Plastid Transformasyonu - AVES

Plastid Transformasyonu
Neşe AKÇAY
Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Fen Bilimleri Enstitüsü
İstanbul Üniversitesi
2011
Plastidler
• Yeşil kloroplastlar
• Kırmızı/portakal
rengi/sarı kromoplastlar
• Renksiz plastidler
– Amiloplastlar
– Elaioplastlar
Proplastid
Tüm plastidler
Plastid Genomu (ptDNA)
• Dairesel çift iplikli DNA
• Arabidopsisde,
– ~120 kloroplast
– ~154-kb 1,000-1,700 kopya
• Tütünde,
– ~100 kloroplast
– ~156-kb ~10,000 kopya
Plastid Genomu
• ptDNA’lar nükleoids (~10 kopya ptDNA’lık
küme) şeklinde membranlarda yer alırlar
• %5-10 oranında korunmuştur
• Semi-otonomdur
• Tetrapartite özellik gösterir
– Büyük ve küçük kopya bölgeleri (LSC ve SSC)
– 2 adet tekrar dizisi (IRA ve IRB) içerir
Plastid Genom Yapısı
Plastid Genomu
• Protein Sentez Genleri
– rRNA’ları
– tRNA’ları
– RNA polimeraz alt birimlerini
– Ribozomal proteinleri kodlar
• Fotosentez İlişkili Genler
– Enzimatik protein komplekslerinin alt birimlerini
– Fotosentezle ilişkili diğer alt birimleri kodlar
• Diğer Genler
Plastid Genomu
• Plastid genlerinin transkripsiyonu 3 farklı RNA
polimaraz tarafından gerçekleştirilir:
– RPOTp
NEP, subselüler lolazisyona
– RPOTmp
sahipler ve monomeriklerdir
– PEP, çok alt birimlidir
Plastid Translasyonu
• Öbakteriler ile benzer özellikler taşı:
– Başlatma faktörleri
– rRNA’lar
– tRNA’lar
– 70S-tip ribozom
– Düzenlenmesi ise mRNA’nın ve nüklear kodlu
translasyon faktörlerinin 5-UTR’deki dizilerin
etkileşimiyle başlatıcı faz tarafından kontrol edilir.
Plastid Transformasyonu
Plastid Transformasyonu
• Plastid dizileri gen insersiyon alanları olarak
kullanılmıştır:
– trnV-3ı/rps12
– trnI/trnA
– trnM/trnG
IR’lerde yer alırlar
LSC’de yer alır
Plastid Transformasyonu
• Vektörlerde Kullanılan Seçici Ajanlar
– neo ve aphA-6 genleri kanamisin’e
– Kimerik aadA geni spektinomisin ve streptomisin’e
– asa2 geni 4-methylindole and 7-methyl-DLtryptophan’a
– cat gen chloramphenicol
Plastid Transformasyonu
• Yabancı DNA’nın katılımı vektörün hedef
bölgesi ile ptDNA arasındaki homolog
rekombinasyona dayanır.
• Transformasyon vektörü E. coli plastidlerde
replike olmaz!!! Bu da homolog
rekombinasyonla plastid genomuna katılırsa
bu gen stabil olarak anlatılacaktır.
Plastid Transformasyonu
• Transform olmuş DNA Polietilen Glikol (PEG)
uygulamasıyla mikroskobik (0,4-1,0 µm) altın
ya da tungten taneciklerinin yüzeyinde
tanıtılacaktır.
• Biyolistik DNA yollanması intak dokularda ki
plastidler hedeflendiğinde kullanılır, PEG
uygulaması protoplastlara DNA tanıtımında
kullanılır
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Terapötik
Proteinler ve Antibiyotikler için
Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Topikal ve sistemik tedavilerde kullanılan yeni
nesil antibiyotiklerin düşük maliyetli
üretilmesinde plastomik bitkiler yeni bir
strateji olarak görülüyor.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Transplastomik tütün bitkilerinde
Thermonifida fusca’dan endoglukanazın ve
Acidothermus celluloyticus’un endo-ᵦ-1,4glucanaz E1 katalitik domainin expresyonu
örnektir.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Transplastomik bitkilerde Thermonifida fusca
bakterisinden hücre duvarını degrade eden
dört enzim setini üretmiştir.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Verma ve ark. (2010) bakteri ve funguslardan
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Endoglukanaz
Ekzoglukanaz
Pektat lizaz
Kutinaz
Swollenin
Ksilanaz
Beta glusosidaz
Lipaz
Asetil ksilen esteraz enzimlerinin anlatımı için plastid
transformasyonu kullanılmıştır ve lignoselülozis biyomasından
fermante edilebilir şekerlerin üretimi için bitki türevli enzim
koktaillerini test etmiştir.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Kim ve ark. (2011) odunsu biyofuel
ürünlerinde hemiselülozun temel bileşenleri
olan ve şekeri fermente edebilen
metilglukuronoksilanın dönüşümünü
maksimuma çıkarmak için tütün
klroplastlarında Thermotoga maritima’dan
alınan GH10 ksilanaz Xyl10B’yi esprese
etmiştir.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
• Krichevsky ve ark. (2010) prokaryotların tam
fonksiyonel bakterial lusiferaz yolunun bitki
plastidlerinde yeniden kurulabildiğini
kanıtlamamıştır.
• Transgenik tütün kloroplastlarında lux
operonunun (luxCDABEG) altı geninin
expresyonu gözle görülebilir ışığı yayabilen ilk
otolüminesent bitkileri üretmişlerdir.
Plastid Transformasyonunun Enzim ve
Diğer Proteinler İçin Uygulamaları
Kaynakça
•
•
•
•
•
•
•
A. Verhounig, D. Karcher, and R. Bock (2010) Inducible gene expression from
the plastid genome by a synthetic riboswitch. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol: 107,
pp: 6204-6209.
Bock R., (2007b). Structure, function, and inheritance of plastid genomes. Top
Curr Genet. 19:29–63.
Boyhan D, Daniell H., (2011). Low-cost production of proinsulin in tobacco and
lettuce chloroplasts for injectable or oral delivery of functional insulin and Cpeptide. Plant Biotechnol J.;9:585–98.
Maliga, P., and Bock, R. (2011). Plastid biotechnology: Food, fuel, and
medicine for the 21st century. Plant Physiol. 155: 1501–1510.
Maliga, P., (2003). Progress towards commercialization of plastid
transformation technology. Trends in Biotechnology , 21, 20-28.
N, Scotti et al., (2011). Production of foreign proteins using plastid
transformation. Biotechnology Advances
Obembe, O.O. et al., (2010). Recent advances in plastid transformasyonu.
Journal science and Technology