RAPD PCR - GEOCITIES.ws

Random Amplified
Polymorphic DNA
(Rasgele Cogaltilmis Polimorfik DNA)
RAPD
Bekir Col, Ph. D.
Mugla Universitesi
Mart 2007. Molekuler Entomoloji Kurs Notlari
Tarihsel Perspektif
• Karl Mullins’in PCR i kesfetmesinden sonra, kisa primerlerin genom
DNAsinda birkac yere baglanabilecegi fark edildi.
• 1990 Williams ve ark. RAPD teknigini gelistirdi. Bu teknik ile 10 nukleotidlik
primerler ve kalip DNA kullanilarak rasgale PCR urunleri elde edilebiliyordu .
• RAPD fragmenleri ayirt edilerek, genetik markorler olarak kullanilabildi.
Sonradan buna Molekuler Markorler dendi. (bir cesit DNA parmak izi!)
• RAPD teknigine yakin teknikler:
– DNA Amplification Fingerprinting (DAF) - Caetano-Anolles et al. (1991) 8
nt buyuklugunde primerler kullandi
– Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) - Welsh and McClelland (1990) daha
buyukce primerler kullandi ama primer baglanma kabiliyetini diger
kosullarla oynayarak arttirdi.
• Polymorphic DNA ne demektir?
– "poly" = "many" "morphic" = "shapes" (Bir cok sekil)
– DNA dizisi turler arasinda ve ayni turun farkli bireyleri
arasinda goreceli olarak cesitlilik gosterir.
– Genom DNA sindaki bazi DNA bolgeleri daha fazla
korunmustur yani cesitlilik gostermez. Bu DNA
bolgeleri biyolojik cesitliligin anlasilmasinda
kullanilmaz. Ama bazi DNA bolgeleri bireyler arasinda
orta derecede ya da cok derecede FARKLILIK
gosterebilir. Bu DNA bolgeleri Biyolojik cesitliligi
anlamak acisindan daha kullanilislidir. Bu DNA
bolgeleri RASGELE olarak RAPD primerleri ile
avlanabilir. Ya da alternatifler teknikler vardir.
Microsatellite DNA bolgeleri gibi. (Baska bir dersin
konusu)
Standard PCR ile RAPD PCR arasindaki fark
RAPD analysis, the target sequence(s) (to be
amplified) is unknown.
Design a primer with an arbitrary sequence.
Standard PCR
simply make up a 10 base pair sequence
carry out a PCR reaction and run an agarose gel to
see if any DNA segments were amplified in the
presence of the arbitrary primer.
Primerlerin baglandiklari yerler acisindan birbirine bakmasi gerekir. Ve iki primer
arasindaki mesafenin makul bir uzaklikta olmasi lazim (1-3 kb gibi)
RAPD reaksiyon #1:
Oklar primerleri isaret ediyor. Okun yonu extension (uzama) yonunu isaret eder. Rakamlar primerin baglanma
bolgelerini isaret eder.
1, 2 ve 3 numaralari boglede primerler asagidaki DNA iplikcigive baglanir. 4,5, ve 6 numarali bogedeki
primerler ise ustteki DNA iplikcigindeki tamamlayici bolgeye baglanir
Ornegin burada sadece 2 tane PCR urunu jelde gozlemlenir. Neden?
2 ile 5 primerleri urun A yi, 3 ila 6 ise urun B yi olusturur.
1 ila 4 bir urun olusturmaz cunku iki orimer birbirine baksalarda birbirinden cok uzaktalar.
4 ila 2 bir urun olusturmaz, cunku ters yone bakkiyorlar. Ha keza 5 ila 3 te de durum boyledir.
RAPD analizi ile genomlar arasinda fakliliklarin bulunmasi
Onceki slayttaki durumu dusunun. O bir bireyden elde edilmis DNA olsun. Asagidaki
Ise baska bir bireyden. Senaryo soyle olabilir.
RAPD reaksiyon #1: Figurde goruldugu gibi 2 numarali primer baglanma bolgesi bu bireyde
bulunmuyor. Yani orada polimorfizm var. Burara artik primer baglanamayacak ve 2 ile 5 in
olusturudugu PCR urunu gorulmeyecek. Sadece 3 ile 6 nin olusturdugu urun gorulecek.
Sonuc: Eger bir 2 RAPD PCR sonucunu agoroz jel elektroforezinde analiz etseydik
Asagidakini gorurduk
RAPD
KALIP
DNA
 Primer kalip DNA uzerinde bir suru yere baglanir.
 Ama sadece birbirine yakin ve 3’OH uclari
birbirine bakan primerler PCR sonucu
gozlemlenebilen urun DNA verebilirler.
RAPD
KALIP
DNA
Primerler ters yone
baktigi icin
gozlemlenebilir urun
olusturmaz
RAPD
KALIP
DNA
Primerler ayni
yone baktigi icin
amplifikasyon
(cogaltma olmaz
RAPD
KALIP
DNA
> 2,000 bases
Primerlerin
baglanma yerleri
birbirinden cok
uzak. Amplifikason
yok
RAPD
KALIP
DNA
100 - 1,500 bp
Primerlerin
birbirine olan
uzakliklari
makul.
Amplifikasyon
olabilir
Agaroz jeldeki RAPD Banlari
RAPD reaksiyonlari
3 lu tekrar olarak
yapildi. Primer ve
kalip DNA ayni ama
magnezyum kons.,
polimeraz miktari ve
primer kons
degistirildi.
4mM MgCl2 4mM MgCl2 2mM MgCl2
1.2 U Taq
0.6 U Taq
1.2 U Taq
5 pM OPA-16 10 pM OPA-16 10 pM OPA-16
M
2 3 4
5
6
7
8
9 10
M
Hangi degisken
BAND
PATERNLERINI
en cok etkiler?
Magnezyum iyon
konsantrasyonunu
azaltmak en
buyuk PCR
bandinin
sentezlenmemesin
e neden oldu. 2-7
de var, 8-10 da
yok.
Show animation at: RAPD
http://www.rvc.ac.uk/Review/DNA_1/5_RAPD.cfm
Ornek RAPD primerler
Group I was
established
between pairs
I029-I040 and
I021-I032 joined
by isolates I031,
I026, I007, I041,
I043, and I023.
Group II
comprised pair
I004-I014, and
isolates I033,
I018, I012, I003,
I006, I022, I030.
Isolate I017, which
forms group III,
showed a banding
pattern
significantly
different from the