gıda biyoteknolojisi-10

6.3.2016
What is an enzyme?
Food Biotechnology
• Reactions in living cells are carried out by the help of
biocatalysts which are called as enzymes.
• Enzymes are proteins which are specific for a specific
reactions
Enzyme Technology
Each enzyme catalyses
only one type of
biochemical reaction
The specificity of the
enzymes is due to 3D
structures of the
enzymes
• Enzimlerin katalitik gücü oldukça yüksektir. Kimyasal
tepkimelerin hızını kendiliğinden gerçekleşen
tepkimelere göre 108-1020 kat arttırırlar
• Enzimle katalizlenen bir tepkimede enzim ile substrat
geçici olarak bir araya gelir ve enzim substrat
kompleksi oluşur. Reaksiyon sonucunda oluşan ürün
enzimden ayrılır.
• E+S
ES
Enzimlerin yapısı
• Genelde küresel proteinlerdir (62 aa-2500aa).
• Çoğu enzim etki ettikleri substratlardan çok daha
büyüktür ve enzimin sadece ufak bir bölümü (3-4
amino asit kalıntısı) kataliz ile doğrudan ilişkilidir.
E + P
Kofaktörler
• Bu katalitik amino asit kalıntıların bulunduğu,
substrata bağlanan ve tepkimeyi yürüten
bölge aktif merkez (veya aktif bölge) olarak
adlandırılır.
Bazı enzimler aktiviteleri için, kofaktör denen, protein olmayan moleküllere gerek
duyarlar.
• Kofaktörler inorganik veya organik bileşikler olabilir.
• Aktif bölgede yer alan aminoasitler genellikle
Lisin, histidin, serin, sistein ve trozindir.
1
6.3.2016
Kofaktörler
Organik
Koenzim
Enzime reaksiyon
sırasıda bağlanır
Reaksiyon sonrasında
aktif merkezden
ayrılıyorsa
Koenzimlerin çoğu
vitamin ve türevleridir
NAD, NADH
KoA
Prostetik grup
Enzime sıkıca bağlıysa
İnorganik
(Aktivatör)
Metaller
Mg++, Ca++, Zn++,
K+, and Na+,
FAD (Flavin adenin
dinükleotit)
Prostetik grup enzimden
ayrılınca enzimin yapısı
bozulur
• Enzimlerin etkileri oldukça spesifiktir, yani her enzim ancak belirli
bir maddeyi parçalar
• Apoenzim: Enzimin protein
kısmına denir
• Haloenzim : Apoenzim +kofaktör
Apoenzim protein yapısında olduğu için sıcaklığa karşı daha hassastır
Koenzim veya prostetik grup ise sıcaklığa karşı daha dayanıklıdır.
Enzimin substrata bağlanması 2 şekilde olur:
Anahtar kilit modeli: Bu modelde enzimin aktif merkezi
substarata birebir benzer.
Uyarılmış uyum modeli: Bu modele göre
enzimin aktif merkezi,enzim
substrattan uzakta olduğu dönemde
substrata benzerlik göstermez. Enzim
substrata yaklaştıkça enzimin aktif
merkezi substratın şeklini alır. Uyarılmışuyum modeli
Bu iki unsur ayrı ayrı kendi başlarına aktif değillerdir (katalitik aktivite
gösteremezler)
Aktif olan haloenzimdir
Enzimlerin sınıflandırılması
Enzimler kataliz ettikleri reaksiyonun tipine göre 6 büyük gruba
ayrılırlar.
1)
Enzimler biyolojik olarak iki gruba ayrılır:
• Hücreiçi (intraselüler): Hücrenin içinde aktivite
gösteren enzimlerdir.
• Hücredışı (Ekstraselüler): Hücrede üretildikten sonra
hücredışına salgılanarak aktivite gösterirler. Protein,
selüloz, nişasta gibi Büyük molekülleri parçalar.
Gıda endüstrisinde hücredışı daha önemlidir.
(EC.1)Oksidoredüktazlar : substratların oksidasyonunu veya redüksiyonunu
katalizler (Dehidrogenaz, oksidaz)
AH + B → A + BH (redüksiyon)
A + O → AO (oksidasyon)
2) (EC.2)transferazlar: bir kimyasal grubun (metil, amin, fosfat vs) bir molekülden
diğerine transferi (Polimeraz)
AB + C → A + BC
3) (EC.3)Hidrolazlar: hidrolizle substrattan iki ürünün oluşmasını sağlarlar (lipaz, amilaz,
protez)
AB + H2O → AOH + BH
4) (EC.4)Liyazlar: iki bileşiğin yeni bir bileşik oluşturma reaksiyonunu veya tersini katalize
ederler. (dekarboksilazlar)
RCOCOOH → RCOH + CO2
5) (EC.5) İzomerazlar: bir molekülde atomların yeniden düzenlenmesini katalize eder
(glikoz izomeraz
AB → BA
6) (EC.6) Ligazlar: ATP yardımı ile iki molekülün birleştirilmesi
X + Y+ ATP → XY + ADP + Pi
2
6.3.2016
EC.1.1.1.1
Tripeptit aminopeptidaz
EC 3.4.11.4
REAKSİYO
N TİPİ
SUBSTRAT
ALT GRUP
ALT GRUP
HİDROLAZ
Enzimlerin isimlendirilmesi
• Enzimler genellikle parçaladıkları maddenin sonuna –az eki
getirilerek adlandırılırlar. Sakkaraz, maltaz, amilaz, proteaz
gibi.
• Katalizledikleri reaksiyona göre de isimlendirilirler
• -oksidaz- oksidasyon reaksiyonunu katalizler
Peptit
bağlarının
hidrolizi
Polipeptit
zincirinden
terminal aa’i
ayırır
Tripeptite
etki eder
Enzim aktivitesi
• Enzimin spesifik bir reaksiyonu katalizleme kapasitesinin
ölçümüdür
• Enzim aktivite birimi “ünite”dir
• Enzim ünitesi (U)- International unit (IU)
• Kısaca U kullanılır.
• Buna göre;
• Bir ünite enzim (U): Bir dakikada 1 µmol ürünün oluşumunu
(veya 1 µmol substratın dönüşümünü) katalizleyen enzim
miktarı
U= µmol/dak.ml
Spesifik aktivite
• Enzim aktivitesini tanımlamak için kullanılan diğer bir
birimdir.
Michaelis-Menten Kinetiği
• Enzimatik reaksiyonun hızının substrat konsantrasyonu ile
değişimini gösterir.
• Reaksiyon hızı: birim zamanda oluşan ürünün mol sayısı
• Bir enzimin spesifik aktivitesi, 1 mg protein başına
düşen enzim ünitesinin sayısıdır.
Spesifik aktivite= U/mg protein
• Saf bir enzimin spesifik aktivitesi sabittir ve o enzime
özgü bir değerdir.
Vmax=maksimum enzimatik
hız
Km= yarı maksimum hızdaki
subsrat konsantrasyonu
S=substrat konsantrasyonu
3
6.3.2016
Enzimleri aktivitesini etkileyen başlıca faktörler:
• Km: reaksiyon hızı maksimum hızın yarısı iken
ortamda bulunan substratın konsantrasyonudur.
• Km her enzimin her substratı için sabit bir değerdir.
Örn: x enziminin A substratı için belli bir reaksiyon
koşulundaki Km değeri hep aynıdır. Ancak reaksiyon
koşulu veya substrat değişirse Km değeri de değişir.
• Km değeri ne kadar düşükse enzimin o substrata
afinitesi o kadar yüksektir
ENZİM TEKNOLOJİSİ
• Enzimler canlı organizmalarda substratların kimyasal
değişimini katalizleyen kompleks protein molekülleridir.
• Enzimler in vitro koşullarda da katalitik aktivite
gösterdiklerinden, mikroorganizmaların bu proteinleri bol
miktarda üretmeleri sonucu izole edilerek çeşitli endüstriyel
alanlarda kullanılabilirler.
• Enzimlerin bu şekilde endüstriyel süreçlerde kullanılma
işlemleri topluca “enzim teknolojisi” olarak adlandırılır.
Endüstriyel uygulama alanlarına göre enzimler 4
gruba ayrılırlar
1) Deterjan enzimleri
2) teknik enzimler (tekstil, deri, etanol ve kağıt endüstrisi
enzimleri)
•
•
•
•
•
•
•
Sıcaklık
Ortam pH’sı
Enzim miktarı
Substrat miktarı
Ürün miktarı
Reaksiyon süresi
Mineral maddelerin ve inhibitör maddelerin varlığı
İnhibitör: Enzim aktivitesini azaltan moleküller
Aktivatör : enzim aktivitesini arttıran moleküller
• Enzim teknolojisi,
– mikrobiyal işlemler (üretici suşların seçimi, geliştirilmesi
vb.),
– enzimlerin fermentasyon yoluyla üretimleri (büyük ölçekte
üretimi için yapılan besiyeri, ortam koşulları vb.
düzeylerdeki optimizasyonlar),
– izolasyonları
– immobilizasyonları (enzimlerin çözünmeyen destek
materyaller yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmesi)
çalışmalarını kapsar.
Gıda ve deterjan enzimleri en büyük Pazar
payına sahiptir
• Yakıt etanol üretiminde kullanılan enzimlerde
de son 4-5 yılda yıllık 10-15% artış olmuştur.
2009 yılında toplam enzim pazarının 11%’ini
bu enzimler oluşturmaktadır.
3) gıda enzimleri
4) yem enzimleri
• 2013 yılında toplam enzim pazarı yaklaşık 7
milyar dolar olmuştur.
Gıda ve deterjan enzimleri en büyük Pazar
payına sahiptir
4
6.3.2016
Endüstriyel olarak en çok kullanılan enzimler
• Amilaz
• Lipaz
• Proteaz
• Selülaz
• ksilanaz
Dünya’daki 3 büyük enzim üreticisi şirket
• Novozymes A/S (Danimarka)
• Genencor International Inc. (ABD)
• DSM N.V (Hollanda).
• Novozymes en büyük şirkettir (% 47 Pazar payı)
Mikrobiyal enzimler,
–
–
–
–
–
süt ürünlerinin üretiminde,
biracılıkta,
etlerin işlenmesinde,
meyve sularının berraklaştırılmasında,
fruktoz şurubu üretiminde kullanılmalarıyla gıda
sektöründe,
– protein ve yağ artıklarını parçalamak üzere deterjan
endüstrisinde,
– deri ve dokuma ipliklerinin işlenmesini kolaylaştırarak
tekstilde,
– teşhis ve tedavi amacıyla tıpta kullanılmaktadırlar
Enzim üretimi
• Çoğu hücre pek çoğu az miktarda üretilen ve hücresel
süreçlerde yer alan yüksek çeşitlilikte enzim üretirler.
• Bununla birlikte bazı enzimler bazı organizmalar
tarafından çok daha fazla miktarda üretilirler.
• Enzimler tipik olarak tek kimyasal fonksiyonel grupları
hedeflediklerinden özellikle yararlı biyokatalizörlerdir.
Enzim üretimi
• Enzimlerin çoğu hücre içinde bulunurken bir kısmı
membranlara bağlıdır bir kısmı ise hücre dışına
salgılanır.
• Bir hücrenin içinde binlerce enzim bulunabileceği ve
hepsinin yapısının protein olduğu düşünülürse
bunları birbirinden ayırıp saflaştırmanın güçlüğü
anlaşılabilir.
• Ekstraselüler enzimlerin saflaştırması nispeten
kolaydır.
Endüstriyel enzim üretiminde diğer endüstriyel
mikrobiyal proses aşamaları (daha önceki
derslerde açıklanan) geçerlidir.
• Mikroorganizma seçimi, izolasyonu
• genetik manipülasyonlar (gerekirse)
• Biyoreaktör seçimi
• Üretim koşullarının optimizasyonu (T, pH,
substrat seçimi, besiyeri optimizasyonu vs)
• Ürün saflaştırma
5
6.3.2016
Enzim immobilizasyonu
• Enzimler suda çözünen spesifik katalizörlerdir
• Endüstriyel uygulamaların çoğu sulu çözeltilerde
gerçekleştiğinden katalizör olarak kullanılan serbest
enzimin aktivitesini yitirmeden geri kazanılması olanak
dışıdır
• Serbest enzim ortamdan istenilen anda
uzaklaştırılamadığından reaksiyonun kontrolü çok
güçtür.
• Reaksiyonun istenilen anda durdurulması için
inhibitör katılabilir. Ancak enzim tarafından
kirletilmiş reaksiyon ürünlerine böylece yeni
kirlilik unsuru eklenmiş olur.
• Ürünün bu kirlilik unsurlarından artırılması
maliyeti çok artırmaktadır. Bu durumda enzimin
tekrar kullanılması da söz konusu değildir.
Maliyeti arttırır.
• Ayrıca serbest enzimler sürekli sistemlere
uygulanamazlar.
• Tüm bu sorunları olumlu yönde
çözümleyebilmek için enzim immobilizasyon
yöntemleri geliştirilmiştir.
• İMMOBİLİZASYON
Enzimlerin çözünmeyen destek görevi gören
materyaller (matriksler) yardımıyla suda
çözünmeyen hale getirilmelerine
immobilizasyon denir.
Enzim immobilizasyonunda kullanılan temel yöntemler
• Kovalent bağlama: Enzimler kimyasal olarak kovalent
bağlarla selüloz, sefadeks, agaroz, poliakrilamid,
porlu seramik gibi suda çözünmeyen taşıyıcılara
bağlanırlar.
İmmobilizasyon yöntemleri
Bağlama
Taşıyıcıya
bağlama
Tutuklama
Çapraz
bağlama
Matrikste
tutuklama
İyonik
bağlama
Kovalent
bağlama
Kapsülleme
(enkapsülasyon
Adsorbsiyon
• Çapraz bağlama: Enzimler glutaraldehit, alifatik
diaminler gibi reaktiflerle çapraz bağlanırlar. Bu
reaktifler enzim molekülleri arasında bağ
oluştururlar. Glutaraldehit enzim moleküllerinin
amino gruplarından, diaminler ise karboksil
gruplarından çapraz bağlarlar.
6
6.3.2016
• Adsorbsiyon: Enzim moleküllerinin taşıyıcıların
yüzeyine adsorblanmaları esasına dayanır. Kolay bir
yöntemdir. Agaroz, sefadeks türevleri, selüloz
türevleri, metal tuzları ve mineraller adsorban olarak
kullanılırlar.
• Tutuklama: matriks veya kapsül içide tutuklama yapılabilir
• Enzimler yapay ya da doğal polimer kafesleri içinde
tutuklanırlar. Polimer kafesler içine substrat girer ve ürün dışarı
çıkar. Çapraz bağlı poliakrilamid jeller, Ca alginat, kappa
karragenan gibi polimerler kullanılır.
• Kapsül içene tutuklama: Enzimler çeşitli
tipteki membranlar içine alınırlar. Bu
membranlar yarı geçirgendir. Düşük molekül
ağırlıklı substratı ve molekülleri geçirirler.
Hegza metilen diamin mikrokapsüllemede
kullanılır.
7