Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi Genetik Testler

1
2
3
4
5
6
7
Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi
Genetik Testler
Doç.Dr.Hüseyin Onay
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD
8
16. Kromozom üzerinde α globin gen bölgesi
11. Kromozom üzerinde β globin gen bölgesi
Globin Genleri
Gen
 globin gen zinciri
 globin gen zinciri
Uzunluk (bç)
Uzunluk (aa)
HBB
754
147
HBD
785
147
HBE1
906
147
HBG1
808
147
HBG2
692
147
HBA1
605
142
HBA2
577
142
HBZ
755
142
HBQ1
536
142
HBM
506
141
HBB geni
• 3 ekzon, 2 intron
 talasemiye neden olan mutasyonlar
Tein SL, Cold Spring Harb Perspect Med, 2013
HBA geni
 Talasemi Mutasyonları
 Talasemide Genetik Danışma
1.
Tarama testlerinde taşıyıcılık
saptanması
2.
Önceki çocukta talasemi major
hastalığı
3.
Kan akrabalarında talasemi major
tanısı almış olgu
4.
Kan akrabalarında taşıyıcılık
saptanması
5.
Öykü olmadan bu hastalık için riski
öğrenmek
 talasemide hematolojik çalışmalarda yol haritası
MCV >78
MCH >27
A
Hb
A2<%3
Normal
< 78
< 27
A
A2>%3,5
F %0.1-7
< 78
< 27
A
A2<%3,5
Taşıyıcı
Fe tayini
Sık
mutasyonlar
için DNA
analizi
Tanımlanmamış
mutasyonların
analizi
Fe eksikliği
< =78
< =27
A
A2<%3
F %2-30
Kantitaif
HbF, F hücre
dağılımı
Normal
α talasemi
taşıyıcısı
Doğrulayıcı
test
Oraklaşma+
HbS
DNA analizi
Demiri
tamamla
Tekrar test yap
Varyant Hb
HbH
inkülizyonları
α gen analizi
βgen analizi
δ+β tal. taşıyıcı
δβ taşıyıcı
Normal Hb A2
δβ talasemi
HPFH
Oraklaşma -
Hb C,D,E
Hb O Arab
Hb Lepore
α talasemi
taşıyıcısı
Diğer
Gerekirse
İleri
araştırma
Old J. Scand J Clin Lab Invest, 2007
Moleküler Genetik Testler
Algoritma
– Talasemilerin coğrafi yayılımı
• Gen tayini
– Mutasyonların coğrafi yayılımı
• Panel tayini
– Hematolojik parametrelerden gelen ipuçları
• Yöntem tayini
Stripassay Uygulamaları
• Çoklu mutasyon taramasına olanak veren sistemler
• Günümüzde sık gözlenen birçok hastalıkla ilgili stripler mevcut
• Hızlı sonuç vermeleri, ucuz olmaları ve kolay uygulanabilir olmaları nedeniyle sıklıkla kullanılan yöntemler
Reverse Hibridizasyon‐ talasemi
•22 mutasyon içeren testle
mutasyonların %90’ ı taranır*
*Tadmouri ve ark. Am J Haemetol 1998
•-87
• -30
• Codon 5
• HbC
• HbS
• Codon 6
• Codon 8
• Codon 8/9
• Codon 22
• Codon 30
• IVS 1.1
• IVS 1.2
•IVS 1.5
• IVS 1.6
• IVS 1.110
• IVS 1.116
• IVS 1.25
• Codon 36/37
• Codon 39
• Codon 44
• IVS 2.1
• IVS 2.745
Reverse Hibridizasyon‐ talasemi
DNA Dizi Analizi
• DNA nükleotid dizisinin yarı‐otomatik ya da otomatik genetik analiz cihazları yardımıyla ortaya çıkartılması
• Mutasyon saptanmasında altın standart kabul edilmekte
HBA Dizi Analizi
Kimerizm Analizi
• Moleküler genetikte kaydedilen gelişmeler, tek yumurta ikizleri hariç bir kişi için özgün olan DNA profilinin tanımlanmasını sağlamıştır
STR Belirteçleri
• STR’lar (Short Tandem Repeat) polimorfik olmaları ve düşük mutasyon hızına sahip olmaları nedeniyle bu amaçla kullanılan önemli genetik markırlardır.
N = 10
100bp
a)
240bp
100bp
N = 13
b)
100bp
100bp
252bp
STR Marker Analizi
MLPA Çalışma Prensibi
1. MLPA probemix denatüre genomik DNA’ ya eklenir
2. Probun her iki parçası hedef diziye hibridize olur
3. Thermostable ligaz ile probun iki parçası birleştirilir
X
5’
3’
X
Y
Hedef A
5’
5’
3’
Y
Hedef B
5’
MLPA Çalışma Prensibi
Örnek
Kontrol
• Amplifiye ürünler kapiller elektroforezle ayrıştırılır
• Hedef bölgedeki kopya sayısı değişiklikleri kontrol örneklerle
karşılaştırılarak elde edilir
• Pik alanları aynı örneğe ait diğer örneklerin pik alanlarının ortalaması ile
normalize edilir
HBA Probları
HBB MLPA
DT: 23.12.1988
Hb: 12,6
Hct: 33,7
MCV: 65
MCH: 24,4
RBC: 5,18
RDW: 18,1
Muğla
Tarama – Kendisi
– Eşi Hb: 11,1
Hct: 30,4
MCV: 69
MCH: 25,1
RBC: 4,41
RDW: 18,1
HbA: 86,4
HbA2: 2
HbF: 11,5
HbA: 91,4
HbA2: 4,8
HbF: 3,8
Talasemi
Taşıyıcılığı
IVS 2.745 [C >G ]
6-7 hafta
Normal
Dizi analizi:
EÜTF Tıbbi Genetik Polikliniği
0
Mapview
c
c
c
c
c
c
c
c
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB exon 03B
11-005.2 HBB exon 03A
11-005.2 HBB intron 02
11-005.2 HBB intron 01
11-005.2 HBB exon 01A
11-005.2 HBB promotor
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB
11-005.2 HBD exon 03
11-005.2 HBD exon 01
11-005.2 HBD
11-005.2 HBBP1 exon 03
11-005.2 HBBP1 exon 01
11-005.2 HBG1
11-005.2 HBG2 exon 03
11-005.2 HBG2
11-005.2 HBE1 exon 01
11-005.2 HS1
11-005.2 HS2
11-005.2 HS3
11-005.2 HS3
11-005.2 HS3
11-005.2 HS4
11-005.2 HS4
11-005.2 HS5
11-006.4 SMPD1
c
c
c
c
c
0.2
c
0.4
c
0.6
c
0.8
c
1
c
1.2
c
1.4
c
Mapview
c
20-04-2012-MLPA.4.fsa^GMsTXT.txt
c
c
c
c
c
c
c
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB exon 03B
11-005.2 HBB exon 03A
11-005.2 HBB intron 02
11-005.2 HBB intron 01
11-005.2 HBB exon 01A
11-005.2 HBB promotor
11-005.2 HBB
11-005.2 HBB
11-005.2 HBD exon 03
11-005.2 HBD exon 01
11-005.2 HBD
11-005.2 HBBP1 exon 03
11-005.2 HBBP1 exon 01
11-005.2 HBG1
11-005.2 HBG2 exon 03
11-005.2 HBG2
11-005.2 HBE1 exon 01
11-005.2 HS1
11-005.2 HS2
11-005.2 HS3
11-005.2 HS3
11-005.2 HS3
11-005.2 HS4
11-005.2 HS4
11-005.2 HS5
0
11-006.4 SMPD1
Delta beta
talasemi taşıyıcısı
Ratio
Normal
Ratio
1.4
20-04-2012-MLPA.3.fsa^GMsTXT.txt
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
Talasemi Mutasyon Veritabanları
• LOVD
–
–
–
–
–
http://lovd.bx.psu.edu/home.php?select_db=HBB
http://lovd.bx.psu.edu/home.php?select_db=HBA1
http://lovd.bx.psu.edu/home.php?select_db=HBA2
http://lovd.bx.psu.edu/home.php?select_db=HBD
http://lovd.bx.psu.edu/home.php?select_db=HBG1
• HGMD
• HbVar
– http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html
• IthaGenes
– http://www.ithanet.eu/db/ithagenes
Bilimsel Güçlükler
• Prenatal genetik danışmada
HS-40
ζ
α2
16. Kromozom
α1
//
5’
globin genleri ve düzenleyici
5’
3’
Fetus
Embriyo
ζ2 ε2 Hb Gower α2 γ2 Hb F
I
α2 ε2 Hb Gower
II
ζ2 γ2 Hb
Portland I
ζ2 β 2 Hb
Portland II
bölgelerindeki kompleks yapılanmaların fenotipi etkileyebileceği söylenmelidir Adult
α2 β2 Hb A
α2 γ2 Hb A2
β
LCR
ε
γG
γA
11.
Kromozom
δ
//
5’
3’
Bilimsel Güçlükler
β talesemide fenotipik spektrumu etkileyen
genetik modifiye edici faktörler
Primer:
β globin gen
mutasyonları
•
•+
•++
Sekonder:
Globin sentezinde
rol alan diğer
genler
Tersiyer:
Globin sentezi
dışında hastalığın
komplikasyonları
üzerine etkili genler
Fetal Hemoglobin Regülatörleri
Sankaran VG et al. Cold Spring Harb Perspect Med 2013
Fetal Hemoglobin Regülatörleri
Hemoglobinopatilerde Prenatal Tanı Aşamaları
• Hasta çocuk sahibi olma riski içinde olan çiftlerin belirlenmesi • Genetik danışma • Çiftlerdeki moleküler defektin tanımlanması
• Bu bozukluğun fetüste araştırılması için fetüsten materyal elde edilmesi
• Genetik test ve sonucun aileye iletilmesi
• Fetüs hasta ise ailenin kararı ile gebelik terminasyonu • Ailenin izlenmesi
Prenatal Tanı
Koriyonik villus biyopsisi
CVS)
16-18.haftalarda
Kordosentez
10-12.
haftalarda
20-. haftalarda
CVS
•CVS talasemi prenatal tanısında uygun bir yöntem
•Elde edilen materyal anne hücrelerinden mikroskop
altında iyi temizlenmeli
Preimplantasyon Genetik Tanı
2.
2. Preimplantasyon
Preimplantasyon genetik
genetiktanı
tanı
Sperm
oosit
Döllenme
zigot
8 blastomer
Fetus--adult
Fetus
PCR
PCR
DNA
DNA analizi
analizi
FISH
FISH
cytogenetik
cytogenetik
Sağlam embriyo
yerleştirilir.
Prenatal tanı ile
Kontrol önerilir
Preimplantasyon Genetik Tanı
• In-vitro oluşturulan embriyolardan,
belirlenmiş genetik hastalıklar açısından,
sağlam olanlarını seçip anne adayına
transfer etmek için uygulanan yöntem
Tek hücre biyopsisi
Hasta
Sağlam
Sağlam
Hasta
SAĞLAM EMRİYO TRANSFERi
Hasta
Non-invazif Prenatal Tanı