hematoloji Onkoloji Dergisi,2004, 14: 52-60. 179. Marnett LJ. Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde. Mutation research,1999, 424: 83-95. 180. Hudson N, Everitt SJ, Edwards T. Elevation of gastric mucosal leukotriene B4 levels of patients on long-standing NSAID therapy. Gastroenterolgy,1991: 86100. 181. Dickinson DA, Forman HJ. Cellular glutathione and thiols metabolism. Biochemical Pharmacololgy,2002, 64: 1019-1026. 182. Mytilineou C, Kramer BC, Yabut JA. Glutathione depletion and oxidative stress. Parkinsonism & related disorders,2002, 8: 385-387. 183. Murray RK, Mayes PA, Granner DK, Radwell VW. Harper’in Biyokimyası. Çeviri: Mentes G, Ersöz B. Baskı. Barış Kitabevi, 1993. 184. Burton GW. Vitamin E: molecular and biological function. Proceedings of the Nutrition Society,1994, 53: 251-262. 185. Nijveldt RJ, van Nood E, van Hoorn DE, Boelens PG, van Norren K, van Leeuwen PA. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. The American journal of clinical nutrition,2001, 74: 418425. 186. Becker MA, Roessler BJ. Hyperuricemia and Gout. İçinde:Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS (editörler). The Metabolic and Moleculer Bases of Inherited Disease, 7 Baskı. New York, McGraw-Hill, 1995: 1655-1677. 106 187. Tadmouri GO, Basak AN. Beta-thalassemia in Turkey: a review of the clinical, epidemiological, molecular, and evolutionary aspects. Hemoglobin,2001, 25: 227-239. 188. De Zwart LL, Meerman JHN, Commandeur JNM, Vermeulen NPE. Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radical Bio Med,1999, 26: 202-226. 189. Burtis CA, Ashwood ER. Vitaminler. İçinde:Aslan D (editör). Klinik Kimyada Temel İlkeler, Ankara, Palme Yayınları, 2005: 332-333, 548-550, 578-601. 190. Sies H, Stahl W, Sundquist AR. Antioxidant functions of vitamins. Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids. Annals of the New York Academy of Sciences,1992, 669: 7-20. 191. Ernster L, Dallner G. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochimica et biophysica acta,1995, 1271: 195-204. 192. Xia L, Bjornstedt M, Nordman T, Eriksson LC, Olsson JM. Reduction of ubiquinone by lipoamide dehydrogenase. An antioxidant regenerating pathway. European Journal of Biochemistry,2001, 268: 1486-1490. 193. Reiter RJ. Interactions of the pineal hormone melatonin with oxygen-centered free radicals: a brief review. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,1993, 26: 1141-1155. 194. Delibaş N, Özcankaya R. Serbest Radikaller. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi,1995, 2: 11-17. 195. Reiter RJ. Antioxidant actions of melatonin. Advances in pharmacology,1997, 38: 103-117. 107 196. Frei B, Stocker R, England L, Ames BN. Ascorbate: the most effective antioxidant in human blood plasma. Advances in experimental medicine and biology,1990, 264: 155-163. 197. Halliwell B, Gutteridge JM. The antioxidants of human extracellular fluids. Archives of biochemistry and biophysics,1990, 280: 1-8. 198. Frei B. Natural Antioxidants in Human Health and Disease. Baskı. San Diego, Academic Press, 1994. 199. Droge W, Schulzeosthoff K, Mihm S, Galter D, Schenk H, Eck HP, Roth S, Gmunder H. Functions of Glutathione and Glutathione Disulfide Immunology and Immunopathology. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology,1994, 8: 1131-1138. 200. Asllani U. Chemical composition of Albanian myrtle oil (Myrtus communis L.). Journal of Essential Oil Research,2000, 12: 140-142. 201. Boelens MH, Jimenez R. The Chemical Composition of Spanish Myrtle Leaf Oils. Part I. Journal of Essential Oil Research,1991, 3: 173-177. 202. Boelens MH, Jimenez R. The Chemical Composition of Spanish Myrtle Oils. Part II. J Essent Oil Res,1992, 4: 349-353. 203. Bradesi P, Tomi F, Casanova J, Costa J, Bernardini AF. Chemical Composition of Myrtle Leaf Essential Oil from Corsica (France). Journal of Essential Oil Research,1997, 9: 283-288. 204. Deidda P, Mulas M. Due specie frutticole minori per una frutticoltura sostenibile : Myrtus communis L. e Arbutus unedo L. Risultati di alcune ricerche condotte in Sardegna (Italia), Actas del Congreso Europeo de Agricultura Sostenible en Ambientes Meditarreneos, 1999, Badajoz-Merida 50-51. 108 205. Cervelli C. Variabilità morfologica in strutture vegetative eriproduttive di Myrtus communis, Atti VI Giornate Scientifiche SOI, 2002, Spoleto 23-25. 206. Akgül A. Spice Science and Technology. Turkish Association of Food Technologists (in Turkish),1993. 207. Davis PH. Flora of Turkey and the East Aegean Islands Baskı. Edinburgh, University Press, 1982: 172-172. 208. Ozek T, Demirci B, Baser KHC. Chemical composition of Turkish myrtle oil. Journal of Essential Oil Research,2000, 12: 541-544. 209. Herrera CM. A Study of Avian Frugivores, Bird-Dispersed Plants, and Their Interaction in Mediterranean Scrublands. Ecol Monogr,1984, 54: 1-23. 210. Aronne G, Russo D. Carnivorous mammals as seed dispersers of Myrtus communis (Myrtaceae) in the Mediterranean shrublands. Plant Biosystems,1997, 131: 189-195. 211. Aronne G, Wilcock CC. First Evidence of Myrmecochory in Fleshy-Fruited Shrubs of the Mediterranean Region. New Phytologist,1994, 127: 781-788. 212. Aydın C, Özcan MM. Determination of nutritional and physical properties of myrtle (Myrtus communis L.) fruits growing wild in Turkey. Journal of Food Engineering,2007, 79: 453-458. 213. Baytop T. Türkiye’de Bitkiler ile Tedavi. 3 Baskı. İstanbul, Nobel Tıp Kitabevi, 2000: 13-31. 214. Oğur R. Mersin Bitkisi (Myrtus Communis L.) Hakkinda Bir İnceleme. Gata Tıp Fakültesi Çevre Dergisi,1994, Ocak-Şubat-Mart. 215. Farah A, Afifi A, Fechtal M, Chhen A, Satrani B, Talbi M, Chaouch A. Fractional distillation effect on the chemical composition of Moroccan myrtle 109 (Myrtus communis L.) essential oils. Flavour and Fragrance Journal,2006, 21: 351-354. 216. Bouzouita N, Kachouri F, Hamdi M, Chaabouni MM. Antimicrobial activity of essential oils from Tunisian aromatic plants. Flavour and Fragrance Journal,2003, 18: 380-383. 217. Yadegarinia D, Gachkar L, Rezaei MB, Taghizadeh M, Astaneh SA, Rasooli I. Biochemical activities of Iranian Mentha piperita L. and Myrtus communis L. essential oils. Phytochemistry,2006, 67: 1249-1255. 218. Jamoussi B, Romdhane M, Abderraba A, Ben Hassine B, El Gadri A. Effect of harvest time on the yield and composition of Tunisian myrtle oils. Flavour Frag J,2005, 20: 274-277. 219. Messaoud C, Zaouali Y, Ben Salah A, Khoudja ML, Boussaid M. Myrtus communis in Tunisia: variability of the essential oil composition in natural populations. Flavour and Fragrance Journal,2005, 20: 577-582. 220. Curini M, Bianchi A, Epifano F, Bruni R, Torta L, Zambonelli A. Composition and in vitro antifungal activity of essential oils of Erigeron canadensis and Myrtus communis from France. Chem Nat Compd+,2003, 39: 191-194. 221. Romani A, Pinelli P, Mulinacci N, Vincieri FF, Tattini M. Identification and quantitation of polyphenols in leaves of Myrtus communis L. Chromatographia,1999, 49: 17-20. 222. Martin T, Rubio B, Villaescusa L, Fernandez L, Diaz AM. Polyphenolic compounds from pericarps of Myrtus communis. Pharmaceutical Biology,1999, 37: 28-31. 110 223. Cakir A. Essential oil and fatty acid composition of the fruits of Hippophae rhamnoides L. (Sea Buckthorn) and Myrtus communis L. from Turkey. Biochemical Systematics and Ecology,2004, 32: 809-816. 224. Romani A, Coinu R, Carta S, Pinelli P, Galardi C, Vincieri FF, Franconi F. Evaluation of antioxidant effect of different extracts of Myrtus communis L. Free radical research,2004, 38: 97-103. 225. Montoro P, Tuberoso CI, Piacente S, Perrone A, De Feo V, Cabras P, Pizza C. Stability and antioxidant activity of polyphenols in extracts of Myrtus communis L. berries used for the preparation of myrtle liqueur. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2006, 41: 1614-1619. 226. Atapour M, Zahedi MJ, Mehrabani M, Safavi M, Keyvanfard V, Foroughi A, Siavoshi F, Foroumadi A. In vitro susceptibility of the Gram-negative bacterium Helicobacter pylori to extracts of Iranian medicinal plants. Pharmaceutical Biology,2009, 47: 77-80. 227. Rotstein A, Lifshitz A, Kashman Y. Isolation and Antibacterial Activity of Acylphloroglucinols from Myrtus-Communis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1974, 6: 539-542. 228. Gars SC, Dengre SI. Antifungal Activity of ten Essential Oil of Myrtus Communis var. Herba Hungarica,1988, 27: 123-125. 229. Bezanger-Bequese L, Pinkas M, Torch A. Maloine. İçinde:Les plantes dans la th´erapeutique moderne, Paris, 1975. 230. Bravo L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutrition reviews,1998, 56: 317-333. 231. Benigni R, Capra C, Cattorini PE. Piante Medicinali. Baskı. Milano, Inverni Della Beffa, 1964. 111 232. Gastaldo P. Compendio della flora officinale italiana. Padova. İçinde:Jennings W, Shibamoto T (editörler). Qualitative analysis of flavor and fragrance volatiles by glass capillary chromatography, New York, Academic Press, 1997. 233. Negri G. Nuovo erbario figurato. Baskı. Milano, Hoepli, 1979. 234. Hosseinzadeh H, Khoshdel M, Ghorbani M. Antinociceptive, anti-inflammatory effects and acute toxicity of aqueous and ethanolic extracts of Myrtus communis L. Aerial parts in mice. Journal of acupuncture and meridian studies,2011, 4: 242-7. 235. Asımgil A. Şifalı Bitkiler. Baskı. İstanbul, Timas yayınları, 1999. 236. Erlaçin S, Erciyas E. Myrtus Communis L. (Mersin Bitkisi) Yapraklarının Tanen Yönünden İncelenmesi. DOĞA II,1978: 75-79. 237. Koukos PK, Papadopoulou KI, Papagiannopoulos AD, Patiaka DT. Chemicals from Greek forestry biomass: Constituents of the leaf oil of Myrtus communis L. grown in Greece. Journal of Essential Oil Research,2001, 13: 245-246. 238. Ivorra MD, Paya M, Villar A. A Review of Natural-Products and Plants as Potential Antidiabetic Drugs. Journal of Ethnopharmacology,1989, 27: 243-275. 239. Alwan AH, Mahmoud MJ, Naji A. Effects of Plant-Extracts on ArylHydrocarbon Hydroxylase-Activity and H-3 Benzo(a)Pyrene Binding to DNA. J Food Safety,1990, 10: 209-218. 240. Hayder N, Abdelwahed A, Kilani S, Ben Ammar R, Mahmoud A, Ghedira K, Chekir-Ghedira L. Anti-genotoxic and free-radical scavenging activities of extracts from (Tunisian) Myrtus communis. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,2004, 564: 89-95. 112 241. Sepici-Dincel A, Acikgoz S, Cevik C, Sengelen M, Yesilada E. Effects of in vivo antioxidant enzyme activities of myrtle oil in normoglycaemic and alloxan diabetic rabbits. Journal of Ethnopharmacolgy,2007, 110: 498-503. 242. Malekpour A, Dehghani S, Zahedi S, Eskandari F. Effects of the hydro-ethanol extract of Myrtus communis L. on blood glucose level and histopathological changes in alloxan-induced diabetic rats Middle-East Journal of Scientific Research,2012, 12: 517-522. 243. Kayaalp SO. Endokrin Sistem Farmakolojisi. 7 Baskı. 1997. 244. Ersoy E, Batsu N. Biyokimya. Baskı. 1986. 245. Eidi A, Eidi M, Darzi R. Antidiabetic effect of Olea europaea L. in normal and diabetic rats. Phytotherapy Research,2009, 23: 347-50. 246. Malstrom B, Andreasson L, Reinhammer B. İçinde:Boyer P (editör). The Enzymes, New York, Academic Press, 1975. 247. Foyer CH, Lelandais M, Kunert KJ. Photooxidative Stress in Plants. Physiologia Plantarum,1994, 92: 696-717. 248. Arias IM, Jakoby WB. Glutathione: Metabolism and Function. Baskı. New York, Raven Press, 1976. 249. Baillie TA, Slatter JG. Glutathione - a Vehicle for the Transport of Chemically Reactive Metabolites Invivo. Accounts of chemical research,1991, 24: 264-270. 250. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Analytical biochemistry,1969, 27: 502-22. 251. Eyer P, Podhradsky D. Evaluation of the Micromethod for Determination of Glutathione Using Enzymatic Cycling and Ellman Reagent. Analytical biochemistry,1986, 153: 57-66. 113 252. Baker MA, Cerniglia GJ, Zaman A. Microtiter plate assay for the measurement of glutathione and glutathione disulfide in large numbers of biological samples. Analytical Biochemistry,1990, 190: 360-5. 253. Yagi K. Simple assay for the level of total lipid peroxides in serum or plasma. Methods in molecular biology,1998, 108: 101-6. 254. Armstrong D, Browne R. The analysis of free radicals, lipid peroxides, antioxidant enzymes and compounds related to oxidative stress as applied to the clinical chemistry laboratory. Advances in experimental medicine and biology,1994, 366: 43-58. 255. Astracheck Glikoz Ölçüm Cihazı. http://www.astramedikal.com/urunler/11astracheck-glikoz-olcum-cihazi.html. 16 Ocak 2014. 256. Avcı A. Diyabet Oluşturulmuş Ratlarda Böbrek Antioksidan Savunma Sistemi ve E Vitaminin Etkileri. Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı. Uzmanlık Tezi, Ankara: Ankara Üniversitesi, 2001. 257. Sharma RD, Sarkar A, Hazra DK, Mishra B, Singh JB, Sharma SK, Maheshwari BB, Maheshwari PK. Use of Fenugreek seed powder in the management of noninsulin dependent diabetes mellitus. Nutrition Research,1996, 16: 1331-1339. 258. Celebi S, Dilsiz N, Yilmaz T, Kukner AS. Effects of melatonin, vitamin E and octreotide on lipid peroxidation during ischemia-reperfusion in the guinea pig retina. European Journal of Ophthalmolgy,2002, 12: 77-83. 259. Cımbız A, Özyurt MS, Dayıoğlu H, Helvacı MR, Yılmaz H. Bitki Özütlerinin Stres, Hiperglisemi, Hiperlipidemi ve Hiperkolesterolemi Seviyeleri Üzerine Olan Etkileri. Dumlupınar üniversitesi Fen Bilimler Enstitüsü Dergisi,2005, 9. 114 260. Heineke EW, Johnson MB, Dillberger JE, Robinson KM. Antioxidant MDL 29,311 Prevents Diabetes in Nonobese Diabetic and Multiple Low-Dose STZInjected Mice. Diabetes,1993, 42: 1721-1730. 261. Pilkis SJ, el-Maghrabi MR, Claus TH. Hormonal regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Annual review of biochemistry,1988, 57: 75577583. 262. Gorogawa S, Kajimoto Y, Umayahara Y, Kaneto H, Watada H, Kuroda A, Kawamori D, Yasuda T, Matsuhisa M, Yamasaki Y, Hori M. Probucol preserves pancreatic beta-cell function through reduction of oxidative stress in type 2 diabetes. Diabetes research and clinical practice,2002, 57: 1-10. 263. Onal S, Timur S, Okutucu B, Zihnioglu F. Type-2 Diabetes and glucosidase inhibitors, The Proceedings of the First National Symposium on Biochemistry, 2000, Kuşadası, Türkiye 111-111. 264. Elfellah MS, Akhter MH, Khan MT. Anti-hyperglycaemic effect of an extract of Myrtus communis in streptozotocin-induced diabetes in mice. Journal of Ethnopharmacolgy,1984, 11: 275-81. 265. Ozcan F, Ozmen A, Akkaya B, Aliciguzel Y, Aslan M. Beneficial effect of myricetin on renal functions in streptozotocin-induced diabetes. Clinical and experimental medicine,2012, 12: 265-272. 266. Benkhayal FA, Musbah E, Ramesh S, El-Ageeli DWH. Pathological studies on the effect of phenolic compounds extracted from Myrtus communis in diabetic rats. Tamilnadu Journal of Veterinary and Animal Sciences,2009, 5: 155-156. 267. Zafar M, Naqvi SN, Ahmed M, Kaimkhani ZA. Altered Liver Morphology and Enzymes in Streptozotocin Induced Diabetic Rats. International Journal of Morphology,2009, 27: 719-725. 115 268. Chularojmontri L, Wattanapitayakul SK, Herunsalee A, Charuchongkolwongse S, Niumsakul S, Srichairat S. Antioxidative and cardioprotective effects of Phyllanthus urinaria L. on doxorubicin-induced cardiotoxicity. Biological & pharmaceutical bulletin,2005, 28: 1165-71. 269. Dalton TP, Shertzer HG, Puga A. Regulation of gene expression by reactive oxygen. Annual review of pharmacology and toxicology,1999, 39: 67-101. 270. Pahlavani MA, Harris MD. Effect of in vitro generation of oxygen free radicals on T cell function in young and old rats. Free radical biology & medicine,1998, 25: 903-913. 271. Messaoud C, Laabidi A, Boussaid M. Myrtus communis L. infusions: the effect of infusion time on phytochemical composition, antioxidant, and antimicrobial activities. Journal of food science,2012, 77: C941-7. 272. Tumen I, Senol FS, Orhan IE. Inhibitory potential of the leaves and berries of Myrtus communis L. (myrtle) against enzymes linked to neurodegenerative diseases and their antioxidant actions. International journal of food sciences and nutrition,2012, 63: 387-92. 273. Nielsen F, Mikkelsen BB, Nielsen JB, Andersen HR, Grandjean P. Plasma malondialdehyde as biomarker for oxidative stress: reference interval and effects of life-style factors. Clinical Chemistry,1997, 43: 1209-14. 274. Claeson K, Aberg F, Karlberg B. Free malondialdehyde determination in rat brain tissue by capillary zone electrophoresis: evaluation of two protein removal procedures. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,2000, 740: 87-92. 116 275. Doganay S, Borazan M, Iraz M, Cigremis Y. The effect of resveratrol in experimental cataract model formed by sodium selenite. Current Eye Research,2006, 31: 147-153. 276. Ilhan N, Halifeoglu I, Ozercan HI, Ilhan N. Tissue malondialdehyde and adenosine triphosphatase level after experimental liver ischaemia-reperfusion damage. Cell biochemistry and function,2001, 19: 207-212. 277. Ray G, Batra S, Shukla NK, Deo S, Raina V, Ashok S, Husain SA. Lipid peroxidation, free radical production and antioxidant status in breast cancer. Breast cancer research and treatment,2000, 59: 163-170. 278. Atkuri KR, Mantovani JJ, Herzenberg LA, Herzenberg LA. N-Acetylcysteine--a safe antidote for cysteine/glutathione deficiency. Current opinion in pharmacology,2007, 7: 355-9. 279. Garg MC, Singh KP, Bansal DD. Effect of vitamin E supplementation on Antioxidant status of diabetic rats. Medical Science Research,1996, 24: 325-326. 280. Unal D, Aksak S, Halici Z, Sengul O, Polat B, Unal B, Halici M. Effects of diabetes mellitus on the rat liver during the postmenopausal period. Journal of molecular histology,2011, 42: 273-87. 281. Imai J, Ide N, Nagae S, Moriguchi T, Matsuura H, Itakura Y. Antioxidant and radical scavenging effects of aged garlic extract and its constituents. Planta medica,1994, 60: 417-20. 282. Stadler RH, Turesky RJ, Muller O, Markovic J, Leong-Morgenthaler PM. The inhibitory effects of coffee on radical-mediated oxidation and mutagenicity. Mutation research,1994, 308: 177-90. 117 283. Prestera T, Zhang Y, Spencer SR, Wilczak CA, Talalay P. The Electrophilic Counterattack Responses: Protection Against Neoplasia and Toxicity. Advances in Enzyme Regulation,1993, 33: 281-296. 284. Van Lieshout EMM, Peters WHM, Jansen JBMJ. Effect of oltipraz, αtocopherol, β-carotene and phenyl isothiocyanate on rat oesophageal, gastric, colonic and hepatic glutathione, glutathione S-transferase and peroxidase. Carcinogenesis,1996, 17: 1439-1445. 118 EKLER EK-1. ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Soyadı : Hatice BAZ Doğum tarihi : 13.06.1984 Doğum yeri : Göksun Medeni hali : Bekar Uyruğu : T.C. Adres : Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, 25240 ERZURUM Tel : 0442 236 00 00 Faks : 0449 236 00 00 E-mail : [email protected] Eğitim Lise : Gaziantep Lisesi (2003) Lisans : Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi (2004-2010) Tezsiz yüksek lisans : Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi (2010) Yabancı Dil Bilgisi İngilizce : Yok Üye Olunan Mesleki Kuruluşlar Yok İlgi Alanları ve Hobiler Kitap okuma, spor yapmak, tiyatro ve sinemaya gitmek. 119 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU 120 EK-3. TEZ SAVUNMA SINAVI TUTANAĞI 121 EK-4. HAYVAN DENEYLERİ YEREL ETİK KURUL KARARI 122
