Fungus Taksonomisi ve Funguslarda Tanı Teknikleri

Fungus Taksonomisi ve Funguslarda
Moleküler Tanı Teknikleri
Minnesota Üniversitesi
Bitki Patoloji Bölümü
St.Paul, Minnesota, Amerika
26 Aralık 2013-26 Mart 2014
Danışman: Brian Steffenson
Zafer Mert
Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü
2
4
Brian J. Steffenson
Professor
Department of Plant
Pathology
University of Minnesota
Brian Steffenson ve
laboratuvar ekibi
5
Melania Figureo
C. Castell-Miller
D. Larson
Z. Mert
6
Fungus tanı Yöntemleri
• Morfolojik Karakterizasyon
• Moleküler Karakterizasyon
7
Morfolojik tanı
•
•
•
•
•
•
•
Konukçu özelleşmesi
Besi ortamı
Konidi büyüklüğü ve şekli
Kültür gelişimi ve rengi
Appressoria oluşumu ve şekli
Teleomorf yapısının olup olmaması
Diğer özellikler …
8
P. Teres kültürleri arasında farklılıklar
9
Colletotrichum aenigma.
A, C, D, E, F. ICMP 18608 –
ex-holotype culture. B.
ICMP 18616. A–B. Cultures
on PDA, 10 d growth from
single conidia, from above
and
below. C–D. Conidia. E–F.
Appressoria. Scale bar C =
20 μm. Scale bar of C
applies to C–F.
10
• Fenotipik (Morfolojik) karakterizasyon
– Stabil değil
– Çevre koşullarına göre değişkenlikler
• Genotipik (Moleküler) karakterizasyon
– Daha doğru sonuçlar
– Hızlı
– Tekrarlanabilir
– Basit-tecrübe gerektirmeyen
11
Moleküler teknikler
Gen Dizilimi analizi gerektirmeyen metotlar
• Fluorescent in situ hibridisation
• DNA array hybridisation
• Multiplex tandem PCR
Gen Dizilimi analizi gerektiren metotlar ve kullanılan bölgeler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) [615 bp],
Mitokondriyal genes (cytochrpme oxydase c subunit 1, etc)
Actin (ACT) [316 bp],
Calmodulin (CAL) [756 bp],
Chitin synthase (CHS-1) [229 bp],
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) [308 bp],
The ribosomal internal transcribed spacer (ITS) [615 bp],
Glutamine synthetase (GS) [907 bp],
Manganesesuperoxide dismutase (SOD2) [376 bp]
β-tubulin 2 (TUB2)[716 bp].
12
ITS (internal transcribed spacers)
• Taksonomik çalışmalarda tür tespiti ve türler arası ilişkilerde çok kullanılmaktadır.
• ITSs bölgeleri fungus taksonomisinde kabul gören resmi bir molekuler barkod haline
gelmiştir (Schoch et al, 2012).
•
ITS bölgeleri ribozomal RNA içerisinde tekrarlanan bir bölgedir.
• Bu bölgede 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA,
ITS2, 28S rRNA ve son olarak da 3' ETS bölgeleri bulunmaktadır.
13
• ITS 1 (5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A – 3‘)
• ITS 2 ( 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’)
14
Hastalık örneklerinin elde edilmesi
• Ülkemiz yabanmersini (Blueberry) alanlarında hastalık
oluşturan, ancak tür tespitleri yapılamamış olan bazı fungal
etmenlerin tür bazında tanımlanabilmesi amacıyla ITS
bölgeleri taranmıştır.
15
Yabanmersini Survey programı
16
Laboratuvar ve Araştırma Olanakları
• Minnesota Üniversitesi Bitki Patolojisi Bölümü Brian Steffenson’a
ait olan laboratuvarlarda çalışmalar yürütülmüştür.
• Bu laboratuvarda temel çalışmalar için gerekli olan mikroskop ve
fotoğraflama sistemleri, klasik ve kantitatif PCR sistemleri (RealTime ya da qPCR), jel elektroforez üniteleri, steril kabin, otoklav,
etüv, inkübatörler, -20ºC ve -80ºC’lik derin dondurucular,
laboratuvar tipi buzdolapları, laboratuvar tipi buz makinesi, çeker
ocak sistemi, otomatik pipetörler, profesyonel fotoğraf
makineleri, sıvı azot tankları, santrifüjler, mini spin cihazı gibi
temel donanımlar bulunmaktadır.
• Üniversite içerisinde diğer bölümlerin laboratuvarları da tüm
araştırmacıların kullanımına açık durumdadır. Patojen teşhisi için
gen sekanslamaya ihtiyaç duyulduğunda ücret karşılığında bu
hizmeti veren üniversite içi bölüm mevcuttur.
17
Fungal Patojenlerin Teşhisinde Polimeraz Zincir
Reaksiyonu (PCR) Yönteminin Kullanılması
• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) moleküler biyolojide çok
kullanılan ve organizmalardaki DNA iplikçiklerinin çoğaltılmasını
amaçlayan enzimatik bir reaksiyondur.
• Bu yöntemde ilk olarak organizmalardaki DNA izole edilmekte
ve daha sonra çeşitli enzimler ve reaksiyon bileşenleriyle izole
edilen DNA çoğaltılmaktadır.
• Çoğaltımı tamamlanan DNA agaroz jel ortamında
koşturulmaktadır.
• Bu aşamalardan sonra hedef gen dizilimi ortaya koyularak ya da
DNA büyüklüğüne göre oluşan bantlar göz önünde tutularak
patojen teşhisleri yapılmaktadır.
• Her organizmanın DNA dizilimi birbirinden farklı olduğundan
kesin tanıya varılabilmektedir.
18
DNA İzolasyonu
• Fungal organizmaların tanılanması için öncelikle miselyumdan
veya spor yapılarından DNA’nın izole edilmesi gerekmektedir.
• Bunun için agar yüzeyinde gelişen fungal koloniden spatul ile
kazınarak fungus sporları ve miseliyal kitle alınır veya pas
sporları gibi toz halinde bulunan fungal etmenlerde doğrudan
sporlar kullanılmaktadır.
• DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak temiz DNA elde edilmiştir.
19
DNA’nın Termocycler Cihazında Çoğaltılması
• İzole edilen DNA’nın çoğaltılması için termocycler cihazı ve
çeşitli enzimler gereklidir.
• İşe başlarken 1.5 ml’lik santrifüj tüpünde kokteyl hazırlanır.
• Bu kokteylin içinde Taq polimeraz enzimi, dNTP nükleotidleri,
MgCl2, nükleazdan arınmış saf su vardır.
• Bu bileşenleri içeren karışım (master mix) tüpe koyulduktan
sonra içine hedef gen bölgesini çoğaltacak oligonükleotid
(primer) eklenir ve sonra iyice karıştırılır.
20
DNA’nın Termocycler Cihazında Çoğaltılması
• Son olarak PCR tüplerine çoğaltılacak
DNA ve kokteyl karışımı bir araya
getirilip, tüpler cihaza yerleştirilir.
• Cihaz primerlerin çalışma sıcaklıkları
da dikkate alınarak programlanır ve
program süresi sonunda çoğalmış
DNA hazır durumdadır.
• Orijinal çalışma yürütülene dek farklı
optimizasyon çalışmaları ile en uygun
PCR koşulları belirlenmiştir.
21
Agaroz Jel Ortamında DNA’nın Görünür Hale
Getirilmesi
• PCR termocycler’da çoğaltılan DNA’yı görünür hale getirmek
için %1.5’luk agaroz jel kullanılır.
• Agaroz jel TBE (Tris Borat EDTA) içinde eritilir ve daha sonra
ethdium bromid gibi bazı maddeller kullanılarak jel tankına
dökülür.
• Jel tankı setinde bulunan taraklardan dolayı jelin içinde
kuyucuklar oluşur.
22
Agaroz Jel Ortamında DNA’nın Görünür Hale
Getirilmesi
• Daha sonra parafilm üzerinde SYBR green boyası ve hedef
DNA karıştırılarak mikropipetör yardımıyla kuyucuklara
doldurulur.
• Bu jel TBE tamponu içinde batık durumdadır. Tankın uçlarına
voltaj verilir ve DNA elektrik akımı doğrultusunda yürütülür.
35-40 dakika sonra jel UV aydınlatıcıya yerleştirilip DNA
bantları gözlenir.
• Oluşan bant büyüklüğü literatüre göre yorumlanarak patojen
varlığı tespit edilir.
23
DNA Dizilerinin Elde Edilmesi ve Patojen
Teşhisleri
• PCR thermocycler’da çoğaltılan DNA, dizileme işleminden önce,
çeşitli firmaların üretmiş olduğu DNA saflaştırma kitleriyle saf
hale getirilirler.
• Daha sonra saflaştırılmış DNA örnekleri özel tüpler içerisinde
dizileme cihazına yollanırlar.
• Dizileme cihazında nükleotid baz dizilimleri belirlenen hedef
bölgenin kodları, elektronik dosya halinde araştırıcıya iletilir.
• Daha sonra bu diziler internet ortamında uluslararası gen
bankasında araştırılarak, söz konusu patojenin teşhisi %100
olasılıkla tespit edilebilmektedir.
24
2
FUNGUS
İZOLASYONU
…
ÖRNEKLERİN
HAZIRLANMASI
Fungal Kültür
karakterizastonu
Yüzey sterilizasyonu
Konidi karakterizasyonu
…
4
MORFOLOJİK
TANIMLAMA
Kültür gelişimi
PDA, MEA or WA
Patojen izolatlar
5
…
…
Tek konidi veya
hif ucu kültürü
…
DNA EKSTRAKSİYONU
CTAB Method
PATHOGENICITY
TEST
…
3
MOLEKÜLER
TANIMLAMA
INOCULATION
Highbush blueberry
cv. Bluecrop
…
PCR İŞLEMİ (ITS1, ITS2,
5.8 rDNA)
Yaralı yaprak ve
Dal
Hastlık etmeni olmadan kontrol
Inkubasyon :
23 ± 2 °C (gündüz)
18 ± 2 °C (gece)
Yaralı olmayan
Yaralı yaprak ve
yaprak ve dallar
Dal
Symptom evaluation (dpi):
• Leaves:
Wounded: 10-25
Unwounded: 20-32
• Twigs
Wounded:40
Gen Diziliminin ortaya
çıkarılması (Sequencing
both forward and reverse
amplicons)
…
Hastalık etmeni miselyumlar ile
Yaralı olmayan
yaprak ve Dal
…
1
BLAST araştırma
(GenBank)
25
NCBI-BLAST
26
Sonuçlar
- Morfolojik ve moleküler tanımlama
- Fungus koloni özellikleri PDA ortamındaki gelişimine göre belirtilmiştir.
A. Botryotinia fuckeliana (e-value= 0.0, percentage of
identity=99, percentage of sequence coverage=100)
Grey to brown
mycelia with
development
of sclerotia
structures
Conidia are
unicellular,
ovoid, 7.7 µm x
10 µm.
Leaf symptoms
are circular
brown spots.
C. Guignardia mangiferae (Phyllosticta sp.) (e-value= 0.0,
percentage of identity=100, percentage of sequence
coverage=100)
Colonies
are oliveblack to
black, with
irregular
margins.
Conidia are Lesions in leaves are brown
unicellular, spots.
with
guttules
and single
appendage,
of 7.6 µm x
10.8 µm in
size.
B. Collectotrichum gloeosporioides (e-value= 0.0, percentage
of identity=100, percentage of sequence coverage=100)
Colonies are
orangebrown
Conidia
unicellular,
hyaline,
with round
ends, 5.35
µm x 15.6
µm.
Collectotrichu Gray to
m
brown
gloeosporioide elongated
s appressorium spots in
11.65 µm x 15.6 twigs.
µm.
27
APS (American Phytopathology Society)
Kongresi, Minnesota
Identification of fungal pathogens
isolated from blueberry gardens in
Turkey
• M. Figueroa 1, T. Dil 2, C. Castell-Miller 1, B. Steffenson
1, A. Karakaya 2, A. Çelik Oǧuz 2, Z. Mert 3
•
1
University of Minnesota, St. Paul, MN, U.S.A.; 2 Ankara University,
Faculty of Agriculture, Department of Plant Protection, Ankara,
Turkey; 3 Central Research Institute for Field Crops, Yenimahalle,
Ankara, Turkey.
28
TAHIL HASTALIKLARI LABORATUVARI
29
UG99 kara pas ırkının RT-PCR ile belirlenmesi
• Araştırma Amerika Tarım bakanlığına Bağlı olarak çalışan Tahıl
hastalıkları Laboratuvarı ile de ortak çalışmalar yürütülmüştür.
• (RT-PCR) kullanılarak elimizde mevcut olan bir kara pas
örneğinin kara pas hastalığında dünyada agresif bir ırk olan
UG99 kara pas ırkı olup olmadığı belirlenmiştir.
• Çalışmada UG99 kara pas ırkını tanımlayan özel problardan
yarrlanılmıştır.
30
• Buna ek olarak Tahıl hastalıkları
Laboratuvarı kara pas ve
kahverengi pas ırk çalışmaları
konusunda bilgiler edinilmiştir.
• Kahverengi ve kara pas da ırk
belirleme çalışmaları hakkında
bilgi alınmıştır.
• İşbirliği gerçekleştirmek için
görüşmeler yapılmıştır.
31
32
33
34
35
TEŞEKKÜRLER…
36