FISH

In situ Hibridizasyon
(ISH, FISH, GISH, CGH)
Fatma Elif Çepni,
N. Özer Şenol,
Murat Pekmez,
Aslıhan Temel,
Barış Eren,
Özgür Çakır
In situ Hibridizasyon (ISH)
-Geçmişi 30 yıldan daha fazlaya dayanan bir yöntemdir,
-Sitolojik preparatlarda, genlerin veya DNA dizilerinin kromozomlar
üzerinde direkt yerleşimine olanak tanır.
-Son 15 yıl içinde yardımcı floresan tekniklerin gelişmesiyle birlikte, bu
tekniğin uygulanmasında bir artış gözlenmiştir.
-ISH tekniğinin önemli modifikasyonlarından biri de genomik in
situ hibridizasyondur (GISH).
-GISH, türler arası hibritlerde, parental genomların ayrılmasına
olanak tanıyan genomik boyama tekniğidir
•
Tek bir nukleusla temsil edilen farklı türlerden köken alan
kromozomların ayırımına dayanan bir yöntemdir.
•
Somatik hibritlerin mayozu ve geri çaprazlama sonucu elde edilen
hibritlerin çalışılmasında kullanılabilir.
•
Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir.
•
Çok sayıda doğal alloploid hibritlerde ve türler arası hibritlerde
kullanılmıştır.
•
ÖR: domates-patates (Jacobsen et al. 1996),
Allium cepa- A. fistulosum (Khrustaleva and Kik, 1998), Alstroemeria
aura- A. inodora (Kamstra et al. 1999)…
FISH
• Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler,
bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı
gelişimiyle sağlanmıştır.
• Standart bantlama teknikleri yalnızca bir
denemede bir hücre için tüm genomu
sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
• Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH),
genleri ve kromozomları boyamada fluoresan
moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak
bantlama
teknikleriyle
birlikte
iyi
bir
değerlendirme aracıdır.
FISH
• Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon
prensibine göre, prob ve örnek arasında melez
bir yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir
işlemdir.
• FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur.
• FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen,
tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin
yerleşimini görebilmek için hibridizasyona
uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob)
kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir.
FISH
• Bu
yöntem
gen
haritalanmasında ve kromozom
aberasyonlarının
tanımlanmasında kullanılır.
• Kromozomların çalışılmasında
kullanılan birçok teknik, aktif
olarak
bölünen
hücreleri
gerektirirken
(metafaz
kromozomları),
• FISH
aynı
zamanda
bölünmeyen
hücrelere
de
uygulanabilir
(interfaz
nukleusu).
– Metafaz delesyonları belirlemede
kullanılır
– Interfaz genelde kromozomların
yeniden
düzenlenmesinin
ve
kromozom
sayılarının
belirlenmesinde kullanılır.
Prob hazırlama
FISH
• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun
belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu
tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi
kromozom
üzerinde
yerleşmiş
olduğunu
belirlemede kullanılır.
• Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar,
kromozomların
sentromerlerinde
bulunan
tekrarlayan
dizilerden
elde
edilir.
Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği
için, bu prob herhangi bir bireyin doğru sayıda
kromozoma
sahip
olup
olmadığının
belirlenmesinde kullanılır.
FISH
• “Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir
kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona
girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu
şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir
kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere
boyanabilir. Bu teknik kromozomal translokasyonların
tanımlanmasında imakan sağlar
• FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi
tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen,
amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise
hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır
FISH
Prosedür
• Metafaz kromozomları veya interfaz
nukleusu kullanılarak preparatların
hazırlanması
• Etanol içinde dehidrasyon
• DNA’yı 70oC’de denatüre etme
• Etiketli probun denatürasyonu
• Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat
inkübasyon
FISH
• FISH metodunu temel alan bazı uygulamalar
geliştirilmiştir
 Multicolour-FISH
1. Spectral Karyotyping
2. Multiplex FISH
3. Combined binary ratio FISH (COBRA-FISH)
 Cross-species colour FISH (R x FISH)
 Comparative Genomic Hybridisation
 Kromozom ve locus Spesifik FISH
FISH
• Spektral Karyotipleme
– Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla
hazırlanmış
probların
24
kromozomla
hibridizayounu ve tek bir filtreye sahip flüoresans
mikroskobu ile analizine dayalıdır.
– Kansere neden olan genomik değişikliklerin
standart bantlama yöntemlerinden daha iyi
anlaşılmasını sağlar.
• M-FISH (Multicolor FISH)
– 5
florokromun
çeşitli
kombinasyonlarıyla
hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı
flouresans sinyalleri ile
analizine dayalı bir
yöntemdir.
FISH
• COBRA-FISH
– Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom
kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si diğer
gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla hibridleştirilirken, 2.
gruba ek olara dördüncü florokrom uygulanır.
– Bu metod, 5. florokrom için, kollara özgü boyama veya MFISH ile locus-specific proba geçiş için kullanılmıştır.
• R x FISH
– Gibbon kromozomlarının prob olarak kullanılır. Gibbon ve insan
kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98 dir.
– RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça değişimleri değil,
aynı
zamanda
kormozom
içi
değişimler
de
belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-bantlama
tekniği ile birlikte kullanıldığında 400 kat daha hassas
sonuçlar vermektedir.
Kanserli bir hücrenin M-FISH ile hazırlanmış
idiogramı
Spektral Karyotipleme
BANTLAMA
M-FISH
FISH
Kullanımdaki faydaları
• Hızlı
• Hibridizasyon ve belirleme için yüksek
etkinlik
• Birçok hücre analiz edilebilir
• Replikasyon geçiren hücrelerin
kullanılması gerekmez
FISH
Kullanımdaki sınırlamalar
• Probun uygun olması ve doğru probun
eldesi için nelere bakılması gerektiğinin
iyi bilinmesi
• Hibridizasyon için birleşme sinyali
• Nuklear organizasyonda beklenmedik
varyasyonlar
GISH(Genomik in situ Hibridizasyon) Temeli
CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon)
-Genom boyunca DNA dizisindeki kopya
inceleyen bir moleküler sitogenetik teknik
saysısı
değişimlerini
-Bu teknik, kazanım (duplikasyon, insersiyon veya amplifikasyon)
veya net kayıp (materyalde delesyon) gibi kromozom anomalilerinin
sınıflandırılmasına olanak sağlar
Yöntemin avantajları:
-Temel
avantaj
DNA
örneklerinin
kullanılarak tüm genomun tek bir deneyde
görüntülenebilmesi
- iki
renkli
görüntüleme
sistemi
kullanılması
sonucunda
kromozom
anomalilerinin daha güvenilir saptanması
- Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli
olması
- Test örneği için metafaz kromozomları
gerekli değil
- Katı
tümörlerin
çalışılmasında
da
elverişlidir.
CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon)