Primer Design

advertisement
Hafta XII
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
EŞ ZAMANLI PCR
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
Son nokta tespitindeki eksiklikler
(End point detection)
•
•
•
•
•
•
•
Düşük hassasiyet
Düşük çözünülürlük
Otomasyon eksikliği
Yalnızca boy belirlenebilmesi
Sonuçların rakamsal olarak ifade edilmemesi
EtBr ile boyamanın nicelik belirlemede etkin olmaması
PCR sonrası işleme devam gereği (agaroz jel
elektroforezi)
www.appliedbiosystems.com
Eş zamanlı PCR Geleneksel
PCR’a Karşı
www.appliedbiosystems.com
Geometrik artış fazı/
Plato etkisi
www.appliedbiosystems.com
Örnekler arası miktar
farkının gözlendiği aşama
www.appliedbiosystems.com
Eş Zamanlı PCR Sistemleri
Eş zamanlı PCR’da saptama
yöntemleri
• Çift zincirli DNA’ya bağlanan boyalar
(SYBR Green; LC Green)
• Hidroliz probları (Taqman probları)
• Hibridizasyon probları
SYBR Green
SYBR Green
www.appliedbiosystems.com
Hidroliz Probları
www.appliedbiosystems.com
Hidroliz Probları
www.appliedbiosystems.com
Hibridizasyon Probları
www.appliedbiosystems.com
Gen ifadesinin bağıl olarak
ölçümü
Gen ifadesinin bağıl olarak
ölçümü
Referans/Standart Gen
Zorunlu İdare Genleri
(Housekeeping Genes)
• Her dokuda hücre hayatiyetini temin
için
mutlak
suretle
ifadelenen
genlerdir.
• İfade düzeylerinin doku/hücreler
arası değişmediği düşünülmektedir.
Zorunlu İdare Genleri Her Dokuda Eş
Düzeyde mi İfadelenir?
Vandesompele J ve ark, 2002, Genome Biology, 3: 7
Gen ifadesinin bağıl olarak
ölçümü
E= 10-1/slope
Erime Eğrisi (Melting Curve)
Roche “PCR Applications Manual”
Erime Eğrisi ile Genotipleme
Roche “PCR Applications Manual”
Erime Eğrisi ile Genotipleme
Roche “PCR Applications Manual”
Download