S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas

Tr. J. of Veterinary and Animal Sciences
23 (1999) Ek Say› 3, 597-608
@ TÜB‹TAK
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve
Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
Mine ER‹fi‹R, Sema Temizer OZAN
F›rat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dal›, Elaz›¤-TÜRK‹YE
Gelifl Tarihi: 04.02.1998
Özet: S›¤›r rumen doku arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›ndan önce ve saflaflt›r›ld›ktan sonra baz› biyokimyasal özellikleri karfl›laflt›r›ld›.
Enzimin saflaflt›r›lmas›nda; homojenizasyon, ›s›tma, aseton ile muamele, amonyum sülfat ile çöktürme, diyaliz, de¤iflik
santrifügasyonlar, sefadeks G-200 jel filtrasyon ifllemleri kullan›lm›flt›r.
Arginaz›n, saflaflt›r›lmadan önce ve saflaflt›r›ld›ktan sonra, preinkübasyon ›s›s›n›n (60 °C) ve substrat› L-arginine karfl› olan Km’nin
(4mM) de¤iflmedi¤i saptanm›flt›r. Saflaflt›r›lmadan önce preinkübasyon süresi 10 dakika, optimal pH 9.7 iken, saflaflt›r›ld›ktan sonra
preinkübasyon süresi 5 dakika, optimal pH ise 10 olarak bulunmufltur. Yine saflaflt›r›lm›fl enzim 2 mM MnCl2 konsantrasyonunda en
yüksek aktiviteyi verirken, saflaflt›r›lmam›fl enzim 1 mM MnCl2 konsantrasyonunda en yüksek aktiviteyi vermektedir.
Neticede, enzimin aktivasyonu için Mn++ katyonlar›n›n ve preinkübasyonun gerekli oldu¤u tespit edilmifltir.
Anahtar Sözcükler: S›¤›r Rumen Dokusu, Arginaz, Saflaflt›rma, Kinetik özellikler.
Some Properties of Purified and Non-purified Rumen Tissue Arginase in Cattle
Abstract: Some biochemical properties of purified and non-purified rumen tissue arginase were compared.
Homogenization, heating, treatment with aceton, precipitation with ammonium sulfate, dialysis, several centrifugations, gel filtration
on sephadex G-200 processes were utilized in the purification procedure of the enzyme.
It was found that pre-incubation temperature (60 °C) of arginase and Km (4mM) to its substrate, L-arginine, did not change before
and after purification. While pre-incubation period was 10 min and optimal pH 9.7 before purification, pre-incubation period was
found to be 5 min and optimal pH 10 after purification. Purified enzyme achieved its highest activity at 2 mM MnCl2 concentration,
whereas non-purified enzyme gave the highest activity at 1 mM MnCl2 concentration.
Consequently, it was determined that Mn++ cations and preincubation were essential for the activation of the enzyme.
Key Words: Cattle Rumen Tissue, Arginase, Purification, Kinetic properties.
Girifl
Ruminant mideleri, s›ras› ile rumen, retikulum,
omasum ve abomasum olmak üzere dört
kompartmandan meydana gelmifltir (1). Ruminantlarda
büyük miktarlarda amonyak ruminal mikroorganizmalar
taraf›ndan oluflturulmaktad›r. Gerek proteinlerden
gerekse protein yap›s›nda olmayan nitrojenli maddelerden
oluflan amonya¤›n büyük bir k›sm› rumenden absorbe
edilerek portal kan yolu ile karaci¤ere tafl›nmakta burada
üreye dönüfltürülmektedir. Sentez edilen ürenin %50’si
baflta tükürük bezleri yolu ile olmak üzere rumene geri
gelerek burada tekrar amonyak ve karbondioksite
parçalanmaktad›r. Rumen ve karaci¤er aras›ndaki bu azot
dolafl›m›na “Rumino-hepatik azot dolafl›m›” denir (1-3).
Arginaz (L-arginin amidinohidrolaz; EC 3.5.3.1) üre
döngüsünün son basama¤›nda L-arginini üre ve ornitine
hidrolize eden bir enzimdir (4).
Üre döngüsü her hücrede bulunmamakla beraber,
arginaz enzimi genellikle birçok hücre ve dokuda (baflta
karaci¤er olmak üzere böbrek, ba¤›rsak, beyin, rumen,
akci¤er, kalp, dalak, iskelet kas›, eritrosit, fibroblast,
* Doktora Tezinin bir k›sm›ndan al›nm›flt›r.
597
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
makrofaj, tükürük bezleri v.s.) bulunmaktad›r (5-10).
Karaci¤er hem arginaz enzimini hem de üre döngüsünün
di¤er enzimlerini içerdi¤inden, üre sentezinin önemli bir
k›sm› bu organda oluflmaktad›r (11, 12).
Rumen dokusunda üre döngüsü bulunmamas›na (13)
ra¤men, arginaz enziminin varl›¤› saptanm›fl (6,14,15)
olup, bunun metabolik fonksiyonu ise henüz bilinmemektedir.
Bu çal›flmada, rumen doku arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›ndan önceki ve sonraki optimal koflullar›n›n ve kinetik
özelliklerinin incelenme ve karfl›laflt›r›lmas› amaçlanm›flt›r.
Materyal ve Metot
Araflt›rma materyalleri, Elaz›¤ Elet Tesisleri’ne kesim
için gelen s›¤›rlardan temin edilmifltir. Kesimden hemen
sonra al›nan rumen parçalar›, musluk suyu ile iyice
y›kanarak rumen muhteviyat› uzaklaflt›r›lm›fl ve doku en
k›sa zamanda, k›r›lm›fl buz içerisinde laboratuara getirilip,
tekrar %0.9’luk NaCl ile temizlenmifltir.
A-Saflaflt›r›lmadan önceki enzim kayna¤›n›n
haz›rlanmas›;
‹ki süzgeç ka¤›d› aras›nda, suyu al›nan rumen dokusu,
tam 1 g olarak tart›l›p bir makas yard›m›yla küçük
parçalara ayr›lm›fl ve pH’s› 7.4 olan 0.01M Tris-HCl
tamponu içinde 1/10 oran›nda (w/v) suland›r›lm›flt›r.
Daha sonra 1/10 oran›nda suland›r›lm›fl materyal, k›r›lm›fl
buz içerisinde Potter-Elvehjem cam-cam homojenizatörle
homojenize edilmifltir. Elde edilen homojenatlar so¤utmal›
santrifüjde (Sorvall RC-5B) 15 000 rpm’de +4°C’de 15
dakika (20 000 g) santrifüj edildikten sonra süpernatantlar al›narak enzim kayna¤› olarak kullan›lm›flt›r (12,16).
B- S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›;
a-Tamponda homojenizasyon: %0.9’luk NaCl ile
y›kanan rumen doku örnekleri homojenize edilmeden
önce iki süzgeç ka¤›d› aras›nda kurutularak 50g olarak
tart›l›p, bir makas ile küçük parçalar haline getirildikten
sonra, a¤›rl›¤›n›n 4 kat› hacime (200 ml) homojenizasyon
çözeltisi [0.05 M MnCL2.4H2O, 0.16 M KCl, 10 mM 2Merkaptoetanol 0.01 M’L›k Tris-HCl tamponu (pH: 7.5)
içinde haz›rland›.] ile tamamlan›p, k›r›lm›fl buz içerisinde
homojenizatörde (Sorvall Omni Mixer) iyice homojenize
edilmifl, homojenat iki defa tülbentten süzülmüfltür.
b-Homojenat santrifügasyonu: Homojenat 50 ml’lik
polipropilen tüplerde, so¤utmal› santrifüjde (Sorvall RC-
598
5B) +2°C’de 14 000 rpm’de 20 dakika (16 000g)
santrifüj edilerek homojenat süpernatant› elde edilmifltir.
c-Is› muamelesi: Süpernatant›n pH’s› 7.5’a ayarland›ktan sonra 60 °C’deki su banyosunda 20 dakika bekletilmifl ve bu zaman sürecinde birkaç defa bagetle kar›flt›r›larak ›s›n›n eflit da¤›l›m› sa¤lanm›flt›r. Is› iflleminden sonra homojenat, k›r›lm›fl buz içerisinde 5 dakika so¤utulmufltur. Is›tma sonucu denatüre olan proteinleri uzaklaflt›rmak amac› ile, homojenat 14 000 rpm’de 20 dakika
santrifüj edilmifltir. Elde edilen süpernatant, süzgeç ka¤›d› ile süzülerek ›s› fraksiyonu elde edilmifltir.
d-Aseton ile muamele: Bir önceki basamaktan elde
edilen süpernatanta hacmi 2.5 misli (%60) oluncaya
kadar, -25 °C’de bekletilmifl asetondan damla damla ilave
edilerek, bu durumda k›r›lm›fl buz içerisinde 30 dakika
kar›flt›r›lm›fl, kar›fl›m 14 000 rpm’de -10 °C’de 10 dakika
santrifüj edilmifltir. Süpernatant k›sm› at›lm›fl, elde edilen
peletler 35 ml homojenizasyon çözeltisi içinde cam-teflon
homojenizatörde homojenize edilmifltir. Daha sonra, 0.01
M Tris-HCl tamponuna karfl› 1 gece dializ edilerek, 17
000 rpm’de 20 dakika (25 000g) santrifüj edilmifltir.
e-(NH4)2SO4 ile doyurma: Elde edilen süpernatanta,
amonyum sülfat; k›r›lm›fl buz içerisinde %55 doygunlu¤a
eriflinceye kadar, yavafl yavafl ilave edilip 30 dakika sürekli
kar›flt›r›lm›flt›r. 10 000 rpm’de 30 dakika (8500 g)
santrifüj edilerek pelet k›sm› ayr›lm›fl, süpernatanttaki
doygunlu¤un %85’e ulaflmas› için gerekli amonyum sülfat
tekrar ilave edilerek, ayn› ifllemler tekrarlanm›flt›r. %55
ve %85 amonyum sülfat doygunlu¤u sonras› elde edilen
peletler birlefltirilmifl ve 20 ml 0.01 M Tris-HCl
tamponunda (pH: 7.5, 10mM 2-Merkaptoetanol içerir)
çözdürülmüfltür. Bu fraksiyon dializ torbalar›na
aktar›larak, 0.01 M Tris-HCl tamponuna karfl› bir gece
diyaliz ifllemine tabii tutulmufltur. Tampon bu süre
içerisinde 3 kez de¤ifltirilmifl, dializat 11 000 rpm’de 20
dakika (10 000g) santrifüj edilmifltir.
f-Jel Filtrasyon: % 0.9 NaCl içeren 0.01M Tris-HCl
tamponu ile dengelenmifl kolona (2cm x 60cm),
amonyum sülfat fraksiyonu uygulanm›fl ve tekrar ayn›
tampon kolondan geçirilerek 3 ml’lik fraksiyonlar halinde
eluatlar al›nm›flt›r. Eluatlar›n 280nm’deki absorbans›
0.005’den küçük oluncaya (A280<0.005) kadar eluat
al›n›m›na devam edilmifltir. Absorbanslar› yüksek olan
tüplerde enzim aktivitesine bak›larak, yüksek aktivite
gösteren tüpler birlefltirilmifl ve saflaflt›r›lm›fl enzim
kayna¤› olarak kullan›lm›flt›r (8, 17-20).
M.ER‹fi‹R, S.T.OZAN
Rumen doku arginaz aktivitesinin ölçümünde
Tiyosemikarbazid Diasetilmonoksim-Üre (TDMU) metodu
kullan›lm›fl (21) ve bu metot L-argininin arginaz ile
hidrolizi sonucu oluflan ürenin, kolorimetrik olarak
ölçümüne dayanmaktad›r.
›s›tmada 2.54, aseton ekstraksiyonunda 10.13,
amonyum sülfat ile çöktürme basama¤›nda 11.16,
Sefadeks G-200 jel filtrasyonda ise 18.46 misli
ar›t›lm›flt›r. S›¤›r rumen doku arginaz› bu saflaflt›rma
basamaklar› sonunda %4.87 verimle 18.46 misli
saflaflt›r›lm›flt›r. Bafllang›çta spesifik aktivitesi 6.47 ünite
olan arganizdan, k›smi saflaflt›rma sonunda, spesifik
aktivitesi 18.46 misli artt›r›larak 119.49 ünite olan
k›smen saf arginaz elde edilmifltir.
Protein miktarlar› Lowry (22) yöntemine göre
ölçülmüfltür.
Ünite: µmol üre/mg protein/saat
Amonyum sülfat fraksiyonundan sonra s›¤›r rumen
doku arginaz›n›n Sefadeks G-200 kolonuna uygulanmas›
ve elusyon profili fiekil 1’de gösterilmifltir.
Bulgular
Tablo 1’de görüldü¤ü üzere s›¤›r rumen doku
arginaz›, homojenat süpernatant›nda 1.16, 60 °C’de
Tablo 1.
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n K›smen Saflaflt›r›lmas›.
Saflaflt›rma Basama¤›
Homojenat
Homojenat süpernatant›
60 °C’de ›s›tma
Total enzim Aktivitesi*
Total Protein (mg)
Verim %
Spesifik Aktivite**
12276.8
11829
Saflaflt›rma (Misli)
1896
100
6.47
-
1566
96.35
7.55
1.16
11774.49
714.95
95.9
16.46
2.54
Aseton ekstraksiyonu
9855.3
150.3
80.27
65.57
10.13
(NH4)2SO4 ile çöktürme
7902.72
109.44
64.37
72.21
11.16
Sefadeks G-200 jel filtrasyon
598.68
5.01
4.87
119.49
18.46
*Total enzim aktivitesi: µmol üre x saat x total hacim
** Ünite: Total enzim aktivitesi/Total protein: Spesifik aktivite
) Absorbans (280 nm)
2
—
200
—
150
—
100
—
50
—
—
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n
Sefadex G-200 Jel Filtrasyon
Elusyon Profili. Kolonun Elüsyon
H›z› 12 ml/saat Olarak Düzenlenmifl ve Eluatlar 3 ml’lik Fraksiyonlar Halinde Toplanm›flt›r.
(
(
1
—
) Arginaz Aktivitesi (µmol üre x saat x ml-1)
fiekil 1.
3
—
15
20
Fraksiyon Numaras›
—
10
—
5
—
0
—
—
0
25
30
35
599
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
1-‹nkübasyon Süresinin Tespiti
Enzimatik reaksiyon için gerekli olan inkübasyon
süresini tespit etmek amac› ile enzim, 37 °C’de ve de¤iflik
zaman aral›klar›nda inkübasyona tabii tutulmufltur. fiekil
2 ve 3’de görüldü¤ü gibi üre sentezindeki art›fl 15.
—
30
—
2-Preinkübasyon S›cakl›¤›n›n Saptanmas›
Preinkübasyon s›cakl›¤›n› tespit etmek ve
preinkübasyon s›cakl›¤›n›n enzim aktivitesine etkisinin,
Mn++ katyonlar›na ba¤l› olup olmad›¤›n› araflt›rmaki için;
40-65 °C’Lik preinkübasyon s›cakl›klar›yla beraber Mn++
iyonlar›n›n varl›¤›nda ve yoklu¤unda enzim aktivitesi
ölçülmüfltür. fiekil 4 ve 5’de görüldü¤ü üzere enzim
30
—
25
—
20
—
15
—
3
—
2
—
1
—
+ MnCl2
20
—
10
—
—
—
10
—
5
—
—
00
Ünite
Ünite
40
dakikaya kadar do¤rusal olup, 15. dakikadan sonra
do¤rusall›ktan sapmaktad›r. ‹nkübasyon süresi
saflaflt›r›lm›fl ve saflaflt›r›lmam›fl rumen doku arginaz› için
13 dakika olarak tespit edilmifltir.
15
20
25
‹nkübasyon Süresi (Dakika)
fiekil 2.
S›¤›r Rumen Dokusundan K›smen Saflaflt›r›lan Arginaz
Aktivitesinin ‹nkübasyon Süresine Ba¤l› Olarak De¤iflimi.
—
—
—
—
—
—
00
- MnCl2
40
45
50
55
60
65
Preinkübasyon S›cakl›¤› (°C)
fiekil 4.
100
80
—
60
—
40
—
20
—
Ünite
Ünite
Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku Arginaz Aktivitesinin
Preinkübasyon S›cakl›¤›na Ba¤l› Olarak De¤iflimi.
—
8
—
6
—
4
—
2
—
+ MnCl2
- MnCl2
fiekil 3.
600
S›¤›r Rumen Dokusundan K›smen Saflaflt›r›lan Arginaz
Aktivitesinin ‹nkübasyon Süresine Ba¤l› Olarak De¤iflimi.
—
0
‹nkübasyon Süresi (Dakika)
—
0
—
25
—
20
—
—
15
—
—
10
—
5
—
—
00
40
45
50
55
60
65
Preinkübasyon S›cakl›¤› (°C)
fiekil 5.
Preinkübasyon S›cakl›¤›n›n K›smen Saflaflt›r›lm›fl Rumen
Doku Arginaz Aktivitesine Etkisi.
M.ER‹fi‹R, S.T.OZAN
aktivitesi, MnCl2 varl›¤›nda 60 °C’ye kadar artmakta, 60
°C’den itibaren düflüfl göstermektedir. 60 °C’lik
preinkübasyon s›cakl›¤› ve Mn++ iyonlar› enzimin
saflaflt›r›lmas›ndan önce aktiviteyi yaklafl›k 10 misli
art›r›rken (fiekil 4), saflaflt›r›ld›ktan sonra 37 misli
art›rm›flt›r (fiekil 5).
3-Preinkübasyon Süresinin Tespiti
Ünite
Enzim; 50, 55, 60, 65 °C’lik preinkübasyon
s›cakl›klar›nda ve de¤iflik sürelerde preinkübasyona tabi
tutulmufltur. En yüksek aktiviteye saflaflt›r›lmam›fl enzim
60 °C’de 10 dakikada (fiekil 6), saflaflt›r›lm›fl enzim ise
60°C’de 5 dakikada (fiekil 7) ulaflmaktad›r. Saflaflt›r›lm›fl
enzimin 60 °C’de 5 dakika preinkübasyonu, enzim
30
—
28
—
26
—
24
—
22
—
aktivitesini preinkübasyon uygulanmam›fla oranla %200225 art›r›rken (fiekil 7), saflaflt›r›lmam›fl enzimin 60
°C’de 10 dakika preinkübasyonu, enzim aktivitesini
preinkübasyon uygulanmam›fla oranla %30 art›rmaktad›r
(fiekil 6).
4-pH’n›n Etkisi
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n, de¤iflik pH’larda ve
çeflitli tamponlar kullan›larak aktivitesi saptanm›fl ve pH
profili ç›kar›lm›flt›r. fiekil 8 ve 9’da görüldügü gibi rumen
doku arginaz aktivitesinin ölçümü için en uygun tampon,
NaHCO3-Na2CO3 tamponu olup, uygun pH ise, arginaz›n
saflaflt›r›lmas›ndan önce 9.7 (fiekil 8), saflaflt›r›lmas›ndan
sonra ise 10’dur (fiekil 9).
fiekil 6.
Farkl› S›cakl›klarda Preinkübasyon
Süresine Ba¤l› Olarak Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku Arginaz
Aktivitesindeki De¤iflimler.
60 °C
65 °C
50 °C
20
—
—
—
—
—
0
5
10
15
20
Ünite
Preinkübasyon Süresi (Dakika)
5-MnCl2’ün etkisi
80
—
70
—
55 °C
60
—
50 °C
60 °C
50
—
40
—
30
—
20
—
—
—
fiekil 7.
5
—
—
0
Preinkübasyon ortam›na 0-5 mM konsantrasyonlarda
MnCl2 ilave edilmifl ve uygun MnCl2 konsantrasyonu tespit
edilmifltir. fiekil 10 ve 11’de görüldü¤ü gibi
preinkübasyon ortam›n›n Mn++ içermedi¤i durumlarda
enzim aktivitesi düflüktür. Ortama Mn++ iyonlar›n›n
ilavesiyle enzim aktivitesi belirgin olarak artmaktad›r.
Rumen doku arginaz› için optimal Mn++ konsantrasyonu
saflaflt›r›lmadan önce 1mM (fiekil 10), saflaflt›r›ld›ktan
sonra ise 2 mM (fiekil 11) olarak saptanm›flt›r.
10
15
20
Preinkübasyon Süresi (Dakika)
Preinkübasyon Süresine Ba¤l› Olarak, K›smen Saflaflt›r›lm›fl
S›¤›r Rumen Doku Arginaz Aktivitesindeki De¤ifliklikler.
6-Rumen Doku Arginaz›n›n L-arginine Karfl› Olan
Km’i
Rumen doku arginaz› için optimal koflullar
belirlendikten sonra arginaz›n substrat› L-arginine karfl›
601
Ünite
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
35
—
30
—
25
—
20
—
fiekil 8.
Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku
Arginaz Aktivitesinin Çeflitli Tampon
Sistemlerine ve pH’ya Göre Gösterdi¤i De¤ifliklikler.
fiekil 9.
K›smen Saflaflt›r›lan S›¤›r Rumen
Doku Arginaz›n›n Optimal pH’s›n›n
Saptanmas›.
Tris-HCl tamponu
Glisin-NaOH tamponu
15
—
10
—
5
—
NaHCO3 - Na2 CO3 tamponu
—
9.5
—
9.0
—
8.5
—
8.0
—
7.5
—
—
7.0
—
—
0
10.0
10.5
11.0
pH
—
60
—
Ünite
80
Tris-HCl tamponu
Glisin-NaOH tamponu
40
—
20
—
9.5
10.0
10.5
pH
olan Km’i Michaelis-Menten eflitli¤i ile incelenmifltir (fiekil
12, 13). Bu amaçla enzim miktar› sabit tutulup, L-arginin
konsantrasyonu art›r›larak arginaz aktivitesine
bak›lm›flt›r. Bafllang›çta, reaksiyon h›z›nda görülen lineer
art›fl daha sonra yerini hiperbolik bir görünüme
b›rakmakta
ve
sonuçta
reaksiyon
substrat
konsantrasyonunun fonksiyonu olmaktan ç›karak, enzim
substrat ile doygun hale gelmektedir. Aktivitede, 2.5 mM
L-arginin konsantrasyonuna kadar olan do¤rusal art›fl, bu
konsantrasyondan itibaren do¤rusall›¤›n› kaybedip,
hiperbolik görünüm almaktad›r. Substrat konsantrasyonu
602
—
9.0
—
8.5
—
8.0
—
—
7.5
—
—
7.0
—
—
0
NaHCO3 - Na2 CO3 tamponu
11.0
20 mM’a ulaflt›¤› zaman, enzimin aktivitesi maksimum
düzeye varmakta ve bu konsantrasyondan itibaren Larginin miktar›n›n artmas› enzimatik reaksiyonun h›z›n›
art›ramamaktad›r.
Enzim aktivitesinin substrat konsantrasyonuna ba¤l›
olarak de¤iflimi Lineweaver-Burk e¤risiyle de de¤erlendirilmifltir (fiekil 14, 15). Bütün de¤erlendirmeler sonunda
görülmüfltür ki; saflaflt›r›lmam›fl ve saflaflt›r›lm›fl s›¤›r
rumen doku arginaz›n›n, substrat› L-arginine karfl› olan
Km’i 4 mM civar›ndad›r.
Ünite
M.ER‹fi‹R, S.T.OZAN
30
—
20
—
10
—
—
—
—
—
0
S›¤›r rumen doku arginaz›n›n, saflaflt›r›lmadan önce ve
saflaflt›r›ld›ktan sonra baz› optimal flartllar› belirlenmifl ve
kinetik özellikleri incelenmifltir. Arginaz›n aktivasyonu için
iki temel faktör gereklidir. Bu faktörler; preinkübasyon
ile enzimin kofaktörü olarak kabul edilen Mn++
katyonlar›d›r.
—
0
bu nedenle rat meme arginaz›n›n saflaflt›r›lmas›nda bu
basamaktan sak›n›lm›flt›r (24). Rat meme arginaz›n›n
aksine, rumen doku arginaz› rat karaci¤er arginaz› (25)
gibi so¤uk asetonla muamele ile denatüre olmaz.
1
2
3
4
5
Daha önce birçok dokuda çal›fl›lan arginazlar›n optimal
preinkübasyon s›cakl›klar› 55 °C civar›nda bulunmufltur
(24, 26, 27). Rumen doku arginaz›n›n optimal preinkübasyon s›cakl›¤› saflaflt›r›lmadan önce (fiekil 4) ve saflaflt›r›ld›ktan sonra (fiekil 5) 60 °C olarak bulunmufltur. S›¤›r
rumen doku arginaz›n›n preinkübasyon s›cakl›¤›n›n (60
°C) di¤er arginazlardan yüksek olmas› rumen doku arginaz›n›n di¤er arginazlardan s›cakl›¤a karfl› daha stabil oldu¤unu göstermektedir.
mM MnCl2
fiekil 10.
Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku Arginaz Aktivitesinin MnCl2
Konsantrasyonuna Ba¤l› Olarak De¤iflimi.
Tart›flma
Preinkübasyon s›cakl›¤›n›n Mn++ katyonlar› ile ilgisi
araflt›r›lm›fl ve Mn++ katyonlar›n›n preinkübasyon için
gerekli oldu¤u saptanm›flt›r. fiekil 4 ve fiekil 5’de
görüldü¤ü gibi preinkübasyon ortam›na MnCl2 ilavesi ve
60 °C’lik preinkübasyon; saflaflt›r›lmadan önce arginaz
aktivitesini yaklafl›k 10 misli art›r›rken, saflaflt›r›ld›ktan
sonra aktiviteyi 37 misli art›rmaktad›r.
S›¤›r rumen doku arginaz› %4.87 verimle 18.46 misli
saflaflt›r›lm›fl ve spesifik aktivitesi 119.49 ünite olan
k›smen saf arginaz elde edilmifltir (Tablo 1).
Homojenizasyon basama¤›nda; 2-merkaptoetanol ve
MnCl2 içeren 0.01 M’l›k Tris-HCl tamponu ile (pH: 7.5)
haz›rlanm›fl homojenizasyon çözeltisi kullan›lm›flt›r. 2merkaptoetanol (23,24), MnCl2 ve nötrale yak›n pH (24)
enzim aktivitesinin kayb›n› önler.
Saflaflt›rma safhalar› esnas›nda, örne¤in jel filtrasyon
ve diyalizle metal iyonlar›n›n bir k›sm› ortamdan uzaklafl›r
(8). Bu nedenle saflaflt›r›lm›fl enzimin aktivitesinin, MnCl2
Rat meme arginaz› so¤uk asetonla muamele
edildi¤inde denatüre olarak aktivitesinin ço¤u kaybolur,
—
60
—
40
—
20
—
fiekil 11.
K›smen Saflaflt›r›lan S›¤›r Rumen
Doku Arginaz› Üzerine MnCl2’ün
De¤iflik Konsantrasyonlar›n›n Etkisi.
Ünite
80
—
—
—
—
0
—
0
1
2
3
4
5
mM MnCl2
603
Ünite
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
35
—
30
—
25
—
20
—
15
—
10
—
5
—
—
—
—
—
—
0
—
0
5
10
15
20
25
30
fiekil 12.
Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku
Arginaz Aktivitesinin L-arginin
Konsantrasyonu Ba¤l› Olarak
De¤iflimi.
fiekil 13.
K›smen Saflaflt›r›lm›fl Rumen
Doku Arginaz Aktivitesinde Larginin Konsantrasyonuna Ba¤l›
Olarak De¤iflimler.
mM L - arginin
—
60
—
40
—
20
—
Ünite
80
—
—
—
5
—
0
—
—
0
10
15
20
25
30
mM L - arginin
yoklu¤unda ve preinkübasyon s›cakl›¤›na ba¤l› olarak
de¤iflim grafi¤i (fiekil 5) yukar›da bahsetti¤imiz
saflaflt›rma basamaklar› esnas›nda ortamdan Mn++
iyonlar›n›n tamamen uzaklaflt›r›lmas› nedeniyle
saflaflt›r›lmam›fl enzimin grafi¤inden (fiekil 4) tamamen
604
farkl›d›r. MnCl2 yoklu¤unda preinkübasyon s›cakl›¤›na
ba¤l› olarak enzim aktivitesinin de¤iflimine bakacak
olursak saflaflt›r›lm›fl enzimin aktivitesinin 40 °C’den
itibaren giderek azalmakta 65 °C’de tamamen s›f›r
oldu¤unu görmekteyiz (fiekil 5). Saflaflt›r›lmam›fl enzimin
M.ER‹fi‹R, S.T.OZAN
fiekil 14.
—
0.100
—
0.075
—
0.050
—
0.025
—
Saflaflt›r›lmam›fl Rumen Doku
Arginaz›n›n L-arginine Karfl›
Olan Km’inin Lineweaver-Burk
E¤risi ile Saptanmas›.
1/V
0.125
-1 / Km
Km = 1 / 0.25 = 4
—
—
—
—
—
—
—
0.000
0.0
0.25
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1/V
1 / [S]
0.05
—
0.04
—
0.03
—
0.02
—
0.01
—
fiekil 15.
K›smen Saflaflt›r›lm›fl S›¤›r Rumen
Doku Arginaz›n›n, L-arginine Karfl›
Olan Km’nin Lineweaver-Burk E¤risi
ile Saptanmas›.
-1 / Km
Km = 1 / 0.25 = 4
—
—
—
—
—
—
0.00
0.0
—
0.25
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1 / [S]
aktivitesinin, MnCl2 yoklu¤unda ve preinkübasyon
s›cakl›¤›na ba¤l› olarak de¤iflim grafi¤i, MnCl2
varl›¤›ndakine paralellik göstermektedir (fiekil 4). Bu da
s›¤›r rumen dokusunun çok düflük deriflimlerde Mn++
katyonu ihtiva etti¤inin göstergesidir. fiekil 5
incelendi¤inde bir yorum daha ortaya ç›karki bu; Mn++
iyonlar›n›n preinkübasyon ortam›na ilavesi arginaz› hem
s›cakl›¤a dayan›kl› hale getirmekte hemde enzimi aktive
etmektedir (12,28).
Preinkübasyon ortam›na ilave edilen Mn++ iyonlar›n›n
enzim-substrat aras›nda bir metal köprü kurdu¤u ve
Enzim-Mn-arginin kompleksinin oluflmas›n›n enzimi
aktive etti¤i bildirilmektedir (29, 30).
Tüm bu verilerimize ve di¤er literatürlere (7, 12, 26,
28, 31, 32) dayanarak diyebiliriz ki Mn++ iyonlar›
preinkübasyon için gereklidir ve Mn ilavesi tüm
dokulardaki arginazlar gibi rumen doku arginaz›n› da
s›cakl›¤a dayan›kl› hale getirir ve aktive eder.
Arginaz›n tam aktivite gösterebilmesi, subunitlerine
dissosiye olmamas› ve quaterner yap›s›n›n flekillenmesi
için her subünitinin bir mol Mn++ içermesi gerekir (31,
605
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
33, 34). fiekil 10’da görüldü¤ü üzere, rumen doku
arginaz› saflaflt›r›lmadan önce en yüksek aktiviteyi 1mM
MnCl2 konsantrasyonunda vermektedir. Saflaflt›r›ld›ktan
sonra ise en yüksek aktivitenin al›nd›¤› MnCl2
konsantrasyonu 2mM’d›r ve 2mM’› aflan MnCl2
konsantrasyonlar›nda enzim aktivitesi belirgin olarak
düflmektedir (fiekil 11). Saflaflt›rma iflleminden sonra
aktivite için ihtiyaç duyulan MnCl2 konsantrasyonunun
artmas›n›n sebebi; daha önce belirtti¤imiz gibi jel
filtrasyon ve diyaliz aflamalar›nda metal iyolar›n›n
ortamdan uzaklaflmas›d›r.
Enzim saflaflt›r›lmadan önce ve saflaflt›r›ld›ktan sonra
en yüksek aktivitiyi 60 °C’de vermekte fakat
preinkübasyon süresi de¤iflmektedir. Saflaflt›r›lmadan
önce en yüksek aktiviteyi 10 dakikada verirken (fiekil 6),
saflaflt›r›ld›ktan sonra 5 dakikada vermektedir (fiekil 7).
Bunun nedeni; saflaflt›rma esnas›nda protein miktar›n›n
giderek azalmas› ve bu nedenle preinkübasyonda
uygulanan s›cakl›¤›n, di¤er proteinler taraf›ndan
maskelenmeyip, direk arginaz proteini taraf›ndan al›nmas›
olabilir. 60 °C’de 10 dakika preinkübe edilmifl enzim,
++
Mn ilave edilmifl fakat preinkübasyon uygulanmam›fl
enzimden, %30 oran›nda daha fazla aktivite art›fl›
göstermektedir (fiekil 6), fakat saflaflt›r›lm›fl enzim (fiekil
7) 60°C’de 5 dakika preinkübe edilirse aktivitesi %200225 art›fl göstermektedir. Böylece diyebiliriz ki; enzim
saflaflt›r›ld›ktan sonra, saflaflt›r›lmam›fla oranla daha k›sa
bir preinkübasyon süresi ile daha fazla aktive
olabilmektedir.
‹nkübasyon süresine ba¤l› olarak enzim aktivitesindeki
lineer art›fl›n 15. dakikadan sonra lineerlikten sapmas›
(fiekil 2,3) reaksiyon sonucu oluflan ornitinin, enzimin
inhibisyonuna (product inhibisyonu) neden olmas›ndan
kaynaklanabilir (29).
Arginaz›n optimal pH’s› birçok doku türünde çal›fl›lm›fl
ve argininin arginaz ile hidrolizi için gerekli optimal pH’n›n
doku türüne göre de¤iflti¤i ve bu pH’n›n 9.3-11
aras›ndaki bazik pH s›n›rlar› içinde oldu¤u bildirilmektedir
(5, 7, 12, 23, 28, 35-37). fiekil 8 ve 9’da da görüldü¤ü
gibi rumen doku arginaz› için de optimal pH alkali s›n›rlar
içindedir.
Rumen doku arginaz›n›n, L-arginine karfl› olan Km’i
Michaelis-Menten (fiekil 12, 13) ve Lineweaver-Burk
606
(fiekil 14, 15) e¤rileri ile araflt›r›ld›¤›nda Km’inin 4mM
civar›nda oldu¤u saptanm›flt›r. Enzimin, saflaflt›r›lmadan
önce ve saflaflt›r›ld›ktan sonra substrat›na olan ilgisi
de¤iflmemifltir.
Rumen dokusunun kineti¤i ile ilgili literatür
bulamad›¤›m›zdan karfl›laflt›rma yapamamaktay›z. Ancak
farkl› dokulardaki arginazlar›n, saflaflt›r›ld›ktan sonra
Km’inin de¤iflmedi¤ini gösteren literatür bilgileri mevcuttur. Mesela; ‹nsan karaci¤er arginaz›n›n saflaflt›r›lmadan
önceki Km’i 10.14mM (12), saflaflt›r›ld›ktan sonraki Km’i
yine 10.5mM’d›r (23). ‹nsan eritrosit arginaz›n›n
saflaflt›r›lmadan önce L-arginine karfl› olan Km’i 1.5mM
(38), saflaflt›r›ld›ktan sonraki Km’i 1.6mM’d›r (8).
Al›nan sonuçlar; Di¤er doku arginazlar›nda oldu¤u gibi
rumen doku arginaz›n›n da aktivasyonu için
++
preinkübasyon ve Mn katyonlar›n›n gerekli oldu¤unu
ortaya koymaktad›r. Rumen doku arginaz› için gereken
preinkübasyon ›s›s›n›n di¤er doku arginazlar›ndan yüksek
olmas› bu dokudaki arginaz proteininin s›cakl›¤a karfl›
daha stabil oldu¤unun göstergesidir.
Rumen dokusunda Krebs-Henseleit üre döngüsü
bulunmay›p (13), sadece döngünün iki enzimi olan
Arginaz ve Ornitin transkarbamilaz bulundu¤una göre
rumende bulunan bu enzimlerin; amonya¤›n
detoksifikasyonundan ziyade nitrojenli bilefliklerin, rumen
içeri¤i ile rumen veni aras›nda resirkülasyonundan
sorumlu olabilece¤i ileri sürülmektedir (14,15).
Üre sentezi olmayan rumen gibi karaci¤er d›fl›ndaki
birçok dokuda ve üreotelik olmayan baz› canl›larda aktif
arginaz enziminin bulunmas›,arginaz enziminin
amonya¤›n detoksifikasyonu ifllemi d›fl›nda da baz›
görevleri (Argininin arginaz ile hidrolizinden oluflan
ornitin; poliamin, prolin ve glutamat biyosentezi için bir
prekürsördür) olabilece¤i düflüncesini gündemde
tutmaktad›r (6, 9, 24, 39-42).
Ruminantlar›n ön midelerinde hiçbir sindirim fermenti
salg›lanmad›¤› halde sindirim olaylar›n›n en önemli
bölümü ön midelerde cereyan etmektedir. Bu nedenle
yukar›da belirtti¤imiz fonksiyonlar, fizyolojik olarak çok
aktif rumen dokusu için gerekli olup di¤er extrahepatik
dokular gibi rumen doku arginaz›n›n önemide glutamat,
prolin ve poliaminlerin biyosentezi için gerekli öncül
molekül olan ornitini üretmek olabilir.
M.ER‹fi‹R, S.T.OZAN
Kaynaklar
1.
Breazile J. E. The Ruminant Stomach. 385-394. In: “Textbook of
Veterinary Physiology”. Lea-Febiger, Ph›ladelph›a, USA, 1971.
2.
Church D.C. and Fontenot J.P. Nitrogen Metabolism and Requirements. 25-55. Ed. D.C. Church. In: “Digestive Physiology and
Nutrition of Ruminants”. 2 nd ed., Vol. 2. Nutrition, Corvallis, Oregon 97330, USA, 1971.
3.
Özgen H. Sindirim ve Emilme. 117-129. “Hayvan Besleme”.
Üçüncü bask›, Yüksekö¤retim Kurulu Matbaas›, Ankara, 1986.
4.
Webster P.D. and Zieve E. Arginase. J. Med. 1962, 267, 604607.
5.
Nikumb S.K., Santhanam K., Rama K. and Rao M.V. Hepatic and
Serum Arginase and Ornithine Transcarbamylase Activities of Rats
Maintained on Diets of Different Protein Quality. Ann. Nut. Metab.
1987, 31, 387-394.
6.
Aminlari M. and Vaseghi T. Arginase Distribution in Tissues of
Domestic Animals. Comp. Biochem. Physiol. 1992, Vol. 103 B, N.
2, pp. 385-389.
7.
Chen P.C. and Broome J.D. Mouse Macrophage Arginase. Analyt.
Biochem. 1980, 163, 354-359.
8.
Ikemoto M., Tabata M., Murach› T. and Totan› M. Purification and
Properties of Human Erythrocyte Arginase. Ann Clin
Biochem.1989, 26; 547-553.
9.
Konarska L. and Tomaszewski L. Studies on L-arginase in Developing Rat Small Intestine, Brain and Kidney. I. Ontogenic Evolution
of Arginase Isoenzymes, Biochem. Med. and Met. Biol. 1986, 35,
156-169.
10.
Ruegg U.T. and Russell A.S. A Rapid and Sensitive Assay for
Arginase. Analyt. Biochem. 1980, 102, 206-212.
11.
Lehninger A.L., Nelson D.L. and Cox M.M. Amino Acid Oxidation
and the Production of Urea. 506-538. In: “Principles of Biochemistry”. 2 nd ed., Worth Publishers, New York, 1993.
12.
Spector E.B., Rice S.C.H., Moedjono S., Bernard B. and Cederbaum S.D. Biochemical Properties of Arginase in Human Adult and
Fetal Tissues. Biochem. Med. 1982, 28, 165-175.
13.
14.
15.
16.
Martincic T. and Krvavica S. Enzymatic Investigations in the
Mucosa of the Rumen. II. On the Presence of Arginase in the Ruminal Mucosa of Cattle. Vet. Arch. Zagreb, 1964, svezak 3-4, pp.
90-93.
Harmeyer J., Kurelec B. und H›ll H. Über Funktionen der Arginase,
Urease und Ornithin-transcarbamylase. 2. Mitteilung: OrnithinTranscarbamylase funktion. Zbl. Vet. Med. 1968, Reihe A, Bd. 15,
Heft 6, 510-516.
Kurelec B., Harmeyer J. und H›ll H. Über Funktionen der Arginase,
Urease und Ornithin-transcarbamylase. 1. Mitteilung: Arginase-und
Urease funktion. Zbl. Vet. Med. 1968, reihe A, Bd. 15, Heft 5,
460-469.
Colombo J. and Konarska L. Arginase. 285-294. Ed. Bergmeyer
H.U. In: “Methods of Enzymatic Analysis”. 3rd ed., Verlag Chemie
GmbH, Weinheim. 1984.
17.
Brusdeilins M.,Kühner R. and Schumacher K. Purification, Affinity
to Anti-Human Arginase Immunoglobulin-Sepharose 4B and Subunit Molecular Weights of Mammalian Arginases.Biochim. Et Biophy. 1985, Acta 840, 79-90.
18.
Ozan, S., Gürsu M.F. ve Gülen fi. K›smen Ar›t›lm›fl Moniezia
expansa Arginaz›n›n Baz› Özellikleri. Do¤a-Tr. J. of Veterinary and
Animal Sciences. 1993, 17, 245-250.
19.
Reyero C. and Dorner F. Purification of Arginases from HumanLeukemic Lymphocytes and Granulocytes: Study of Their Phyiscochemical and Kinetic Properties. Eur. J. Biochem. 1975, 56, 137147.
20.
Skrzypek-Osiecka I., Robin Y. and Porembska Z. Purification of
Rat Kidney Arginases A1 and A4 and Their Subcellular Distribution,
1983, Vol. 30, No. 1, Acta Biochim. Polon., 83-92.
21.
Geyer J.W. and Dabich D. Rapid Method for Determination of
Arginase Activity in Tissue Homogenates. Analy. Biochem. 1971,
39, 412-417.
22.
Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein
Measurements with the Folin Phenol Reagent J. Biol. Chem. 1951,
193, 265-275.
23.
Berüter J., Colombo J.P. and Bachmann C. Purification and Properties of Arginase from Human Liver and Erythrocytes. Biochem. J.
1978, 175, 449-454.
24.
Jenkinson C.P. and Grigor M.R. Rat Mammary Arginase: Isolation
and Characterization. Biochem. Med. and Met. Biol. 1994, 51,
156-165.
25.
Schimke R.T. Arginase (rat liver). Methods Enzymol A. 1970, 17:
313-317.
26.
Halifeo¤lu ‹. ‹nsan Karaci¤er, Eritrosit ve Uterus Doku Arginaz›n›n
Kinetik Özellikleri. F›rat Üniversitesi T›p Fakültesi Biyokimya
Anabilim Dal›, Doktora Tezi. 1993.
27.
Schimke R.T. Adaptive Characteristics of Urea Cycle Enzymes in
the Rat. J. Biol. Chem. 1982; Vol. 237, No. 2, 459-468.
28.
Kuhn N.J., Talbot J. and Ward S. pH-Sensitive Control of Arginase
by Mn (II) Ions at Submicromolar Concentrations. Archs. Biochem.
and Biophys. 1991, Vol. 286, No. 1, pp. 217-221.
29.
Gürsu M.F. Çeflitli Türlerin Humor Vitreuslar›nda Üre ve Kaynaklar›n›n Araflt›r›lmas›. F›rat Üniversitesi T›p Fakültesi Biyokimya
Anabilim Dal›, Doktora Tezi, 1993.
30.
‹lhan N. ‹nsan Tiroid Doku Arginaz›n›n Kinetik Özellikleri. F›rat
Üniversitesi Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi. 1992.
31.
Muszynska G. and Wojtczak M. Influence of Immobilization on
Conformation of rat liver Arginase. Int. J. Biochem. 1979, Vol. 10,
pp. 665-668.
32.
Van Elsen A.F. and Leroy J.G. Arginase Isoenzymes in Human
Diploid Fibroblasts. Biochem. and Biophy. Res. Commun. 1975;
Vol. 62, No. 2, 191-198.
607
S›¤›r Rumen Doku Arginaz›n›n Saflaflt›r›lmas›ndan Önce ve Saflaflt›r›lmas›ndan Sonra Baz› Özellikleri
33.
Hirsch-Kolb H., Kolb H.J. and Greenberg D.M. Nuclear Magnetic
Resonance Studies of Manganese Binding of Rat Liver Arginase. J.
Biol. Chem. 1971, 246, 395-401.
38.
Sondaç Ü. Orak Hücre Hastal›¤›nda Eritrosit Arginaz Aktivitesi ve
Karbamilasyonun Etkisi. F›rat Üniversitesi T›p Fakültesi Biyokimya
Anabilim Dal›, Uzmanl›k tezi, 1991.
34.
Powers G.S. and Meister T. Urea Synthesis and ammonia Metabolism. 251-263. Edited by I. Arias, H. Popper, D. Schachter and
D.A. Shafritz. In: “The liver: Biology and Pathobiology”. Raven
Press, New York. 1982.
39.
Carvajal N. and Cederbaum S.D. Kinetics of Inhibition of Rat Liver
and Kidney Arginases by Prolin and Branched-Chain Amino Acids.
Biochim. et Biophy. Acta, 1986, 870, 181-184.
40.
35.
Colombo J. and Konarska L. Arginase. 285-294. Ed. Bergmeyer
H.U. In: “Methods of Enzymatic Analysis”. 3rd ed., Verlag Chemie
GmbH, Weinheim. 1984.
Konarska L., Tomaszewski L. and Rolczyk U. Studies on L-arginase
in Developing Rat Small Intestine, Brain and Kidney. Biochem.
Med. and Met. Biol. 1984, 35, 170-178.
41.
36.
Konarska L., Tomaszewski L., Colombo J.P. and Terheggen H.G.
Human Salivary Arginase ad Its Deficiency in Argininaemia. j. Clin.
Chem. Clin. Biochem. 1985, Vol. 23, pp. 337-342.
Remesar X., Arola LI., Palou A. and Alemany M. Activities of Amino
Acid Metabolising Enzymes in the Stomach and Small Intestine of
Developing Rats. Reprod. Nutr. Develop. 1985, 25 (5), 861-866.
42.
37.
Schimke R.T. Adaptive Characteristics of Urea Cycle Enzymes in
the Rat. J. Biol. Chem. 1982, Vol. 237, No. 2, 459-468.
Yip M.C. and Knox W.E. Function of Arginase in Lactating Mammary Gland. Biochem. J. 1972, 127, 893.
608