118 BS-018 - KimyaKongreleri.org

118 BS-018
Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 Suşundan Klonlanan Rekombinant
Fosfotriesteraz Homolog Proteininin Mutasyonu ve İzlenmesi
Fulya Öz, Melike Yıldırım Akatın, Ahmet Çolak, Yakup Kolcuoğlu, Nagihan Sağlam Ertunga
Karadeniz Teknik Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü, 61080 Trabzon
[email protected]
Sarin, soman ve VX gibi kimyasal savaş ajanlarının geliştirilmesinde ve tarımda böcek
öldürücülerin üretiminde yaygın olarak kullanılan organofosfatlardaki fosfoester bağlarının hidrolizini
katalizleyen enzimler fosfotriesteraz (PTE)’lar olarak adlandırılır [1,2]. Fosfotriesteraz homolog
protein (PHP)’ler, fosfotriesterazlarla, aktif bölgelerinin yapısı ve üç boyutlu yapıları açısından
benzerlik göstermektedir [3]. PHP’nin varlığı bugüne kadar çok az sayıda mikroorganizmada
bildirilmiştir. Ayrıca, farklı organizmalardan PHP kodlayan genlerin klonlanması ve ekspres edilip
ayrıntılı biyokimyasal karakterizasyonunun yapıldığı çalışmaların sayısı da yok denecek kadar azdır
[4].
Yapılan çalışmalarla, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4’ten elde edilen rekombinant
fosfotriesteraz homolog proteininin (TK4PHP) amino asit sırasının, Pseudomonas diminuta PTE’si
(PDPTE), Mycobacterium tuberculosis PHP’si (MTPHP) ve Escherichia coli PHP’sinin (ePHP)
amino asit sıraları ile karşılaştırılması sonucunda, birinci, yedinci ve sekizinci β/α birimlerini örten
3 aktif bölge lopunun (lop 1, lop 7, lop 8) TK4PHP’sinde PDPTE’den daha kısa olduğu görülmüştür
[3,4]. Lop 8, substrat bağlanma birimleri olan Phe 306 ve Tyr 309’u içermektedir. Bu nedenle, ilk
olarak TK4PHP’sinin lop 8’inde, PTE’ lerden 9 amino asit kısa olan bu farklılığı gidermek için bir
mutasyon
yapılmasına
karar
verildi.
Bunun
için,
ve
M3R
M3F
(5’-gtggctttagcagctatgtgaccaacattcaatcacatttactttctcgcggcgg-3’)
(5’-gaatgttggtcacatagctgctaaagccacgcgttacatcgctagaaagcaag-3’) primer seti ile TK4PHP’sini içeren
pET28-a(+) vektörü kullanılarak bir PCR yapıldı. PCR ürünü kit kullanılarak saflaştırıldı. DpnI enzimi
ile uygun şartlar altında kesim yapıldıktan sonra, E. coli DH5α hücresine transformasyon
gerçekleştirildi. Büyüyen kolonilerden plazmit izolasyonu yapılarak DNA sıra analizi için Macrogen
Inc.’ye gönderildi. Gelen sonuçların incelenmesi ile istenilen 27 nükleotidin belirlenen bölgeye, doğru
bir şekilde yerleştirildiği görüldü.
Mutant gen, E. coli BL21(DE3)pLysS konakçı hücresine transformasyon yapıldı ve mutant
protein ekspres edildi. Ekspres edilen protein, N ucunda 6 tane histidin birimi içerdiğinden dolayı,
paramagnetik nikel parçacıkları içeren “MagneHis Protein Purification System (Promega)”
kullanılarak saflaştırıldı. Protein ekspresyonu ve saflaştırma işlemi, SDS-poliakrilamid jel
elektroforezi yapılarak doğrulandı.
Çalışmanın bundan sonraki aşamalarında mutant proteinin biyokimyasal karakterizasyonu
gerçekleştirilecektir.
KAYNAKLAR
[1] Raushel, F.M. Current Opinion in Microbiology 5, 288-295, 2002.
[2] Hou, X., Maser, R.L. Magenheimer, B.S. and Calvet, J.P., Gene, 168, 157-163, 1996.
[3] Afriat, L., Roodveldt, C., Manco, G. and Tawfik, D.S., Biochemistry, 45, 13677-13686, 2006.
[4] Yildirim M., Colak, A., Col, M. and Canakci, S., Process Biochemistry, 44, 1366-1377, 2009.