KONU-7. MOLEKÜLER BĠYOLOJĠDE TEMEL TEKNĠKLER

KONU-7. MOLEKÜLER BĠYOLOJĠDE TEMEL TEKNĠKLER
BĠTKĠDEN GENOMĠK DNA ĠZOLASYONU
Kullanılan Tamponlar:
1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide)
1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mM EDTA
100 mM Tris-HCl (pH 8)
CTAB: Nükleaz inhibisyonu ve proteinlerin nükleik asitlerden ayrılmasında kullanılır.
Bitki DNA izolasyonunda en çok kullanılan deterjandır.
NaCl: Nükleik asit çöktürmesinde kullanılan tek değerli katyondur.
β-merkaptoetanol: Nükleik asitleri nükleaz aktivitesinden koruyan ve proteinleri
denature eden ajandır.
EDTA: DNazların kofaktörü olan Mg+2’ a bağlanarak, DNaz enzimini inhibe eder.
Tris-HCl: Ortam pH’ sını tamponlamak amacıyla kullanılır.
2. Kloroform/Ġzoamilalkol (veya Kloroform/Oktanol;24:1)
Kloroform lipidlerin uzaklaştırılmasında kullanılmasına ek olarak, proteinleri denature
eder. İzoamilalkol faz ayrımına yardımcı olur ve köpüklenmeyi azaltır.
3. TE Tamponu: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA
Ġzolasyon Protokolü (Lodhi et. al., 1994):
1. Derin dondurucuda saklanan 0.5 gr’lık yapraklar sıvı azotta ezilir. Sıvı azot hücreleri
sertleştirerek, daha kolay kırılmasını sağlar.
2. Ezilen yapraklara 5 ml ekstraksiyon tamponu eklenerek, karıştırılır.
3. Çözelti 15 ml’ lik steril propilen santrifüj tüpüne konur, havana 1 ml daha
ekstraksiyon tamponu eklenerek yıkanır ve tüpe eklenir.
4. Üstüne 50 mg PVP (polyvinlyprolidone) eklenir ve tüp ters çevrilerek, birkaç kez
karıştırılır. PVP nükleik asitlerin proteinler, lipitler ve ekstraksiyonda istenmeyen
diğer moleküllerden arındırılmasına yardımcı olur.
5. Karışım 60ºC’ ta 25 dakika bekletilir ve oda sıcaklığında soğutulur.
Yrd. Doç. Dr. Yelda ÖZDEN (2010)
6. Oda sıcaklığında soğutulan karışıma 6 ml kloroform/oktanol eklenir ve emülsiyon
oluşması için tüpler 20-25 defa hızla çalkalanır.
7. Çalkalanan tüpler oda sıcaklığında masaüstü santrifüjde 4000 rpm’ de 25 dakika
santrifüj edilir.
8. Üstteki sıvı faz 15 ml’ lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarılır. Eğer PVP’nin varlığından
dolayı
sıvı
faz
berrak
değilse
ikinci
bir
kloroform/oktanol
izolasyonu
gerçekleştirilebilir.
9. Elde edilen çözeltiye 0.5 hacim 5 M NaCl eklenerek iyice karıştırılır. Yüksek
yoğunluktaki NaCl ile DNA-tuz kompleksi oluşur.
10. Karıştırılan çözeltiye 1 hacim soğuk (-20ºC’ ta bekletilmiş) %95’ lik izopropanol
(veya 2 hacim etanol) eklenir ve buzdolabında (4-6ºC’ ta) DNA iplikçikleri belirene
kadar bekletilir. İzopropanol veya etanol ile nükleik asitlerin çökmesi sağlanır.
11. DNA iplikçikleri belirlendikten sonra oda sıcaklığında sırasıyla 3000 rpm’ de 3 dakika
ve 5000 rpm’ de 3 dakika santrifüj edilir. Değişik rpm’ deki santrifüjleme DNA’ nın
santrifüj tüpü dibinde yığılmasını sağlar.
12. Supernatant dökülür ve pellet 0-4ºC’ ta bekletilmiş %76’ lık etanol ile yıkanır. Bu
basamakta sulu etanol kullanılmasının nedeni DNA etanol ile dibe çöktürülürken su ile
önceki basamaklarda oluşturulmuş DNA-tuz kompleksindeki tuzun çözülerek sıvı faza
geçmesi sağlanır.
13. Tüpler 37ºC’ ta 20-30 dakika ters çevrilerek pellet DNA kurutulmadan etanolun
uzaklaştırılması sağlanır.
14. Pellet DNA 200-300 µl TE’ de çözülerek, eppendorf tüpe aktarılır.
Yrd. Doç. Dr. Yelda ÖZDEN (2010)
RASTGELE ÇOĞALTILMIġ POLĠMORFĠK DNA (RAPD) ANALĠZLERĠ
Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD), polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)
yöntemine dayanan ve çalışılan genom hakkında özgün nükleotid dizi bilgisi yokluğunda
rastgele primerler kullanılarak, genomik DNA’nın çoğaltılmasını içeren bir yöntemdir
(Williams et. al., 1990). RAPD uygulamasında dizisi rastgele seçilmiş tek bir oligonükleotid
ile genomik DNA, ısıya dayanıklı uygun bir DNA polimeraz varlığında karıştırılır ve PZR’a
benzer olarak döngüsel sıcaklık koşullarında muamele edilir. RAPD yönteminin en büyük
üstünlüğü çok sayıda genetik belirteç sağlamasıdır. Yöntem çeşitli bitki ve hayvanlarda
polimorfizmin ve genetik belirteçlerin belirlenmesinde hızlı ve etkindir (Ellsworth et. al.,
1993).
Kekik bitkisinde RAPD uygulaması:
RAPD uygulaması 0.5 ml’ lik mikro tüplerde 25 µl’ lik toplam reaksiyon hacminde
gerçekleştirilecektir. Aşağıdaki çizelge tüpe eklenen bileşenlerin miktarını ve tüpe eklenme
sırasını göstermektedir.
Tüpe Eklenme
Sırası
BileĢen
Ġçeriği
Reaksiyon DeriĢimi
1
Enjeksiyonluk su
-
-
Tris-HCl (pH 8.8)
10 mM
KCl
50 mM
Nonidet P 40
% 0.01 (w/v)
2
10x PCR tampon
3
MgCl2
-
2 mM
4
Genomik DNA
-
100 ng
5
Primer
-
50 ng
dATP
5 mM
dCTP
5 mM
dTTP
5 mM
dGTP
5 mM
-
0.5 U
6
7
dNTP mix
Taq Polimeraz
Yrd. Doç. Dr. Yelda ÖZDEN (2010)
(5u/µl)
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ
İzole edilen genomik DNA ve RAPD sonucu elde edilen bant profilleri agaroz jel
elektroforezi ile incelenmektedir. Agaroz jel elektroforezinin yapılması için kullanılan
kimyasal ve tamponlar aşağıda çizelge halinde sunulmuştur.
Madde Ġsmi
Ġçeriği
Miktarı
Agaroz
-
-
Trizma base
1.21 gr
Borik asit
28.6 gr
EDTA (0.5 M)
50 gr
Bromofenol
0.05 gr
Sukroz
8 gr
dH2O
11.95 ml
Etidyum Bromür
1 gr
dH2O
100 ml
TBE Tamponu (5x) (500 ml)
Bromofenol mavisi (20 ml)
Etidyum Bromür (10 mg/ml)
Agaroz Jelin Hazırlanması (%1’ lik):
1. Kaset hazırlanır ve taraklar yerleştirilir.
2. Erlene 0.40 gr agaroz tartılıp koyulur.
3. Üzerine 40 ml TBE tampon eklenir.
4. Mikrodalga fırında (yaklaşık 160ºC’ ta) 4-5 dakika ısıtılarak, agarozun homojen bir
biçimde eritilmesi sağlanır.
5. Jelin sıcaklığı 40-45ºC’ ta düştüğünde üzerine 4 µl Et-Br eklenir.
6. Jel elektroforez kasetine dökülür, uygun jel tarakları takılır ve iyice donması için
beklenir.
7. Jel donunca taraklar çıkarılıp, elektroforez tankına yerleştirilir ve örnekler yüklenir.
Yrd. Doç. Dr. Yelda ÖZDEN (2010)
DNA Örneklerinin Jele Yüklenmesi:
1. DNA örneklerine 1 µl 6x boya (agaroz için) eklenir, karıştırılır ve birkaç saniye
santrifüj edilir. Boya sukroz içeriğinden DNA örneklerinin TBE’ den ağır olmasını
ve kuyularda kalmasını, aynı zamanda içerdiği Bromofenol mavisi boya nedeniyle
elektroforezin ve DNA moleküllerinin hareketinin gözlenmesini sağlar.
2. DNA örnekleri bir DNA belirteç ile birlikte pipet yardımıyla jele yüklenir.
Örneklerin yandaki kuyulara kaçmamasına özen gösterilmelidir.
3. Elektrotlar güç kaynağına uygun şekilde bağlanır, 80 V’a ayarlanır ve güç kaynağı
açılır.
4. Bromofenol
mavisinin
pozisyonuna
göre
yeterince
yürütüldüğüne
karar
verildiğinde güç kaynağı kapatılarak jel UV transilluminatörde incelenir.
Gerekiyorsa bir süre daha yürütülebilir.
5. İstenirse jelin fotoğrafı çekilebilir. Bu amaçla Polaroid Tip 52 (400 ASA) film
kullanılabilir. Objektifte kırmızı filtre kullanılmalıdır.
KAYNAKLAR:
1.
Ellsworth D.L., Rittenhouse K.D., Honeycutt R.L. 1993. Artifacturing variation randomly
amplified polymorphic DNA banding patterns. BioTechniques, 14 (2): 214-216.
2.
Lodhi M.A., Guang-Ning Y., Weeden N.F., Reisch B.I. 1994. A simple and efficient method for
DNA extraction for grapvine cultivars and Vitis species. Molecular Biology Reporter, 6-13.
3.
Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski, J.A., Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18: 65316535.
Yrd. Doç. Dr. Yelda ÖZDEN (2010)