Blotlama Teknikleri
advertisement
Blotlama Teknikleri Southern Blot (1975) • Bu yöntemde izole edilen DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilir ve belirli sayı ve uzunlukta DNA frangmentlerinin oluşumu sağlanır. Agaroz jel elektroforez yöntemi ile jel üzerinde büyüklüklerine göre birbirinden ayrılan bu fragmentler önce yüksek pH ile denatüre edilip blot yöntemi ile nitroselüloz filtre üzerine geçirilir. Southern Blot (1975) • 32p (ya da başka bir radyoaktif olmayan nükleotit analoğu) ile işaretli denatüre edilmiş ve incelenecek bölgeye özgü prob, filte üzerinde tutulan fragmentler ile uygun koşullar sağlanarak hibridize edilir. Sonra filtre üzerine bir röntgen filmi konularak otoradyografi işlemi gerçekleştirilir. Prob yalnızca kendisine tümleyici bazları içeren DNA fragmenti ile hibridize olacak ve otoradyogram sonucu bu bandın üzerinde gözlenebilecektir. Western Blot • Western blot, moleküler biyolojide, bir protein solüsyonunda, aranan bir proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle HIV (+) bulunan örneklerin doğrulanmasında başvurulur. Western Blot • Sds-page uygulandıktan sonra, elektro blotting yöntemiyle proteinler bir membrana geçirilir. Daha sonra çeşitli solüsyonlarla işleme tabi tutulan membrandaki proteinlere spesifik antikorlar bağlanır. Bu antikorların tespit edilmesiyle proteinin olup olmadığı, çıkan bantların kalınlığının kontrol bantlarıyla karşılaştırılmasıyla da ne kadar olduğu anlaşılır. Western Blot Northern Blot • Bu teknik Southern blot'a çok benzer, ancak bu yöntemde DNA yerine mRNA veya virüs RNA'sı kullanılarak işlem yürütülür. Prob olarak, RNA'ya eşlenik olan işaretli 32p cDNA veya cRNA'dan yararlanılır. Testin yapılışı ve değerlendirilmesi Southern blot hibridizasyonunda olduğu gibi, filtre üzerine bir röntgen filmi konularak otoradyografisi gerçekleştirilir. Filtre üzeride RNA-DNA ya da RNA-RNA hibridizasyonu gerçekleştirilir. Northern Blot
