Papatya (Tripleurospermum Parviflorum Willd

ÖZEL EGE LİSESİ
Papatya (Tripleurospermum parviflorum Willd)
kanser tedavisinde kullanılabilir mi?
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ: Barış KANTARCI
DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Mesut ESEN
2010
İZMİR
İÇERİK LİSTESİ
PROJENİN ADI ..................................................................................................................... 1
PROJENİN AMACI ................................................................................................................ 1
1. GİRİŞ ................................................................................................................................ 1
2. YÖNTEM ............................................................................................................................3
2.1. Kullanılan Bitki Ekstreleri .................................................................................................3
2.2. Sitotoksik Çalışmalar .......................................................................................................3
2.3. Deney Düzeneği ..............................................................................................................3
2.4. Enzim Aktivite Ölçümleri ..................................................................................................3
2.4.1. Topoizomeraz I Aktivite Ölçümleri.................................................................................3
2.4.2. Topoizomeraz II Aktivite Ölçümleri................................................................................4
3. SONUÇLAR .......................................................................................................................4
3.1. Enzim aktivite belirlemeleri ..............................................................................................4
3.2. Topoizomeraz l ile alınan sonuçlar ..................................................................................6
3.3. Topoizomeraz II ile alınan sonuçlar .................................................................................7
4. ÖNERİLER .........................................................................................................................8
5. TEŞEKKÜR........................................................................................................................8
6. KAYNAKÇA .......................................................................................................................9
Proje Adı: Papatya (Tripleurospermum parviflorum Willd)
kanser tedavisinde kullanılabilir mi?
Projenin Amacı:
Kanser hücreleri kontrolsüz olarak çoğalırlar. Çoğalmaları sırasında çok sayıda hücre
bölünmesi gerçekleşir. Bu yüzden anti-kanser ilaç geliştirme çalışmalarında bu süreçte görev
alan topoizomeraz enzimleri hedeflenmektedir. Bu çalışmamda, Ege Üniversitesi Eczacılık
Fakültesi Farmakognozi Anabilim Dalınca hazırlanan ve sitotoksik özelliği tanımlanmış İzmir
Ödemiş Bozdağ Ovacık köyünden Mayıs 2007 sezonunda toplanan (Herbarium No:1366)
Tripleurospermum parviflorum Willd bitki ekstrelerinin, topoizomeraz I ve topoizomeraz II
enzimleri ile etkileşimleri araştırılmıştır. Projenin amacı ülkemizin zengin bitki çeşitliliğinden
yola çıkarak topoizomeraz enzimleri üzerinde etkisi olan bitki ekstrelerinin çalışılmasının
önemini vurgulamaktır.
1. Giriş
Kanser hücreleri, en genel anlamıyla, kontrolsüz olarak çoğalan hücreler olarak tanımlanır.
Hücre bölünmesi ise replikasyon olarak adlandırılan, DNA moleküllerinin kendilerini eşlediği
bir işlemdir. Diğer birçok genetik işlemde olduğu gibi replikasyon aşamasında da DNA
moleküllerinin geometrisini düzenleyen topoizomeraz enzimleri vazgeçilmez öneme sahiptir.
(Wang 1996). Topoizomeraz enzimleri tarafından gerçekleştirilen reaksiyon örnekleri Şekil 1
de şematik olarak verilmiştir. Topoizomerazlar reaksiyon özellikleri bakımından topoizomeraz
I ve topoizomeraz II olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar. Topoizomeraz I enzimleri her basamakta
DNA zincirlerinden bir tanesinde, topoizomeraz II enzimleri ise her basamakta DNA
zincirlerinin her ikisinde kırıklar oluşturarak reaksiyonlarını gerçekleştirirler. Günümüzde
kullanılan ve geliştirilmesi için çalışılan antikanser özellikteki çok sayıda sentetik ve doğal
madde bu enzimleri hedeflemek üzere şekillendirilmektedir. Bu nedenle, sitotoksik özellikteki
birçok maddenin aynı zamanda topoizomeraz enzimleri üzerinde etkili olduğu bulunmuştur
(Topcu 2001). Benzer şekilde, topoizomerazları etkileyen birçok maddenin de aynı zamanda
sitotoksik olduğu araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir. Buradan hareketle antikanser ilaç
geliştirme
çalışmalarında
topoizomeraz
enzimleri
çoğalmasının durdurulması amaçlanmaktadır.
hedeflenerek
kanser
hücrelerinin
Şekil. 1. Topoizomeraz enzimleri tarafından gerçekleştirilen reaksiyon örnekleri.
a.Süpersarmal ve relax
DNA formları arasında değişim, b. Tek zincirli-dairesel DNA molekülleri arasında bağlanma reaksiyonları, c. Çift
zincirli-dairesel DNA molekülleri katenasyon ve dekatenasyon reaksiyonları.
Kanser tüm dünyada olduğu gibi Türkiye’de de bir sağlık sorunudur. Ülkemizin zengin bitki
çeşitliliği nedeniyle, topoizomeraz enzimleri üzerinde etkisi olan bitki özlerinin aranması bu
nedenle yararlı bir konudur. Bu çalışmamızda Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi
Farmakognozi Anabilim Dalınca hazırlanan ve sitotoksik özelliği tanımlanmış İzmir Ödemiş
Bozdağ Ovacık köyünden Mayıs 2007 sezonunda toplanan (Herbarium No:1366)
Tripleurospermum parviflorum Willd bitki ekstrelerinin topoizomeraz I ve topoizomeraz II
enzimleri ile etkileşimleri araştırılmıştır (Fafal T. ve ark.,2007). Tripleurospermum parviflorum
Willd bitkisi Asteraceae (Compositae) familyasına ait olup özellikle Batı ve İç Anadolu’da
yetişmektedir (Mill, R.R. ve Tan, K., 1988). Tripleurospermum türleri ayrıca antioksidan ve
antibakteriyel aktiviteye sahiptir (Honda G. ve ark., 1996; Fafal Erdoğan T., ve ark., 2008).
Görünüm olarak papatyaya benzeyen bir bitkidir, halk arasında da papatya adı ile bilinir, ama
tıbbi olarak kullanılan papatyadan
farklıdır. Halk arasında tıbbi papatya (Matricaria
chamomilla) gibi, mide rahatsızlıklarında, bebeklerdeki gaz sancısında kullanılmaktadır.
2.Yöntem :
2.1. Kullanılan Bitki Ekstreleri
Tripleurospermum parviflorum Willd’in çeşitli çözücülerdeki (etanol ve distile su) ekstreleri
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Anabilim Dalı’nca hazırlanmıştır.
2.2. Sitotoksik Çalışmalar
Bitkinin sitotoksik aktiviteye sahip olduğu Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Anabilim
Dalı’nda karides larvaları üzerinde yapılan sitotoksisite çalışmalarıyla saptanmıştır (Bakınız
Ek:1).
2.3. Deney Düzeneği
Agaroz Jel Elektroforezi
%1’lik standart agaroz Tris/Borik asit/EDTA (TBE) ( 45 mM Tris Borate and 1mM EDTA, pH
8.0) tamponu içerisinde eritilerek hazırlanmış ve örnekler Gliserol/Xylene Cylanol ve Brom
Fenol mavisi çözeltisi ile 20 µl hacimlerde uygulanmıştır (Sambrook ve ark. 1989). Elektrik
alanında 240 volt.saat yürütülerek örneklerin toplam mesafenin 2/3’ünü kat etmesiyle
elektroforez sonlandırılmıştır. Topoizomeraz II enzim analizlerinde Ethidyum-Bromid (Etd-Br)
jel kompozisyonuna eklenmiş, topoizomeraz I enzim analizlerinde ise Etd-Br elektroforez
sonrası boyamada kullanılmıştır.
2.4. Enzim Aktivite Belirlemeleri:
2.4.1. Topoizomeraz I Aktivite Ölçümleri
Tip I topoizomeraz ölçümleri süpersarmal DNA’nın (Form I) relax hale (Form II) dönüşümünü
inceleyerek yapılmıştır. Bunun için 0.5 µg süpersarmal pBR322 plazmid DNA’sı uygun
koşullar altında [35 mM Tris-HCI (pH 8.0), 72 mM KCI, 5 mM MgCI2, 5 mM DTT, 5 mM
spermidin, %0.1 Albümin] 1 ünite enzim ile 37
o
C’de 30 dakika inkübasyonla
gerçekleştirilmiştir. Örnekler %1’lik agaroz jeline yüklenmiş, 120 volt uygulanarak 2 saat
süresince yürütülmüş ve Etd-Br ile 30 dakika boyanmıştır.(0,5µg/mL). Boyanan jel distile su
ile 5 dakika muamele edildikten sonra 200 nm dalga boyunda UV-lambası altında
görüntülenmiştir. Bir ünite topoizomeraz I enzim aktivitesi 0.5 µg DNA’nın 37 oC’de 30 dakika
içerisinde relax hale dönüşümü için gerekli enzim aktivitesi olarak tanımlanmıştır.
2.4.2. Topoizomeraz II Aktivite Ölçümleri
Topoizomeraz II ölçümleri 0.2 µg kinetoplast DNA kullanılarak [50 mM Tris CI, pH 8.0, 120
mM KCI, 10 mM MgCI2 . 0.5 mM ATP, 0.5 mM DTT] 1 ünite topoizomeraz II enzimi
kullanılarak yapılmıştır. Reaksiyonlar sonlandırma çözeltisi ile (%5 sarkozil mavisi 1, %
0.0025 brom fenol mavisi, % 25 Gliserol) tamamlanarak 0.5 µg/ml Etd-Br içeren %1’lik
agaroz jeline yüklenmiş, Bölüm “2.4.1” de açıklandığı şekilde elektroforez gerçekleştirilmiştir.
DNA bandları 260nm dalga boyunda UV lambası altında görüntülenmiştir. Bir ünite
topoizomeraz II enzim aktivitesi 0.2 µg kinetoplast DNA’nın 37 oC’de 30 dakika içerisinde
dekatenasyonu için gerekli enzim aktivitesi olarak tanımlanmıştır.
3. Sonuçlar
3.1. Enzim aktivite belirlemeleri
Çalışmamız papatya bitki ekstresinin bilinen sitotoksik etkisinin topoizomeraz enzimleri ile
etkileşimi de kapsayıp kapsamadığını araştırmak üzere şekillendirilmiştir. Bu çalışmada ana
yöntem olarak DNA moleküllerinin ayrıştırılmasında güçlü bir yöntem olan agaroz jel
elektroforezi kullanılmıştır. Yöntemin ana ilkesi farklı fiziksel formlardaki plazmid DNA
moleküllerinin agaroz jeli içerisinde elektrik akımı uygulandığında farklı hareketlilik göstererek
ayrıştırılmasına dayanmaktadır. Şekil 2’de bu metod ayrıntılı bir şekilde izlenmektedir.
Şekil 2. DNA topoizomeraz I aktivite ölçüm örneği. Reaksiyon süpersarmal DNA’nın relax forma dönüşümünü
inceleyerek yapılmıştır. Etd-Br ile boyanan jel 200 nm dalga boyunda UV-lambası altında görüntülenmiştir.
Uygulama 1, 2, 3 ve 4 sırasıyla 0, 0.5, 0.75 ve 1 ünite enzim varlığında ayrıştırılan DNA bandlarına karşılık
gelmektedir.
Enzim yokluğunda hızlı hareketliliği ile görüntülenen Form I DNA, 2. 3. ve 4. uygulamalarda
sırasıyla 0.5, 0.75 ve 1 ünite enzim varlığında geometrik özelliği daha yavaş hareketlilik
gösteren Form II DNA molekülüne dönüşmektedir.
a.
b.
Şekil 3. DNA Topoizomeraz II aktivite ölçüm örneği.
a. Topoizomeraz II topoizomeraz tarafından
gerçekleştirilen dekatenasyon reaksiyon örneği.
Uygulama 1; Kinetoplast mini dairesel DNA sı,
Uygulama 2; Topoizomeraz II varlığında hareketlilik
kazanan kinetoplast mini dairesel DNA sı, Uygulama
3; Çözücünün reaksiyonu etkilemediğine yönelik
DMSO
uygulaması,
Uygulama
4;
Bilinen
topoizomeraz II inhibitörü olan mAMSA varlığında
alınan DNA bandları.
b. Topoizomeraz II aktivite ölçüm örneği.
(Uygulamalar (1-6) sırasıyla 0, 0.25, 0.375, 0.5, 1 ve 2
ünite enzim varlığında elde edilen DNA bandlarına
karşılık gelmektedir. Topoizomeraz II enzim
varlığında DNA bandlarının görüntülenmesi Şekil 2
de belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir.
Deneylerimizde kullandığımız diğer enzim olan Topoizomeraz II aktivite kontrolü ise Şekil 3’
de görülmektedir. Bu ölçüm Topoizomeraz I ‘den farklı olarak, büyüklükleri nedeniyle jele
giremeyen mini-halkasal DNA monomerlerinin enzim etkisi ile jele girmesi esasına
dayanmaktadır. Şekil 3a’ da 1. uygulama jele giremeyen halkasal DNA’ları, 2. uygulama ise
enzim etkisi ile hareketlilik gösteren DNA’lara karşılık gelmektedir. 3. uygulama, bitki
ekstresini çözmede kullandığımız %10’luk DMSO’nun bu reaksiyon üzerinde etkili olmadığını
göstermek üzere yapılmıştır. Şekil 3a’daki 4. ve son uygulama bilinen bir Topoizomeraz II
inhibitörü olan mAMSA varlığında enzimin inaktif hale geldiğini göstermektedir. Şekil 3b’de
ise bu reaksiyonun 0, 0.25, 0.375, 0.5, 1 ve 2 ünite Topoizomeraz II enzim varlığında
gösterdiği hareketliliği göstermektedir.
3.2. Topoizomeraz l ile alınan sonuçlar
Şekil 4. Papatya bitkisinin Etanol ve distile su ekstrelerinin topoizomeraz I üzerindeki etkisi.
Papatya bitkisinin Etanol ve distile su ekstrelerinin topoizomeraz I üzerindeki etkisi Şekil 4’te
verilmiştir. Şekil 4’te görüldüğü gibi ilk uygulama enzimsiz yapılan negatif kontroldür.
Süpersarmal durumdaki DNA kompakt yapısından dolayı hızlı hareketlilik göstermektedir. 2.
uygulamada topoizomeraz varlığında Form I DNA relax hale geldiği için hareketlilik
azalmıştır. 3., 4. ve 5. uygulamalar Etanol ekstresinin, 6, 7 ve 8. uygulamalar ise distile su
ekstresinin sırasıyla 10 mg/ml, 1 mg/ml ve 0.1 mg/ml konsantrasyondaki uygulamalarının
enzim üzerinde etkisini göstermektedir. Görüldüğü gibi 3. ve 6. sırada negatif kontrole benzer
bir hareketlilik elde edilmiştir. Ancak maddenin konsantrasyonu düşürüldüğünde (Etanol
ekstresi uygulamaları için 4 ve 5, distile su ekstresi etkisi uygulamaları için 7 ve 8) hızlı
hareket eden kompakt DNA bandları yerine yavaş hareketlilik gösteren relax DNA bandları
yoğunlaşmıştır.
3.3. Topoizomeraz II ile alınan sonuçlar
Şekil 5. Papatya bitkisinin Etanol ve distile su ekstrelerinin topoizomeraz II üzerindeki etkisi.
Papatya bitkisinin Etanol ve distile su ekstrelerinin topoizomeraz II üzerindeki etkisi Şekil 5’te
verilmiştir. İlk uygulama enzimsiz yapılan negatif kontroldür. Görüldüğü gibi iç içe geçmiş
mini halkasal DNA molekülleri jele giremeyip uygulama bölgesinde yoğunlaşmıştır. 2. ve 3.
uygulamalar, aynı DNA moleküllerinin 1 ünite enzim etkisi ile DMSO yokluğunda ve
varlığında açılarak jelde hareketlilik kazandıklarını göstermektedir. Etanol (Şekil 4, 5 ve 6
uygulamalar) ve distile su ekstreleri (Şekil 4, 8 ve 9 uygulamalar) 10 mg/ml (Şekil 4, 5. ve 8.
uygulamalar) ve 1 mg/ml (Şekil 4, 6. ve 9. uygulamalar) konsantrasyonlarda enzim üzerinde
mAMSA varlığındaki görüntüye (Şekil 4, 4. uygulama) benzer bir bandlaşma vermiştir. Ancak
0.1 mg/ml konsantrasyonda etanol (Şekil 4, uygulama 7) ve distile su ekstresinin (Şekil 4,
uygulama 10) bu etkisi azalarak enzim aktivitesi gözlenmeye başlanmıştır. Her iki ekstre
karşılaştırıldığında distile su ekstresi diğerine göre daha göze çapar etki göstermektedir.
Çalışmamız özetlendiğinde aşağıdaki bulgular ön plana çıkmaktadır:
1. Papatya bitkisinin Etanol ve distile su ekstreleri topoizomeraz I ve topoizomeraz II enzimleri ile belirli ölçüde etkileşmektedir.
2. Etkileşimler yüksek konsantrasyonlarda gerçekleşmektedir, konsantrasyonun düşürülmesi
etkinin kaybolmasına yol açmaktadır.
3. Daha düşük konsantrasyonda etkileşimin gösterilmesi için ekstrenin kimyasal kompozisyonunun nicel olarak tanımlanması gerekir. Bu tanımlama Etanol ve distile su ekstreleri
arasında topoizomeraz II enzimi ile alınan sonuçların farkını da açıklayabilecektir.
4. Görüldüğü gibi anti-kanser ilaç geliştirme çalışmalarında topoizomeraz enzimleri ideal bir
modeldir. Zengin biti örtüsüne sahip ülkemiz için bu son derece umut verici bir konudur.
4. ÖNERİLER:
Anti-kanser ilaç geliştirme çalışmalarında topoizomeraz enzimleri ideal bir modeldir.
ÇalışmamızdaTripleurospermum parviflorum Willd’in etanol ve distile su ekstrelerinin her iki
enzim ile yüksek konsantrasyonda etkileşebildiğini görülmektedir. Zengin biti örtüsüne sahip
ülkemiz için bu, etkileşim gösterebilen yeni bitki türlerinin aranmasını özendirmek
bakımından son derece önemli bir bulgudur. Ancak bu bitkinin ilaç geliştirme çalışmalarında
daha fazla önem kazanması için ekstrenin kimyasal kompozisyonu nicel olarak
tanımlanmalıdır. Bu tanımlama bitki ekstresinin içindeki hangi bileşenin bu sonucu
oluşturduğunu göstererek daha düşük konsantrasyonda topoizomeraz enzimleri ile etkileşim
arama imkânı verecektir.
5. TEŞEKKÜR:
Proje çalışmalarında bana destek olan okul müdürümüz Aylin Musluoğlu’na, danışman
öğretmenimiz Mesut Esen’e, laboratuvar, malzeme ve alan bilgisi bakımından yardımcı olan
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr.
Zeki Topçu’ya ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı çalışanlarına, bitki ekstrelerini
hazırlayan Farmakognozi Bilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Bijen Kıvçak’a ve Farmakognozi Bilim
Dalı çalışanlarına yapmış oldukları katkılardan dolayı teşekkür ederim.
6. KAYNAKÇA:
1. Fafal T., Baltacı S., Kıvçak B., Tripleurospermum parviflorum Willd. üzerinde sitotoksik
aktivite çalışmaları, XVII. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Ege Üniversitesi, Kuşadası,
İzmir, 2629 Ekim 2007.
2. Sambrook J FE, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Ed. (1989) Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
3. Fafal Erdoğan T., Gönenç T.M., Oskay M., Kıvçak b., XVIII. Bitkisel İlaç Hammaddeleri
Toplantısı, İstanbul Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, İstanbul, 16-18 Ekim 2008.
4. Honda,G., Yeşilada, E., Tabata, M., Sezik., E., Fujita, T., Takeda,Y., Tanaka,T.,
“Traditional Medicine in West Anatolia;Afyon, Kütahya, Denizli, Muğla, Aydın provinces,
Journal of Ethnopharmacology.
5. Mill, R.R., Tan, K., “Flora of Turkey and The Aegean Islands”, Ed. Davis, P.H., Edinburg
University Press, 1988, 10, 489-501.
6. Topcu Z. DNA topoisomerases as targets for anticancer drugs. J Clin Pharm Ther
2001;26:405-416
7. Wang JC. DNA topoisomeases. Ann Rev Biochem 1996;65:635-692.