Materials and Methods
advertisement
TÜBİTAK PROJESİ Kırkağaç 637 Kavun Çeşidine Kabak Sarılık Mozayik Virüsü Kılıf Protein Geninin Aktarılması ve Transgenik Kavun Bitkilerinin Elde Edilmesi Yeşim YALÇIN-MENDİ 2004 İÇİNDEKİLER 1-Giriş 7 2-Materyal ve Metod 12 2.1.Materyal 12 2.2.Metod 12 2.2.1.Rejenerasyon Denemeleri ve Histolojik Analizler 12 2.2.1.1. Kırkağaç ve Ananas Çeşitlerinde Rejenerasyon 12 2.2.1.2. Kırkağaç 637 Kavun Çeşidinde Rejenerasyonun Anotomik ve Morfolojik Yapısının İncelenmesi 14 2.2.1.3. Hasanbey ve Ç.Ü.MA2 Kavun Çeşitlerinde Rejenerasyon 14 2.2.1.4. Ananas Kavun Çeşidinde Histolojik Analizler 15 2.2.2. Transformasyon Denemeleri 15 2.2.2.1. Tohumların Sterilizasyonu 16 2.2.2.2. Agrobacterium Bakterisinin Hazırlanması 16 2.2.2.3. Transformasyon ve Rejenerasyon 16 2.2.2.4. Eksplantların Seleksiyon Ortamına Aktarılması (M2) 17 2.2.2.5. Eksplantların İkinci Seleksiyon Ortamına Aktarılması (M3) 18 2.2.2.6. Sürgün Geliştirme ve Köklendirme Ortamlarına Aktarılması 18 2.2.2.7. ELISA Testi 19 2.2.2.8. DNA İzolasyonu 19 2.2.2.9. PCR Testi 19 3-Sonuçlar 20 3.1. Rejenerasyon Denemeleri ve Histolojik Analiz Sonuçları 20 3.2. Transformasyon Denemesi Sonuçları 28 3.2.1. Farklı Tohum Yaşı ve Eksplant Tiplerinin Rejenerasyon Üzerine Etkileri ve Transformasyon 4-Kaynaklar 28 52 2 ÇİZELGE LİSTESİ Çizelge 1. NA8 rejenerasyon ortamının içeriği 13 Çizelge 2. NB00101 sürgün geliştirme ortamının içeriği 13 Çizelge 3. Transformantlarda PCR analizi sonucunda ZYMV CP (1000baz çift) geninin X2 analizi 33 3 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1. Eksplantların Agrobacterium ile İnoküle Edilmesi 16 Şekil.2. MR Ortamı Üzerindeki İnoküle Edilmiş Eksplantlar 17 Şekil. 3. İlk Seleksiyon Ortamı Üzerindeki Eksplantlar (MR+ timentin) 17 Şekil.4. İkinci Seleksiyon Ortamı Üzerindeki Eksplantlar (MR+ timentin+kanamysin)18 Şekil.5. Sürgün Geliştirme Ortamındaki Eksplantlar 18 Şekil.6. Köklendirme Ortamındaki Eksplantlar 19 Şekil 7. Ananas kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 1. (A), 2.(B), 6. (C),12. (D), günlerden sonraki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 21 Şekil.8. Kırkağaç 637 kavun çeşidinin 5 (A),8 (B),10 (C),12 (D),14 (E) günlük kotiledonlarının rejenerasyon durumları 22 Şekil 9. Kırkağaç 637 kavun çeşidinde gerçek büyüme ucunun görüntüsü (A). NA8 rejenerasyon ortamına konulan 4 (B), 4 (C), 6 (D), 10 (E), 12 (F),14 (G) günlük kotiledon eksplantlarının hücresel düzeydeki görünümü . (C: Kotiledon; UE : üst meristem; SP: sünger parankiması; PP; palisat parankiması; AE: alt epidermis; MB: meristematik bölge;SP:sürgün primordiyumu). 23 Şekil 10. Hasanbey kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 3.(A), 6.(B), 9. (C),12.(D), 15.(E) günlerdeki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 25 Şekil 11. ÇÜ.MA2 kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 0.(A), 3.(B), 6. (C), 9.(D), 11.(E), 14.(F), 17.(G), 20. (H) günlerdeki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 26 Şekil 12. Ananas kavun çeşidinde NA8 rejenerasyon ortamına konulan 3 (A1, A2), 6 (B1, B2), 9 (C1, C2), 12 (D1, D2), 15 (E1, E2) günlük kotiledon eksplantlarının hücresel düzeydeki görünümü . (PP; palisat parankiması; SP: sünger parankiması; MB: meristematik bölge) 27 Şekil 13. 1. ELISA (NPT II) Testi Sonuçları (Mavi renk: Pozitif, Siyah renk:Negatif) 29 Şekil 14. 2. ELISA (NPT II) Testi Sonuçları (Mavi renk: Pozitif, Siyah renk:Negatif) 29 Şekil 15. İzole Edilmiş Olan DNA’ların Jel Elektroforesisdeki Görünümü 30 Şekil 16. PCR Yapılan 2 Farklı DNA’da ZYMV Kılıf Protein Genini Kodlayan Yaklaşık 1000 Baz Çiftlik Bandın Görünümü 30 Şekil 17. PCR Reaksiyonu Sonucunda ZYMV Kılıf Protein Genini Kodlayan Yaklaşık 1000 Baz Çiftlik Bandın Görünümü 31 4 Şekil 18. Doku Kültüründen Çıkarılan Bitkilerin Plastik Poşetler İçerisinde Adaptasyonlarının Sağlanması 34 Şekil 19. Bitkiciklerin 1 / 1 Oranında Torf ve Perlit İçeren Saksılara Aktarılması 34 Şekil 20. Bitkiciklerin Küçük Saksılardan Büyük Saksılara Aktarılması 35 Şekil 21. Büyük Saksılarda Gelişen Bitkilerin İpe Alınması 36 Şekil 21’in devamı..Büyük Saksılarda Gelişen Bitkilerin İpe Alınması 37 Şekil 22. Bitkicikler Üzerinde İlk Olarak Gelişen Erkek Çiçeklerin Görünümü 38 Şekil 23. Sera’ya Aktarılan Bitkiciklerin Görünümü 39 Şekil 24. Dişi ve Erkek Çiçeklerin Bir Gün Önceden Maşa ile Kapatılarak Kendileme İçin Hazırlanması 40 Şekil 25. Erkek ve Dişi Çiçeklerin Görünümü 41 Şekil 26. Klon 20’de Dişi Çiçeklerin Ana Gövdeden Erkek Çiçeklerin ise Yan Dallardan Geliyor Olması 42 Şekil 27. Serada Gelişen Bitkilerin Görünümü 42 Şekil 28. Dişi ve Erkek Çiçeklerin Gelişim Durumları 43 Şekil 29. Klon 4 Bitkisinin ve Meyvesinin Görünümü 44 Şekil 30. Klon 20’nin Bitki ve Meyvesinin Morfolojik Görünümü 45 Şekil 31. Birgün Önce Kapatılan Dişi ve Erkek Çiçeklerin Bir Gün Sonra Kendilenmesi 45 Şekil 32. Kendileme Sonucunda Elde Edilmiş Meyvenin Görünümü 46 Şekil 33. Klon 4 ve 20’nin Gelişmiş Olan Meyvelerinden Görünüm 47 Şekil 34. Çiçekte ve Meyvede Rastlanan Şekil Bozuklukları 48 Şekil 35. Klon 4’ün Meyvesinin Görünümü 49 Şekil 36. Klon 4 ve 20’nin Meyvelerinin Görünümü 50 Şekil 37. Klon 4 ve 20’de Elde Edilmiş Olan Tohumların Çimlendirildikten Sonra Virüs İnokülasyonlarının Yapılması 51 5 ÖZET Türkiye’de ekonomik önemi olan Kırkağaç, Ananas, Hasanbey ve ÇÜ.MA2 kavun çeşitlerinde bitki rejenerasyonu ve gen transferi koşulları optimize edilmiştir. Agrobacterium tumefaciens yoluyla Kırkagac 637 kavun çeşidine, Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMV; Zucchini Yellow Mosaic Virus) kılıf protein geni aktarılarak dayanıklı kavun hatları elde edilmiştir. Transformasyon sonucunda elde edilen bitkilerde ELISA testi ve PCR analizi yapılmış ve transgenik olduğu varsayılan bitkicikler belirlenmiştir. Dört transformant (20.1, 20.2, 4.1, 4.2) kendine tozlanarak yeni generasyonlar (F2) elde edilmiştir. F2 generasyonundaki bitkiciklerde PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiş ve ZYMV kılıf protein genini (1000 bp) içerip içermedikleri ve genin Mendel esaslarına göre alt generasyonlara geçişi incelenmiştir. Toplam 4 grubun açılım oranı X2 analiziyle test edildiğinde tahmini Mendel oranlarıyla uyumlu olduğu bulunmuştur. Her durumdaki P değeri P= % 5 önem düzeyinden büyük olarak saptanmıştır. 6 ABSTRACT Plant regeneration and transformation conditions were optimized for Kırkağaç, Ananas, Hasanbey and ÇU.MA2 melon varieties, important for Turkey. ZYMV coat protein gene was transferred into Kirkagac 637 melon variety using Agrobacterium tumefaciens and obtained resistant lines to ZYMV (ZYMV; Zucchini Yellow Mosaic Virus). ELISA test and PCR analysis were performed to determine transformants. Four transformants (20.1, 20.2, 4.1 and 4.2) were self pollinated to obtained new generation lines (F2). The plants from F2 generation lines were tested by PCR to observe ZYMV coat protein gene (1000 bp) and Mendel Segregation Ratio. Segregation of 4 transformants was tested by X2 analysis. It was found that the results were consistent with predicted Mendelian ratios as tested by X2 analysis. In each case the P values were much greater than the rejection level of P= % 5. 7 1-Giriş Türkiye’de 774.563 ha’lık alanda yaklaşık 19 milyon ton sebze üretimi yapılmaktadır. Bu üretimin yaklaşık %40’ını Cucurbitacea familyasına ait sebze türleri oluşturmakta ve kavun bu familya içerisinde üretim bakımından 1.8 milyon ton ile karpuzdan sonra ikinci sırayı almaktadır (Anonim 1999). Ülkemizde gerçekleştirilen bu üretimin %35’i Orta Anadolu Bölgesinde, %27’si Ege, %15’i Güneydoğu Anadolu, %7’si Akdeniz, %16’sı ise diğer bölgelerde üretilmektedir. Akdeniz bölgesinde kavun genel olarak alçak tüneller altında, serada veya açıkta erken ilkbahar döneminde yetiştirilirken; Ege, Orta Anadolu, Marmara ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde ise çoğunlukla açıkta ve yaz aylarında yetiştirilmektedir. Diğer bitki türlerinde olduğu gibi kabakgil familyası sebzelerinin üretimini sınırlandıran en önemli faktörlerin başında hastalıklar ve zararlılar gelmektedir. Hastalık ve zararlılar, birim alandan alınan verimin azalmasına, bazı çeşitlerimizin kaybolma tehlikesi ile karşı karşıya kalmasına ve ürün ve kalitenin kaybolmasına neden olmaktadır. Bunlar içerisinde de doğrudan mücadelesi olmadığı için virüs hastalıkları önemli bir yere sahip olmaktadır. Virüs hastalıklarının şiddeti yıldan yıla, virüs, konukçu vektör ve çevre faktörlerinin bireysel veya kompleks etkisine göre değişebilmektedir. Kavun türünde etkili olan çok sayıda virüs hastalığı bulunmakla birlikte, Türkiye’de bunlardan en yaygın olarak bulunanlarının ZYMV ve CMV (Yılmaz ve Davis, 1984, Yılmaz ve ark., 1992) olduğu tespit edilmiştir. Türkiye’de yaygın olarak yetiştirilen bazı kavun genotipleriyle yapılan çalışmalarda, denemede yer alan tüm çeşitlerin ZYMV’ye hassas oldukları; bu hassasiyetin özellikle Yuva ve Hasanbey’de ölümlerle sonuçlandığı saptanmıştır (Sarı ve ark., 1994). Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMV; Zucchini Yellow Mosaic Virus), yapraklarda belirli mozayikler oluşturan, yaprak kenarlarının dişli bir yapı almasına neden olan, yaprakta kloklar, sararma, deformasyonlar, damar açılmaları, boğum aralarının kısalması ile çeşide ve patotiplere göre öldürücü simptomlara da neden olabilen bir virüsdür; yaprak biti (Aphis gossypii ve Myzus persicae) ile taşınır. Hastalığa karşı değişik kabakgil türlerinde dayanıklılık özelliği bulunmaktadır. Kavun türünde de C. melo’ya giren PI414723 materyalinde ZYMV’ye dayanıklılık ve bu dayanıklılığın tek bir genle idare edildiği saptanmıştır (Pitrat ve Lecoq, 1984). 8 Virüs hastalıkları dışındaki hastalık ve zararlılarla mücadelede kimyasal preparatlar kullanılarak kayıplar bir miktar azaltılabilmektedir. Ancak hastalık etmenlerinin kimyasal maddelere dayanıklı ırklar (suşlar) geliştirmeleri, yeni kimyasalların kullanımını gerekli kılmakta, bu da doğal dengeyi bozarak önemli çevre sorunlarına yol açmaktadır. Özellikle son yıllarda çevre bilincinin artmasıyla kimyasal ilaçların ekolojik denge ve insan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri daha fazla tartışılır hale gelmiş ve böylece kimyasal maddelere alternatif olabilecek sistemler üzerindeki çalışmalar artmıştır (Çetiner, 1993). Dünya’da 20.yy’da klasik ıslah yöntemleriyle elde edilen yeni çeşitler, bitkisel üretimi önemli bir düzeyde arttırmasına rağmen, 21.yy’da artacak nüfusun ihtiyaç duyacağı bitkisel ürünü karşılamada yetersiz kalacağı düşünülmektedir. Çünkü, klasik ıslah yöntemleriyle yürütülen ıslah programları yıllarca devam etmekte, kısırlık ve uyuşmazlık gibi durumlarda işlevini yitirmekte, ve organizmalar arasında gen alışverişini sınırlamaktadır. Bu gibi durumlarda biyoteknolojik yöntemlere başvurulmaktadır. Tarımsal üretimin arttırılmasında modern biyoteknolojik yöntemler arasında şüphesiz en fazla ilgi çekeni genetik mühendisliği ya da ‘Reombinant DNA’ teknikleridir. Bunun nedeni özellikle bitki ıslahı alanında somaklonal varyasyon ve protoplast füzyonu tekniklerinin ilk zamanlardaki fazla iyimser beklentilere yanıt veremeyişlerinin yanında genetik mühendisliğinin açtığı yeni ufuklardır (Çetiner, 1993). Virüslere dayanıklı bitkilerin elde edilmesinde izlenen yol bakteri ve funguslara dayanıklılıktan oldukça farklıdır. Virüs kılıf proteinlerini şifreleyen genler saptanıp gerekli konstrüksiyon işlemlerinden sonra bitkilere aktarıldığında, yeterli çapraz korunmanın sağlandığı görülmüştür (Powel-Abel ve ark., 1986). Bu temel prensip ile farklı taksonomik gruplara ait virüslerin kılıf proteinlerini şifreleyen genlerin aktarıldığı çeşitli ürün bitkilerinde sera veya tarla denemelerinde de hastalık simptomlarının geciktiği veya hiç görülmediği saptanmıştır. Bunlara örnek olarak: tütünde tütün mozaik virüsü (TMV), tütün şerit virüsü (TSV), tütün çıngırak virüsü (TRV), yonca mozaik virüsü (AIMV), hıyar mozaik virüsü (CMV), soya mozaik virüsü (SMV), patateslerde patates yaprak kıvırcıklığı virüsü (PLRV), patates X ve patates Y virüsleridir. Bugüne kadar elde edilen transgenik bitkilerin önemli bir bölümünde, Agrobacterium aracılığı ile gen aktarma yöntemi kullanılmıştır. Çift çenekli bitkilerde kanser gibi tümör oluşturan A. tumefaciens’in bu özelliği bilim adamlarının ilgisini çekmiş ve bu hastalığa neden olan etmenler biyokimyasal ve genetik olarak saptanmıştır. Elde edilen sonuçların birleştirilmesi ile tümör oluşturan etmenlerin, Agrobacterium içerisindeki 9 büyük bir plasmid (pTi= tümör oluşturan plazmid) üzerinde bulunan ve oksin biyosentezi (iaaM ve iaaH) ile sitokinin biyosentezinde (ipt) rol oynayan enzimleri şifreleyen genler olduğu belirlenmiştir (Zambryski, 1992). Agrobacterium tumefaciens kullanılarak ‘Karpuz Mozaik Virüs II’ (WMV) ve ‘Zucchini Yellow Mosaic Virus’in (ZYMV) kılıf protein geni Nicotiana benthamiana bitkisine aktarılmıştır. VMV II veya ZYMV’nin kılıf protein genini eksprese eden transgenik N.benthamiana bitkileri, WMVII ve diğer 6 potyvirüs (BYMV), PVY, PeaMV, CYVV, PeMV, TFV ile inoküle edildiği zaman simptom gelişimine karşı korunma göstermişlerdir. Bitkilere gen transferinde, transgenik hücrelerin regenere olması ve bunlardan bitki elde edilmesi, son derece önemlidir. Farklı genotiplerin ve farklı eksplantların değişik düzeylerde regenere olduğu kavunda bu konu özellikle dikkat çekecek düzeydedir (Çürük ve ark., 1998). Bu itibarla transformasyon çalışmalarında, öncelikle söz konusu genotiplerin en yüksek düzeyde regenere olabildikleri protokolün optimize edilmesi transformasyon sisteminin etkinliğini arttırmaktadır. Fang ve Grumet (1990), in vitro koşullarda yetiştirilen 4-5 günlük fidelerin kotiledon yapraklarının 4 kenarını kör bistüri ucu ile keserek elde ettikleri eksplantları kullanmak suretiyle, NPTII genini Hale’s Best Jumbo kavun çeşidine aktarmak amacıyla çeşitli denemeler yapmışlardır. Gen aktarma çalışmalarının 107-108 hücre/ml yoğunluğundaki bakteri kültürü ile yürütüldüğünü, en uygun bakteri inokülasyon süresinin 10 ile 30 dakika olduğunu saptamışlardır. Araştırıcılar, inoküle ettikleri eksplantlardan % 3 ile % 7’sinden transgenik bitki üretebildiklerini vurgulamışlardır. Fang ve Grumet (1993) adlı araştırıcılar, ZYMV’ne dayanıklılık sağlayan kılıf protein genini kavuna aktararak ZYMV’ne dayanıklı transgenik bitkiler geliştirmişlerdir. Valles ve Lasa (1994) adlı araştırıcılar, in vitro koşullarda yetiştirilen 5 günlük fidelerin kotiledon yapraklarını kullanarak, pBI121 plazmidine sahip A. tumefaciens’in LBA4404 suşu aracılığıyla, NPTII ve GUS genlerini Amarillo.Oro kavun çeşidine aktarmak amacıyla çeşitli denemeler yapmışlardır. IK1560, NB00101 ve BM3 ortamlarını sırasıyla regenerasyon, sürgün büyütme ve köklendirme ortamları olarak kullanmışlardır. Regenerasyonda 0, 25, 100 ve 200 mg/l’lik kanamisin konsantrasyonlarını deneyerek 100 mg/l’lik dozda büyüme ve gelişmenin etkili bir şekilde engellendiğini belirlemişlerdir. Eksplantların Agrobacterium ile bulaştırıldıktan sonra antibiyotik (kanamisin ve sefatoksim) içermeyen regenerasyon ortamında 1, 2, ve 3 günlük farklı bekletme 10 sürelerinin transformasyon oranı üzerine olan etkisini araştırdıklarını ve en uygun sürenin 2 gün olduğunu tespit etmişlerdir. 3 günlük sürenin uygulandığı eksplantlarda hiç regenerasyon gözlenmediğini ve bunun Agrobacterium’un ortamdan uzaklaştırılamamasından kaynaklanmış olabileceğini vurgulamışlardır. İnokülasyondan 10 gün sonra eksplantların yaklaşık % 10’unun tomurcuk oluşturduğunu, oluşan tomurcukların ise % 50’sinin küçük sürgünlere dönüştüğünü saptamışlardır. Bordas ve ark., (1997) kavunda genetik transformasyonu optimize etmek amacıyla, transformasyon etkinliğinde önemli bir rol oynayan pek çok faktörün etkisini araştırdıklarını bildirmişlerdir. Araştırıcılar, eksplant olarak ‘Pharo’ kavun çeşidinin hem gerçek yapraklarından hem de kotiledon yapraklarından, ‘Amarillo Canario’ çeşidinin ise sadece gerçek yapraklarından aldıkları parçaları kullanmışlardır. Araştırmada HAL1 (Tuzluluğa dayanıklılık sağlayan gen), GUS ve NPTII genlerini ihtiva eden pRS655 plazmidine sahip A.tumefaciens’in LBA4404 suşunu kullanmışlardır. Pharo çeşidinin gerçek yaprakları kullanılarak yapılan gen aktarma çalışmalarında, % 0.4 oranında transgenik bitki elde edildiğini saptamışlardır. Amarillo Canario çeşidinin gerçek yapraklarının eksplant olarak kullanıldığı ve 200 µM acetosyringone’nun co-cultivation ortamına eklendiğinde veya hem bakteri çoğaltma ortamında hem de co-cultivation süresi boyunca ortama eklendiğinde ya da acetosyringon kullanılmadığında elde ettikleri transformasyon oranının sırasıyla % 0.7, % 13 ve % 0 olduğunu bildirmişlerdir. Çürük ve ark. (1998), yapmış oldukları çalışmada kavunun hipokotil uç kısmını içeren eksplantlarının, tepe tomurcuğu olmaksızın MS ve BA içeren ortamda çok sayıda sürgün oluşturabilme yeteneğine sahip olduğunu belirtmişlerdir. Elde etmiş oldukları bulgular sonucunda; hipokotilin tepe kısmından regenerasyonun daha hızlı olduğunu ve 2 gün içerisinde ilk sürgünlerini oluşturduğunu buna nazaran kotiledon yapraklarında bu sürenin 1 ay gibi bir süre olduğunu, hipokotilin tepe kısmından regenerasyonun karanlıkta meydana geldiğini, kotiledon eksplantlarından regenerasyonun ise ışığa ihtiyaç duyduğunu, hipokotilin tepe kısmından regenerasyonun % 100 diploid olan sürgün oluşumu ile sonuçlandığını, buna karşıt olarak kotiledon kısmından regenerasyonun % 42 tetraploid olarak sonuçlandığını bildirmişlerdir. Gaba ve ark. (1999)’nın bildirdiğine göre; hıyar (Gambley ve Dodd 1990; ColijnHooymans ve ark. 1994), kavun (Leshem, 1989; Gonzalves ve ark., 1994) ve karpuz (Compton ve Gray, 1993) gibi çoğu baklagil türlerinde kotiledon yaprağının proksimak 11 kısmının tohum apeksine yakın kesim bölgesi regenerasyon açısından en çok aktif olan bölge olarak kabul edilmiştir. In vitro koşullarda kotiledon eksplantlarından sadece direkt organogenesis yoluyla regenere olan kavunun Galia çeşidinde gözlenen göz (tomurcuk) regenerasyonunun anatomisi ve morfolojisi, Gaba ve ark. (1999) tarafından araştırılmıştır. Araştırma sonucunda, kavun kotiledon yapraklarından elde edilen direk rejenerasyonun epidermis tabakasındaki hücre bölünmesi sonucu oluştuğunu bildirmişlerdir. Araştırmanın konusu Türkiye’de ekonomik önemi olan Kırkağaç, Ananas, Hasanbey ve Ç:Ü.MA2 kavun çeşitlerinde bitki rejenerasyonu ve gen transferi koşullarını optimize etmek ve Agrobacterium tumefaciens ve partikül bombardmant yoluyla bu çeşitlere Kabak Sarı Mozayik Virüsüne (ZYMV; Zucchini Yellow Mosaic Virus) karşı dayanıklılık genini aktararak önemli ekonomik kayıplara neden olan bu virüs hastalığına dayanıklı kavun hatlarını elde etmektir. 12 2-Materyal ve Metod 2.1.Materyal Araştırmada Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsünden temin edilmiş olan Kırkağaç 637, ticari tohum firmasından (May tohum) temin edilmiş olan Ananas, Hasanbey ve Çukurova Üniversitesi tarafından geliştirilmiş olan Ç.Ü.MA2 kavun çeşitleri kullanılmıştır. 2.2.Metod 2.2.1.Rejenerasyon Denemeleri ve Histolojik Analizler 2.2.1.1. Kırkağaç ve Ananas Çeşitlerinde Rejenerasyon Kırkağaç 637 ve Ananas kavun çeşitlerinde rejenerasyon kapasitesini ve sürgün oluşum oranını arttırmak amacıyla farklı denemeler kurulmuştur. Yapılan birinci denemede; çimlendirme aşamasındaki karanlık ve aydınlık uygulamalarının ve aynı zamanda eksplant yaşının sürgün oluşum oranı üzerine etkisi araştırılmıştır. Rejenerasyon çalışmalarında kullanılan kavun fideleri in vitro’da yetiştirilmiştir. Tohumlar, tohum kabukları soyulmadan önce % 50’lik sodyum hipoklorit çözeltisinde 15 dakika bekletilmiş, steril kabin içerisinde, 3 kez steril saf su ile yıkandıktan sonra steril bir pens yardımıyla tohum kabukları soyulmuş, kabukları soyulan kavun tohumları, %70’lik etil alkol çözeltisi içerisinde 5 dakika karıştırılarak bekletilmiş, yeniden 3 kez steril saf su ile yıkama işlemi yapılmış ve yıkanan tohumlar % 30’luk sodyum hipoklorid çözeltisine hazırlanan çözeltide 10 dakika karıştırılarak 1-2 damla Tween 20 damlatılarak bekletilmiş ve kabin içerisinde sterilant maddeleri uzaklaştırmak amacıyla üç kez steril saf su ile yıkanmışlardır. Sterilizasyon işlemleri tamamlanan kavun tohumları, çimlenmeleri için içerisinde 1520 ml MS (Murashige and Skoog, 1962) ortamı bulunan küçük kavanozlara ekilmiş ve 26 ± 1°C sıcaklık ve 60-75 μmol/m2.sn ışıklanmanın sağlandığı bir büyütme odasına alınmıştır. 3., 5. ve 7. günlerin sonunda çimlenmiş olan tohumlar rejenerasyon ortamına transfer edilmişlerdir. Çimlenme esnasında tohumların bir kısmı karanlıkta bir kısmı da aydınlıkta inkübe edilmiş ve böylece hem 3, 5 ve 7. günlerin hem de aydınlık ve karanlığın rejenerasyon üzerine etkisi araştırılmıştır. In vitro’da yetiştirilen 3, 5 ve 7 günlük fidelerin kotiledonları eksplant olarak alınmıştır. Kavun fidelerinin kotiledon yapraklarının hem hipokotil kısmı hem de kotiledonun uç kısmı kesilerek ayrılmıştır. Her kotiledon 4 parça olacak şekilde ortadan kesilmiş ve içerisinde 10 ml rejenerasyon ortamı bulunan bir cam petriye konulmuştur. Regenerasyon ortamı olarak NA8 ortamı kullanılmıştır (Çizelge 1). 13 Çizelge 1. NA8 rejenerasyon ortamının içeriği MS Makro (× 10 ) 100 ml/l MS Mikro (× 100 ) 10 ml/l MS Vitamin 1 mg/l IAA 5 μM BA 5 μM Sukroz 30 g/l Agar 8 g/l Her çeşitten toplam 60 fide ile çalışma yapılmıştır. Hem aydınlık hem de karanlıkta 3, 5 ve 7 gün boyunca çimlendirilmeye bırakılan tohumlar, NA8 rejenerasyon ortamına transfer edilmiş, 1 petride 1 fidenin kotiledonları olacak şekilde 10’er fide konulmuştur. Bu işlemler steril kabin içerisinde yapılmıştır. Rejenerasyon ortamına alınan eksplantlar 26±1°C sıcaklık ve 60-75 μmol/m2sn ışıklanmanın sağlandığı büyütme odasına konulmuştur. Rejenerasyon ortamına alınan eksplantlarda ilk hafta kallus oluşumu, 2. hafta organogenesis, 3. hafta ise sürgün primordiyumu oluşum oranlarını belirlemek amacıyla gözlemler yapılmıştır. Farklı günlerin ve aynı zamanda aydınlık ve karanlığın rejenerasyon ve sürgün oluşumu üzerine etkileri belirlenmiştir. Rejenerasyon ortamında organogenesis başlangıcı ve organogenesis gösteren eksplantlar rejenerasyon ortamına alındıktan 4 hafta sonra sürgün geliştirme ortamı olan NB00101’e (Çizelge 2) aktarılmışlardır. Çizelge 2. NB00101 sürgün geliştirme ortamının içeriği MS Makro (× 10 ) 100 ml/l MS Mikro (× 100 ) 10 ml/l Thiamine/HCl 1 mg/l NAA 0.01mg/l BA 0.1 mg/l Sukroz 30 g/l Myo-inositol, Agar 100 mg/l, 8 g/l Organogenesis gösteren kısım zarar görmeyecek şekilde etrafındaki sararmış, vitrifikasyon göstermiş ve ölü dokular temizlenmiş ve daha sonra sürgün geliştirme ortamına 14 alınmıştır. Sürgün geliştirme ortamına eksplantların alınma işlemi de diğer çalışmalarda olduğu gibi steril kabin içerisinde ve steril çalışma koşullarında yapılmıştır. Sürgün geliştirme ortamında 3-4 hafta kalan sürgünler daha sonra köklendirme ortamına aktarılmışlardır. 2.2.1.2. Kırkağaç 637 Kavun Çeşidinde Rejenerasyonun Anotomik ve Morfolojik Yapısının İncelenmesi Kırkağaç 637 kavun çeşidinde rejenerasyonun anotomik ve morfolojik yapısı incelenmiştir. Öncelikle kavun tohumları rejenerasyon denemelerinde olduğu gibi sterilize edilmiştir. Yüzey sterilizasyonu yapılan tohumlar 30-35 ml MS ortamı konulan kültür kaplarına ekilmiş ve 24 + 2 oCde ve 60-75 μmol/m2sn ışıklanmanın sağlandığı büyütme odasına konulmuştur. Kültür odası koşullarında yetişen 3 günlük kavun fidelerinin kotiledon yapraklarının herbiri ucundan ve proksimal kısmındaki yaprak sapı ile hipokotil kısmından kesilerek atılmıştır. Kotiledonun kalan kısmı enine 2 eşit parçaya bölünerek yeşil yüzeyi ortama gelecek şekilde NA8 (Çizelge 1) ortamına yerleştirilmiştir. Ortamlara yerleştirilen eksplantlardan aynı gün ve bunu takip eden 20 gün içerisinde iki günde bir kez örnekler alınarak fiksasyon solusyonu FDA (% 90 etil alkol + % 5 fenilalenin + % 5) içerisine koyulmuşlardır. Fiksasyon solusyonuna koyulan eksplantlar en az 24 saat süreyle FDA solusyonunda bekletilmiş, daha sonra % 70’lik alkol konsantrasyonunda (300 ml saf su, 500 ml % 96’lık etil alkol, 200 ml tersiyer bütir alkol) iki saat, % 85’lik alkol konsantrasyonunda (150 ml saf su, 500 ml % 96’lık etil alkol, 350 ml tersiyer bütir alkol) iki saat, % 95’lik alkol konsantrasyonunda (450ml % 96’lık etil alkol, 550 ml tersiyer bütir alkol) iki saat ve % 100’lük alkol konsantrasyonunda (200 ml % 96’lık etil alkol, 800 ml tersiyer bütir alkol) iki saat bekletildikten sonra, TBA (tersiyer bütir alkol) içerisine konulan eksplantlar burada 1 gece bekletilmişlerdir. Daha sonra eksplantlar sırasıyla TBA-2 ve TBA-3 solusyonları içerisine alınmış ve burada 3’er saat bekletilmişlerdir. Buradan alınan eksplantlar sıvı parafin içerisine yerleştirilerek en az 24 saat süre ile 65 oC’de bekletildikten sonra buz üzerine yerleştirilen camlar üzerinde hızlıca soğutulmuştur. Buradan alınan örnekler bölünerek bloklar üzerine yerleştirilmiş ve mikrotom üzerinde kesitler alınmıştır. 2.2.1.3. Hasanbey ve Ç.Ü.MA2 Kavun Çeşitlerinde Rejenerasyon Hasanbey ve Ç.Ü.MA2 kavun tohumlarının sterilizasyonu, çimlendirilmesi ve rejenerasyonu için gerekli olan ortamlar, Kırkağaç ve Ananas çeşitlerinde uygulanmış olan protokoller esas alınarak hazırlanmıştır. 15 In vitro’da yetiştirilen 3 günlük fidelerin kotiledonları eksplant olarak alınmıştır. Kavun fidelerinin kotiledon yapraklarının hem hipokotil kısmı hem de kotiledonun uç kısmı kesilerek ayrılmıştır. Her kotiledon 4 parça olacak şekilde ortadan kesilmiş ve içerisinde 10 ml rejenerasyon ortamı bulunan bir cam petriye konulmuştur. Rejenerasyon ortamına alınan eksplantlar 26±1°C sıcaklık ve 60-75 μmol/m2sn ışıklanmanın sağlandığı büyütme odasına konulmuşlardır. 2.2.1.4. Ananas Kavun Çeşidinde Histolojik Analizler Yapılan diğer bir denemede ise Ananas kavun çeşidinde rejenerasyonun anotomik ve morfolojik yapısı incelenmiştir. Histolojik analizler için Kırkağaç 637’de kullanılan protokol kullanılmıştır. 2.2.2. Transformasyon Denemeleri Projenin dördüncü 6 aylık döneminde, ZYMV ‘Kabak Sarılık Mozayik Virüsü’ kılıf protein geninin Agrobacterium vasıtasıyla kavunlara aktarılması çalışmalarına başlanmıştır. ZYMV kılıf protein geninin klonlama çalışmaları proje işbölümü kısmında da belirtildiği üzere, Dr. Victor GABA ve Dr. Amit GAL-ON tarafından İsrail’de ‘Volcani Center’, Viroloji Bölümünde gerçekleştirilmiştir. Genin klonlanmasında karşılaşılan problemlerden dolayı çalışmanın transformasyon kısmında da gecikmeler yaşanmıştır. Gen klonlanma çalışmaları ve Agrobacterium içerisine genin aktarılması çalışması 2002 yılında tamamlanmıştır. Beşinci 6 aylık dönemin başından itibaren transformasyon protokolünün oturtulması üzerine yoğunlaşılmıştır. Tübitak NATO B2 bursu çerçevesinde, Kırkağaç 637 kavun çeşidine ‘Kabak Sarılık Mozayik Virüsü kılıf protein geninin aktarılması ve transgenik kavun bitkilerinin elde edilmesi’ konulu araştırmayı yürütmek üzere 2 Mayıs 2002 tarihinde Michigan Eyalet Üniversitesi, Bahçe Bitkileri Bölümü, Dr. Rebecca GRUMET’in genetik laboratuvarında çalışmalara başlanmıştır. Dr. Rebecca Grumet ve grubu ilk olarak kavunda genetik transformasyonu gerçekleştirmişlerdir. Bu araştırıcılar, aynı zamanda son yıllarda yaptıkları çalışmalarda, Ananas kavun çeşidine Kabak Sarılık Mozayik Virüsü kılıf protein genini aktararak bu geni taşıyan transgenik bitkileri elde etmişlerdir. Bu nedenle çalışmamızda sadece Kırkağaç 637 kavun çeşidi üzerinde yoğunlaşılmıştır. Çalışmaların ilk 3 aylık dönemi Kabak Sarılık Mozayik Virüsü (ZYMV) kılıf protein geninin, Kırkağaç 637 kavun çeşidine aktarılması üzerine olmuştur. Ancak İsrail’den temin 16 edilen gen’de yaşanan problemlerden dolayı Grumet ve grubu tarafından klonlanmış CaMV35S promotır’ının kontrolü altındaki ZYMV kılıf protein genini taşıyan PGA643 ekspresyon vektörünün kullanılmasına karar verilmiştir. Aşağıda kısaca kavun tohumlarına ZYMV kılıf protein geninin aktarılma protokolü belirtilmektedir; 2.2.2.1. Tohumların Sterilizasyonu Sterilizasyonun ilk aşamasında tohum kabukları soyulmuş ve 10-12 dak. % 15 NaOCl + 1-2 damla tween 20’de bekletilmişlerdir. Daha sonra tohumlar 3-4 defa steril saf su ile çalkalanmış ve bir gece steril saf suda karanlıkta bırakılmışlardır. 2.2.2.2. Agrobacterium Bakterisinin Hazırlanması Bir gece önceden –80 oC’de muhafaza edilen ZYMV kılıf protein genini içeren agrobacterium, 2 ml LB + 5 µg/ml kanamyasin içeren ortama inoküle edilmiştir. İkinci gün gelişen kültürden 200-500 µl alınıp 20 ml LB ortamına aktarılmıştır. 1 gece boyunca bekletilen tohumlar, 20 ml agrobacterium içeren LB ortamına konulmuşlardır. 2.2.2.3. Transformasyon ve Rejenerasyon Sterilize edilmiş kavun tohumları ve hazırlanmış olan agrobacterium kültürü steril petri kabına konulmuştur. Tohumlar, ilk olarak proksimal ve distal kotiledon olmak üzere iki parçaya bölünmüşlerdir. Proksimal kotiledondan apikal meristem çıkarılmış ve geriye kalan kısım bakteri içerisinde inkübe edilmiştir. Aynı zamanda, distal kotiledon eksplantları ise bakteri kültürü içerisinde ilk olarak yarıya, daha sonra da 6 parçaya bölünmüştür. Bu sayede bakterinin bitkiye bulaştırılması için yara dokusu oluşturulmuştur (Şekil 1). Şekil 1. Eksplantların Agrobacterium ile İnoküle Edilmesi 17 Kesilen parçalar 10 dak. agrobacterium içeren solusyonda bırakılmıştır. Daha sonra bakteri boşaltılıp bulaştırılan dokular filtre kağıdına yayılmış ve MR ortamına yerleştirilerek 3-4 gün karanlıkta bekletilmişlerdir (Şekil.2) (Bu aşamada amacımız; 3 gün boyunca antibiyotiksiz ortamda gelişen bakterilerin, kotiledon eksplantlarının kesilmiş yerlerinden içeri girmesine izin verilmesidir). Şekil.2. MR Ortamı Üzerindeki İnoküle Edilmiş Eksplantlar 2.2.2.4. Eksplantların Seleksiyon Ortamına Aktarılması (M2) MR ortamında 3 gün boyunca bekletilen eksplantlar, steril saf su ile 3 kez çalkalanmış ve steril filtre kağıdının üzerine yayılmıştır. Daha sonra dokular, M2 (MR+timentin) ortamına belirli aralıklarla konulmuş ve büyütme odasında 7 gün boyunca ışıkta bekletilmişlerdir (M2 ortamına konulan timentin, ortamda bakterinin gelişimini engelleyecektir) (Şekil. 3). Şekil. 3. İlk Seleksiyon Ortamı Üzerindeki Eksplantlar (MR+ timentin) 18 2.2.2.5. Eksplantların İkinci Seleksiyon Ortamına Aktarılması (M3) Yedinci günün sonunda M2 (MR+timentin) ortamında bulunan eksplantlar, M3 ortamına (MR+ timentin+kanamayasin) aktarılmıştır (Şekil.4). Şekil.4. İkinci Seleksiyon Ortamı Üzerindeki Eksplantlar (MR+ timentin+kanamysin) 2.2.2.6. Sürgün Geliştirme ve Köklendirme Ortamlarına Aktarılması M3 rejenerasyon ortamı üzerinde 4-5 hafta içerisinde oluşan sürgünler, kan. ve tim. içeren sürgün geliştirme ortamına aktarılmışlardır. Geni almış olan hücrelerden gelişen sürgünler daha sağlıklı gelişirken, geni almamış olanlar zayıf kalmıştır (Şekil.5). Şekil.5. Sürgün Geliştirme Ortamındaki Eksplantlar 19 Son olarak da gelişmiş olan sürgünlerin köklendirme ortamına aktarılması ve köklenen sürgünlerde DNA, RNA ve Protein analizlerinin yapılmasıdır (Şekil.6). Şekil.6. Köklendirme Ortamındaki Eksplantlar 2.2.2.7. ELISA Testi Patho Screen Kit’i (Neomycin phosphotransferase II) kullanılarak, köklendirme ortamında bulunan bitkilere ELISA testi yapılmıştır. 2.2.2.8. DNA İzolasyonu Bitkilerden DNA’lar Promega’nın belirtmiş olduğu yöntem’e göre izole edilmiştir; Doku kültüründeki bitkilerden yaprak örnekleri alınarak eppendrof tüpler içerisine konulmuş ve sıvı azotta dondurulmuştur. Üzerlerine 200µl ‘Nuclei Lysis’ solusyonu eklenmiş ve 65 o C’de 10 dakika bekletilmiştir. 1µl RNase eklenen örnekler, 37 oC’de 10 dakika inkübe edilmiştir. Daha sonra 60 µl ‘Protein Precipitation’ solusyonu eklenerek hafifçe el ile çalkalanmıştır. 5 dakika 13.000 rpm’de santrifüj edilen örneklerin süpernatant kısımları ayrılmış ve üzerlerine 180 µl isopropanol eklenmiş ve buzdolabında 15 dakika bekletilmiştir. Son olarak soğuk odada 15 dakika santrifüj edilen örneklerin süpernatant kısımları atılmış, geriye kalan DNA kısmı ilk olarak % 70 ethanol ile yıkanarak kurutulmuş ve üzerlerine 50 µl steril saf su eklenerek muhafaza edilmiştir. 2.2.2.9. PCR Testi PCR reaksiyonu için; 14.8 µl H2O, 2.5 µl 10 x buffer, 2.0 µl dNTP, 1.5 µl MgCl2, 0.2 µl Pri I, 0.2 µl Pri.II, 3.0 µl DNA 0.2 µl Taq Polymerase kullanılmıştır. 20 3-Sonuçlar 3.1. Rejenerasyon Denemeleri ve Histolojik Analiz Sonuçları Ananas kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının, NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 0, 2, 6 ve 12. günlerden sonraki rejenerasyon durumları görsel olarak incelenmiştir. Altıncı günden itibaren dokularda organogenetik farklılaşmalar belirginleşmiştir. Sürgün primordiyum oluşumlarına ise 10. ve 12. günlerden itibaren rastlanmıştır (Şekil 7). Kırkağaç 637 kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının, NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 5, 8, 10, 12 ve 14. günlerden sonraki rejenerasyon durumları görsel olarak incelenmiştir. 8. günden itibaren dokularda şişkinleşmeler ve farklılaşmalar başlamıştır. Sürgün primordiyum oluşumları 10. günden itibaren görülmüş, 12. ve 14. günlerde ise bu durum belirginleşmiştir (Şekil 8). Aynı zamanda Kırkağaç 637 kavun çeşidinde rejenerasyonun anotomik ve morfolojik yapısı da incelenmiştir. Kotiledonun en dış kısmından içeriye doğru üst epidermis, palisat parankiması, sünger parankiması ve alt epidermis bulunmaktadır. NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 4 gün sonraki kotiledon eksplantlarında henüz organogenetik bir farklılaşma görülmemektedir. 6 günlük eksplantlarda rejenerasyonun, epidermisin alt kısmındaki hücrelerde yani palisat parankimasının bulunduğu bölgelerde başladığı belirlenmiştir. 10 ve 12 günlük rejenere olmuş dokularda ise epidermis tabakasında ve palisat parankimasının bulunduğu bölgelerde meristematik bölgenin ve sürgün primordiyum yapılarının oluştuğu görülmektedir (Şekil 9). Kırkağaç 637 kavun çeşidinde çimlendirme aşamasında aydınlık ve karanlık uygulamalarının etkisi araştırılmıştır. MS (Murashige and Skoog., 1962) çimlendirme ortamında 3, 5, ve 7 gün boyunca hem aydınlıkta hem de karanlıkta bekletilen kavun tohumları, günlerin sonunda NA8 rejenerasyon ortamına (Çizelge 1) aktarılmışlardır. 1, 2 ve 3. hafta sonunda kallus, organogenetik farklılaşma ve sürgün primordiyum oluşum oranları hesaplanmıştır (Tukey’s, % 5). Yaklaşık 1 ay sonra rejenere olmuş dokular NB00101 sürgün geliştirme ortamına (Çizelge 2) aktarılmıştır. Birinci hafta sonunda 7.günde % 83; 5.günde %79; 3 günde ise % 67 oranında kallus oluşumu saptanmıştır. İkinci hafta ise 3.günde % 73; 5.günde %73; 7.günde ise % 42 oranında organogenetik farklılaşma belirlenmiştir. Üçüncü hafta ise en fazla sürgün primordiyum ve sürgün oluşum oranları sırasıyla 3, 5 ve 7.günlerde % 87, %51 ve % 23 oranında saptanmıştır. Günler arasında aydınlık ve karanlıkta istatistiksel anlamda farka 21 rastlanmamıştır. Sürgün oluşumu ise 3 günlük karanlıktan ve aydınlıktan gelen eksplantlardan elde edilmiştir (% 64 ve % 19). 5 ve 7 günlük eksplantlardan, kallus oluşumu ve bakteriyel enfeksiyon nedeniyle sürgün elde edilememiştir. A B C D Şekil 7. Ananas kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 1. (A), 2.(B), 6. (C),12. (D), günlerden sonraki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 22 A B C D E Şekil.8. Kırkağaç 637 kavun çeşidinin 5 (A),8 (B),10 (C),12 (D),14 (E) günlük kotiledonlarının rejenerasyon durumları 23 MB C A ÜE SP PP AE MB B E SP UE PP C PP D F G Şekil 9. Kırkağaç 637 kavun çeşidinde gerçek büyüme ucunun görüntüsü (A). NA8 rejenerasyon ortamına konulan 4 (B), 4 (C), 6 (D), 10 (E), 12 (F),14 (G) günlük kotiledon eksplantlarının hücresel düzeydeki görünümü . (C: Kotiledon; UE : üst meristem; SP: sünger parankiması; PP; palisat parankiması; AE: alt epidermis; MB: meristematik bölge;SP:sürgün primordiyumu). 24 Hasanbey kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının, NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 3, 6, 9, 12, 15. günlerdeki rejenerasyon durumları görsel olarak incelenmiştir. Altıncı günden itibaren dokularda organogenetik farklılaşmalar belirginleşmiştir. Sürgün primordiyum oluşumlarına ise 9 ve 12. günlerden itibaren rastlanmıştır (Şekil 10). 15. günde ise sürgün oluşumları saptanmıştır. Ç.Ü.MA2 kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının, NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 0, 3, 6, 9, 11, 14, 17, 20. günlerdeki rejenerasyon durumları görsel olarak incelenmiştir. Altıncı günden itibaren dokularda organogenetik farklılaşmalar belirginleşmiştir. Sürgün primordiyum oluşumlarına ise aynı şekilde 9. ve 11. günlerden itibaren rastlanmıştır (Şekil 11). 14 ve 17. günlerden sonra ise sürgün oluşumları görülmüştür. Yeterli oranda Hasanbey ve Ç.Ü.MA2 tohumlarından temin edilemediğinden dolayı bu çeşitlerle sadece rejenerasyon denemeleri kurulabilmiş ancak transformasyon çalışmaları yapılamamıştır. Ananas kavun çeşidinde de rejenerasyonun anotomik ve morfolojik yapısı incelenmiştir. NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 3 gün sonraki kotiledon eksplantlarında organogenetik bir farklılaşma görülmemiştir. 6 günlük eksplantlarda ise aynı Kırkağaç kavun çeşidinde olduğu gibi rejenerasyonun, epidermisin alt kısmındaki hücrelerde yani palisat parankimasının bulunduğu bölgelerde başladığı belirlenmiştir. 9 ve 12 günlük rejenere olmuş dokularda ise epidermis, palisat ve sünger parankimasının bulunduğu bölgelerde meristematik bölgenin ve sürgün primordiyum yapılarının oluştuğu, meristematik bölgenin şekillendiği saptanmıştır (Şekil 12). 25 A B C D E Şekil 10. Hasanbey kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 3.(A), 6.(B), 9. (C),12.(D), 15.(E) günlerdeki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 26 A E B F C G D H Şekil 11. ÇÜ.MA2 kavun çeşidinin NA8 rejenerasyon ortamına konulduktan 0.(A), 3.(B), 6. (C), 9.(D), 11.(E), 14.(F), 17.(G), 20. (H) günlerdeki kotiledonlarının rejenerasyon durumları 27 SP PP A1 A2 B1 B2 C1 D1 C2 D2 MB MB E1 E2 Şekil 12. Ananas kavun çeşidinde NA8 rejenerasyon ortamına konulan 3 (A1, A2), 6 (B1, B2), 9 (C1, C2), 12 (D1, D2), 15 (E1, E2) günlük kotiledon eksplantlarının hücresel düzeydeki görünümü . (PP; palisat parankiması; SP: sünger parankiması; MB: meristematik bölge). 28 3.2. Transformasyon Denemesi Sonuçları Bu denemede transformasyon aşamasında 1800 kavun tohumu kullanılmıştır. Rejenerasyon kapasitesini arttırmak amacıyla farklı tohum yaşları (suyun içerisinde 6, 15, 21 saat bekletilerek) ve farklı eksplant tipleri (distal ve proksimal kotiledon) denenmiştir. 3.2.1. Farklı Tohum Yaşı ve Eksplant Tiplerinin Rejenerasyon Üzerine Etkileri ve Transformasyon Tohumlar sterilize edilerek 6, 15, 21 saat steril saf su içerisinde ayrı olarak karanlıkta bekletilmiş ve daha sonra bir gece önceden hazırlanmış olan bakteri ile inoküle edilmiştir. Tohumlar, ilk olarak proksimal ve distal kotiledon olmak üzere iki parçaya bölünmüşlerdir. Proksimal kotiledondan apikal meristem çıkarılmış ve geriye kalan kısım bakteri içerisinde inkübe edilmiştir. Aynı zamanda, distal kotiledon eksplantları bakteri kültürü içerisinde ilk olarak yarıya, daha sonra da 6 parçaya bölünmüştür. Bakteri ile bulaştırılmış olan eksplantlar ayrı olarak MR ortamına yerleştirilmiş ve 3 gün karanlıkta bekletilmiştir. MR ortamında antibiyotik bulunmadığından dolayı dokuların etrafında bakteri gelişmiştir. Bu aşama Agrobacterium’un yara dokularından içeri girmesinde etkili olmuştur. Daha sonra eksplantlar, steril su ile çalkalanmış ve sadece timentin içeren ilk seleksiyon ortamına aktarılmıştır. Ortam içerisinde bulunan timentin, bakterinin gelişimini engellemiştir. Eksplantlar 7 gün boyunca ışıklı ortamda bırakılmış ve timentin ve kanamayasin içeren ikinci seleksiyon ortamına transfer edilmişlerdir. Distal kotiledon eksplantlarının yarısı abaksiyal diğer yarısı da adaksiyal yüzeyi ortama gelecek şekilde yerleştirilmiştir. M3 ortamı içerisindeki eksplantların ilk gözlemi 10. günün sonunda yapılmıştır. Proksimal kotiledon eksplantlarında distal’e nazaran daha fazla şişkinlik ve kallus oluşumu gözlenmiştir. Kotiledonun abaksiyal ve adaksiyal yüzeyleri arasında önemli farklılıklar gözlenmemiştir. Farklı suda bekletme zamanlarının rejenerasyon üzerine çok büyük etkisi olmamıştır. Rejenerasyon ve sürgün oluşumunu gözlemek amacıyla 20 gün sonra ikinci gözlem yapılmıştır. Rejenerasyon ve sürgün oluşum kapasitesi proksimal kotiledonda distal’e nazaran daha yüksek bulunmuştur. Farklı suda bekletme zamanları, rejenerasyon açısından benzer sonuçlar vermiş olsa da sürgün oluşumu açısından farklı sonuçlar doğurmuştur. Bakteri ile bulaştırılmadan önce 15 ve 21 saat suda bekletilmiş olan dokular, 6 saat bekletilene oranla daha yüksek oranda sürgün oluşturmuşlardır. Aynı zamanda transforme olmuş hücreler daha sağlıklı gelişip yeşil renge dönerken, transforme olmamış hücreler, kallus, organize olmamış dokular ve sarı renkli yapraklar 29 oluşturmuşlardır. Sağlıklı olarak gelişmiş olan sürgünler, sürgün geliştirme ortamına aktarılmıştır. Bu aşamada da kanamayasinden dolayı transforme olmuş eksplantların seçimi devam etmiştir. Aktarılmış olan geni içeren hücrelerden rejenere olmuş sürgünler gelişimine devam ederken, diğerleri sarı renge dönmüş ve kurumuşlardır. M3 ortamı üzerinde rejenere olarak gelişen sürgünlere ELISA (NPT II) testi uygulanmıştır. İlk gelişen 44 bitki içerisinde 25’i pozitif bulunmuştur. Daha sonra gelişimini tamamlayan 78 bitki içerisinden de 31’i pozitif olarak saptanmıştır (Şekil 13, 14). 1 1 2 3x 4x 5x 6 7 2 9x 10 11x 12x 13x 14 15 3 17 18 19x 20x 21 22x 23x 4 25x 26 27 28 29x 30x 31x 5 33x 34 35x 36 37 38x 39 8x 16x 24x 32x 40 6 41x 42x 43x 44 -bitki + bitki Tampon solusyon NPT kit Şekil 13. 1. ELISA (NPT II) Testi Sonuçları (Mavi renk: Pozitif, Siyah renk:Negatif) 1 45 2 53 46 47 48x 49 50 51 52 54 55 56 57 58x 59x 60 3 61 4 69 5 6 77 7 85 8 93 9 10 11 101x 109 117x 62x 63 64 65 66x 67x 68x 70x 71x 72 73 74 75x 76x 78x 79 80x 81 82x 83x 84 86 87x 88x 89x 90 91 92x 94 95x 96x 97x 98 99x 100x 102x 103 104x 105 106 107x 108 110 111 112 113 114 115 116 118 119x 120 121x 122 Tampon solusyon NPT kit +plant -plant Şekil 14. 2. ELISA (NPT II) Testi Sonuçları (Mavi renk: Pozitif, Siyah renk:Negatif) ELISA testi sonucunda pozitif olarak görünen bitkilerden DNA’lar izole edilmiştir. İzole edilen DNA’ların bir kısmı agaroz jel elektroforez’de koşularak konsantrasyonları belirlenmiştir (Şekil 15). 30 Şekil 15. İzole Edilmiş Olan DNA’ların Jel Elektroforesisdeki Görünümü ELISA testi sonucunda pozitif olarak saptanan bitkilerden izole edilmiş olan birkaç DNA’da PCR analizi yapılmış, PCR koşulları optimize edilmiş ve ZYMV kılıf protein genini kodlayan1000 çiftlik band incelenmiştir (Şekil 16). ↓ 1000 baz çifti Şekil 16. PCR Yapılan 2 Farklı DNA’da ZYMV Kılıf Protein Genini Kodlayan Yaklaşık 1000 Baz Çiftlik Bandın Görünümü 31 Klon 4 ↓ Klon 20 ↓ Şekil 17. PCR Reaksiyonu Sonucunda ZYMV Kılıf Protein Genini Kodlayan Yaklaşık 1000 Baz Çiftlik Bandın Görünümü PCR koşulları optimize edildikten sonra izole edilmiş diğer DNA’larda da PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiş ve ZYMV kılıf protein genini kodlayan 1000 baz çiftlik band incelenmiştir (Şekil 17). ELISA testi sonucunda pozitif olarak saptanan bitkilerin tamamında 1000 baz çiftindeki banda ratlanmamıştır. Bandın görülmemesinin nedeni, PCR koşullarının optimizasyonundan kaynaklanabileceği gibi izole edilmiş DNA’nın kalitesinin de iyi olmamasından kaynaklanabilmektedir. Bitkilerin büyük bir kısmını kaybetmiş olduğumuzdan dolayı PCR reaksiyonu tekrar edilmemiştir. Ancak şu anda elimizde bulunan klon 4 ve klon 20’de 1000 baz çiftlik band Şekil 17’de de görülmektedir. Markır olarak da λ Hind III kullanılmıştır. Klon 4 ve 20’nin bitkileri, ilk olarak dış ortama adapte edilmek amacıyla üstlerine plastik poşet geçirilerek içerisinde 1 / 1 oranında torf ve perlit bulunan küçük saksılara aktarılmıştır (Şekil 18). Yaklaşık 2 hafta büyütme odasında tutularak bitkilerin adaptasyonu ve gelişimleri sağlanmıştır. Haftada 2 kez olmak üzere MS vitamin verilmiştir. Gelişimlerini tamamlayan bitkiler daha büyük saksılara aktarılarak serada büyümeye bırakılmışlardır (Şekil 19). Bitkiler üzerinde ilk olarak erkek çiçekler daha sonra da dişi çiçekler görülmüştür. Erkek ve dişi çiçek gelişimleri tamamlandıktan sonra kendileme çalışmaları başlamıştır. Birgün önceden dişi ve erkek çiçekler bir maşa yardımı ile kapatılarak ikinci gün 32 yapılacak olan tozlanma çalışmasına hazırlanmıştır (Şekil 24). Yeterli toz ihtiyacını sağlayabilmek amacıyla 1 dişi çiçeğe 2-3 erkek çiçek olacak şekilde ayarlanmıştır. İkinci günün çok erken saatlerinde tozlanma işlemi gerçekleştirilmiş ve dişi çiçek bir plastik poşet ile kapatılmıştır. Yaklaşık bir hafta içerisinde eğer iyi bir tozlanma gerçekleşmişse dişi çiçeğin alt kısmında bulunan yumurtalık kısmı kendini toparlayarak gelişimine başlamıştır. Klon 20’de rastlanılan ilginç bir durum olarak dişi çiçeklerin ana gövdeden erkek çiçeklerin ise yan dallardan geldiği gözlenmiştir. Bilindiği gibi normal şartlarda erkek çiçekler ana dal üzerinden dişi çiçekler ise yan dallardan gelmektedir. Klon 20’de aynı zamanda yaprak alt kısmı, yeni tutan ve kendilenmiş meyve üzerlerinin aşırı tüylü olduğu gözlenmiştir. Ancak meyve, gelişimini tamamladıktan sonra normal morfolojisine kavuşmuştur. Tad kontrolü, laboratuvarda çalışan öğrencilerle birlikte yapılmış ve normal Kırkağaç kavunları ile karşılaştırıldığında belirgin bir farklılık gözlenmemiştir (Şekil 30). Klon 4 ’de de yaprak alt ve üst yüzeyinde daha belirgin ve sık tüyler, meyve üzerinde aşırı tüylülük, yeni çıkan yapraklarda ise normal bir morfolojik yapı gözlenmiştir (Şekil 29). Döllenmede istenmeyen şartlardan kaynaklanan çiçekte ve meyvede şekil bozukluklarına rastlanmıştır (Şekil 34). Virüs testlerine gelince, klon 4 ve 20’nin meyvelerinden elde edilmiş olan tohumlar, 1/1 oranında torf ve perlit bulunan viollerde çimlendirilerek gelişmeye bırakılmışlardır. Viollerde çimlenip gelişmiş olan bitkiler büyük saksılara transfer edilmiştir. İlk gerçek yaprak şekillenmeye başladığı zaman, kotiledon yaprakları üzerine karborandum tozu serpilmiş ve daha sonra üzerine 0.01 M fosfat tamponu (pH:7) içerisinde 1/10 oranında çözünmüş enfekteli doku içeren solusyon spatula yardımı ile inoküle edilmiştir (Şekil 37). 5 -10 dakika sonra piset ile çeşme suyuyla yıkanmıştır. Daha sonra bitkiler büyütme odasında gelişmeye bırakılmışlardır. 10-15 gün içerisinde semptomlar gözlenmiştir. Kontrol olarak kullanılan transgenik olmayan bitkilerde yoğun bir semptom gözlenirken, transgenik olduğunu düşündüğümüz klon 4 ve 20’nin bitkilerinde çok az semptoma rastlanmıştır. Daha once yapılan çalışmalar da incelendiğinde dayanıklı olduğu farzedilen bitkilerin ya hiç semptom göstermediği ya da çok az semptom gösterdiği belirtilmiştir. Dört transformant (20.1, 20.2, 4.1, 4.2) kendine tozlanarak yeni generasyon (F2) elde edilmiştir. Herbirinden toplam 20 tohum çimlendirilmiş ve DNA’ları izole edilmiştir. İzole edilmiş bu DNA’lar kullanılarak PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiş ve ZYMV kılıf protein genini içerip içermedikleri ve yeni generasyonlara genin geçişi incelenmiştir. 33 Toplam 4 grubun açılım oranı X2 analiziyle test edildiğinde tahmini Mendel oranlarıyla uyumlu olduğu bulunmuştur. Her durumdaki P değeri P= % 5 önem düzeyinden büyük olarak saptanmıştır. Kendilenen bitkilerden 20.1 ve 4.1; 3:1 (ZYMV pozitif:ZYMV negative) beklenen açılımı göstererek 1 gen lokusunun bulunduğunu, 4.2; 15:1 açılımını göstererek 2 gen lokusunun bulunduğunu, 20.2 ise 1:3 açılımını göstererek 1 gen lokusu tarafından karekterize edildiğini göstermiştir (Çizelge 3). Çizelge 3. Transformantlarda PCR analizi sonucunda ZYMV CP (1000baz çift) geninin X2 analizi Melon transgenic +ZYMV -ZYMV Plants Probable lines CP gene CP gene tested integrations Expected X2 P ratio 20.1 13 7 20 1 3:1 1.06 30 % 20.2 7 13 20 1 1:3 1.06 30 % 4.1 16 4 20 1 3:1 0.26 50-70% 4.2 18 2 20 2 15:1 0.48 50 % 34 Şekil 18. Doku Kültüründen Çıkarılan Bitkilerin Plastik Poşetler İçerisinde Adaptasyonlarının Sağlanması Şekil 19. Bitkiciklerin 1 / 1 Oranında Torf ve Perlit İçeren Saksılara Aktarılması 35 Şekil 20. Bitkiciklerin Küçük Saksılardan Büyük Saksılara Aktarılması 36 Şekil 21. Büyük Saksılarda Gelişen Bitkilerin İpe Alınması 37 Şekil 21’in devamı..Büyük Saksılarda Gelişen Bitkilerin İpe Alınması 38 Şekil 22. Bitkicikler Üzerinde İlk Olarak Gelişen Erkek Çiçeklerin Görünümü 39 Şekil 23. Sera’ya Aktarılan Bitkiciklerin Görünümü 40 Şekil 24. Dişi ve Erkek Çiçeklerin Bir Gün Önceden Maşa ile Kapatılarak Kendileme İçin Hazırlanması 41 Şekil 25. Erkek ve Dişi Çiçeklerin Görünümü 42 Şekil 26. Klon 20’de Dişi Çiçeklerin Ana Gövdeden Erkek Çiçeklerin ise Yan Dallardan Geliyor Olması. Şekil 27. Serada Gelişen Bitkilerin Görünümü 43 Şekil 28. Dişi ve Erkek Çiçeklerin Gelişim Durumları 44 Şekil 29. Klon 4 Bitkisinin ve Meyvesinin Görünümü. 45 Şekil 30. Klon 20’nin Bitki ve Meyvesinin Morfolojik Görünümü Şekil 31. Birgün Önce Kapatılan Dişi ve Erkek Çiçeklerin Bir Gün Sonra Kendilenmesi 46 Şekil 32. Kendileme Sonucunda Elde Edilmiş Meyvenin Görünümü 47 Şekil 33. Klon 4 ve 20’nin Gelişmiş Olan Meyvelerinden Görünüm 48 Şekil 34. Çiçekte ve Meyvede Rastlanan Şekil Bozuklukları 49 Şekil 35. Klon 4’ün Meyvesinin Görünümü 50 Şekil 36. Klon 4 ve 20’nin Meyvelerinin Görünümü 51 Şekil 37. Klon 4 ve 20’de Elde Edilmiş Olan Tohumların Çimlendirildikten Sonra Virüs İnokülasyonlarının Yapılması 52 4-Kaynaklar ÇÜRÜK, S., Elman, C., Schlarman, E., Sagee, O., Çetiner, S., Gray, D.J., Gaba, V., Direct shoot regeneration from the top of the hypocotyl of melon is distinct from direct regeneration from melon cotyledons, (1998). EZURA, H., How biotechnology can contribute to conventional breeding in melon. Proc. 1st Int. Symp. On Cucurbits Acta Hort. 492, ISHS, (1999). FANG, G and Grumet, R., Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of muskmelon plants. Plant Cell Rep. 9: 160-164, (1990). FANG, G and Grumet, R., Genetic engineering of potyvirus resistance using constructs derived from the zucchinellow mosaic virus coat protein gene. Molec. Plant Microbe Interact. 6: 358-367, (1993). GABA, V., Feldmesser, E., Gal-On, A., Kless, H., and Antignus, Y., Genetic transformation of a recalcitrant melon (Cucumis melo L.) variety. Cucurbitaceae, 94:188-190, (1995). GABA, V., Schlarman, E., Elman, C., Sagee, O., Watad, A.A., and Gary, D.J., In vitro studies on the anatomy and morphology of bud regeneration in melon cotyledons. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 35:1-7, (1999). GRUMET, R., Yadav, R.C., Geethanjali, A., Hammar, S. and Provvidenti, R., Genetic Engineering of virus resistance in cucurbit crops. Cucurbitaceae’94, 17-22, (1995). GONSALVES, C., Xue, B., Yepes, M., Transferring cucumber mosaic virus-white leaf strain coat protein gene into Cucumis melo L. and evaluating transgenic plants for protection against infections. J.Am.Soc.Hortic.Sci.119: 345-355, (1994). MANİATİS, T., Fritsch, E.F. and sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, (1982). MOLİNA, R.V. and Nuez, F., Correlated Response of in vitro regeneration capacity from different source of explants in Cucumis melo. Plant Cell Reports, 15: 129-132, (1996). NAMETH, S.T., Dodds,J.A., Paulus, A.O. and Laemmlen, F.F., Cucurbit viruses of California: An ever changing problem. Plant Dis. 70: 8-11, (1986). SASS, J.E., Botanical microtechnique. Third edition. Ames, Iowa: Iowa State University Press; 73-74, (1958). YOSHİOKA, K., Hanada, K, Nakazaki, Y., Minobe, T. and Oosawa, K., Successful transfer of the cucumber mosaic virus coat protein gene to Cucumis melo L. Jor. Breed. 42: 278-285, (1992). 53 MURASHIGE, T. and Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497, (1962). 54 55
