m.krob.yoloj. gr.-2010-2 - Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi

Türk Mikrobiyol Cem Derg (2010) 40 (2): 97 - 108
© 1993 Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti / Turkish Microbiyological Society
ISSN 0258-2171
ÖZGÜN ARAfiTIRMA
*Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda
S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve
Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
Class 1 and Class 2 Integron Gene Cassettes and
Characterization of Antibiotic Resistance in Coliforms of
Sea Water Origin
Feyza Çolako¤lu1, Osman Birol Özgümüfl1,2, Cemal Sandall›1,
Elif Çelik Sevim1, fiengül Alpay Karao¤lu1
Rize Üniversitesi 1Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji ve Moleküler Biyoloji Araflt›rma Laboratuvar›,
2
T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Rize
*Bu çal›flma XIX. Ulusal Biyoloji Kongresi’nde (23-27 Haziran 2008 Trabzon) poster olarak sunulmufltur.
ÖZET
Amaç: Bu çal›flmada Karadeniz’in do¤u sahilinden izole edilen 43 koliform bakterideki antibiyotik direncinin
moleküler karakterizasyonu amaçland›.
Gereç ve Yöntem: Sufllar›n disk difüzyon metoduyla çeflitli antibiyotiklere dirençleri tarand›. Ampisiline dirençli
sufllarda TEM tipi β-laktamaz geni, s›n›f 1 ve s›n›f 2 integron gen kasetleri ve tetrasikline dirençli sufllarda tetrasiklin
direnç determinantlar› polimeraz zincir reaksiyonu ile araflt›r›ld›. Plazmid transformasyon deneyleri ›s› flok
metoduyla yap›ld›.
Bulgular: On yedi (%39.5) suflun bir veya daha fazla say›da antibiyoti¤e dirençli oldu¤u bulundu. Bir ampisiline
dirençli Escherichia coli’nin TEM-1 tip β-laktamaz geni içerdi¤i ve tetrasikline dirençli sufllar aras›nda tet(B)
geninin yayg›n oldu¤u tespit edildi. Bir E. coli suflu 2.0-kb s›n›f 1 integron, di¤er bir E. coli suflunun ise 2.2-kb
s›n›f 2 integron tafl›d›¤› ve DNA dizi analizi ile s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n s›ras›yla blaOXA-30 – aadA1 ve
dfrA1-sat2-aadA gen kasetlerini içerdi¤i gösterildi. Ampisiline, tetrasikline ve streptomisine karfl› dirençlerin
transfer edilebilir özellikler oldu¤u bulundu.
Sonuç: Deniz ortam›nda, antibiyotiklere dirençli koliformlar›n bulunmas› halk ve çevre sa¤l›¤› aç›s›ndan risk
tafl›yabilir ve bu çal›flma, deniz suyundan izole edilmifl koliformlarda s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n gösterildi¤i
ilk çal›flma olmas› aç›s›ndan önemlidir.
Anahtar Kelimeler: Deniz suyu, koliform bakteriler, s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar.
97
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
SUMMARY
Objective: The aim of this study was molecular characterization of the antibiotic resistance in 43 coliforms
isolated from the east coastal zone of Black Sea, Turkey.
Materials and Methods: All strains were screened for resistance to certain antibiotics by disk diffusion method.
TEM-type β-lactamase gene in ampicillin-resistant strains, class 1 and class 2 integron gene cassettes and
tetracycline resistance determinants in tetracycline-resistant strains were investigated by polymerase chain
reaction. Plasmid transformation experiments were performed by heat shock method.
Results: We found that 17 (39.5%) strains were resistant to one or more antibiotics. One ampicillin-resistant
Escherichia coli strain harbored a TEM-1 type β-lactamase gene. tet(B) gene was common among tetracyclineresistant strains. One E. coli strain carried a 2.0-kb class 1 integron, and one E. coli carried a 2.2-kb class
2 integron. DNA sequencing results demonstrated that class 1 and class 2 integrons contained blaOXA-30-aadA1
and dfrA1-sat2-aadA gene cassette arrays, respectively. Resistance to ampicillin, tetracycline or streptomycin
was transferable traits.
Conclusion: We are of the opinion that there are antibiotic resistance determinants in coliforms of human origin
in marine environment, carrying a risk for public and environmental health. To our knowledge, this is the first
report for class 1 and class 2 integrons in coliform bacteria isolated from sea water in Turkey.
Key Words: Sea water, coliform bacteria, class 1 and class 2 integrons.
G‹R‹fi
Klinik ortamlar olmamalar›na ra¤men, okyanus
sular›nda, sahillerde, nehirlerde, yüzey sular› ve
çökeltilerinde, göllerde ve içme sular›nda antibiyotiklere karfl› dirençli bakteriler tespit edilmifltir (1). ‹nsan t›bb› ve veterinerlikte antibiyotiklerin yo¤un kullan›mlar›, bakteriler üzerinde
seçici bir bask› oluflturmakta ve bu bask›n›n antibiyotik direncinin ortaya ç›kmas›na ve yay›lmas›na neden oldu¤una inan›lmaktad›r (2).
Çevre kökenli direnç genlerinin takibinde tetrasikline karfl› direnç oran›n›n anahtar role sahip
olmas›, özellikle veterinerlikte ve ziraatta bu
antibiyoti¤in s›k kullan›m›ndan kaynaklanmaktad›r. Ak›lc› olmayan reçeteler, uygunsuz kullan›m ve antibiyotik art›klar›n›n çevreye kar›flmas›ndan dolay› antibiyotiklere karfl› hem çevresel
hem de klinik kökenli bakterilerdeki artan direncin, toplum sa¤l›¤›n› tehdit eden t›bbi sorunlar olarak karfl›m›za ç›kt›¤› bilinmektedir (3).
Antibiyotik direnç genleri, direnç (R) plazmidleri, transpozonlar ve integronlar›n horizontal
transferleri vas›tas›yla aktar›l›r ve kazan›l›r (4).
98
Beta-laktamlar›n klinik kullan›ma girmesinin en
önemli sonuçlar›ndan biri de plazmid arac›l›
β-laktamazlar›n yay›lmas›d›r. Plazmid arac›l›
β-laktamazlardan en s›k bulunan› TEM-1’dir.
TEM-1 geni (blaTEM-1) Tn3 transpozonuyla tafl›n›r ve Enterobacteriaceae ailesi üyelerinin %
20-60’›na yay›lm›fl durumda oldu¤u rapor edilmektedir (5).
‹ntegronlar; tetrasiklinler, trimetoprim, aminoglikozidler, kloramfenikol ve hatta β-laktamlar
gibi antibiyotiklere karfl› direnç kodlayan gen
kasetlerini tafl›yabilme veya entegre edebilme
yeteneklerine sahiptirler. S›n›f 1 integronlar
Tn21 gibi transpozonlar üzerinde tespit edilmifllerdir ve prototip say›l›rlar (6). S›n›f 1 integronun yap›s›nda bir 5'- ve 3'- korunmufl segment
(5'-CS ve 3'-CS) ve bir de de¤iflken bölge vard›r
(7,8). 5'-korunmufl segment intI geni (integraz)
ve insert olan gen/genlerin ekspresyonu için
kullan›lan bir promotor bölgeden oluflur (7). 3'korunmufl segment defektif kuaterner amonyum
direnç geni qacE∆1 ve sülfonamidlere direnç
Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
sa¤layan sulI geni içerir. ‹ki korunmufl bölge
aras›nda bulunan de¤iflken bölge antibiyotik direnç gen kasetlerinin girmesi için rekombinasyon yeridir. Bu yüzden rekombinasyon mekanizmas›na kat›lan ve 59-baz çifti (bç) eleman
olarak bilinen attC geni içerir. S›n›f 2 integronlar ise Tn7’de bulunmufl olup, dihidrofolat redüktaz gen kaseti içermektedir (7,9) ve s›ras›yla
trimetoprime, streptotrisine ve streptomisin/spektinomisine direnç sa¤layan dfrA1, sat2
ve aadA1 gibi üç klasik gen kasetleri tafl›maktad›r (10). S›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n, g›dalardan, sulama kanallar›ndan ve nehirlerden izole
edilen koliform bakterilerde tafl›nabildi¤i rapor
edilmifltir (4,11-14). Ancak, fiziksel özellikleri
bak›m›ndan hayatta kalabilmenin zor oldu¤u ortamlar olarak bilinen deniz ve okyanuslar›n insan kaynakl› kirlenmeye maruz kalm›fl sular›ndan izole edilen koliform bakterilerdeki antibiyotik direnç durumu ve moleküler mekanizmalar› ile ilgili detayl› çal›flmalara rastlanmam›flt›r.
Bu çal›flmada, Do¤u Karadeniz’in insan kaynakl› kirlenmeye maruz kalm›fl k›y›lar›ndan izole
edilmifl koliform bakterilerdeki antibiyotik direncinin moleküler analizleri yap›ld›. Bunun yan›nda, integron gen kaset içerikleri tarand› ve bu
genetik yap›lar›n moleküler yap›lar› ayd›nlat›ld›.
GEREÇ VE YÖNTEM
Koliform bakteriler. Rize ili sahilinde dokuz
istasyondan Kas›m 2000 ile A¤ustos 2001 aras›nda 10 ay boyunca ayda bir kere deniz suyu
örne¤i topland›. Deniz suyu örnekleri Lactose
Peptone Water (Oxoid, ‹ngiltere) besiyerine ekilerek fakültatif anaerop üreme takip edildi. ‹zole edilen fakültatif anaerop gram-negatif koliformlar, Rize Üniversitesi’nin Mikrobiyoloji ve
Moleküler Biyoloji Araflt›rma Laboratuvar›
Bakteri Koleksiyonu’nda %20 gliserol ortam›n-
da -35°C’de, yap›lmas› planlanan çal›flmalar
için stokland›. Çal›flma yap›laca¤› zaman, bakteriler Nutrient agar (Merck, Almanya) besiyerinde canland›r›ld› ve biyokimyasal reaksiyonlar›na göre tür seviyesinde tan›mlamalar› ve
do¤rulamalar› yap›ld› (15).
Antimikrobik duyarl›l›k ve çift disk sinerji
(ÇDS) testleri. Koliform bakteriler ve transformantlar›n antimikrobik duyarl›l›k testleri "Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI)"rehberindeki standart disk difüzyon metoduyla yap›ld›. Sonuçlar, ayn› rehberdeki standart zon çap› ölçütleriyle mukayese edilerek yorumland› (16). Duyarl›l›k testlerinde ampisilin
(10 µg), gentamisin (10 µg), amikasin (30 µg),
netilmisin (10 µg), kanamisin (30 µg), streptomisin (10 µg), tetrasiklin (30 µg), kloramfenikol
(30 µg), nalidiksik asit (30 µg), sulfametoksazol
(100 µg) ve trimetoprim (5 µg) standart antibiyotik diskleri (Oxoid, ‹ngiltere) kullan›ld›. Sulfametoksazol (100 µg) diskinin inhibisyon zon
çaplar›n›n de¤erlendirilmesi Blahna ve arkadafllar›n›n (17) çal›flmas›nda belirtilen referans de¤ere (R ≤12 mm) göre yap›ld›. Escherichia coli
ATCC 25922 suflu kalite kontrol suflu olarak
kullan›ld›.
Sufllardaki genifllemifl spektrumlu β-laktamaz
(GSBL) enzimi varl›¤›na, ÇDS testi ile standart
disk difüzyon metodu kullan›larak, MuellerHinton agar (Merck, Almanya) besiyeride bak›ld› (16,18). Seftazidim antibiyotik diski (30 µg)
(Oxoid, ‹ngiltere) etraf›ndaki inhibisyon zonunun amoksisilin-klavulanik asit diski (20 µg/10
µg) (Oxoid, ‹ngiltere) taraf›ndan art›r›lmas›
muhtemel GSBL varl›¤›n› gösterdi. Dr. George
A. Jacoby (Lahey Clinic, Massachusetts, USA)
taraf›ndan hediye edilen Escherichia coli J53-2
(SHV-3 tip GSBL enzimi kodlayan pUD18
plazmidi içeriyor) suflu, ÇDS testlerinde GSBL
pozitif kontrol olarak kullan›ld›.
99
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
Plazmid izolasyonu ve transformasyon deneyi.
Toplam plazmid DNA’lar› alkalen ekstraksiyon
metodu ile antibiyotiklere dirençli sufllardan
izole edildi ve kompetan E. coli JM101 (RecA-)
hücrelerine ›s› floku metoduyla aktar›ld› (19,20).
Transformantlar 50 µg/ml ampisilin (Fisher Scientific, ABD) içeren Luria-Bertani (LB) agar
(%1 tripton, %0.5 sodyum klorür, %0.5 maya
özütü, %1.5 agar; pH 7.4) besiyerinde seçildi.
Seçici besiyerinde üreyen transformantlar›n, 50
µg/ml ampisilin (Fisher Scientific, New Jersey,
ABD) içeren LB s›v› besiyerine tekrar ekimleri
yap›ld›. Üreyen bakterilerden tekrar plazmid
DNA’lar› saflaflt›r›larak 0.5 µg/ml etidiyum bromür (Sigma-Aldrich, Missouri, ABD) içeren
%0.7’lik agaroz jelde yürütüldü ve UV transillüminatöründe incelendi.
Antibiyotik direnç genleri ve integronlar için
polimeraz zincir reaksiyonu (PZR). Koliformlar ve transformant sufllar 3 ml LB s›v› besiyerine ekildiler ve 37°C’de 20 saat çalkalanarak enkübe edildiler. S›v› bakteri kültürünün 1.5
ml’si mikro-santrifügasyonla çöktürüldü. Süpernatant at›ld›ktan sonra çökelti 500 µl steril
deiyonize su ile yeniden çözüldü. Hücreler daha
sonra 10 dk kaynat›larak parçaland›. Tekrar
mikro-santrifügasyonla çöktürüldü ve süpernatant›n 1 µl’si tüm PZR deneylerinde kal›p DNA
kayna¤› olarak kullan›ld›. Tüm PZR reaksiyonlar›nda MBI Fermentas’›n (Vilnius, Litvanya)
Taq polimeraz enzimi, nükleotidler ve tamponlar›
kullan›ld›. Is› döngüleri Mastercycler Personal
thermal cycler (Eppendorf, ABD)’da yap›ld›.
Ampisiline dirençli sufllarda TEM-tipi β-laktamaz genleri, Arlet ve Philippon’un (21) tarif etti¤i gen içi OT1/OT2 primerleri (Tablo 1), reaksiyon kar›fl›m› ve döngü parametreleri kullan›larak araflt›r›ld›. Tetrasikline dirençli sufllarda
tet(A), tet(B) ve tet(C) genleri Tablo 1’de gösterilen primer çiftleri kullan›larak tarand›. Ampli-
100
fikasyonlar›n reaksiyon kompozisyonlar› ve
döngü parametreleri Aarestrup ve arkadafllar›n›n
(22) tariflerine göre yap›ld›. Tablo 1’de listelenen integron spesifik primerler (5’-CS/3’-CS ve
hep51/hep74), antibiyotiklere dirençli sufllardaki s›n›f 1 ve s›n›f 2 integronlar›n de¤iflken bölgelerini ço¤alt›lmak için kullan›ld›. Reaksiyon
kompozisyonlar› ve döngü parametreleri s›n›f 1
integronlar için Lévesque ve arkadafllar›n›n (8),
s›n›f 2 integronlar için White ve arkadafllar›n›n
(23) tariflerine göre yap›ld›. Amplifikasyon
ürünleri daha sonra 0.5 µg/mL etidiyum bromür
(Sigma-Aldrich, ABD) içeren %1’lik agaroz jelde yürütüldü ve UV ›fl›¤› alt›nda incelendi.
DNA dizi analizi ve biyoinformatik. ‹ntegronlar›n de¤iflken bölgelerinin PZR ürünleri QIAQuick® Purification Kits (QIAgen, ‹ngiltere)
kullan›larak agaroz jelden saflaflt›r›ld›lar ve
pGEM-T Easy vector (Promega, ABD) plazmidine üretici firman›n önerileri do¤rultusunda
klonland›lar. Elde edilen rekombinant plazmidler, sekans analizi için Macrogen Enstitüsüne
(Seul, Kore) gönderildi. pGEM-T plazmid vektörünün DNA dizisine komplementer iki üniversal primer (SP6/T7 promotor primerler) kullan›larak klonlanm›fl fragmanlar›n DNA dizileri belirlendi. Tablo 1’de DNA dizisi verilen OT3/OT4
primerleri ile Arlet ve arkadafllar›n›n (24) tarif etti¤i reaksiyon kar›fl›m› ve döngü parametreleri
kullan›larak TEM-tipi β-laktamaz genlerinin tamam› ço¤alt›ld›. Saflaflt›r›l›p temizlenen amplikonlar OT3/OT4 primerleri ile birlikte DNA dizilerinin belirlenmesi için Macrogen Enstitüsüne
(Seul, Kore) gönderildiler. Elde edilen nükleotid
dizileri ve varsay›lan proteininin amino asit dizilerinin http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
sitesindeki BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool) analizi ve http://www.ebi.
ac.uk/clustalw/ sitesindeki ClustalW (Multiple
Sequence Alignment) programlar› kullan›larak
Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
Tablo 1. PZR deneylerinde kullan›lan oligonükleotid primerler
Primer
OT-1
OT-2
OT-3
OT-4
tet(A)-1
tet(A)-2
Hedef
blaTEM (gen içi)
blaTEM (tam gen)
tet(A) geni
tet(B)-1
tet(B)-2
Amplikon (bç)
5’- TAATTGTTGCCGGGAAGCTA -3’
5'- ATGAGTATTCAACATTTCCG -3
Kaynak
504
21
857
24
917
22
375
22
506
22
5'- CAATGCTTAATCAGTGAGG -3'
5’- GTAATTCTGAGCACTGTCGC -3’
5’- CTGCCTGGACAACATTGCTT -3’
5’- CTCAGTATTCCAAGCCTTTG -3’
tet(B) geni
tet(C)-1
tet(C)-2
Nükleotid dizisi
5’- TTGGGTGCACGAGTGGGTTA -3’
5’- ACTCCCCTGAGCTTGAGGGG -3’
5’- GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC -3’
tet(C) geni
5’- CCTCTTGCGGGAATCGTCC -3’
5’-CS
S›n›f 1 integron
5’- GGCATCCAAGCAGCAAG -3’
3’-CS
de¤iflken bölge
5’- AAGCAGACTTGACCTGA -3’
hep51
S›n›f 2 integron
5’- GATGCCATCGCAAGTACGAG -3’
hep74
de¤iflken bölge
5’- CGGGATCCCGGACGGATGCACGATTTGTA -3’
GenBank veritaban›ndaki di¤er nükleotid dizileri ve proteinlerinin amino asit dizileriyle karfl›laflt›r›larak biyoinformatik analizleri yap›ld›.
Nükleotid dizisi girifl numaras›. Bu çal›flmada
tespit edilen s›n›f 1 integron ve s›n›f 2 integronlar›n nükleotid dizileri EMBL ve GenBank veritaban›nda depoland›lar ve s›ras›yla EF543148
ve EF543147 girifl numaralar› al›nd›.
BULGULAR
Deniz suyu örneklerinden 39 Escherichia coli,
iki Enterobacter cloacae, bir Klebsiella pneumoniae ve bir Citrobacter koseri olmak üzere
43 koliform bakteri izole edildi. K›rk üç koliform suflunun 17’si test edilen 10 antibiyoti¤in
en az bir veya daha fazlas›na dirençli bulundu.
Geri kalan bakteriler (%60.5) bütün antibiyotiklere hassas olarak tespit edildi.
‹zole edilen 43 koliformdaki antimikrobik direnç s›kl›¤› fiekil 1’de gösterilmektedir. En yüksek direnç insidans› tetrasikline (%23.2) karfl›
olmakla birlikte, bunu ampisilin (%20), sulfametoksazol (%11.6), streptomisin (%9.3) ve
kloramfenikol (%4.6) takip etti. En düflük di-
8
23
renç oran› trimetoprime (%2.3) karfl› saptand›.
Nalidiksik aside ve streptomisin hariç di¤er
aminoglikozidlere (gentamisin, kanamisin ve
amikasin) direnç tespit edilmedi. Antibiyotik direnci tafl›yan deniz izolatlar›n›n antibiyotik direnç fenotipleri ise Tablo 2’de görülmektedir.
TEM-tipi β-laktamaz geni (blaTEM), 11 ampisiline dirençli E. coli sufllar› ve Citrobacter koseri
suflunda arand›. Enterobacter ve Klebsiella cinsleri ampisiline do¤al dirençli olduklar›ndan bu
sufllarda direnç genlerine bak›lmad›. E. coli sufllar›ndan bir tanesinde (E. coli FD3) PZR ile 504 bç
TEM-tipi β-laktamaz geni (blaTEM) tespit edildi
(fiekil 2). DNA dizi analizi genin blaTEM-1 oldu¤unu gösterdi. BLAST analizi genin varsay›lan amino asit translasyonunun GenBank’ta depolanm›fl di¤er blaTEM-1 genlerinin amino asit
translasyonu ile %100 benzerlik gösterdi¤ini
saptad›. Polimeraz zincir reaksiyonu ile blaTEM
geni tespit edilmeyen di¤er ampisiline dirençli
sufllarda ÇDS testi negatif bulundu ve sufllar›n
GSBL üretmedi¤i anlafl›ld›.
Sufllarda tet(B) geninin yayg›n oldu¤u belirlendi. Tetrasikline dirençli 10 suflun yedisi tet(B)
geni aç›s›ndan PZR ile pozitif saptand› (375 bç
101
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
Tablo 2. Karadeniz’den izole edilen antibiyotiklere dirençli koliform bakterilerin fenotipik ve genotipik karakterizasyonlar›.
Sufl
Tür
Direnç fenotipia
FD1
E. coli
AMP
Transformant fenotipi
AMP TE
tet tipib
TEM-tipi genc,d
tet(B)
blaTEM-1
FD3
E. coli
AMP, TE
FD6
E. coli
AMP, TE
tet(B)
FD7
E. coli
TE
tet(B)
FD8b
E. coli
AMP, TE, C, SMZ
(–)
FD8bA
E. coli
AMP, TE, C, S, SMZ
(–)
FD12
E. coli
AMP
FD13a
E. coli
AMP, TE, S
FD18
E. coli
TE
tet(B)
FD19
E. coli
AMP, TE, TMP, S, SMZ
tet(B)
FD29
K. pneumoniae
AMP
FD39
E. coli
SMZ
FD44
E. cloacae
AMP
FD45
C. koseri
AMP
FD51
E. coli
SMZ
FD52a
E. coli
TE
FD54
E. coli
TE, S
AMP TE S
Gen kaset s›ras›
blaOXA-30 aadA1
–
tet(B)
dfrA1–sat2–aadA
tet(B)
(–)
a
AMP: ampisilin; TE: tetrasiklin; C: kloramfenikol; S: streptomisin; TMP: trimetoprim; SMZ: sulfametoksazol.
(–), tet(A), tet(B) ve tet(C) yok.
c
Transformantta da TEM-spesifik PZR pozitif.
d
Yaln›zca E. coli ve Citrobacter koseri sufllar›nda bak›ld›.
b
ürün) (fiekil 2). tet(A) veya tet(C) arac›l› tetrasiklin direnci tespit edilmedi. Transformasyon
deneyi ile iki E. coli suflunda aktar›labilir antibiyotik direnci gösterildi. Bu sufllar antibiyotik direnç paternlerinin (AMP-TE ve AMP-TE-S) tamam›n› transformasyon deneyinde hassas bir E.
Test edilen antibiyotikler
fiekil 1. Deniz suyundan izole edilmifl 43 koliformda
antimikrobiyallere direncin toplam s›kl›¤›.
102
coli K-12 sufluna aktard› (Tablo 2). Polimeraz
zincir reaksiyonu ile transformantlarda da tet(B)
geni ve blaTEM-1 genleri tespit edildi. Bu sonuçlar direnç fenotiplerinin plazmid arac›l› genetik
özellikler oldu¤unu göstermektedir.
fiekil 2. ‹ntegronlar ve direnç genlerinin PZR analizi. S›ra
M: 100 bp DNA Ladder (Promega, ABD); S›ra 1: s›n›f 1
integron (E. coli FD8bA); S›ra 2: s›n›f 2 integron (E. coli
FD19); S›ra 3: tet(B) amplikon; S›ra 4: blaTEM-1 amplikon
(E. coli FD3).
Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
fiekil 3. Çal›flmada tespit edilen s›n›f 1 (GenBank girifl numaras› EF543148) (A) ve s›n›f 2 (GenBank girifl numaras›
EF543147) (B) integronlara sokulmufl gen kaset s›ralar›n›n flematik gösterimi. Siyah yuvarlaklar 59-bç elamanlar›, beyaz yuvarlaklar ise attI bölgelerini temsil etmektedir.
Birer E. coli sufllar›nda s›n›f 1 (E. coli FD8bA)
ve s›n›f 2 (E. coli FD19) integron saptand› (fiekil 2). 2013-bç’lik s›n›f 1 integronun (GenBank
girifl numaras› EF543148) iki gen kaseti tafl›d›¤›
(fiekil 3) ve DNA dizi analizine göre ilki
blaOXA-30 gen kaseti olup, ampisiline ve 1. kuflak
sefalosporinlere direnç sa¤layan genifl-spektrumlu bir b-laktamaz kodlad›¤› bulundu. Bu genin yan›ndaki bölgede bir aadA1 gen kaseti bulundu¤u ve aminoglikozid 3’-(9)-O-adeniltransferaz enzimi kodlad›¤› anlafl›ld›. Bu enzim
streptomisin/spektinomisine direnç sa¤lamaktad›r. Bu integronun kaset s›ras› (blaOXA-30-aadA1)önceden rapor edilmifl klinik veya g›da orijinli Shigella flexneri (GenBank girifl numaralar› DQ923619 ve AY574195) ve Salmonella enterica serovar Typhimurium’da (GenBank girifl
numaralar› DQ861642 ve AY534545) tespit edilenlerle %100 benzerlik göstermektedir.
Tespit etti¤imiz 2224 bç-s›n›f 2 integron (GenBank girifl numaras› EF543147) ise üç gen kaseti tafl›maktad›r (fiekil 3). DNA dizi analizine
göre ilki dfrA1 geni olup, dihidrofolatredüktaz
enzimi kodlamaktad›r ve trimetoprime direnç
sa¤lamaktad›r. ‹kincisi sat2 genidir ve streptotrisin asetiltransferaz enzimi kodlamaktad›r ve
streptotrisin antibiyoti¤ine direnç sa¤lamaktad›r. Üçüncü gen kaseti aadA genidir ve aminoglikozid adeniltransferaz A enzimi kodlamaktad›r
ve streptomisin/spektinomisine direnç sa¤lamaktad›r. Bu integronun kaset s›ras› (dfrA1sat2-aadA) önceden rapor edilmifl klinik orijinli
Shigella türü (GenBank girifl numaralar›
AY639870 ve AY140652) ve Vibrio cholerae’da
(GenBank girifl numaras› AB199789) tespit edilenlerle %100 benzerlik göstermektedir.
TARTIfiMA
Ülkemizde, toplum ve hastane kökenli koliform
bakterilerde yüksek düzey antibiyotik direnci
ile ilgili raporlar mevcuttur (25,26). At›k sular,
la¤›m, dereler ve içme sular› gibi sucul çevrelerdeki bakterilerde de insan t›bb› ve veterinerlikte kullan›lan baz› antibiyotiklere karfl› direnç
rapor edilmesine ra¤men, moleküler mekanizmalar› ve ekolojileri üzerine sistematik çal›flmalar bulunmamaktad›r. Ayr›ca, deniz ekosistemindeki fekal orijinli bakterilerde ortaya ç›kan
antibiyotik direnci üzerine s›n›rl› say›da çal›flma
bulunmaktad›r. Özgümüfl ve arkadafllar› (27) bu
çal›flman›n yap›ld›¤› bölgede halk›n kulland›¤›
103
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
içme sular›ndan (musluk ve p›nar sular›) izole
ettikleri ço¤ul antibiyotik dirençli fekal koliformlardaki antibiyotik direncinin, hareketli genetik elemanlar olan konjugatif R plazmidleri,
transpozonlar ve integronlar taraf›ndan tafl›nd›¤›n› tespit etmifllerdir. Ayn› araflt›rmac›lar bölgedeki nehir sular›ndan izole edilen Enterobacteriaceae ailesi üyesi koliform bakterilerde s›n›f
1 ve s›n›f 2 integronlar›n yan›nda, ço¤ul antibiyotik dirençli birçok suflun bu direnci hareketli
genetik elemanlar vas›tas›yla yayabilece¤ini
göstermifllerdir (14). Bu bilgiler ›fl›¤›nda mevcut çal›flma, integron veya benzer genetik yap›lar vas›tas›yla antibiyotiklere dirençli bakterilerin nehir, dere veya di¤er su ak›mlar› vas›tas›yla
denizlere ulaflarak, rekreasyon amaçl› kullan›lan
veya hayvansal besin kayna¤› olan deniz ekosistemlerine de direnç genlerini yayabilece¤i ihtimalini araflt›rmaktad›r. Deniz ortam›n›n oligotropik flartlar›nda k›y›sal bölgeler besin niteli¤indeki maddelerce zengin at›k sular›n ve ak›mlar›n girdileri nedeniyle besleyici maddeler aç›s›ndan zengindir. E. coli Ayr›ca, Karadeniz’in
tuzluluk derecesi (yaklafl›k 18.5 ppt) ise oldukça azd›r (28). Böyle ortamlar bakteri populasyonlar›n›n hayatta kalabilme flanslar› aç›s›nda
pratikte uygun çevrelerdir.
Enterik bakterilerdeki plazmid arac›l› enzimler
aras›nda en s›k rastlan›lan›n TEM-1 oldu¤u rapor edilmektedir (29,30). Bu enzime ampisiline
dirençli klinik E. coli kökenlerinin yaklafl›k
%50’sinde rastlanmaktad›r (31,32). A s›n›f βlaktamaz enzimi olan TEM-1 tip β-laktamaz,
s›kl›kla nokta mutasyonlar›na maruz kalarak
substrat aral›¤›n› geniflletmektedir (33). Ülkemizdeki sa¤l›kl› insanlar›n ba¤›rsak floralar›ndan izole edilen E. coli’lerde de gösterilmifltir
(34). Bu çal›flmada TEM-1 tip β-laktamaz, sahil
sular›ndan izole edilen bir koliformda tespit
edildi ve bu bulgunun yörede yaflayan halk›n
104
sa¤l›¤› aç›s›ndan bir tehdit oluflturabilece¤ini
düflündürdü. Çal›flmam›zda, GSBL-negatif sufllar›n büyük olas›l›kla kromozomal β-laktamazlar› vas›tas›yla ampisiline direnç sa¤lad›¤› kan›s›na var›ld›. Genellikle büyük miktarlarda AmpC tip β-laktamaz üretimi, suflu ampisiline ve 1.
kuflak sefalosporinlere dirençli hale getirebilmektedir (35). Ülkemizde yap›lan son çal›flmalarda GSBL’nin Türkiye’deki hastane izolat›
Gram-negatif bakterilerde önemli bir sorun olarak karfl›m›za ç›kt›¤› rapor edilmektedir (36).
Yo¤un antibiyotik bask›s› alt›nda bu genin mutasyonlar vas›tas›yla kolayca evrimleflerek
substrat aral›¤›n› geniflletmesi mümkün olabilir.
Bunu kan›tlayabilmek için çevre kökenli bakterilerin ve içerdikleri direnç genlerinin moleküler epidemiyolojilerinin izlenmesi ve konuyla
ilgili farkl› disiplinlerin çal›flmalar›na veritaban›
oluflturacak bilgilerin sistematik bir biçimde yorumlanmas› gerekti¤ine inanmaktay›z. Özellikle
sucul ortamlardaki antibiyotik art›klar›n›n ve
metabolitlerinin miktarlar› ve ekosistemdeki
bakteri populasyonlar› üzerindeki etkilerinin ayd›nlat›lmas› gerekmektedir. Çevre bakterilerindeki direnç evriminin moleküler mekanizmalar›yla ilgili s›n›rl› say›da çal›flma bulunmaktad›r.
Song ve arkadafllar› (37) derin denizin yaklafl›k
on bin y›ll›k so¤uk katman sedimanlar›n›n metagenomik kitapl›klar›nda TEM-tipi β-laktamaz
geni belirlediklerini rapor etmifllerdir. Araflt›r›c›lar, "antibiyotik direnç genlerinin b-laktamlar
gibi antibiyotiklerin modern klinik kullan›mlar›na cevap olarak evrimleflti¤i" hipotezine karfl›
ç›kmaktad›rlar. Yani, bakterilerdeki β-laktam
direncinin modern antibiyotik ça¤›ndan önce
ortaya ç›km›fl olabilece¤i hipotezini önermektedirler. Ancak, biz bu hipotezin do¤rulanmas›n›n
karasal ve sucul ekosistemlerdeki bakteriyal populasyonlarda yap›lacak daha kapsaml› ve çeflitli moleküler çal›flmalarla desteklenmesi gerekti-
Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
¤ine inanmaktay›z. Deniz bakterilerinde ortaya
ç›kan antibiyotik direncinin insanlar ve ekosistem üzerine olan etkilerini ayd›nlatmak için olgunun moleküler biyolojik ve evrimsel mekanizmalar›n›n ayd›nlat›lmas›na ve bu konularda
daha fazla bilgiye ihtiyaç oldu¤unu düflünmekteyiz. Önceki bir çal›flmam›zda bu bölgedeki içme sular›ndan izole edilen fekal koliformlarda
blaTEM-1 gen tafl›y›c›l›¤› tespit edilmifltir (38).
fiafl›rt›c› bir biçimde, bu bakterilerin baz›lar›nda
blaTEM-1 gen varl›¤› gösterilmesine ra¤men, izoelektrik fokuslama tekni¤i kullan›ld›¤›nda bakterilerde fenotipik olarak TEM-1 enzim üretimi
do¤rulanmam›flt›r. Sonuçlar, muhtemelen bakterilerin kullanmaya gerek duymad›¤› çevrelerde baz› genlerini eksprese etmedi¤ini ima etmektedir.
Brezilya’daki üç plajdan izole edilen enterobakterilerde yüksek düzeyde antibiyotik direncine
rastlanm›flt›r. Direnç s›kl›¤› ampisilin için %14,
sulfametoksazol için %12, tetrasiklin için %9
ve kloramfenikol için %1 olarak belirlenmifltir
(39). Direnç oranlar› bizim çal›flmam›zdakilerden daha azd›r. Çal›flmam›zdaki antibiyotiklere
duyarl› sufllar›n, vahfli veya evcil hayvan ba¤›rsa¤› kökenli olma ihtimalleri yüksektir. Çünkü
sucul ortamlardan izole edilen ço¤ul antibiyotik
dirençli koliform bakterilerin insan ba¤›rsa¤›
kaynakl› olma ihtimalinin çok yüksek oldu¤u
rapor edilmifltir (40). Buna ra¤men, solar ültraviyolenin do¤al sular›n dekontaminasyonunda
önemli katk›s›n›n oldu¤u da bilinmektedir (41).
Tetrasiklin grubu antibiyotikler insan enfeksiyonlar›n›n tedavisinde ve profilaksisinde kullan›lmaktad›r. Ayr›ca, veterinerlikte ve kültür bal›kç›l›¤›ndaki bakteri enfeksiyonlar›n›n kontrolünde de tercih edilen gruplardand›r. Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde farkl› birçok tet geni
belirlenmifltir. Bu grup bakterilerde en s›k rastlanan tet genleri tet(A) ile tet(E) aras›ndaki s›-
n›flard›r (42). Guardabassi ve arkadafllar› (43)
tet(A) ve tet(B) genleri taraf›ndan sa¤lanan tetrasikline direnç mekanizmalar›n›n, sucul ve klinik orijinli Acinetobacter baumannii sufllar›nda
yayg›n oldu¤unu rapor etmifllerdir. Özgümüfl ve
arkadafllar› (27) ise Rize yöresindeki halk›n kulland›¤› içme sular›ndan izole ettikleri E. coli
sufllar›nda da tet(A) ve tet(B) genlerinin yayg›n
oldu¤unu belirlemifllerdir. Mevcut çal›flmada ise
ayn› bölgedeki deniz suyundan izole edilen tetrasikline dirençli koliformlarda yayg›n genin
sadece tet(B) oldu¤u saptand›. Tetrasiklin, oksitetrasiklin ve klortetrasikline karfl› direnç sa¤layan tet(A) genine nazaran tet(B) geninin ek olarak doksisikline karfl› da direnç sa¤lad›¤› bilinmektedir (44). Di¤er tetrasikline dirençli sufllar
(tet(A) veya tet(B) tespit edilmeyen) alternatif
tet genlerinden (örne¤in; tet(D) ve tet(E) veya
eflüks mekanizmalar› kodlayan di¤er genler)
kaynaklanan dirence sahip olabilirler. Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde farkl› tet genleri
vas›tas›yla sa¤lanan di¤er bir direnç mekanizmas› olarak "ribozomal korunma" da gösterilmifltir
(45). Bulgular›m›z›n bölgedeki bal›k çiftlikleri
ve kültür bal›kç›l›¤›ndaki bal›k hastal›klar› uzmanlar› ve halk sa¤l›¤› takipçileri taraf›ndan de¤erlendirilmesinin yararl› olaca¤› kan›s›nday›z.
‹ntegron gen kasetleri tafl›yan deniz kökenli sufllar›n tespit edilmesinin epidemiyolojik olarak
ilginç ve kayda de¤er bir bulgu oldu¤una inanmaktay›z. Ayr›ca, içme sular›ndan izole edilen
E. coli sufllar› üzerinde yap›lm›fl önceki çal›flmam›zda, dfrA1-aadA1 (GenBank girifl numaralar› DQ875875 ve DQ875876) ve dfrA17-aadA5 (GenBank girifl numaras› DQ875874) gen
kasetleri tafl›yan s›n›f 1 integronlar gösterilmifltir (27). Di¤er taraftan, Özgümüfl ve arkadafllar›
(46) ayn› bölgedeki hastane enfeksiyonlar›ndan
izole edilmifl Pseudomonas aeroginosa sufllar›nda s›n›f 1 integronlara entegre olmufl yeni an-
105
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
tibiyotik direnç geni kasetleri tespit etmifllerdir.
Çevre veya klinik ortamlarda direnç genlerinin
bakteriler aras›nda sürekli paylafl›ld›¤› ve genler
aras›ndaki genetik rekombinasyonun yeni direnç
genlerini ortaya ç›kard›¤› kan›s›nday›z. Ülkemizdeki benzer çal›flmalar, antibiyotiklere direncin
evrimi ve hareketli antibiyotik direnç determinantlar›n›n moleküler epidemiyolojisi gibi konular›n yeni oldu¤unu göstermektedir. Bu genetik
yap›lar› tafl›yan elemanlar›n, toplum ve hastane
kökenli bakterilerin klinik ortamlar›n›n izlenmesi, g›dalar, içme sular›, y›kanma ve rekreasyon
amaçl› kullan›lan su rezervleri gibi çevresel ortamlar›n›n takibi, antibiyotiklerin kontrollü kullan›m› ve bu antibiyotiklerin çevreye kar›flmalar›n›n kontrolü için sürveyans çal›flmalar› gerekti¤ini önermekteyiz. Patojen bakteriler aras›nda antibiyotik direncinin yay›lmas› en önemli toplum
sa¤l›¤› problemlerinden biridir. Bu çal›flmadaki
duyarl› sufllar›n dirençli olanlardan daha fazla olmas› antibiyotik direncinin deniz kökenli bakterilerdeki boyutunun korku verici olmad›¤›n› düflündürmektedir. Fakat do¤al sucul çevrelerde yaflayan, antibiyotiklere dirençli patojenlerin veya
kommensal bakterilerin, antibiyotiklere duyarl›
olanlar›na nazaran her zaman daha fazla seçici
avantaja sahip oldu¤u unutulmamal›d›r.
Kaynaklar
1. Mezrioui N, Baleux B. Resistance patterns of Escherichia coli strains isolated from domestic sewage before and after treatment in both aerobic lagoon and activated sludge. Water Res 1994; 28:2399-406.
2. Young HK. Antimicrobial resistance spread in aquatic
environment. Antimicrob Agents Chemother 1993;
31:627–35.
3. Davis J, Amabile-Cuevas CF. The rise of antibiotic resistance. In: Amabile-Cuevas CF, ed. Multiple Drug
Resistant Bacteria. Wiltshire: Horizon Scientific Press,
2003: 1–7.
4. Leverstein van Hall MA, Box ATA, Blok HEM, Paauw A, Fluit AC, Verhoef J. Evidence of extensive interspecies transfer of integron-mediated antimicrobial
resistance genes among multidrug resistant Enterobacteriaceae in a clinical setting. J Infect Dis 2001;
186:49-56.
5. Matthew M. Plasmid-mediated β-lactamases of gramnegative bacteria: properties and distribution. J Antimicrob Chemother 1979; 5:349-58.
6. Grinsted J, Cruz F, Schmitt R. The Tn21 subgroup of
bacterial transposable elements. Plasmid 1990;
24:163–89.
7. Stokes HW, Hall RM. A novel family of potentially
mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol Microbiol 1989;
3:1669–83.
8. Lévesque C, Piche L, Larose C, Roy PH. PCR mapping of integrons reveals several novel combinations
of resistance genes. Antimicrob Agents Chemother
1995; 39:185-91.
9. Fling ME, Richards C. The nucleotide sequence of the
trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase gene
harbored by Tn7. Nucleic Acids Res 1983;
11:5147–58.
Bu çal›flmada rapor edilen integron gen kaset
yap›lar›n›n dünya genelinde di¤er çal›flmalardaki klinik orijinli bakterilerde de gösterilmifl olmas›, belki de, "farkl› çevre kökenli mikroorganizmalar aras›nda ortak bir genetik havuzun nas›l paylafl›ld›¤›n›" göstermektedir.
11. Sunde M. Prevalence and characterization of class 1
and class 2 integrons in Escherichia coli isolated from
meat and meat products of Norwegian origin. J Antimicrob Chemother 2005; 56:1019-24.
‹letiflim / Correspondence
12. Roe MT, Vega E, Pillai SD. Antimicrobial resistance
markers of class 1 and class 2 integron bearing Escherichia coli from irrigation water and sediments. Emerg
Infect Dis 2003; 9:822-6.
Osman Birol Özgümüfl
Rize Üniversitesi, T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji
Anabilim Dal›
‹slampafla Mahallesi 53100 Rize
Tel: 0464 212 3009 – 12 Dahili: 3202
Faks: 0464 212 3015
e-mail: [email protected]
106
10. Hansson K, Sundström L, Pelletier A, Roy PH. IntI2
integron integrase in Tn7. J Bacteriol 2002; 184:1712-21.
13. Mukherjee S, Chakraborty R. Incidence of class 1 integrons in multiple antibiotic-resistant gram-negative
copiotrophic bacteria from the river Torsa in India. Res
Microbiol 2006; 157:220-6.
Deniz Suyu Kökenli Koliformlarda S›n›f 1 ve S›n›f 2 Integron Gen Kasetleri ve Antibiyotik Direncinin Karakterizasyonu
14. Özgümüfl OB, Sandalli C, Sevim A, Celik-Sevim E,
Nuket S. Class 1 and class 2 integrons and plasmid
mediated antibiotic resistance in coliforms isolated
from ten rivers in northern Turkey. J Microbiol 2009;
47:19-27.
26. Özyurt M, Haznedaro¤lu T, Sahiner F, et al. Antimicrobial resistance profiles of community-acquired uropathogenic Escherichia coli isolates during 2004-2006
in a training hospital in ‹stanbul. Mikrobiyol Bul 2008;
42:231-43.
15. Brenner DJ. Facultatively anaerobic gram-negative
rods. In: Krieg NR, Holt JG, eds. Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology. Baltimore:Williams and Wilkins, 1986: 408-516.
27. Özgümüfl OB, Çelik-Sevim E, Alpay-Karaoglu, S,
Sandall› C, Sevim A. Molecular characterization of antibiotic resistant Escherichia coli strains isolated from
tap and spring waters in a coastal region in Turkey. J
Microbiol 2007; 45:379-87.
16. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Performance standards for antimicrobial susceptibility
testing. 19th informational supplement, M100-S19.
Wayne: CLSI, 2009.
17. Blahna MT, Zalewski CA, Reuer J, Kahlmeter G, Foxman B, Marrs CF. The role of horizontal gene transfer
in the spread of trimethoprim-sulfamethoxazole resistance among uropathogenic Escherichia coli in Europe
and Canada. J Antimicrob Chemother 2006; 57:666-72.
18. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility
patterns. Rev Infect Dis 1988; 10:867-78.
19. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and
isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981;
145:1365–73.
20. Ausubel FM, Brient R, Kingston RE, et al. Short Protocols in Molecular Biology. 2nd ed. New York:John
Willey and Sons, 1995.
21. Arlet G, Philippon A. Construction by polymerase
chain reaction and use of intragenic DNA probes for
three main types of transferable β-lactamases (TEM,
SHV, CARB). FEMS Microbiol Lett 1991; 82:19-26.
22. Aarestrup FM, Lertworapreecha M, Evans MC, et al.
Antimicrobial susceptibility and occurrence of resistance genes among Salmonella enterica serovar Weltevreden from different countries. J Antimicrob Chemother 2003; 52:715–8.
23. White PA, McIver CJ, Rawlinson WD. Integrons and
gene cassettes in the Enterobacteriaceae. Antimicrob
Agents Chemother 2001; 45:2658-61.
24. Arlet G, Brami G, Décrè D, et al. Molecular characterization by PCR-restriction fragment length polymorphism of TEM β-lactamases. FEMS Microbiol Lett
1995; 134:203-8.
25. Usluer G, Bafl›büyük N, Çolak H, Akflit F. Antimicrobial sensitivity of some gram-negative bacterial strains
causing hospital or community-acquired infections.
Mikrobiyol Bul 1993; 27:221-7.
28. Sivri N, Kose E, Feyzioglu AM. Modeling the effects
of industrial discharged waters to Degirmendere River
(South Eastern Black Sea). J Sci Ind Res 2006;
65:632–8.
29. Bush K, Jacoby GA. Nomenclature of TEM β-lactamases. J Antimicrob Chemother 1997; 39:1-3.
30. Sirot D, Recule C, Chaibi EB, et al. Complex mutant
of TEM-1 β-lactamase with mutations encountered in
both IRT-4 and extended spectrum TEM-15, produced
by an Escherichia coli clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:1322-5.
31. Sanders CC, Sanders WE. β-lactam resistance in gram
negative bacteria: global trends and clinical impact.
Clin Infect Dis 1992; 15:824-39.
32. Özgümüfl OB, Tosun ‹, Ayd›n F, K›l›ç, AO. Non-conjugative plasmids encoding TEM-type β-lactamase in
clinical isolates of Escherichia coli. ‹nfek Derg 2002;
16:329–3.
33. Medeiros AA. Evolution and dissemination of β-lactamases accelerated by generations of β-lactams. Clin
Infect Dis 1997; 24 (suppl 1): S19-45.
34. Özgümüfl OB, Tosun ‹, Ayd›n F, K›l›ç AO, Ertürk M.
Carriage of mobilizable plasmid-mediated β-lactamase
gene in ampicillin-resistant Escherichia coli strains
with origin of normal fecal flora. Turk J Med Sci
2006; 36:307–14.
35. Livermore DM. β-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995; 8:557-84.
36. Gür D, Gülay Z, Ar›kan AÖ, et al. Resistance to newer
ß-lactams and related ESBL types in gram-negative
nosocomial isolates in Turkish hospitals: results of the
multicentre HITIT study. Mikrobiyol Bul 2008;
42:537-44.
37. Song JS, Jeon JH, Lee JH, et al. Molecular characterization of TEM-type β-lactamase identified in cold-seep
sediments of Edison Seamont (South of Lihir Island,
Papua New Guinea). J Microbiol 2005; 43:172-8.
38. Alpay-Karaoglu S, Özgümüfl OB, Sevim E, Kolayli F,
Sevim A, Yeflilgil P. Investigation of antibiotic resistance profile and TEM-type β-lactamase gene carriage
of ampicillin-resistant Escherichia coli strains isolated
from drinking water. Ann Microbiol 2007; 57:281-8.
107
F. Çolako¤lu, O. B. Özgümüfl, C. Sandall›, E. Ç. Sevim, fi. A. Karao¤lu
39. Cardonha AMS, Viera RHSF, Rogrigues DP, Macrae
A, Peirano G, Teophilo GND. Fecal pollution in water
from storm sewer and adjacent seashores in Natal, Rio
Grande do Norte, Brazil. Int Microbiol 2004; 7:231-8.
44. Dang H, Zhang X, Song L, Chang Y, Yang G. Molecular determination of oxytetracycline-resistant bacteria
and their resistance genes from mariculture environments of China. J Appl Microbiol 2007; 103:2580–92.
40. Kasper CW, Burgess JL, Knight IT, Colwell RR. Antibiotic resistance indexing of Escherichia coli to identify sources of fecal contamination in water. Can J
Microbiol 1990; 36:891–4.
45. Taylor DE, Chau A. Tetracycline resistance mediated
by ribosomal protection. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40:1–5.
41. Grigsby P, Calkins J. The inactivation of a natural population of coliform bacteria by sunlight. Photochem
Photobiol 1980; 31:291-4.
42. Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of
action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol Mol Biol Rev
2001; 65:232–60.
43. Guardabassi L, Dijkshoorn L, Collard JM, Olsen JE,
Dalsgaard A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. J Med Microbiol 2000;
49:929–36.
108
46. Özgümüfl OB, Caylan R, Tosun I, Sandalli C, Aydin K,
Koksal I. Molecular epidemiology of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates carrying the IMP-1 metallo-β-lactamase gene in a university hospital in Turkey.
Microb Drug Resist 2007; 13:191-8.