Plastid Transformasyonu - AVES
advertisement
Plastid Transformasyonu Neşe AKÇAY Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi 2011 Plastidler • Yeşil kloroplastlar • Kırmızı/portakal rengi/sarı kromoplastlar • Renksiz plastidler – Amiloplastlar – Elaioplastlar Proplastid Tüm plastidler Plastid Genomu (ptDNA) • Dairesel çift iplikli DNA • Arabidopsisde, – ~120 kloroplast – ~154-kb 1,000-1,700 kopya • Tütünde, – ~100 kloroplast – ~156-kb ~10,000 kopya Plastid Genomu • ptDNA’lar nükleoids (~10 kopya ptDNA’lık küme) şeklinde membranlarda yer alırlar • %5-10 oranında korunmuştur • Semi-otonomdur • Tetrapartite özellik gösterir – Büyük ve küçük kopya bölgeleri (LSC ve SSC) – 2 adet tekrar dizisi (IRA ve IRB) içerir Plastid Genom Yapısı Plastid Genomu • Protein Sentez Genleri – rRNA’ları – tRNA’ları – RNA polimeraz alt birimlerini – Ribozomal proteinleri kodlar • Fotosentez İlişkili Genler – Enzimatik protein komplekslerinin alt birimlerini – Fotosentezle ilişkili diğer alt birimleri kodlar • Diğer Genler Plastid Genomu • Plastid genlerinin transkripsiyonu 3 farklı RNA polimaraz tarafından gerçekleştirilir: – RPOTp NEP, subselüler lolazisyona – RPOTmp sahipler ve monomeriklerdir – PEP, çok alt birimlidir Plastid Translasyonu • Öbakteriler ile benzer özellikler taşı: – Başlatma faktörleri – rRNA’lar – tRNA’lar – 70S-tip ribozom – Düzenlenmesi ise mRNA’nın ve nüklear kodlu translasyon faktörlerinin 5-UTR’deki dizilerin etkileşimiyle başlatıcı faz tarafından kontrol edilir. Plastid Transformasyonu Plastid Transformasyonu • Plastid dizileri gen insersiyon alanları olarak kullanılmıştır: – trnV-3ı/rps12 – trnI/trnA – trnM/trnG IR’lerde yer alırlar LSC’de yer alır Plastid Transformasyonu • Vektörlerde Kullanılan Seçici Ajanlar – neo ve aphA-6 genleri kanamisin’e – Kimerik aadA geni spektinomisin ve streptomisin’e – asa2 geni 4-methylindole and 7-methyl-DLtryptophan’a – cat gen chloramphenicol Plastid Transformasyonu • Yabancı DNA’nın katılımı vektörün hedef bölgesi ile ptDNA arasındaki homolog rekombinasyona dayanır. • Transformasyon vektörü E. coli plastidlerde replike olmaz!!! Bu da homolog rekombinasyonla plastid genomuna katılırsa bu gen stabil olarak anlatılacaktır. Plastid Transformasyonu • Transform olmuş DNA Polietilen Glikol (PEG) uygulamasıyla mikroskobik (0,4-1,0 µm) altın ya da tungten taneciklerinin yüzeyinde tanıtılacaktır. • Biyolistik DNA yollanması intak dokularda ki plastidler hedeflendiğinde kullanılır, PEG uygulaması protoplastlara DNA tanıtımında kullanılır Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Terapötik Proteinler ve Antibiyotikler için Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Topikal ve sistemik tedavilerde kullanılan yeni nesil antibiyotiklerin düşük maliyetli üretilmesinde plastomik bitkiler yeni bir strateji olarak görülüyor. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Transplastomik tütün bitkilerinde Thermonifida fusca’dan endoglukanazın ve Acidothermus celluloyticus’un endo-ᵦ-1,4glucanaz E1 katalitik domainin expresyonu örnektir. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Transplastomik bitkilerde Thermonifida fusca bakterisinden hücre duvarını degrade eden dört enzim setini üretmiştir. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Verma ve ark. (2010) bakteri ve funguslardan – – – – – – – – – Endoglukanaz Ekzoglukanaz Pektat lizaz Kutinaz Swollenin Ksilanaz Beta glusosidaz Lipaz Asetil ksilen esteraz enzimlerinin anlatımı için plastid transformasyonu kullanılmıştır ve lignoselülozis biyomasından fermante edilebilir şekerlerin üretimi için bitki türevli enzim koktaillerini test etmiştir. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Kim ve ark. (2011) odunsu biyofuel ürünlerinde hemiselülozun temel bileşenleri olan ve şekeri fermente edebilen metilglukuronoksilanın dönüşümünü maksimuma çıkarmak için tütün klroplastlarında Thermotoga maritima’dan alınan GH10 ksilanaz Xyl10B’yi esprese etmiştir. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları • Krichevsky ve ark. (2010) prokaryotların tam fonksiyonel bakterial lusiferaz yolunun bitki plastidlerinde yeniden kurulabildiğini kanıtlamamıştır. • Transgenik tütün kloroplastlarında lux operonunun (luxCDABEG) altı geninin expresyonu gözle görülebilir ışığı yayabilen ilk otolüminesent bitkileri üretmişlerdir. Plastid Transformasyonunun Enzim ve Diğer Proteinler İçin Uygulamaları Kaynakça • • • • • • • A. Verhounig, D. Karcher, and R. Bock (2010) Inducible gene expression from the plastid genome by a synthetic riboswitch. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol: 107, pp: 6204-6209. Bock R., (2007b). Structure, function, and inheritance of plastid genomes. Top Curr Genet. 19:29–63. Boyhan D, Daniell H., (2011). Low-cost production of proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectable or oral delivery of functional insulin and Cpeptide. Plant Biotechnol J.;9:585–98. Maliga, P., and Bock, R. (2011). Plastid biotechnology: Food, fuel, and medicine for the 21st century. Plant Physiol. 155: 1501–1510. Maliga, P., (2003). Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends in Biotechnology , 21, 20-28. N, Scotti et al., (2011). Production of foreign proteins using plastid transformation. Biotechnology Advances Obembe, O.O. et al., (2010). Recent advances in plastid transformasyonu. Journal science and Technology