MBKY II-8 Enzimatik Analiz ve Aktivitenin Ölçülmesi

ENZİMATİK ANALİZ
VE
AKTİVİTE TAYİNLERİ
• Enzim Tanımı
• Sınıflandırma
• Üç Boyutlu Yapı
• Etkime Şekli
Enzimler biyolojik katalizörlerdir, yani biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran biyolojik kökenli maddelerdir. Hemen hemen tüm enzimler protein yapıdadır.
Enzimlerin en önemli özellikleri:
katalitik etkinlik,
spesifiklik
ve
regülasyondur.
Katalitik etkinlik
• Enzimler reaksiyonları yaklaşık 1 milyon kat
hızlandırırlar. Normalde biyolojik sistemlerde
bu reaksiyonlar gerçekleşir, fakat çok daha
yavaş bir şekilde…
• Bilinen en hızlı enzim karbonik anhidraz
saniyede 105 CO2 molekülü bağlayabilir
(dokulardan kana CO2 taşır). Reaksiyonu 107
kat hızlandırır.
Spesifiklik
Regülasyon
SINIFLANDIRMA
• Bilinen tüm enzimler hem reaksiyon özgüllükleri
hem de substrat özgüllükleri dikkate alınarak
“ Enzim Komisyonu (E.C.) ” tarafından 6 Temel
sınıfa ayrılmıştır.
1. Oksidoredüktazlar
2. Transferazlar
3. Hidrolazlar
4. Liyazlar
5. İzomerazlar
6. Ligazlar
Enzimler şu şekilde numaralandırılmaktadır:
W X
Y
Wà 6 büyük sınıf
X à Alt sınıflar
Y à Alt-alt sınıf
Z à Enzimin seri numarası
Z
Laktat dehidrogenaz (1.1.1.27)
1.1.1.27
Oksidoredüktaz CH-OH grubu
elektron donörü
NAD(P)+
elektron alıcısı
Seri no
Üç boyutlu yapı?
Üreaz (EC 3.5.1.5)
Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum pH değeri vardır.
Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum sıcaklık derecesi vardır.
GENEL REAKSİYON:
Enzim (E), reaksiyonda değişikliğe uğrayacak
madde(ler) (Substrat, S) ile reaksiyona girer,
reaksiyon tamamlandığında ürün (Ü)(ler) oluşurken
enzim tekrar ilk şekline döner.
E + S D ES " Ü1 + Ü2 + E
Enzimlerin
•
•
•
•
•
•
Varlıklarını
Etkinliklerini
Dokuda/hücrede bulundukları yeri
Kataliz mekanizmasını
Miktarlarını
Saflıklarını belirlemenin en etkin yolu;
AKTİVİTE ÖLÇÜMÜDÜR.
ENZİM AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜLMESİ
ve
HESAPLANMASI
Enzimlerin doku ve hücrelerdeki konsantrasyonu son derece düşük olduğundan miktarlarını ölçmek çok güçtür. En iyi ölçme yöntemi enzimin katalitik aktivitesini ölçmektir. UV-­‐VIS ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ
FLUORESANS
SPEKTROFOTOMETRİSİ
RADYOAKTİF YÖNTEMLER
SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERLE ENZİM AKTİVİTESİNİ ÖLÇMEK:
Belli bir zaman aralığında enzimin kataliz etkinliği sonucu oluşan
DEĞİŞİMİ
saptamaktır.
ÜRÜN OLUŞUMU
Enzim miktarı, genelde, enzim konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak meydana gelen ürün miktarı ölçülerek saptanır.
SUBSTRAT EKSİLMESİ
Başlangıç Hızı "Initial rate": vo
• Aktivite ölçümü, henüz reaksiyon hızında bir düşmenin olmadığı kısa zaman aralığında yapılır.
Bu dönemde güvenilir bir ölçüm için:
• Enzim ve substrat derişimi reaksiyonun
optimum hızda gerçekleşmesine yetecek
şekilde ayarlanmalı,
• Sıcaklık kontrol altında tutulmalı,
• Ölçüm yapılan karışımın homojen olması
sağlanmalı,
• Çok sağlıklı
yapılmalıdır.
kör
ve
kontrol
ölçümleri
KÖR (BLANK)
Çalışılan dalga boyundaki ışını absorplayacak maddeyi içermeyen
reaksiyon ortamı KONTROL(LER)
Reaksiyon ortamındaki etkinliği şüpheli olan bileşenler (ör. Koenzimler)
Reaksiyonun başında değişim DOĞRUSAL, sonra
ürün oluşumunda meydana gelen azalma
nedeniyle doğrusallık bozulur.
NEDENLERİ:
• Substratın tükenmesi
(Substrat bitince reaksiyon durur. Ölçüm sırasında bitmemesi için yüksek substrat
konsantrasyonunda çalışılır.)
• İki yönlü reaksiyonlarda dengeye yaklaşılması
(Reaksiyonun geri dönmesi ile üründen substrat oluşmaya başlar. Bunu önlemek için
ürün ortamdan uzaklaştırılır. Ortama, ürünü substrat olarak kullanacak 2. bir enzim
veya bağlayacak bir madde eklenir.)
• Ürün İnhibisyonu
(Ürün enzimi inhibe ediyorsa aktivite kaybolur. Bu nedenle ürün ortamdan
uzaklaştırılır.)
• Enzimin veya reaksiyon bileşenlerinin (substrat,
kofaktörler, aktivatörler, reaktifler) stabilitesini
kaybetmesi
(Her bir bileşenin stabilitesi ön deneylerle saptanmalıdır.)
•
pH değişimi
(Reaksiyon sırasında hızlı bir pH değişimi meydana geliyorsa bu da aktiviteyi hızla
düşürür. Ortam çok iyi tamponlanmalı, reaksiyonun başında ve sonunda pH kontrolü
yapılmalıdır.)
İŞLEMLER
• Spektrofotometre ölçümden 10-­‐15 dak önce
çalıştırılır; çalışma ortamının sıcaklığı ayarlanır;
doğru ve temiz küvetler seçilir.
• Reaksiyonu başlatacak bileşen hariç diğer tüm
bileşenler küvete (çift ışınlı aletlerde her iki küvete)
konulur. Alet sıfırlanır ("Auto-­‐Zero").
• Reaksiyonu başlatacak bileşen eklenir ve etkin bir
şekilde karışması sağlanarak ölçüm yapılır.
TEKNİK OLARAK DİKKAT EDİLECEK NOKTALAR
• Yüksek Km değeri söz konusu ise aktivite ölçümünde substrat
konsantrasyonu yüksek tutulmalıdır.
• Olanaklar el verdiği ölçüde saf enzimle çalışmakta yarar vardır.
• Çözelti şeklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybı olacağı
unutulmamalıdır. Liyofilize halde saklamak daha elverişlidir.
• Ölçümlerde kullanılan kimyasalların saf olması şarttır. Kalite ne kadar
yüksek olursa, hata payı o kadar azalır.
• Cam eşyaların temiz olması, deterjan artığı bulunmaması, saf suyun
yüksek kalitede olmasına özen gösterilmelidir.
• Reaksiyon karışımına katılacak maddelerin pH'ları elverişli olmalıdır.
ENZİM AKTİVİTESİNİN HESAPLANMASI:
Birimler ve Spesifik Aktivite
Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı
Spektrofotometrik ölçümün dayandığı Beer-­‐Lambert
yasasına göre Absorbans (A; ya da Optik Dansite, O.D.),
absorpsiyon yapan maddenin derişimi (c) ve ışının
katettiği yol (d) ile doğru orantılıdır:
Buna göre:
A=ελcd
A
c =
ελ
A
c =
ε λd
1 cm old.
A=ελcd
1M
1 cm
Derişimi 1 M olan bir kromoforun ışık yolu 1 cm olan bir spektrofotometrede ortaya koyduğu absorbans Molar Absorpsiyon
(Ekstinksiyon) Katsayısı (ελ) olarak tanımlanır.
Birimi M-­‐1cm-­‐1 'dir.
(lmol-­‐1cm-­‐1 veya mmol-­‐1cm2 'ye eşdeğerdir)
cm2mol-­‐1 (M-­‐1cm-­‐1'in 1000 katı) olarak da ifade edilir Bu durumda hesaplanan derişimin (c'nin) birimi M (mol/l)'dır. Enzim Aktivitesinin Tanımlanması
Bir enzimin aktivitesini çeşitli biçimlerde ifade etmek
mümkündür:
Örneğin,
• Birim zamanda enzim tarafından meydana getirilen
absorbans değişimi:
(dA/dt)
• Ancak daha standart bir birim olan
"International Unit", IU)
ÜNİTE (U;
daha geniş kullanım
alanı bulur.
Buna göre 1 Ünite Enzim, 1 dakikada 1 µmol ürünün
oluşumunu (veya 1 µmol substratın dönüşümünü)
katalizleyen enzim miktarıdır (U= µmol /dak).
Deneysel Ölçümlerin Üniteye Dönüştürülmesi
Örnekteki Enzim V x dA/dt x 1000 x sulandırma faktörü
t
Ünitesi =
ελ vs x d
Vt = Reaksiyon karışımının toplam hacmi (ml)
dA/dt = dakikada Absorbans değişimi (dak-­‐1)
ελ = Absorpsiyon katsayısı (cm2mol-­‐1)
Vs = Reaksiyon ortamına katılan örnek (enzim) hacmi (ml)
D = küvetteki ışık yolu (genellikle 1 cm)
1000 çarpanı enzimi µmole çevirmek içindir.
SPESİFİK AKTİVİTE = U/mg protein
Saf bir enzimin spesifik aktivitesi sabittir ve o enzime özgü bir değerdir.
Bu aktivite birimi, enzimin saflığını tanımlayan bir
ölçüttür. Ham özütlerde protein derişimi yüksektir. Dolayısıyla ilgilenilen enzimin spesifik aktivitesi DÜŞÜK çıkar. Enzimi SAFLAŞTIRDIKÇA spesifik aktivitesi YÜKSELİR.