In-vitro Araştirma için – Diagnostik Ürünlerde kullanım için değil

SAKLAMA VE STABİLİTE
ALTERNATİF PATHWAY HEMOLİTİK
KOMPLEMAN KIT
Açılmamış kitler 2-8ºC de saklanmalıdır ve kit kutusunun etiketinde gösterilen
son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. DONDURMAYIN. Alternatif pathway
hemolitik kompleman plaklar tavuk eritrositlerinin yaşamıyla sınırlı raf ömrüne
sahiptir ve mümkün olan her yerde soğutulmuş tutulmalıdır. Agaroz jel dondurma
ile yıkılır, bu nedenle plakları buzdolaplarında soğutucu elementlerden uzak
tutun. Açılmamış plaklar kuyularda biriken yoğunlaşmayı önlemek için düz ve
başaşağı saklanmalıdır (torba etiketi üstte). Jelin zarar görmesini önlemek için
plaklar dikkatli kullanılmalıdır.
In-vitro Araştirma için –
Diagnostik Ürünlerde kullanım için değil
Ürün Kodu: RC003.1/3
Üretici:
The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK.
www.bindingsite.co.uk
Telefon: +44 (0)121 456 9500
Fax: +44 (0)121 456 9749
e-mail: [email protected]
1
KULLANIM AMACI
Bu kit insan serumunda alternatif pathway tarafından hemolitik kompleman
aktivitesinin ölçümesi için amaçlanır.
ÖRNEK TOPLAMA VE HAZIRLAMA
Toplandıktan sonra mümkün olduğu kadar çabuk buz üzerinde pıhtılaşmış
taze serum örnekleri kullanın. Örneklerin saklanması aliquot ve dondurma
gerektirir, tercihen -70C de.
8
2
ÖZET VE AÇIKLAMA
Alternatif kompleman pathway hücre membranlarının parçalanmasına ve sonuç
olarak hücre ölümüne yol açan 8 protein içeren reaksiyonlar kademesidir.
Sürekli C3 ün düşük seviye hidrolizi tarafından oluşan C3b molekülleri hücre
yüzeylerine bağlanır ve mikrobiyel polisakkaritlerin varlığı tarafından stabilize
edilir. Bu Faktör B nin bağlanmasına ve Factor D ve Properdin hareketi ile sonraki
C5 konvertaz oluşumuna olanak sağlar. C5 aktivasyonu üzerine ( C5b gibi) C6,
7, 8 ve C9 un birkaç molekülünü bağlar, membran attack kompleks (MAC) olarak
bilinen büyük bir kompleks oluşturur. Bu kompleks hücre ölümüne yol açarak
hücre membranlarını bozar.
Azalan alternatif pathway aktivitesi her bir bileşenin, kalıtsal veya edinilen,
herhangi birisinin eksikliği tarafından kaynaklanabilir.
3
PRENSİP
METODOLOJİ
(Tüm prosedürün özeti bu kullanım kitapçığın sonunda verilir.)
8.1
Bir kez sulandırıldığında, kalibratörler ve kontroller hemen kullanılmalıdır.
Sulandırılan materyalin saklanması gerekiyorsa, ör. part-used plaklar ile
kullanım için, aliquotlar dondurulmalıdır, tercihen -70C de.
8.1.1
8.1.2
8.1.3
8.1.4
8.1.5
8.1.6
8.2
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.3
Sağlanan materyaller:
1 x Folyo torbada alternatif pathway hemolitik kompleman plak (3
plak kit içinde 3)
2 x Plak başına jel bölümleme blades (3 plak kit içinde 8)
1 x Liyofilize kalibratör (3 plak kit içinde 3)
1 x Liyofilize kontrol (3 plak kit içinde 3)
1 x Kullanım kitapçığı
Semi-log grafik kağıdı
Gerekli ama sağlanmayan materyaller:
Test örneklerinin toplanması ve hazırlanması için ekipman ör. örnek
tüpleri, santrifüj vs.
Kalibratörler ve kontrolün doğru sulandırılması ve kalibratörün dilüsyonu
için pipetler
Örnek uygulaması için mikropipetler. Bu tam olarak 5μL hacim dağıtma
kapasitesine sahip olmalıdır. Binding Site Mikropipetler (kod AD041)
veya ‘Hamilton’ şırıngalar önerilir.
Parçalanma bölgesinin çapını 0.1mm ye büyütmek ve doğru şekilde
ölçmek için Jeweller’s Mercek (Kod AD040)
Reaktif Hazırlama
8.3.1
Bu metod, tavuk eritrositleri içeren bir agaroz jel ile silindirik bir kuyudan 2-6-C de
radyal olarak yayılan aktif kompleman bileşenleri içeren serum içerir. Bu yayılma
süresi esnasında C3b molekülleri C5 konvertazın oluşumuna olanak sağlayarak
membran yüzeylerine bağlanır. 37C de inkübe edildiğinde kompleman kademesi
devam eder, tavuk eritrositlerinin parçalanmasına yol açar, açık bir bölgede ortaya
çıkar, boyutu serumdaki alternatif pathway kompleman aktivitesine bağlıdır.
Bilinen alternatif pathway kompleman aktivitesi serumlarının sayısıyla oluşturulan
parçalanma bölgelerinin ölçülmesiyle bir kalibrasyon eğrisi semi-log grafik kağıdı
üzerinde alternatif pathway kompleman aktivitesine (% normal) karşı bölge
çapları (in mm) işaretlenerek oluşturulabilir. Bilinmeyen örnekteki kompleman
aktivitesi sonra parçalanma bölgesi ölçülerek belirlenebilir ve kalibrasyon eğrisi
okunabilir.
4
4.1
REAKTİFLER
Alternatif Pathway Hemolitik Kompleman Plakları (tekrar kapanabilir folyo
torbalara sağlanan). Tavuk eritrositleri içerir. On dört örneğe kadar plak
başına çalışılabilir (kalibratörler ve kontroller dahil).
Koruyucular sodyum azid içerir.
4.2
Kalibratörler. Liyofilize sağlanırlar. Şişe etiketinde verilen kompleman
aktivitesi normal yüzdede ifade edilir.
4.3
Kontroller. Liyofilize sağlanırlar. Beklenen alternatif pathway kompleman
aktivitesi şişe etiketinde verilir.
DİKKAT
Bu kitte sağlanan insan materyallerinin tüm donörleri serum/plazma test
edilmiştir ve hepatit B yüzey antijeni (HBsAg),hepatit C ve insan
immunodeficiency virus (HIV) antikoru için negatif bulunmuştur. Ancak bu testler
bulaşıcı maddelerin yokluğunu garanti edemez. Uygun kullanım ve atma
yöntemleri tüm potensiyel olarak bulaşıcı materyaller için olduğu gibi
belirlenmelidir ve sadece bu tip yöntemlerde yeterli eğitim almış personel bu
prosedürleri gerçekleştirmek için izinli olmalıdır.
APHC Plak Hazırlama
Jelin kontaminasyonunu önlemek için, plaklar dust-free ortamda kullanılmalıdır.
Folyo torbadan plağı alın ve kapağı çıkartın. Yoğunlaşma görülüyorsa plak jel
üzerine düşen damlacıkların önlenmesi için kapak çıkarılana kadar baş aşağı
tutulmalıdır. Plağı saklama ve taşımada zarar oluşmadığından emin olmak için
kontrol edin, ör. jelde bölünmeler. Kuyularda herhangi yoğunlaşmaya veya jel
yüzeyinde buharlaşmaya olanak sağlamak için plağı oda sıcaklığında 10-15
dakika (veya gerekirse daha uzun) açık bırakın. Örnekler hala nemin görünür
olduğu kuyular için asla uygulanmamalıdır.-
Plak bölümleme: Plaklar sağlanan jel bölücüler kullanılarak dört kısıma kadar
bölümlenebilir. Her bölücü kenarı aşağı doğru keserek, merkezi plak etiketine
dayanan stabilize edici kol ile jel üstünde dikkatli konumlandırılmalıdır. Jeli
kesmek için kol üstüne sıkıca bastırın ve poziyonda bırakın. Plak konumlandırma
başlangıç olarak plağın sadece bir kısmı kullanılacaksa önerilir. İlk kullanımdan
sonra, bölümlenen plaklar folyo torbalarında tekrar kapatılmalıdır ve yerinde
hücre bölücüler ile 2-8ºC saklanmalıdır. Bölümlenmiş plakları sağ tarafı yukarı
şekilde saklayın.
8.3.2
Kalibratör Hazırlama
Liyofilize kalibratörler şişe etiketlerinde belirtilen hacim kullanılarak 2-8C ye
önceden soğutulmuş distile su ile sulandırılmalıdır. Kullanımdan önce, şişedeki
tüm materyal, tıpaya yapışmış herhangi bir şey dahil, ters çevirme ile tamamen
çözülmelidir. 100L fizyoloıjik saline ile 100L kalibratör karıştırılarak 4C ye
önceden soğutulmuş 1/2 dilüsyon ve 100L kalibratör ve 300L önceden
soğutulmuş saline karıştırılarak
1/4 dilüsyon hazırlayın.
Kalibratör ve
dilüsyonları kompleman bileşenlerinin bütünlüğünü korumak için hazırlama
esnasında mümkün olduğu kadar soğuk tutulmalıdır.
8.3.3
Kontrol Hazırlama
Liyofilize kontrol serumu şişe etiketinde belirtilen hacim kullanılarak 2-8C ye
önceden soğutulmuş distile su ile sulandırılmalıdır. İçerikler tamamen
çözülünceye kadar ters çevirme ile hafifçe karıştırılmalıdır.
8.3.4
Örnek Hazırlama
Örnekler neat uygulanmalıdır. Ancak dilüsyon gerekiyorsa 2-8C ye önceden
soğutulmuş fizyolojik saline kullanın.
Plaklar koruyucu olarak sodyum azid içerir. Bu nedenle kullanımda ve atmada
her zamanki önlemler dikkate alınmalıdır.
Insert Code: RIN119, Version: 13th October 2011, Page 1 of 2
5.
8.4
Kalibratörler, Kontroller ve Örneklerin Uygulanması
Kalibratörler, kontrol ve test örnekleri kullanımdan hemen önce hafifçe
karıştırılmalıdır. Üç kalibratör dilüsyonunun her birinden 5L üç ayrı kuyuya
pipetlenmelidir. Kalan kuyular sonra gerektiği gibi örnekler ve kontrolün 5L
aliquot ile doldurulmalıdır. Plaklar jelin aşırı kurumasına sabep olacağından
kalibratör/ örnek uygulaması esnasında uzun süreler için açık bırakılmamalıdır.
Örnek uygulamasından sonra en kısa sürede, bu plaklar örnekler, kalibratörler ve
kontrolün degradasyonunu önlemek için 2-8C de yerleştirilmelidir.
8.5
Kapağı değiştirin ve 2 - 6C de 6 ve 18 saat arasında oluşması için
yayılmaya izin verin
6.
7.
8.
Minimum 120 dk 37C de inkübe edin.
Parçalanma bölgelerini ölçün.
Kalibrasyon eğrisi işaretleyin ve sonuçları okuyun.
Yayılma
Bu alternatif pathway hemolitik kompleman plaklar aynı gün ya da bir gece
boyunca test yapmak için kullanılabilir. Aynı gün testi için örneklerin lytic bölge
çaplarının yeterli ayrılmasını sağlamak için en az 6 saat 2-6C de yayılmasına
olanak sağlanmalıdır.
Gece boyu testi yapmak için kullanıldığında, yayılma 18 saate kadar yapılabilir.
Her iki test için bu yayılma aşaması 2-6C de yapılmaldır ancak geceboyu testi
için, daha kırılgan kompleman bileşenlerinin degradasyonunu önlemek için
sıcaklığın mümkün olduğunca 4C ye yakın tutulması özellikle önemlidir. Bu
parçalanmanın son bölgelerinin iyi belirlenmiş sınırlarla net olmasını sağlar.
Yayılma süresince inkübasyon sıcaklıkları >6ºC tam parçalanmayı
önleyebilir.
8.6
İnkübasyon
Gerekli yayılma süresini takiben plaklar minimum 120 dk 37C de inkübe
edilmelidir. Jelin kurumaması önemlidir ve bunu minimize etmek için folyo
torbalarında yeniden kapatın veya nemli bir kutuda saklayın (nemli kağıt mendil
içeren kapalı plastik kutu).
8.7
Kalite Kontrol
Kontrol, sulandırmayı izleyen, tam olarak bir test örneği gibi işlenmelidir. Kontrol
için elde edilen değerler şişe etiketinde belirtilen değerin %20 içinde olmalıdır.
HALKA ÖLÇÜMÜ VE SONUÇ İŞLEME
İnkübasyon sonrası parçalanma bölgelerinin çapları jewellers’ mercek veya bir
RID plak okuyucu kullanılarak 0.1mm ye en yakın ölçülmelidir.
Sağlanan semi-log grafik kağıdı kullanılarak log x axis üzerinde ilgili aktivitelerine
karşı (% normal içinde) lineer y axis üzerinde üç kalibratör dilüsyonu için elde
edilen çaplar (in mm) işaretlenerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bu eğriden,
birlikte noktaların katılmasıyla oluşan ve best fit çizgi olmayan, örnekler ve
kontrol için değerler okunabilir.
10
PROSEDÜR SINIRLAMALARI
10.1
Neat kalibratörden daha büyük parçalanma bölgeleri veren örnekler için
elde edilen sonuçlar sadece yaklaşık olarak düşünülmelidir ama alternatif
pathway kompleman aktivitesi normal düşünülebilir. İstenirse örnekler
saline içinde seyreltilebilir ve tekrar test edilebilir.
10.2
İki veya daha fazla plak aynı anda kullanılacaksa her plak için ayrı bir
kalibrasyon eğrisi oluşturulmalıdır.
10.3
Kısmi Kullanılmış Plakların Yeniden Kullanımı
Kısmi kullanılmış plakların kullanılmamış kuyuları plağın bozulma belirtisi
göstermemesi şartıyla daha fazla örneğin testi için kullanılabilir. Her
kullanım için yeni bir kalibrasyon eğrisi gerekir.
Önceden kullanılmış kuyuların etrafındaki parçalanma bölgeleri 37C de
daha fazla inkübasyon nedeniyle büyüyebilir. Bu bozulma olarak
düşünülmemelidir ve plağın performansını etkilemez.
10.4
Kalibratörler ve kontroller taze örneklerden daha zayıf halka kalitesi
verebilir. Bu testin doğruluğunu etkilemez.
10.5
Sorun Giderme
Sorun
Olası Sebepler
Önerilen Eylemler
Kullanımdan önce temiz
bölgeler
Kötü saklama/taşıma
Saklama/taşımayı yeniden inceleyin
Kitlerin süresi bitmiş
Kit kutu etiketini kontrol edin
11
PROSEDÜR ÖZETİ
1.
Kalibratör ve kontrolü 2-8C ye önceden soğutulmuş distile su ile sulandırın.
2.
Soğuk saline solüsyonu kullanılarak kalibratörün 1/2 ve 1/4 dilüsyonlarını hazırlayın.
3.
Plaklardan buharlaşma için yoğunlaşmaya izin verin.
4.
Kalibratör, kalibratör dilüsyonları, kontrol ve örnekleri plağa 5L hacimde
uygulayın.
Insert Code: RIN119, Version: 13th October 2011, Page 2 of 2