Full Text - Erciyes Medical Journal

ARAÞTIRMALAR (Research Reports)
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer
Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü
Flow Cytomeric Measurement of Nuclear Protein Content induced by
Intensive Sporting Exercise
Zuhal Hamurcu
PhD.
Assist. Professor of Medical Biology
Erciyes University
[email protected]
Nazmi Sarýtaþ
PhD.
Assist. Prof. of College of Physical Education and Sports
Erciyes University
[email protected]
Halil Demirtaþ
Assist. Professor of Medical Biology
Erciyes University
[email protected]
Özet
Amaç: Yoðun sportif egzersiz, bedendeki oksidatif stres oluþumunu tetiklemektedir. Genelde
hücre çekirdeðindeki oksidatif baský, DNA hasarýna ve nükleer proteinlerin deðiþimine neden
olmaktadýr. Organizmayý mütasyonlardan korumak için, DNA hasarý mümkün olduðu kadar
kýsa sürede onarýlmak zorundadýr. Bunun için onarým proteinleri gereklidir. Bu yüzden,
çalýþmamýzýn amacý, yoðun egzersizden dolayý nükleer protein içeriðinde bir deðiþikliðin olup
olmadýðýný araþtýrmaktýr.
Gereç ve Yöntem: Yaþ ortalamasý 21,92±3,34 olan elit düzeyde 12 erkek atlet öðrenciye
koþu bandýnda Brouce protokolüne göre egzersiz yaptýrýldý. Sporculardan egzersiz öncesi,
egzersizden hemen ve 24 saat sonra periferal kan örnekleri alýndý. Periferal kan mononükleer
hücrelerden çekirdek izole edildi ve DNA/protein ölçümü için, sýrasýyla propidium iyodid /floresan
izotiyosiyanat ile boyandý; akým sitometride ölçüldü.
Bulgular: On sporcunun nükleer protein içeriðinde, egzersiz öncesine göre, egzersizden hemen
sonra artýþ bulunurken (p=0,001), egzersiz öncesi ile 24 saat sonrasý arasýnda fark bulunamadý.
Sonuç: Bulgularýmýza göre, yoðun egzersiz sonucunda hücre çekirdeðindeki oksitlenmeyi/
hasarý önlemek için protein içeriðinde bir artýþ olmakta ve bu proteinler görevlerini yaptýktan
kýsa bir süre sonra yeniden sitoplazmaya geçmektedirler.
Anahtar kelimeler: Akým Sitometri; Egzersiz; Nükleer Proteinler.
The present study was presented at the Xth National Medical
Biology and Genetics Congress, 6-9, September, 2007, Antalya.
Submitted
Revised
Accepted
: March 25, 2010
: June 15, 2010
: July 06, 2010
Abstract
Purpose: Intensive exercise induces oxidative stress. Oxidative stress may cause DNA damage
and protein modifications. DNA damage should be repaired as soon as possible to avoid
mutation to the organism. For this purpose, repair proteins are required. The aim of this study
is to test whether or not intensive exercise results in an alteration in nuclear protein content.
Material and Methods: Twelve athletes were exposed to exercise on a treadmill. Buruce
protocol was used for exercise. Peripheral bloods with heparin samples were obtained from
athletes before, immediately after, and 24 hours after the exercise. Nuclei from peripheral
blood mononuclear cell were isolated and stained with propidium iodide, and fluorescein
isothiocyanate for DNA and proteins measurement respectively, and was measured.
Results: While an increase in the nuclear protein content of 10 athletes were increased
immediately after exercise compared with that before exercise (p=0.001), no difference was
found between the pre- and post-exercise.
Conclusion: Our findings suggest that intensive exercise induces an increase in the protein
content to prevent the oxidation/damage in cell nucleus and these proteins return to cytoplasm
after fulfilling their duty.
Key words: Exercise; Flow Cytometry; Nuclear Proteins.
Corresponding Author:
Yard. Doç. Dr. Zuhal Hamurcu
Erciyes Üniversitesi Týp Fakültesi
Týbbi Biyoloji Anabilim Dalý
38039 Kayseri – Turkey.
Phone : +90- 352 437 49 01 / 23334
e-mail : [email protected]
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160
155
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü
Giriþ
Düzenli egzersizin, birçok patolojik hastalýklarýn oluþma
riskini azalttýðý, yaþam ömrünü uzattýðý için saðlýk açýsýndan
yararlý olduðu bilinmektedir. Bununla birlikte, uzun
süreli/yoðun egzersiz sýrasýnda alýnan oksijen miktarýnýn
artmasýyla birlikte, reaktif oksijen türlerinin (ROT) aþýrý
üretilmesi, oksidatif stresi artýrarak saðlýða zarar
verebilmektedir (1- 4). Oksijen canlýlarýn yaþamlarýný
sürdürebilmeleri için mutlak gerekli bir elementtir. Oksijen,
hücre içinde dört elektron gerektiren bir dizi reaksiyon
sonucunda indirgenir (H2O’ya dönüþür) ve bu sýrada hücre
kendisi için gerekli olan enerjiyi saðlar. Bu süreçte
oksijenin az bir kýsmý (%1- 3) tam olarak suya dönüþmez
ve bu reaksiyonlarda ara ürün olarak serbest radikaller
olan süperoksit anyonu (-O2), hidrojen peroksit (H2O2)
ve hidroksil radikalleri (-OH) oluþur. Serbest radikaller
bir veya daha fazla ortaklanmamýþ elektron ihtiva eden
atom veya moleküllerdir. Oksijenin normal metabolizma
basamaklarýnda indirgenmesi sonucu açýða çýkan serbest
radikaller hücre ve dokularda birçok zarara yol açmaktadýr
(5).
Oksidatif stresin, çekirdek içerisinde; DNA ve protein
gibi nükleer yapýlarda amino-asit oksidasyonu , proteinprotein çapraz baðlarýnýn , DNA-protein çapraz baðlarýnýn
oluþmasý, DNA da zincir kýrýklarý ve baz oksidasyonu
(8-hiroksideoksiguanozin) gibi birtakým lezyonlar
oluþturarak hasarlanmalara yol açtýðý belirtilmiþtir.(6).
Çekirdek içerisinde oksidatif stresin; iyonize (iyonlaþtýrýcý)
radyasyon, UV radyasyonu, kemoterapi, yoðun egzersiz
ve çeþitli kimyasallar olmak üzere farklý kaynaklardan
oluþtuðu rapor edilmiþtir (7). Hatta yapýlan yoðun
egzersizin DNA’da oksidatif hasarlanmalara yol açtýðý
birçok çalýþmalarla gösterilmiþtir (3, 8, 9). Ancak,
literatürde yoðun egzersizin nükleer protein içeriðine
etkisinin olup olmadýðýna dair bir veriye rastlanýlamamýþtýr.
Bu yüzden, çalýþmamýzýn amacý, yoðun egzersizden dolayý
nükleer protein içeriðinde bir deðiþikliðin olup olmadýðýný
araþtýrmaktýr.
Gereç ve Yöntem
Bireyler ve Egzersiz Protokolü. Tüm bireyler çalýþma
hakkýnda bilgilendirildi. Çalýþma protokolü yerel etik
kurul tarafýndan onaylandý ve çalýþma Helsinki Bildirgesine
göre yürütüldü. Katýlýmcýlardan, yazýlý onam formu
alýndýktan sonra çalýþmaya baþlandý. Çalýþma Erciyes
Üniversitesi Beden Eðitimi ve Spor Yüksek Okulu’nda
okuyan yaþ ortalamasý 21,92±3,34 olan, sigara
kullanmayan 12 atlet erkek öðrencide yapýldý. Fiziksel
156
egzersiz, koþu bandýnýn hýz ve eðimi üçer dakikalýk
aralýklarla artýrýlarak yapýldý (Bruce protokolü, 10)
Periferal Kan Mononükleer Hücrelerin (PKMH)
Çekirdeklerinin Ýzolasyonu. Bireylerden egzersizden
önce (E.Ö.), egzersizden hemen sonra (E.S.) ve 24 saat
sonra (24 S.S.) 2 ml heparinli kan örneði alýndý. Çekirdekler
izole edildi (12, 13), 2 ml heparinli kan örneði 3 ml fikolhistopak üzerine yayýldý ve oda ýsýnda 1300 rpm de 25
dakika santrifüj edildi. Ýzole olan PKMH’ler pastör pipeti
ile baþka bir tüpe alýndý ve PBS soluyonu (5g FA- Bacto
Buffer Difco kat no: 223142, 500 ml distile suda çözüldü)
ile oda ýsýsýnda 900 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek
iki kez yýkandý ve hücrelerin üzerine 500 ml Nukleer
Ýzolasyon Solusyonu (NÝS: 0,661 g Tris-HCl Sigma kat
no: T-3253; 0.097; Tris-base Sigma kat no: T-1503; 0.29
g NaCl Merck kat no: 6400; 0.04 g EDTA- tetra Na Sigma
kat no: ED455; 0.50 ml NP-40 Sigma kat no: 127087-870 100 ml distile suda çözüldü, pH = 7.53) ilave edildi.
Süspansiyonun ml’sinde 1x 106 çekirdek olacak þekilde
NÝS ile sulandýrýldý.
Çekirdeklerin Boyanmasý. Hücre süspansiyonun 1 ml’si
akým sitometresinde ölçüm için kullanýlan tüpe transfer
edildi. Üzerine 1 ml 900 ml NaCl-bikarbonat solüsyonu
(10,18 g NaCl + 0,25 g NaHCO3 100 ml distile suda
çözüldü) , 100 ml flöresan izotiyosiyanat (FITC) solusyonu
(6 mg flöresan izotiyosiyanat Sigma F-7250, 2 ml
bikarbonat solusyonunda çözüldü ve NaCl-bikarbonat
solüsyonu ile 1:1000 oranýnda sulandýrýldý.) ve 1 ml
propidiyum iyodid (PI) solusyonu (6 mg propidiyum
iyodid 6 ml NaCl-bikarbonat solusyonunda çözüldü. NaClbikarbonat solüsyonu 1:14.3 oranýnda sulandýrýldý.) ilave
edildi. Bu karýþým akým sitometrisinde ölçülmeden önce
30 dakika 4 oC’de inkübe edildi (11, 12).
Akým Sitometri. PKMH çekirdeklerinin DNA ve protein
içeriklerinin analizi için Becman Coulter Epics XL-MCL
flow cytometer kullanýldý ve her bir örnek için 10.000
çekirdek ölçüldü. PI ve FITC’nin uyarýlmasý için tek lazerli
488 nm dalga boyunda argon iyon lambasý kullanýldý.
Uyarýlma sonucunda kýrmýzý flöresan emisyonu (PI)
(F=620, FL3, F: Flüoresan, FL3: Kýrmýzý Flüoresan) DNA
içeriðini ve yeþil flüoresan emisyonu (FITC) (F=525, FL1:
Yeþil Flüoresan) protein içeriðini göstermektedir.
Deðerlendirme için akým sitometride ölçüm sonucunda
elde edilen sonuçlardan FL1 (protein) ve FL3 (DNA)’ün
mean X verileri kullanýldý.
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160
Zuhal Hamurcu, Nazmi Sarýtaþ, Halil Demirtaþ
Ýstatistiksel Analiz. Verilerin normal daðýlýma
uygunluðunu test edildikten sonra, istatistiksel
deðerlendirme Genel Linear Model (GLM) içerisinde yer
alan tekrarlanan ölçümlerde varyans analiz kullanýlarak
yapýldý. Farklýlýklarý belirlemek için Scheffe testi uygulandý.
Anlamlýlýk düzeyi 0,05 olarak alýndý. Veriler ortalama
± standart sapma olarak verildi.
Bulgular
Çalýþmaya katýlan öðrencilerin özellikleri ve maksimum
oksijen alma kapasiteleri (VO2 max) Tablo I’de verildi.
Öðrencilerin egzersiz öncesi, egzersiz sonrasý, 24 saat
sonrasý periferal kan mononükleer hücreler’in çekirdek
protein içerikleri ise tablo II’de sunuldu. Yapýlan istatistiksel
analiz sonuçlarýna göre verilerin normal daðýlým
gösterdikleri bulundu (p=0,152).
Çalýþmaya katýlan atlet öðrencilerin nükleer protein
içerikleri egzersiz öncesine göre, egzersizden hemen sonra
artmýþ bulunurken (sýrasýyla 168,49 ± 5,08 ve 180,11 ±
7,58; p=0,001, egzersiz öncesi ile 24 saat sonrasý arasýnda
fark bulunamadý (sýrasýyla 168,49 ± 5,08 ve 169,12 ±5,45;
p=1.000 Tablo 2). Bir gönüllünün (A.D) örnek ölçüm
sonuçlarý ise Þekil 1’de verildi.
Tablo I. Öðrencilerin Özellikleri ve Maksimum Oksijen Alma Kapasiteleri
Öðrenci
(n=12)
Yaþ
(yýl)
Boy
(cm)
Vücut Aðýrlýðý
(kg)
Vücut Kitle indeksi
(kg/cm2)
Sporcu
yýlý
VO2max
(ml/kg/dk)
EM
TC
AÇ
EB
EI
ÝÖ
AD
AG
KY
UM
AY
AK
Ortalama
Standart sapma
18
26
26
19
18
23
21
20
19
21
25
27
21,92
3,34
161,00
170,00
175,00
177,00
165,00
178,00
183,00
176,00
170,00
183,00
176,00
176,00
174,17
6,62
52,00
65,00
62,00
69,00
55,00
72,00
76,00
72,00
54,00
72,00
77,00
74,00
66,67
8,92
20,10
22,50
20,20
22,00
20,20
22,70
22,70
23,20
18,70
21,50
24,90
23,90
21,88
1,80
6
10
12
7
6
2
7
6
7
4
18
8
7,75
4,11
64,90
65,20
65,00
64,40
62,10
60,00
63,70
45,50
62,00
53,80
54,80
55,10
59,71
6,15
VO2 max: maksimum oksijen alma kapasitesi
Tablo II. Öðrencilerin Egzersiz Öncesi, Egzersiz Sonrasý, 24 Saat Sonrasý Periferal Kan Mononükleer Hücreler’in
Çekirdek Protein Ýçerikleri (F525 mean X).
Öðrenci
(n=12)
Egzersiz Öncesi
F525 mean X
Egzersiz Sonrasý
F525 mean X
24 Saat Sonrasý
F525 mean X
EM
TC
AÇ
EB
EI
ÝÖ
AD
AG
KY
UM
AY
AK
Ortalama
Standart Sapma
165,90
161,60
178,40
164,90
170,10
175,40
169,80
166,60
165,60
166,60
169,10
165,40
168,28
4,69
177,40
174,10
175,60
185,60
192,90
185,90
182,40
180,30
165,30
181,60
173,60
177,40
179,34
7,14
164,70
169,60
168,20
166,80
177,70
176,40
173,60
161,10
163,60
169,50
169,20
162,60
168,58
5,28
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160
157
488
FL1
FL1
1024
FL1
0
FL3
1024
FL1
0
FL3
1024
0
FL3
1024
1024
0
FL1
Count
0
0
0
1024
0
1024
436
FL1
96
0
FS
1024
0
0
0
Count
SS
0
0
FL3
Count
76
Count
SS
1024
1024
FS
0
1024
492
0
1024
0
1024
1024
FS
0
0
c-)
0
Count
SS
0
0
b-)
Count
84
1024
a-)
1024
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü
0
FL3
1024
0
FL3
1024
Þekil 1. Bir gönüllünün (A.D) örnek sonuçlarý. a. Egzersiz öncesi (F525 mean X: 169,3); b. Egzersiz sonrasý (F525 mean X: 182,4) ve
c. Egzersizden 24 saat sonraki (F525 mean X: 173,6).
Tartýþma
Egzersiz sýrasýnda enerjiye ihtiyaç duyulmaktadýr (1, 3).
Enerji tüketiminin temel ilkesi oksidasyondur. Oksidasyon
sýrasýnda hidrojen peroksit gibi oksijen ve türevlerinin
oldukça aktif þekilleri üretilmektedir. Radikaller membran
peroksidasyonuna neden olmakta, membran geçirgenliðini
bozmakta ve hücre hasarý ortaya çýkmaktadýr. Özellikle
akut ve aðýr egzersizin oksidatif hasarý tetiklediði ileri
sürülmektedir (1, 2, 4). Bu nedenle, egzersiz sýrasýnda
yüksek oksijen alýmýnýn oksidatif strese neden olup
olmadýðý ve biyolojik sistemler (DNA, lipid, protein
metabolizmasý) üzerinde risk oluþturup oluþturmadýðýna
dair sorularýn cevaplanmasý için birçok araþtýrmalar
yapýlmýþtýr (1, 3, 13). Çünkü oksidatif stres sonucu oluþan
158
ROT çekirdek porlarýndan geçerek çekirdek içerisine
yayýlabilir ve DNA, protein gibi nükleer yapýlarý
hasarlayabilirler. Oluþan DNA hasarý, olasý mutasyonlardan
sakýnabilmek için hýzlýca tamir edilmek zorundadýr. Bunun
için onarým proteinleri gereklidir (7). Proteozomal sistem
(20S proteozomlardan oluþur.) oksitlenerek hasarlanmýþ
proteinlerin indirgenmesinden sorumludur. Proteozomlar
hem sitozolde hem de çekirdek içerisinde bulunmaktadýr.
Nükleer proteozomlar, oksidatif olarak hasarlanmýþ histon
gibi DNA-protein kompleksinin, baðýmsýz olarak bulunan
oksitlenmiþ nükleer proteinlerin uzaklaþtýrýlmasýndan
sorumludurlar ve proteozomlar onarým iþlevlerini yaptýktan
sonra hýzlý bir þekilde çekirdekten uzaklaþýrlar (6, 7).
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160
Zuhal Hamurcu, Nazmi Sarýtaþ, Halil Demirtaþ
Yoðun egzersizin DNA üzerine etkileri ile ilgili yapýlan
çalýþmalarda, bazýlarýnda egzersizle oksidatif DNA
hasarýnýn arttýðý (1, 3, 14, 15), bazýlarýnda azaldýðý (17),
bazýlarýnda ise herhangi bir deðiþikliðin olmadýðý (18-21)
gösterilmiþtir. Bu çeliþkili sonuçlarýn bireylerin antrenman
düzeylerine, uygulanan egzersizin tipine ve süresine baðlý
olabilmektedir (3, 20).
Çalýþmamýzda yoðun egzersizin DNA, protein gibi nükleer
yapýlarda oksidatif hasara yol açýp açmadýðýný bilemiyoruz.
Ancak, çalýþmamýzda, egzersizden hemen sonra nükleer
protein içeriðinin arttýðý, egzersizden 24 saat sonra ise
tekrar eski düzeyine geldiði bulundu. Egzersizden hemen
sonra nükleer protein içeriðindeki artýþýn, çekirdek içerisine
giren proteozomlara baðlý olabileceðini düþünmekteyiz.
Bize göre, egzersiz sýrasýnda oksijene duyulan talep
artmakta ve buna baðlý olarak çekirdek içerisinde
oksidasyon yükselmekte ve oksidasyondan dolayý da
çekirdek içerisinde oluþabilecek olasý oksidatif hasarý
önlemek için proteozom giriþi artmaktadýr. Fakat sunulan
çalýþma egzersiz ile çekirdek proteinleri arasýndaki iliþkiyi
gösteren literatürdeki ilk veriler olup, bundan sonra
yapýlacak araþtýrmalarla desteklenmesi gerekmektedir.
Teþekkür
Yazarlar, Akým sitometri cihazýnýn kullanýlmasýna izin
veren Prof. Dr. Türkan Patýroðlu’na ve çalýþmanýn
yapýlmasýna destek saðlayan Prof. Dr. Bekir Çoksevim’e
teþekkürlerini sunar.
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160
159
Yoðun Sportif Egzersiz ile Ýndüklenen Nükleer Protein Ýçeriðinin Akým Sitometrisi ile Ölçümü
Kaynaklar
1.Rodak Z, Pucsuk J, Boros S, Josfai L, Taylor AW.
Changes in ürine 8-hytdroxydeoxyguanozine levels of
super-marathon runners during a four-day race period.
Life Sci 2000; 66:1763–1767.
12.Hamurcu Z, Demirtaþ H, Patýroðlu T, Kumandas S.
Nuclear protein contents in peripheral blood mononuclear
cells of trisomy 21 infants. Cytometry B Clin Cytometry
2008; 74:128-132.
2.Nakatani K, Komatsu M, Kato T, et al. Habitual exercise
induced resistance to oxidative stres. Free Radical Res
2005; 39:905–911.
13.Poulsen HE, Loft S, Výstýsen K. Extreme exercise and
oxidative DNA modification. J Sports Sci 1996; 14:
343-346.
3.Orhan H, Van Holland B, Krab B, et al. Evaluation of
a multi-parameter biomarker set for oxidative damage
in man: Increased urinary excretion of lipid, protein and
DNA oxidation products after one hour of exercise. Free
Radical Res 2004; 38: 1269–1279.
14.Almar M, Villa JG, Cuevas MJ, Rodríguez-Marroyo
JA, Avila C, Gonzalez-Gallego J. Urinary levels of
8-hydroxydeoyguanosine as a marker of oxidative damage
in road cycling. Free Radic Res 2002.36: 247-253.
4.Rodak Z, Kaneko T, Tahara S, et al. The effect of exercise
training on oxidative damage of lipids, proteins, and DNA
in rat skeletal muscle: evidence for beneficial outcomes.
Free Radic Biol Med, 1999; 27:69-74.
5.Mercan U. Toksikolojide Serbest Radikallerin Önemi.
Yüzüncü Yýl üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 2004,
15:91-96
6.Ullrich O, Sitte N, Sommerburg O, Sandig V, Davies
KJ,ÊGrune T. Influence of DNA binding on the degradation
of oxidized histones by the 20S proteasome. Arch Biochem
Biophys 1999; 362:211–216.
7.Voss P, Grune T. The nuclear proteasome and the
degradation of oxidatively damaged proteins. Amino Acid,
2007; 32:527-534.
8.Tsai K, Hsu TG, Hsu KM, et al Oxidative DNA damage
in human peripheral leukocytes induced by massive
aerobic exercise. Free Radic Biol Med 2001; 31:14651472.
9.Poulsen HE, Loft S, Vistisen K. Extreme exercise and
oxidative DNA modification. J Sports Sci 1996; 14:
343-361.
10.Noonan V, Dean E. Submaximal Exercise Testing:
Clinical Application and Interpretation, Phsical Therapy,
2000; 80: 782–807.
15.Tsai K, Hsu TG, Hsu KM, et al. Oxidative DNA damage
in human peripheral leukocytes induced by massive aerobic
exercise. Free Radic Biol Med, 2001, 31: 1465-1472.
16.Hamurcu Z, Sarýtaþ N, Baþkol G, Akpýnar N. Effect
of wrestling exercise on oxidative DNA damage, nitric
oxide level and paraoxonase activity in adolescent boys.
Pediatr Exrc Sci 2010; 22: 60-68.
17.Bloomer RJ, Goldfarb AH, Wideman L,.McKenzie MJ,
Consitt LA. Effects of acute aerobic and anaerobic exercise
on blood markers of oxidative stress. J Strength Cond Res
2005, 19:276-285.
18.Hartmann A, Pfuhler S, Dennog C, Germadnik D,
Pilger A, Speit G. Exercise-induced DNA effects in human
leukocytes are not accompanied by increased formation
of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine or induction of
micronuclei. Free Radic Biol Med 24: 254-251, 1998.
19.Inoue T, Mu Z , Sumikawa K, Adachi K, Okochi T.
Effect of physical exercise on the content of 8hydroxydeoxyguanosine in nuclear DNA prepared from
human lymphocytes. Jpn J Cancer Res 1993 ; 84:
720-725.
20.Nakatani K. Komatsu M, Kato T, et al. Habitual exercise
induced resistance to oxidative stress. Free Radic. Res
2005; 39:905-911.
11.Robinson JP, Editor. Handbook of Flow Cytometry
Methods. Wiley-Liss Inc: New York; 1993 p.109.
160
Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2010;32(3):155-160