Primer Design
advertisement
Hafta XII PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları EŞ ZAMANLI PCR Prof. Dr. Hilâl Özdağ Son nokta tespitindeki eksiklikler (End point detection) • • • • • • • Düşük hassasiyet Düşük çözünülürlük Otomasyon eksikliği Yalnızca boy belirlenebilmesi Sonuçların rakamsal olarak ifade edilmemesi EtBr ile boyamanın nicelik belirlemede etkin olmaması PCR sonrası işleme devam gereği (agaroz jel elektroforezi) www.appliedbiosystems.com Eş zamanlı PCR Geleneksel PCR’a Karşı www.appliedbiosystems.com Geometrik artış fazı/ Plato etkisi www.appliedbiosystems.com Örnekler arası miktar farkının gözlendiği aşama www.appliedbiosystems.com Eş Zamanlı PCR Sistemleri Eş zamanlı PCR’da saptama yöntemleri • Çift zincirli DNA’ya bağlanan boyalar (SYBR Green; LC Green) • Hidroliz probları (Taqman probları) • Hibridizasyon probları SYBR Green SYBR Green www.appliedbiosystems.com Hidroliz Probları www.appliedbiosystems.com Hidroliz Probları www.appliedbiosystems.com Hibridizasyon Probları www.appliedbiosystems.com Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü Referans/Standart Gen Zorunlu İdare Genleri (Housekeeping Genes) • Her dokuda hücre hayatiyetini temin için mutlak suretle ifadelenen genlerdir. • İfade düzeylerinin doku/hücreler arası değişmediği düşünülmektedir. Zorunlu İdare Genleri Her Dokuda Eş Düzeyde mi İfadelenir? Vandesompele J ve ark, 2002, Genome Biology, 3: 7 Gen ifadesinin bağıl olarak ölçümü E= 10-1/slope Erime Eğrisi (Melting Curve) Roche “PCR Applications Manual” Erime Eğrisi ile Genotipleme Roche “PCR Applications Manual” Erime Eğrisi ile Genotipleme Roche “PCR Applications Manual”