MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

MOLEKÜLER DNA DİZİ ANALİZ
YÖNTEMLERİ

DNA dizi analizleri ya da sekanslama; DNA birincil (temel)
yapılarının belirlenmesinde kullanılan yöntemlerdir, DNA’nın
nukleotid dizilerinin saptanması anlamına gelir.

DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları
hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır.

Özellikle kalıtsal hastalıkların meydana gelme ve tedavi
süreçleriyle ilgili mekanizmaların anlaşılması için, araştırma
yapılan konuya etki eden gen bölgelerinin belirlenmesi gerekir.
2

Bu bakımdan DNA dizi analizlerinin yapılması, tedavi sürecinin
başlangıcı ve devamında izlenecek yolu belirleyen en önemli
faktördür.

DNA dizi analizi ile birçok organizmanın genlerinin yapısı ve
organizasyonu hakkında önemli bilgiler elde edilmiştir.

Birçok canlı türünün tüm genom haritaları tanımlanmıştır
3

Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.) tespiti yada
rekombinant DNA oluşum yapılarının tayininde kullanılır

Preimplantasyon tanısı, kalıtsal hastalık tayininde oldukça sık
kullanılır.

Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek embriyolarından
alınan DNA’lar bu yöntemle analiz edilerek taşıyıcı embriyolar
elenip, genetik hastalık taşımayanların doğması sağlanmaktadır.
4
Tarihçe

DNA’nın 3 boyutlu yapısı, 1953 yılında tanımlandıktan sonra dizi
analiz çalışmalarına öncülük oluşturacak ilk denemeler küçük
RNA parçaları ile çalışılmış olup, Robert Holley tarafından 1965
yılında tRNA molekülünün dizi analizi yapılmıştır.

1977 yılında Allan Maxam-Walter Gilbert ve Sanger tarafından
iki farklı DNA dizi analiz yöntemi bulunmuştur.

Otomatik dizi analiz cihazları 1985 yılından itibaren
geliştirilmiştir.

1992 yılında 21. kromozomun DNA dizi analizi tamamlanmıştır.
1999 yılında insanın 22. kromozomunun DNA dizisi
tamamlanmıştır.

5
Nükleik asitler

Nükleik asitler genetik bilginin depolanması ve ifade
edilmesinden sorumlu moleküllerdir.

DNA ve RNA olmak üzere iki tip nükleik asit vardır.

Nükleik asitlerin yapısında:
- Pürin ve primidin bazları
- Şekerler
- Nükleozidler
-Nükleotidler
-Polinükleotidler
6
Şekerler

DNA da 2-deoksiriboz, RNA da ise riboz şekeri bulunur.

Nükleik asit şekerlerinin 3 karbon atomuna bağlı OH grubu
kendisinden sonra gelen nükleik asit şekerinin 5 karbon
atomuna bağlı fosfat grubu ile reaksiyona girerek ester bağı
oluşturur.
7
Pürin ve pirimidin bazları

Adenin, guanin, hipoksantin ve ksantin pürin bazlarıdır.

Adenin ve guanin hem DNA hemde RNA’ nın yapısında
bulunmaktadır.

Hipoksantin ve ksantin nükleik asit yapısına katılmazlar.

Urasil, timin, sitozin ve oratik asit pirimidin bazlarıdır.

Sitozin hem DNA hem de RNA’ da, urasil ise sadece RNA’ da
bulunur.
8

NÜKLEOZİD:
Pürin yada pirimidin bazına şeker eklenmesi ile oluşur.

NÜKLEOTİD:
Nükleozidlere fosfat grubunun eklenmesi ile ortaya çıkar.
Genellikle fosfat grubu şekerin 5 karbonuna ester bağı ile bağlı
durumdadır.
9
DNA’NIN YAPISI

Nükleotidlerin arasındaki hidrojen bağları iki zinciri bir arada tutar.

Nükleotidler birbirlerine şeker-fosfatlar aracılığıyla kovalent
bağlanmışlardır.

Nükleotid alt birimlerinin birlikte sıralandıkları şekil DNA dizisine
kimyasal bir kutupluluk verir. Bir DNA zincirindeki bu kutupluluk bir
uca 3̀ ve diğer uca 5̀ ucu adı verilerek belirtilmiştir.
.

Bir DNA molekülü dört tip nükleotid alt biriminden oluşan iki uzun
polinükleotid zincirinden meydana gelmiştir.
10
DNA
11

DNA’nın üç boyutlu yapısı (çift sarmal), iki polinükleotid zincirinin
kimyasal ve yapısal özelliklerinden kaynaklanır.

İki zincir farklı iplikler üzerindeki bazların arasındaki hidrojen
bağlarıyla bir arada tutulduğundan bütün bazlar çift sarmalın iç
tarafında, şeker-fosfat omurgası ise iç taraftadır.

Her durumda adenin(A), timin(T) ile ve guanin(G) her zaman
sitozin(C) ile birleşir.
G ve C arasında üç, A ve T arasında iki hidrojen bağı vardır.
Bu eşleşmeler baz çiftinin çift sarmal içinde enerji açısından en
uygun şekilde paketlenmelerine izin verir.
Şeker fosfat omurgası 10 baz çiftinde bir tam dönüşle bir çift sarmal
oluşturmak üzere birbirinin etrafında döner.



12
DİZİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

Geleneksel yöntemler:
- Sanger dideoksi yöntemi
- Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemi

Shotgun

Pyrosequencing
13
Her iki geleneksel teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır.
• DNA’nın hazırlanması
• Reaksiyonlar
• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
14
• Geleneksel yöntemlerde analiz sırasında
tek iplikli DNA parçaları
hazırlanır.
• DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temel fark DNA parçacıklarının
üretilme biçiminden kaynaklanır.
•Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNA moleküllerini ayrıştırdığı için
her iki metot da kullanılır.
15
MAXAM-GİLBERT DİZİLEME YÖNTEMİ

Farklı uzunluktaki DNA parçalarının oluşumu ile sonlanan DNA’
yı kesmek için kimyasalların (Hidrazin, dimetil sülfat ya da
formik asit) kullanıldığı yöntemdir.

Tek bir sekans jelinde 40 klonun analiz edilmesini sağlar.

Yöntemin temel prensibi, DNA’ da bulunan bazların kimyasallar
kullanılarak değiştirilmesine ve daha sonra değişikliğe uğramış
nükleotidlerin (Piperidin) bulunduğu noktalardan zinciri kırması
esasına dayanır.
16
Maxam Gilbert yöntemi

Pürinlerin kırılmasında dimetil sülfat kullanılır.

Bazik ortamda DNA guanin bazından kırılırken asidik ortamda
DNA adenin bazından kırılır.

Primidin bazlarının kırılması hidrazin ile yapılır.

Hidrazin DNA’yı hem sitozin hem de timin bazından kırar.

Yüksek tuz derişimi ve bazik ortamda DNA sitozin bazından
kırılır.
17
Maxam Gilbert yönteminde kullanılan kimyasallar
Özgül baz
Baza özgül
Baz ayırmada
kullanılan
Zincir kırmada
kullanılan
G
Dimetil sülfat
Piperidin
Piperidin
A+G
Asit
Asit
Piperidin
C+T
Hidrazin
Piperidin
Piperidin
C
Hidrazin+baz
Piperidin
Piperidin
18
Maxam Gilbert yöntemi

Bu yöntemde nükleotid dizisi saptanacak DNA, önce 5̀ ucunda P ile
ya da floresan bir boya ile işaretlenir.

DNA’ nın iki iplikçiği birbirinden ayrılarak, ya da DNA uygun bir
restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’nın bir ucundan işaretlenmesi
sağlanır.

İkinci adımda ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G, T
nükleotidlerini kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir.
19
Maxam Gilbert yöntemi

Reaksiyon sonunda her tüpte farklı pozisyonlardaki hedef
nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir.

Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5̀ ucundan işaretli
ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA parçası elde edilmiş olur.

Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri jel elektroforezi ile
birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi
uygulanarak bantlar görüntülenebilir.
20
21
SANGER DİZİLEME YÖNTEMİ

Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve en yaygın
kullanılan dizi analiz tekniğidir.

Yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek
iplik için kalıp olarak kullanılır.

DNA sentezi sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, ters
transkriptaz yada sequenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.
22
Sanger dizi analiz yöntemi

Yöntemin temeli, DNA polimerazın dNTP (deoksiribonükleozid
trifosfat) ve ddNTP (dideoksiribonükleozid trifosfat) leri de
substrat olarak kullanabilmesi esasına dayanır.

Teknik olarak dizi analizi 3 basamaktan oluşur.
a ) polimeraz zincir reaksiyonu
b ) dizileme reaksiyonu
c ) jel elektroforezi ve bilgisayarda değerlendirme
23
İŞLEYİŞ



DNA tek zincir haline getirilir.Reaksiyona girecek olan karışımda bol
miktarda dört çeşit normal nükleotid bulunur.
 dATP
 dGTP
 dCTP
 dTTP.
Karışımda aynı zamanda diziyi rastgele sonlandırmak için farklı
renkte flouresan kimyasallarla işaretlenmiş dideoxynukleotidler
vardır.
 ddATP
 ddGTP
 ddCTP
 ddTTP
DNA polymerase I ise sentezde zincirin uzaması aşamasında
gereklidir.
24
Sanger dizi analiz yöntemi


PZR’ da denatürasyon, bağlanma ve uzama basamakları ile
hedef DNA çoğaltılır.
Dizileme reaksiyonu için gerekenler:
-DNA kalıbı
-Taq DNA polimeraz (tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında
tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim
türüdür.)
-Primer
-Deoksinükleotid (d NTP)
-Dideoksinükleotid (ddNTP)
25
Sanger dizi analiz yöntemi

DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’ler ortama konulup
işaretli nükleotitin yapıya katılması sağlanır.

Kullanılan ddNTP’lerin konsantrasyonu diğer maddelerden daha
düşük olmalıdır.

İşaretleme primere de yapılabilir. İşaretlemeden sonra zincir
sonlanması reaksiyonlarına geçilir.
26
Sanger dizi analiz yöntemi

Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Her tüpe gerekli
enzim faktörleriyle birlikte düşük derişimli farklı ddNTP’ler
konulur ve inkübe edilir.

ddNTP’ler ve dNTP’ler aynı karışıma konduğunda aralarında bir
yarışma olur. Substrat olarak dNTP’ler kullanıldığı sürece
uzama devam eder. Sentezin herhangi bir noktasında yapıya
dideoksi girdiğinde reaksiyon durur.
27
Sanger dizi analiz yöntemi

Her tüpte aynı anda birbirinden bağımsız birçok reaksiyon
olmuştur.

Sonuçta primer sonundan başlayıp prematüre sonlanmaların
olduğu bölgelere kadar çeşitli uzunlukta DNA parçaları oluşur.

DNA dizi analizi sonucu elde edilen DNA dizileri jel üzerinde
gümüş boyama, radyoaktif ve flouresan boyalarla işaretlenerek
tespit edilebilir.
28
Sanger dizi analiz yöntemi

Dizileme reaksiyonu PZR gibi üç ana basamakta ve 30-40
döngüde gerçekleşir.

Sentezlenen DNA ya bir ddNTP’nin katılması 3̀ pozisyonunda
OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.

Reaksiyon sonunda deoksinükleotidlerle uzamış ve ddNTP lerle
sonlanmış diziler elde edilir.

Sonlandırıcı özellikteki bazlar flouresan boyalarla işaretlenebilir.
29
Bu resim için web sitesi
the-scientist.com
•Tam boyutlu resim - Aynı boyutlux daha büyük
Boyut: 752 × 532
Tür:
109KB JPG
Bu görselin telif hakkı korunuyor olabilir.
30
Sanger dizi analiz yöntemi

Elde edilen DNA dizilerine jel elektroforezi uygulanabileceği gibi
otomatik dizi analizi cihazlarınca okuma yapılabilir.

Jel elektoforezinde DNA parçaları elektriksel alanda
uzunluklarına göre sıralanır ve DNA dizisi jelden okunur.

Poliakrilamid jeller yüksek ayırım gücüne sahiptir.

Poliakrilamid jeller uygun süre ve uygun voltajda tek bir
nükleotid farkını bile ayırabilir.
31
32
OTOMATİK DİZİ ANALİZİ

İnsan Genom Projesi gibi büyük projeler çok sayıda DNA dizi
analizi yapılmasını gerektirmektedir.

Artan analiz sayısı, uzun zaman ve yüksek iş gücü gerektirir.

Bu gelişmeler sonucunda otomasyon kaçınılmaz olmuştur.

Otomatik DNA dizi analizleri zaman kazancı yanında, standart
çalışma koşulları ve elde edilen sonuçların değerlendirilmesinde
de yarar sağlamıştır.

Otomatik analizde de Sanger’in enzimatik DNA sentezine
dayanan zincir sonlanma yöntemi kullanılmıştır.
33
Otomatik dizi analizi

Otomatik DNA dizi analiz cihazları basit olarak sabit bilgisayarda
yüklü programlar ile bu programların yönettiği elektroforez
sistemini içerir.

Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile
monokromatik bir ışık oluşturulur.

Söz konusu DNA’nın bulunduğu jel matriks bu monokromatik
ışık ile taranır.
34
Otomatik dizi analizi

Elektroforez süresince DNA’ya bağlanan flouresan boya ışık ile
taranan bölgeye geldiğinde uyarılır.

Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı
geri yansıtır.

Yansıyan bu ışık demeti bir dedektör tarafından kaydedilir.

Bu veriler bilgisayar programları ile değerlendirilerek sonuçlar
grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılır.

Dizi analiz cihazları ile 6 bazdan 1000 baza kadar güvenli
okuma yapılabilmektedir.
35
Otomatik DNA dizi analizi cihazı



Sabit bilgisayarda yüklü programlar
Programın yönettiği elektroforez sistemi
Poliakrilamid jelin yerini polimer almıştır
36
37
SHOTGUN DİZİLEME YÖNTEMİ

Bu yöntemde çok büyük klonlanmış DNA parçaları bir çok
parçaya bölünerek alt klonlar halinde dizileme yapılır.

DNA parçaları sekanslandıktan sonra orijinal DNA yeniden
yapılandırılmaya çalışılır.

Bu yöntemde amaç; hem hız kazanmak hem de doğruluk oranı
daha yüksek sonuçlara ulaşmaktır.

Yaklaşık 10000 bazda 1 hata oranı ile çalışıldığı kabul edilir.

Özellikle kromozom analizlerinde ve genom projelerinde tercih
edilir.
38
PYROSEKANSLAMA

Dizi analizi için en sık kullanılan yöntem olan Sanger metodunun
uzun sürmesi, bir çok aşamayı içermesi gibi çeşitli
dezavantajlarını ortadan kaldıran, 1986 yılında Pal Nyren
tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir.

Single-nükleotide addition (SNA) yani tek nükleotid eklenmesi
yöntemi ile dizi analizi yapmaktadır.
39
PYROSEKANS

Sentez yaparak dizi analizi yapma prensibine dayanır.

DNA sentezi esnasında açığa çıkan pirofosfat’ların saptanması
esasına dayanan bir real-time (gerçek-zamanlı) kantitatif dizi
analizi tekniğidir.

İşlem PZR ürünlerinin tek zincir DNA (ssDNA) ya dönüşmesi ile
başlar .

Tek sarmal DNA kalıp olarak kullanılmak üzere izole edilir, her
bir primer çifti biotin ile 5' ucundan işaretlenir.
40
Pyrosekans aşamaları
1.Aşama

Sekans primeri PZR ile çoğaltılmış olan bir tek zincir DNA ile
hibridize edilir.

Enzim olarak DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lüsiferaz ve apiraz
kullanılır.

Substrat olarak adenozin 5‘ fosfosülfat ve lusiferin ile inkübe edilir.
41
Pyrosekans aşamaları
1.Aşama



Sekans primeri + ssDNA kalıbı
hibridizasyon

Enzimler:
DNA polimeraz, ATP sülfürilaz,
lusiferaz ve apiraz,
Substratlar:
Adenozin 5’ fosfosülfat (APS) ve
lusiferin
42
2. Aşama




d NTP (deoksiribonükleotid trifosfat) lardan ilki reaksiyona
eklenir.
Eğer dNTP kalıp DNA’ daki baza komplementer ise ortamda
bulunan DNA polimeraz, bu dNTP’nin DNA sarmalına
eklenmesini kataliz eder.
dNTP DNA kalıbına bağlanırken dNTP üzerindeki 2 adet fosfat
açığa çıkar ve ortama 2 fosfatlı bir yapı olan pirofosfat (Ppi)
ortama geçmiş olur.
Her nükleotid eklenmesinde bir pirofosfat serbest kalır.
43
3. Aşama

Ortama çıkan pirofosfat; ATP sulfurylase yardımı ile ATP’ ye
çevrilir.

Oluşan ATP’ nin yardımı ile lusiferin, oksilusiferin’ e dönüşür.

Oksilusiferin ise görünür bir ışın yayar.

Oluşan bu ışın miktarı ATP miktarı ile orantılıdır.

Oluşan ışın CCD (kızıl ötesi) kamera ile tespit edilir ve seri
tepecik şeklinde kaydedilir.
44



Işınların seri tepecik şeklinde kaydedilmesine Pyrogram adı
verilir.
Işın pyrogramda bir yükseklik veya tepecik şeklinde görülür.
Her bir tepeciğin yüksekliği eklenmiş olan nükleotid sayısıyla
orantılıdır.
45
3. Aşama
ATP sülfirilaz
PPi
ATP
(Adenosine 5’ fosfosulfat (APS))
lusiferaz
Lusiferin
oksilusiferin
(ATP)
46
Pyrogram


Işın miktarı ATP miktarı
ile orantılıdır
Işın Pyrogram’da bir
yükseklik olarak görülür
47
4. Aşama





Nükleotid parçalayıcı bir enzim olan apiraz devamlı olarak ATP
ve dNTP’ leri parçalar.
Böylece ışık oluşumu kesilir. Yani ortamda yeni reaksiyon
oluşturacak d NTP ve ATP kalmamış olur ve bu şekilde ortam
ikinci nükleotidin ilave edilmesine hazırlanmış olur.
Bu teknoloji ile DNA parçacığının 100 nükleotidi okunmuş olur.
Dört enzimin yer aldığı bu aşamalar kapalı bir sistemde, plakta
ve tek bir kuyucukta yapılabilir.
İşlemin süresi kısadır.
48
4. Aşama


Apyrase ATP’yi ve bağlanmamış olan dNTP’leri parçalar  ışık
kesilir.
Reaksiyon solüsyonu yenilenir.
49
5. Aşama

Komplementer DNA zinciri
yapılır.

Nükleotid dizisi
Pyrogram’daki sinyal
tepeciklerinden saptanır.

Pyrogram’da iki kat yükseklik
gösteren tepecikler eş iki
nükleotidin ardarda
bağlanması sonucu
oluşmaktadır.
50
Pyrosekans Prensibi
51

PZR aşamasından sonra pyrosequencing, sekanslanacak baz
sayısına bağlı olarak 10 dakika kadar kısa sürede sonuç
verebilmektedir ve kolaylık, eleman, zaman ve maliyet açısından
avantajlara sahiptir.

Halen bir PZR ürününün dizi analizini yapan en hızlı yöntemdir
ve doğruluk oranı oldukça yüksektir.

Sanger tekniğindeki gibi işaretli primer, işaretli nükleotid ve jel
elektroforezine ihtiyaç olmaması bu tekniğin önemli
avantajlarıdır.
52
Kullanım Alanları







Metilasyon analizleri
Heteroplazmik DNA sekanslaması,
Adli tıp analizleri,
Viral tiplendirme ve direnç,
Bakteriyal tiplendirme ve direnç,
Fungal tiplendirme ve direnç,
İnsersiyon, delesyon saptanmaları
53

Herhangi bir örnekten elde edilen DNA ve RNA’ ya
uygulanabilir.

Klinik araştırmaları kolaylaştırmakta ve hızlandırmaktadır;
örneğin Alzheimer hastalığı, otoimmün hastalıklar, koroner arter
hastalığı, diabet vb…
54
Mikrobiyoloji açısından faydaları




Mikrobiyal sekansı 1 saat içinde yapabilmektedir.
Gerçek DNA sekans verilerinin klinik olarak uygun bir süre içinde
elde edilmesi,
Tür tanımlaması ve direnç karakterizasyonunun tek bir sistem
içinde yapılabilmesi,
Multi-kopya (çok kopyalı) genlerin miktar tayinleri-antibiyotik
direnç tanımlaması, viral ve fungal yük ölçülebilir.
55
MİKROBİYOLOJİDE DİZİ ANALİZİ

Mikrorganizmaların tanımlanması veya sınıflamadaki yerlerinin
belirlenmesi

Salgınlara yol açan etkenlerin belirlenmesi
İlaç direncinin belirlenmesi


Mikroorganizmadaki virülans, metabolik enzimler ve düzenleyici
genlerin moleküler seviyede incelenmesi

Genotiplerin belirlenmesi

Mutant suşların belirlenmesi
56
KAYNAKLAR

Uygulamalı moleküler mikrobiyoloji, Prof. Dr. Rıza Durmaz

Klinik mikrobiyolojide pyrosekans kursu, Kurs özet kitabı
57

teşekkürler