CRISPR\CAS9 Gen Mühendisliği: Biyoloji ve Teknoloji Doc. Dr. Zeliha Sahin, PhD Hubrecht Institute Developmental Biology and Stem Research Utrecht, The Netherlands Hücredeki DNA, canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeleri için gerekli olan genetik kodları taşır. Hücrenin DNA'sını word’deki yazım hatalarını düzelttiğimiz gibi düzeltebilsek nasıl olur? Devrim niteliğindeki gen mühendisliği teknolojisi… Bakteri hücresi Virus Bakterilerin gribe karşı nasıl savaştıklarını merak ile başladı. CRISPR: Prokaryot’ların virus saldırılarına karşı geliştirdiği adatif immün sistem'dir. • CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) cas genes CRISPR repeat-spacer array repeats spacers Bacteria/Archaea genome Bolotin et.al. 2005 Mojica et al. 2005 Pourcel et.al.2005 Genetik nasılinformation depolanır veistransfer edilir Howbilgi genetic stored and transferred Bazen RNA molekülleri, proteine kodlanmadan How genetic information is stored and transferred fonksiyon görürler Bakterilerin, virüse karşı geliştirdiği 3 basamaklı adaptif immun sistem Crispr-Cas9: DNA'yı kesmek üzere programlanabilen protein Single-guide RNA (sgRNA) ile programlanabilen Cas9 Jinek et al, Science 337, 2012. Programmed Cas9tarafından cleaves DNA at specified Programlanabilen Cas9, gRNA tanınan DNA’yı spesifik sites olarak keser Jinek et al. Science 337, 816 (2012) Cas9’in diğer adaptasyonları CRISPR\CAS Sınıflandırma Type I Cas1 Cas2 Type II Cas1 Cas4 Cas4 Cas6 Cas9 Cas5 RNase III Cas7 Cas8 HDCas3 Cas2 Type III Cas1 Cas2 Cas10 Cas7 Cas5 Csn2 COG15 17 Cas2 Type VI Cas1 Cas8 Cas2 Cas4 Cas4 Adaptation spacer acquisition Cpf1 C2c2 Expression pre-crRNA processing Cas7 Cpf1 HDCas10 Cas3 Type V Cas1 Cas6 Cas5 Cas9 Type IV C2c2 Interference crRNA and target binding target cleavage optional components (function unclear) DinG Class 1 CRISPR-Cas systems multi-protein effector complexes Class 2 CRISPR-Cas systems single-protein effectors (Koonin & Krupovic, Nat Rev Genet. 2015’ den adapte edilmiştir) CRISPR\CAS Sınıflandırma Type I Cas1 Cas2 Type II Cas1 Cas4 Cas4 Cas6 Cas9 Cas5 RNase III Cas7 Cas8 HDCas3 Cas2 Type III Cas1 Cas6 Cas5 Cas9 Cas3 Csn2 Cas2 Type V Cas1 Cas2 Type VI Cas1 Cas4 Cas4 Adaptation spacer acquisition Cpf1 C2c2 Expression pre-crRNA processing Cas7 Cas10 Cas2 Cpf1 C2c2 Interference crRNA and target binding HDCas10 target cleavage COG15 17 optional components (function unclear) Class 1 CRISPR-Cas systems multi-protein effector complexes Class 2 CRISPR-Cas systems single-protein effectors (Koonin & Krupovic, Nat Rev Genet. 2015’ den adapte edilmiştir) Genome Editing CRISPR Teknoloji http://www.genome-engineering.org/crispr/ Cas9 protein RNA DNA Genome editing begins with dsDNA Gen modifikasyonu, dsDNA'nın kopması ile başlar cleavage Cas9:sgRNA DNA non-homologous end joining (NHEJ) homology-directed repair (HDR) CRISPR/Cas9 sistemi ile deney hayvanlarında germline-modifikasyonu Cas/gRNA’ın eukaryot hücrelere transferi in vitro / ex vivo DNA kodlayan Cas ve gRNA plasmid Cas mRNA ve gRNA in vivo Cas proteingRNA RNP plasmid virus transfeksiyon transfeksiyon transfeksiyon elektroporasyon elektroporasyon elektroporasyon zigot injk. zigot injk. zigot injk. enfeksiyon DNA kodlayan Cas ve gRNA virus Cas mRNA ve gRNA Cas proteingRNA RNP Lipid nanoparticles Lipid nanoparticles hydrodynamic injection iv. injection iv. injection embryo injection embryo injection membran deformasyon lokal injection iTOP iTOP iTOP: induced Transduction by Osmocytosis and Propanebetaine Makropinositoz iTOP ( Cell, 2015) iTOP: protein-DNA-RNA gibi makro molekülerin makropinositoz ile hücre içerisine girmesini sağlayan tekniktir Proteinlerin ve diğer makro moleküllerin hücre içerisine alınmasını sağlayan tekniktir Herhangi bir taşıyıcı peptide gerek yoktur (non-viral). Birçok primer hücre hattı'nın gen modifikasyonunda etkilidir ( Cell, 2015) Makropinositoz’daki Yolakların Tanımlanması İçin Haploid Genetik Tarama KBM7 hücrelerinin gene trapping yontemi ile mutasyona uğratılması: Mutasyona uğramış KBM7 hücrelerinin genetik taraması . Haploid KBM7 cells mutagenized with gene trap Toxin transduction by iTOP Micropinocytosis deficient selection Clonal expansion Identification of genes involved in macropinocytosis process Her şeyi değiştiren teknolojiler Things that changed everything Figures: www.opte.org; Pixabay.com and Wikipedia CRISPR\Cas teknolojisi ile gen modifikasyonundaki teknolojik bariyer ortadan kalkmıştır. Bu teknoloji, genetik hastalıkların tedavisinde Demokrasi sağlayacaktır. Yakın zamanda, insanda genetik hastalıkların tedavisinde kullanımını göreceğiz.