m‹zampaj 250-277 - Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi
advertisement
Türk Mikrobiyol Cem Derg 32: 260-264 KIA ve Triptofanl› Buyyon Besiyerindeki Biyokimyasal Özelliklerine Göre Enterik Bakterilerin Tan›mlanmas›nda Klasik Yöntemlerin Modifikasyonu Halil YAZGI(*) ÖZET SUMMARY Enterebacteriaceae ailesi içinde 30’dan fazla cins ve 130’dan fazla tür bulunmaktad›r. Bu 130 tür bakteriden klinik örneklerde en s›k izole edilenler Escherichia coli, Shigella serogrup A,B,C,D, Salmonellalar, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Edwardsiella tarda, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Providencia alcalifaciens, Morganella morganii, Yersinia entero-colitica, Yersinia pestis ve Yersinia pseudotu-berculosis’dir. Modification of the Classical Methods in Identification of Enterobacteriaceae by Their Biochemical Properties on KIA and Tryptone Broth Media Enterik bakterilerin tan›mlanmas› biyokimyasal testlerle olur. Bu amaçla en s›k kullan›lan besiyerleri Kligler’s iron agar (KIA) ve triptofanl› buyyon’dur. Enterik bakterilerin biyokimyasal özelliklerinin de¤erlendirilmesinde klasik de¤erlendirme tablolar›n›n kullan›m› pratik uygulamalarda pek uygun de¤ildir. Özellikle mikrobiyoloji uzmanl›k e¤itimine yeni bafllam›fl araflt›rma görevlileri için bu tablolar› de¤erlendirmek daha da zaman al›c› olmaktad›r. Tan›mlama tablosunun bu de¤erlendirme zorlu¤unu gidermek amac›yla enterik bakterinin KIA da oluflturdu¤u özellikleri ve indol deneyini birlikte de¤erlendirmek suretiyle bir tan›mlama tablosu tasarlanm›flt›r. Tasarlanan bu tablo yard›m›yla s›k izole edilen enterik bakterilerin tan›mlanmas› daha kolay ve k›sa sürede gerçeklefltirilmektedir. There are more than 30 genera and more than 130 species in Enterobacteriaceae . The most commonly isolated bacteria are Escherichia coli, Shigella serogrup A,B,C,D, some Salmonella serotypes, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Edwardsiella tarda, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, P rovidencia rettgeri, Providencia stuartii, Providencia alcalifaciens, Morganella morganii, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. The identification of Enterobacteriaceae could be done by biochemical tests. For this purpose, the most commonly used media are KIA and tryptone broth. The use of classical evaluation tables is not practical in the evaluation of biochemical features of Enterobacteriaceae. Moreover evaluation of these tables could be time-consuming, especially for those who are at the beginning of microbiology residency programme. For this purpose, we composed an identification table evaluating features of Enterobacteriaceae both in KIA and tryptone broth media. With the aid of this table the identification of commonly isolated Enterobacteriaceae could be easier and not timeconsuming. Key words: Enterobacteriaceae, identification table Anahtar kelimeler: Enterik bakteriler, tan›mlama tablosu G‹R‹fi Enterebacteriaceae ailesinin yada k›saca enterik bakterilerin genel özellikleri flunlard›r: 0,3-0,5 mm en ve 1-6mm boyunda ço¤u hareketli, baz›s› hareketsiz, düz, Gram negatif , sporsuz, çomak biçiminde *Atatürk Üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Erzurum 260 bakterilerdir. Fakültatif anaeropturlar. Genel kullan›m besiyerlerinde kolayl›kla ürerler. Fermentatif metabolizmalar› var olup tümü glikozu parçalayarak asit ve birço¤u da gaz olufltururlar. Katalaz olumlu, oksidaz olumsuzdur. Nitratlar› nitritlere çevirirler (1). Enterebacteriaceae ailesi içinde 30’dan fazla cins ve 130’dan fazla tür bulunmaktad›r (2). Ancak bu 130 H. Yazg›., KIA ve Triptofanl› Buyyon Besiyerindeki Biyokimyasal Özelliklerine Göre Enterik Bakterilerin Tan›mlanmas›nda Klasik Yöntemlerin Modifikasyonu tür bakteriden klinik örneklerde en s›k izole edilenler E. coli, Shigella serogrup A,B,C,D, Salmonellalar, C.freundii, C. diversus , E. tarda, K. pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae, H. alvei, S. marcescens, P. mirabilis, P. vulgaris, P. rettgeri, P. stuartii, P. alcalifaciens, M. morganii, Y. enterocolitica, Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis’dir(3). Ülkemizde yap›lm›fl çal›flmalarda da klinik örneklerden yaklafl›k olarak benzer bakteriler izole edilmektedir (4-11). Enterik bakterilerin etken olabilece¤i hastal›k materyallerinden ilk ekimler en az bir adet zengin besiyerine, örne¤in kanl› agar, bir de EMB, Endo, Mac Conkey gibi ay›rtedici bir besiyerine yap›lmal›d›r (1). EMB, Endo, Mac Conkey besiyerlerinde Gram pozitif bakteriler ve müflkülpesent Gram negatif bakteriler üreyemez iken enterik bakteriler iyi ürer (1,12).EMB, Endo, Mac Concey gibi besiyerinde üreyen bakterilerin kesin tan›s› biyokimyasal yöntemlerle yap›l›r. Bu amaçla kullan›lan k›rktan fazla test vard›r (2). Özellikle rutin mikrobiyolojik çal›flmalarda her enterik bakterinin tan›s›nda bu testlerin hepsinin yap›lmas›na gerek yoktur. Ayr›ca zaman ve ekonomik bak›mdan uygun da de¤ildir. Enterik bakterilerin tan›s›nda uygulanan biyokimyasal deneylerde en s›k kullan›lan besiyerleri Triple Sugar Iron (TSI= Üç flekerli demir) besiyeri ve triptofanl› buyyon’dur (13). TS‹ besiyerinin yerine ayn› amaçla Kligler’s Iron Agar (KIA) da kullan›labilir(12). Bu iki besiyerinin içeri¤indeki temel fark TSI de üç çeflit (glukoz, laktoz ve sukroz) fleker bulunmas› oysa K‹A da iki çeflit (glukoz ve laktoz) fleker bulunmas›d›r. Sukrozu fermente eden bakteriler TSI besiyerinin yat›k k›sm›nda asit reaksiyon oluflumuna neden olmaktad›r. Klinik örneklerden s›k olarak izole edilen bakterilerin laktoz fermente etme özellikleri sukroz fermente etme özellikleriyle genellikle paralellik göstermektedir. Ancak bu paralellik durumu her bakteride bulunmamaktad›r. Örne¤in Y. enterocolitica, P. vulgaris ve S. marcescens’te laktoz negatif olmas›na karfl›n sukroz pozitiftir (2). Laktoz negatif ve sukroz pozitif özellikteki bir bakteriyi TSI besiyerine ekti¤imizde sukrozun fermentasyonu TSI besiyerinin yat›k k›sm›n› sar› renge dönüfltürmesinden dolay› sanki bakteri laktoz pozitifmifl gibi de¤erlendirme hatalar› ortaya ç›kabilir. Bu yan›l- g›ya meydan vermemesinden dolay›, özellikle d›flk› örneklerinde Salmonella Shigella ve Yersinia cinslerinin izole edilme olas›l›¤› varsa, KIA besiyeri TSI besiyerine tercih edilebilir (12). EMB yada Mac Conkey gibi bir besiyerinde üremifl ve oksidaz negatif olan bir bakteri kolonisinden KIA besiyerinin dip k›sm›na bat›r›l›p sonra yat›k yüzeyine zikzak çizilerek ekim yap›l›r. 35 °C’ de 18-24 saat inkübe edilir. Bu süre sonunda KIA besiyerinde oluflan özelliklerin de¤erlendirilmesi flu flekildedir: Dipte sar› (asit ), yat›k k›sm›nda k›rm›z› (alkali) reaksiyon gösteren bakteriler, yaln›z glukozu fermente etmifl laktozu edememifllerdir. Dip ve yat›k k›s›mda sar› (asit) reaksiyon verenler, hem glukozu hem de laktozu fermente etmifllerdir. Besiyerinde hava kabarc›klar›n›n yada çatlamalar›n varl›¤› bakterinin gaz, siyah rengin oluflumu H2S oluflturdu¤unu gösterir (1). Klinik örneklerden s›kl›kla izole edilen enterik bakterilerin KIA ve triptofanl› buyyon besiyerinde oluflturdu¤u özellikler klasik flekliyle Tablo 1’ de gösterilmifltir ( 1-3 ). Enterik bakterilerin biyokimyasal özelliklerinin de¤erlendirilmesinde klasik de¤erlendirme tablolar›n›n kullan›m› pratik uygulamalarda pek uygun de¤ildir. Özellikle mikrobiyoloji uzmanl›k e¤itimine yeni bafllam›fl araflt›rma görevlileri için bu tablolar› de¤erlendirmek daha da zaman al›c› olmaktad›r. Örne¤in “glukoz pozitif, glukozdan gaz oluflumu negatif, H2S pozitif, laktoz negatif, indol pozitif ” özellikte olan bir bakteri suflunu tan›mlayabilmek için Tablo 1’ de teorik olarak yaklafl›k 50 kareyi iflaretlememiz gerekmektedir. Tan›mlama tablosunun bu de¤erlendirme zorlu¤unu gidermek amac›yla bakterinin KIA da oluflturdu¤u özellikleri ve indol deneyini birlikte de¤erlendirmek suretiyle Tablo 2’ de görülen tan›mlama tablosu tasarland›. Tablonun tasar›m›nda bakterilerin laktoz fermentasyonu özelli¤i özel önem tafl›maktad›r. Enterik bakterilerin bu özelli¤i onlar›n ayr›mlar› bak›m›ndan önemlidir (1). Özellikle enterik patojenlerin büyük bir bölümünün laktoz negatif olmas›, tablonun bu flekilde tasarlamas›nda etkili olmufltur. ‹ncelendi¤inde görülece¤i üzere Tablo 2’nin birinci 261 Türk Mikrobiyol Cem Derg 32:260-264 Tablo 1. Enterik bakterilerin KIA ve ‹ndol besiyerinde oluflturdu¤u özellikler (Klasik tablo)* Bakteri Glukoz fermentasyonu Glukozdan gaz oluflumu Laktoz fermentasyonu H2S oluflumu E. coli + + + - + Shigella serogrup B,C + - - - +/-(%50+) S. dysenteriae + - - - +/-(%45+) S. sonnei + - - - - Salmonella most serotypes + + - + - S. typhi + - - + - S. paratyphi A + + - - - C. freundii + + +/- (%50 +) +/-(%80+) - C. diversus + + +/- (%35 +) - + E. tarda + + - + + K. pneumonia + + + - - K. oxitoca + + + - + E. aerogenes + + + - - E. cloacae + + + - - H. alvei + + - - - S. marcescens + +/- (% 55 +) - - - P. mirabilis + + - + - P. vulgaris + +/-(%85 +) - + + P. rettgeri + - - - + P. stuarti + - - - + P. alcalifaciens + +/- (%85 +) - - + M. morganii + + - - + Y. enterocolitica + - - - +/-(%50 +) Y. pestis + - - - - Y. pseudotuberculosisw + - - - - ‹ndol üretimi *Aç›klama: + = kökenlerin en az %90’› olumlu +/- =kökenlerin % 11-89’u olumlu - =kökenlerin 0-10’u olumlu (1-3). bölgesinde enterik bakterilerin KIA ve indol deneylerine ait veriler, ikinci bölgesinde ise enterik bakterilerin tan›mlanmas›nda s›k kullan›lan di¤er biyokimyasal testlere ait veriler bulunmaktad›r. Ayr›ca tablonun üst taraf›nda laktoz negatif bakteriler, alt taraf›nda ise laktoz pozitif bakteriler bulunmaktad›r. Yukar›da kal›n (bold) yaz›m fleklinde biyokimyasal özellikleri verilen bakterinin Tablo 2’ye göre de¤erlendirildi¤inde P roteus vulgaris oldu¤u kolayca görülmektedir. Tablo 2 incelendi¤inde baz› bakterilerin birden fazla bölgede yer ald›¤› görülmektedir. Bunun nedeni o bakterilerin biyokimyasal özelliklerinden bir yada birkaç›n›n de¤iflken olmas›d›r. Örne¤in C.freundii’nin KIA ve triptofanl› buyyonda izlenen biyokimyasal özellikleri klasik tan›mlama tablosun- 262 da indol üretimi negatif, H2S de¤iflken, glukozdan gaz oluflumu pozitif ve laktoz fermentasyonu de¤iflken olarak görülmektedir. C. freundii’nin bu dört biyokimyasal özelli¤inden ikisinin de¤iflken olmas› tasarlanan tabloda bu bakterinin dört farkl› bölgede yer almas›na neden olmufltur. SONUÇ Tasarlanan tabloda baz› gruplarda (örne¤in laktoz pozitif, glukozdan gaz pozitif, H2S pozitif, indol negatif grupta oldu¤u gibi) sadece bir bakteri türü bulunmakta ve bu bakteri türünün tan›mlanmas›nda KIA ve triptofanl› buyyon besiyerinden elde etti¤imiz veriler yeterli olmaktad›r. Öte yandan di¤er baz› gruplarda ( örne¤in laktoz negatif, glukozdan gaz ne- H. Yazg›., KIA ve Triptofanl› Buyyon Besiyerindeki Biyokimyasal Özelliklerine Göre Enterik Bakterilerin Tan›mlanmas›nda Klasik Yöntemlerin Modifikasyonu Tablo 2. Enterik bakterilerin KIA ve ‹ndol besiyerinde oluflturdu¤u özellikler (tasarlanan tablo)** 1.Bölge N E G A T ‹ F L A K T O Z LAKTOZ POZ‹T‹F 2. Bölge Olas› etken KIA+‹ndol Özelli¤i MR VP Citrat Üreaz LD OD Mannitol Hareket Gaz (-) H2S (-) ‹ndol(-) S. sonnei S. dysenteriae Shigella serogrup B,C S. marcescens Y. enterocolitica Y. pestis Y. pseudotuberculosis + + + D + D + + - + - D D + + - + + + - + + + + + + + - Gaz (-) H2S (-) ‹ndol(+) S. dysenteriae Shigella serogrup B,C P. rettgeri P. stuartii P. alcalifaciens Y. enterocolitica + + + + + + - + + + - + D D - + + + + + D + - Gaz (-) H2S (+) ‹ndol(-) S. thypi + - - - + - + + Gaz (+) H2S (-) ‹ndol(-) S. paratyphi A H. alvei S. marcescens C. freundii + D D + D + - + D D D + + - + + + - + + + + + D + + Gaz (+) H2S (-) ‹ndol(+) P. alcalifaciens M. morganii C. diversus + + + - + + + D - + + + + + + Gaz (+) H2S (+) ‹ndol(-) Salmonella most serotypes P. mirabilis C. freundii + + + D - + D D + D + - + + - + + + + + Gaz (+) H2S (+) ‹ndol(+) P. vulgaris E. tarda + + - D - + - + + - + + Gaz (-) H2S (+) ‹ndol(+) P. vulgaris + - D + - - - + Gaz (+) H2S (-) ‹ndol(-) K. pneumonia E. aerogenes E. cloacae C. freundii + + + + - + + + D + D D + + - + + - + + + + + + + Gaz (+) H2S (-) ‹ndol(+) E. coli C. diversus K. oxitoca + + D + + + D + + + D + - + + + + + - Gaz (+) H2S (+) ‹ndol(-) C. freundii + - D D - - + + **Aç›klama : 1.gaz= glukozdan gaz oluflumu, MR= metil k›rm›z›s›, VP=Voges Proskauer, Citrat= citrat utilizasyonu, Üreaz= üre hidrolizi, LD=lizin dekarboksilaz, OD= ornitin dekarboksilaz 2.Sadece bir tek grupta yer alan bakteri türlerinin belirtilen özelikleri %90 ve üstündeki de¤erlerde ise (+), %10 ve alt›ndaki de¤erlerde ise (-) olarak de¤erlendirildi. 3.Birden fazla grupta yer alan bakteri türlerinin belirtilen özelliklerinden bir yada birkaç›n›n pozitiflik oranlar› %11-89 aras›ndad›r. 4.De¤erlendirme tablosunda yer alan salmonella, shigella ve E.coli türlerinin kesin tan›s› için biyokimyasal testlerin yan›s›ra serolojik deneylerle antijenik yap›lar›n›n incelenmesi de uygun olur. 5. + = kökenlerin en az%90’› olumlu - =kökenlerin %0-10’u olumlu D =kökenlerin %11-89’u olumlu (1-3). gatif, H2S negatif , indol negatif grupta oldu¤u gibi) birden fazla bakteri türü bulunmaktad›r. Bu gibi durumlarda triptofanl› buyyon ve KIA besiyerinden elde etti¤imiz veriler yetersiz kalmakta ve kesin tan›mlama yap›lamamaktad›r. Bu nedenle KIA ve indol deneyine ek olarak baz› biyokimyasal deneyler de yap›lmal›d›r. S›kl›kla kullan›lan bu deneylerden baz›lar› üreaz , lizin-ornitin dekarboksilaz etkinlikleri, hareket, sitrat› tek karbon kayna¤› olarak kullanma yetene¤i, Voges–Proskauer, metil k›rm›z›s› ve mannitol fermentasyonudur (3). Laboratuvar olanaklar›na göre KIA ve indol deneylerine ilave olarak bu testlerden dört yada befl tanesinin uygulanmas› kesin 263 Türk Mikrobiyol Cem Derg 32:260-264 tan›mlama için genellikle yeterli olmaktad›r. Biyokimyasal özellikleri ile Salmonella, Shigella yada E.coli olarak tan›mlanan bakteri türlerinin kesin tan›s› için biyokimyasal testlerin yan›s›ra serolojik deneylerle antijenik yap›lar›n›n incelenmesi de uygun olur (1). Salmonella sadece cins düzeyinde biyokimyasal olarak tan›mlan›r, serotip tayini ise anti O ve anti H serumlar› ile yap›l›r. Shigella için biyokimyasal yöntemlerle tür düzeyinde tan› yap›l›r, serotipleri ise grup ve tipe özgü polivalan Shigella antiserumlar› kullan›larak belirlenir. E. coli için gerekirse polivalan E. coli O antiserumlar› ile lam aglutinasyonu yap›larak serotiplendirme yap›lmal›d›r (14). Tablo 2’de KIA besiyerinden elde edilen verilerin yerine TSI agar besiyerinden elde edilen veriler de ayn› amaçla kullan›labilir. Tasarlanan tablonun s›k izole edilen enterik bakterilerin tan›mlanmas›nda genç mikrobiyologlara faydal› olaca¤›n› ummaktay›z. KAYNAKLAR 1.Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tan›, s385, 1.bask›, Bar›fl Yay›nlar› Fakülteler Kitapevi, ‹zmir (1992). 2.Farmer JJ lll: Enterobacteriaceae:Introduction and identification. ”Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC,Yolken RH (eds): Manual of Clinical Microbiology”, pp 442, 7th ed, ASM Press, Washington DC (1999). 3.Baron EJ, Finegold SM: Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, p 363, 8th ed, Mosby, St Louis, Misouri (1990). 4.Aksaray S, Güvener E: Yo¤un bak›m ünitelerinden izole edilen Gram olumsuz bakterilerin antibiyotik duyarl›l›¤›, 28. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 4-9 Ekim Özet Kita- 264 b›(1998). 5.Hoflo¤lu S, Ayaz C, Geyik MF, Köko¤lu ÖF, Demirel M: Aerobik bakteriemi etkenlerinin izolasyonunda BACTEC 9240 sisteminin de¤erlendirilmesi. ‹nfek Derg 13:85 (1999). 6.Özyurt M, Albay A, Y›ld›ran fiT, Baflustao¤lu A, Gün H: BacT/Alert otomatize kan kültür sistemi ile iki y›ll›k dönemde al›nan sonuçlar: Retrospektif bir çal›flma, ‹nfek Derg 12:323 (1998). 7.Köksal F, Samast› M: Kan kültürlerinden izole edilen enterik bakterilerin antibiyotiklere direnç durumlar›. 29. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, Program ve Özet Kitab› (2000). 8.Bozkurt H, Berktafl M, Güdücüo¤lu H, Kurto¤lu MG: Van yöresinde çocuk yafl grubu idrar kültürlerinin de¤erlendirilmesi. 10. Türk Mikrobiyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Kongresi Program Kitab› (2001). 9.Durmaz B, Tekereko¤lu MS, Tafltekin N, Otlu B: ‹nönü Üniversitesi Turgut Özal T›p Merkezi’nde BACTEC kan kültür sistemi ile al›nan sonuçlar›n de¤erlendirilmesi. ‹nfek Derg 14:397 (2000). 10. Durmaz Çetin B, Gündüz A, fiensoy A, Korkmaz F, Seber E: Hastane infeksiyonu etkeni Gram negatif çomaklarda genifllemifl spektrumlu beta-laktamaz üretimi ve antibiyotiklere duyarl›l›k özellikleri. Türk Mikrobiyol Cem Derg 31:41 (2001). 11.Köseo¤lu Ö, Öztoklu ‹, Tezcan S, Hasçelik G, Günalp A: Hacettepe Üniversitesi T›p Fakültesi Eriflkin Hastanesi kan kültürlerinin mikrobiyolojik ve klinik de¤erlendirilmesi: Tan›mlay›c›/metodolojik bir çal›flma. ‹nfek Derg 14:387 (2000). 12.Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC Jr: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, p105, 4th ed. J.B. Lippincott Company, Philadelphia (1992). 13.Brooks GF, Butel JS, Ornston LN: Jawetz, Melnick and Adelberg’s Medical Microbiology, p 212, 19th ed. Appleton and Lange, International Edition (1991). 14.Birsel Erdem: Enterobacteriaceae. “Ustaçelebi fi (ed): Temel ve Klinik Mikrobiyoloji” s472, Günefl Kitabevi, Ankara (1999).