Farklı Hayvan Türlerinde Saptanan Rotavirusların VP4, VP6, VP7 ve
advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Farklı Hayvan Türlerinde Saptanan Rotavirusların VP4, VP6, VP7 ve NSP4 Gen Bölgelerinin Moleküler Karakterizasyonu Prof. Dr. Feray ALKAN Araş.Gör. Mehmet Özkan TİMURKAN 09B3338006 30/10/2009 30/04/2011 15/10/2011 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2011 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri FARKLI HAYVAN TÜRLERİNDE SAPTANAN ROTAVİRUSLARIN VP4, VP6, VP7 VE NSP4 GEN BÖLGELERİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU MOLECULAR CHARACTERIZATION OF VP4, VP6, VP7 AND NSP4 GENES OF ROTAVIRUSES FROM DIFFERENT ANIMAL SPECIES Rotaviruslar, birçok hayvan türü ve insanların yeni doğanlarının en önemli enteritis etkenlerindendir. Farklı serotip/genotipe sahip rotaviruslar, enfeksiyonun epidemiyolojisi ve patogenezinde önemli role sahiptirler. Bir popülasyondaki rotavirus tiplerinin (özellikle VP4 ve VP7) belirlenmesi, enfeksiyondan korunmak için kullanılacak aşıların seçiminde önem taşımaktadır. Özellikle enteroksin kodlayan gen bölgesinin (NSP4) farklılığına bağlı olarak, etkenlerin farklı konakçı türlerinde hastalık oluşturma niteliğinin değişebilmesi ise son zamanlarda rotavirus enfeksiyonlarının zoonotik potansiyelinin araştırılması gerekliliğini gündeme getirmektedir. Bu bilgiler ışığında planlanan bu çalışmada, Türkiye’de farklı hayvan türlerine ait rotavirusların VP4, VP6, VP7 ve NSP4 gen bölgelerinin moleküler yapılarının aydınlatılması ve farklı moleküler karakterizasyona sahip segment kombinasyonlarının belirlenmesi amaçlanmış olup, elde edilen verilere dayanılarak enfeksiyonun patogenezi ve epidemiyolojisi konusunda yeni bilgilerin ortaya konulabilmesi ve özellikle ülkemizde enfeksiyonla mücadele stratejilerine ışık tutacak önemli bilimsel verilerin sağlanması hedeflenmiştir. II. Amaç ve Kapsam Bu çalışmada, ishalli buzağı, oğlak ve kuzulardan sağlanan toplam 20 adet gaita örneğinde saptanan ve G/P genotip kombinasyonları bilinen rotavirus saha suşunun VP4, VP7, VP6 ve NSP4 genlerinin moleküler karakterizasyonu yapılarak, BLAST veri tabanında yer alan insan ve farklı hayvan türlerine ait rotavirusların ilgili gen bölgelerine ait dizin analizleri ile karşılaştırılarak, filogenetik analizlerinin yapılması amaçlanmıştır. Elde edilen veriler, 1. Türkiye’de bildirilen türlerde enfeksiyon oluşturan rotavirusların VP4, VP7, VP6 ve NSP4 gen bölgelerinin karakterizasyon sonuçları, 2. Bireysel moleküler karakterizasyon sonuçlarının karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi sonucunda, Türkiye’de rotavirusların genetik benzerlik/ farklılıklarının saptanması, 3. Farklı ülkelerde rotavirus suşları ile genetik benzerlik/ farklılıklarının saptanması, noktasında değerlendirilebilir niteliktedir. Bu bilgiler temelde; 1. Rotavirus enfeksiyonundan korunmada başlıca strateji olarak benimsenen aşı uygulamasından etkin sonuçların alınabilmesi amacıyla geliştirilecek yerel aşı üretimi çalışmaları ile ticari olarak var olan rotavirus aşı tercihlerinin yapılmasında, 2. Farklı türlerde saptanan rotavirusların, bildirilen gen bölgelerinin analizi sonucunda türler arası nakil olasılığının incelenmesinde, 3. Rotavirus enfeksiyonunun patogenezine ilişkin değerlendirmeler yapılmasında kullanılacaktır. III. Materyal ve Yöntem Gaita Örnekleri ve Referenz Viruslar: Araştırma kapsamında ishal klinik bulgulu 14 sığır, 3 koyun ve 2 keçiden sağlanan toplam 19 adet gaita örneği ile Kırklareli ilinde ishalli yenidoğan oğlaklardan MA-104 hücre kültüründe izole edilen bir rotavirus izolatı (RVA/goat-tc/TUR/Kırklareli/2007/GXPX) kullanıldı. Söz konusu gaita örneklerinin bir kısmı Alkan ve ark. (2010) tarafından yapılan bir çalışmada, tip spesifik primerler kullanılarak G ve P tiplendirmesi yapılmış olan rotavirus saha suşlarını içerdiği sığır gaita örnekleri, diğerleri ise araştırma süresince kazanılan yeni gaita örneklerinden (koyun ve keçi örnekleri) oluştu (Tablo1). Ayrıca Rotavirus saha suşları yanı sıra Grup A BRV referenz suşları olan NCDV (G6P[1]), B223(G10P[11]) ve UK (G6P[5]) suşları da kullanıldı. Söz konusu suşlar Dr. Peter Nettleton, Moredun Araştırma Enstitüsü, Edinburg, İngiltere’den (2004 tarihli kullanım izni belgesi ile) temin edildi. Tablo 1. Araştırmada kullanılan rotavirus saha suşlarına ilgili bilgiler Sıra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 16 19 2 Orijin Ankara (Polatlı) Konya (Altınova) Bursa (Karacabey) Ankara (Bala) Samsun (Karaköy) Iğdır (K. Karabekir) Samsun (Çatalçam) Sivas (Ulaş) Balıkesir (Tahirova) Aksaray (Koçaş) Eskişehir (Anadolu) Denizli (Acıpayam) Kütahya Ankara Kırklareli Eşkişehir Kod No Ank-Po-C1 Kon-Al-C1 Bur-Ka-C1 Ank-Ba-C1 Ank-Ba-C2 Sam-Ka-C1 Iğd-Ka-C1 Sam-Ça-C1 Siv-U1-C1 Bal-Ta-C1 Aks-Ko-C1 Aks-Ko-C2 Esk-An-C1 Den-Ac-C1 Küt-Ko-S1 Ank-Ka-S1 Ank-Ka-S2 Kır-Ke-G1 Esk-An-G1 Esk-An-G2 Yıl 1997 1997 2000 2001 2007 206 2003 2006 2008 2008 2005 2008 2008 1997 2008 2009 2009 2007 2009 2009 Tür Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Koyun Koyun Koyun Keçi Keçi Keçi RNA Ekstraksiyonu: RNA ekstraksiyonu High Pure Viral RNA Ekstraksiyon (Roche) kiti kullanılarak, üretici firmanın belirttiği prosedüre uygun olarak yapıldı. PCR Uygulamaları Rotavirusların genotiplendirilmesi RT işlemi için Revert Aid First Strand cDNA Sentesis Kit (Fermentas, Litvanya) kullanılarak, üretici firmanın belirttiği prosedüre uygun olarak yapıldı. Hazırlanan cDNA örnekleri, Tablo 2-5’de bildirilen primerler ve referanslar kullanılarak rotavirus VP4,VP6,VP7,NSP4 gen bölgeleri için PCR testleri (RT-PCR, heminested ve nested PCR) gerçekleştirildi. Tablo 2: VP7 gen bölgesi için RT-PCR’da kullanılacak primer dizinleri Hedef G jenerik G nested jenerik G nested jenerik Primer adı PRİMER DİZİN (5’→3’) Beg 9 Eng 9 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG GENDEKİ LOKUS 1-28 1062-1036 ÜRÜN (bp) Referans Eng 9 crw End 9 deg GGT CAC ATC TTA CAG CTT TAA CCT GGT CAC ATC DWM CAR YTC TAA YYH M 1062-1039 1062-1038 9 con 1 S end 9 TAG CTC CTT TTA ATG TAT GG GGT CAC ATC ATA CAA TTC 37-56 1062-1045 1025 Das et al. 1994 Gouvea et al. 1994 VP7-F VP7-R ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC 51-71 914-932 880 Iturriza Gómara et al, 2001 Gouvea et al. 1990 1062 Gouvea et al. 1993 Tablo 3: VP4 gen bölgesi için RT-PCR’da kullanılacak primer dizinleri Hedef P generic P semi-nested generic P nested generic Primer adı Con 3 4 con 4 Con 3 Con 2 VP4F VP4R PRİMER DİZİN TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A AAT GCT TGT GAA TCA TCC CAG TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC TAT GCT CCA GTN AAT TGG ATT GCA TTT CTT TCC ATA ATG GENDEKİ LOKUS 1-22 1073-1053 1-22 884-865 132-149 775-795 ÜRÜN (bp) Referans Gentsch et al1992 1073 877 663 Tablo 4: VP6 gen bölgesi için RT-PCR’da kullanılacak primer dizinleri Hedef VP6 generic VP6 generic semi nested Primer adı 157 VP6-R VP6-F VP6-R PRİMER DİZİN GTT TTC CAA GAG TDA THA HYT CAG C GTC CAA TTC ATN CCT GGT GG GAC GGV GCR ACT ACA TGG T GTC CAA TTC ATN CCT GGT GG GENDEKİ LOKUS 721-745 1126-1106 747-766 1126-1106 ÜRÜN (bp) 405 bp Referans IturrizaGomara et al 2002 379 bp Tablo 5: NSP4 gen bölgesi için RT-PCR’da kullanılacak primer dizinleri Hedef NSP4 gneric NSP4 nested generic Primer adı 10 beg 1 (151) 10 end 722 (152) 10 beg 16 (150) 10 rew 612 (153) PRİMER DİZİN GGCTTT WAA AAG TTC TGTTCCGAG AGAG TAA GAC CRT TCC YTC CAT TAA C TGT TCC GAG AGA GTG TGT G GAA CTC CGC CGC TTC CGA AGA C GENDEKİ LOKUS 1-28 742-722 16-35 591-612 ÜRÜN (bp) 740 bp Referans Ciarlet et al 2000 596 bp DNA Dizin Analizi ve Filogenetik Analiz: Belirtilen gen bölgelerine ilgili olarak elde edilen ürünler (amplicon) High Pure PCR Product Purification kit (Roche) ile temizlendikten sonra, otomatik DNA dizin analiz cihazı (Beckman Coulter CEQ 8000) ve PCR uygulamasında kullanılan primerler kullanılarak dizin analizine alındı. Elde edilen dizin analizlerinin, gerek kendi aralarında gerekse BLAST veri tabanında bulunan diğer rotaviruslara ilgili veriler ile kullanılarak, MEGA 4 (Tamura ve ark. 2007) programı ile filogenetik analizleri yapıldı. Analiz ve Bulgular Çalışmada Türkiye’nin değişik bölgelerinde (Şekil-1) yetiştirilen 3 kuzu, 3 oğlak ve 14 buzağıda enfeksiyon oluşturan rotavirus saha suşunun analizi gerçekleştirildi. Şekil-1: İllere göre materyallerin dağılımı (n: ornek sayisi, B:buzagi, K:Kuzu, O:Oglak) Çalışmada VP4,VP6,VP7 ve NSP4 için ayrı ayrı olarak jenerik, nested ve semi nested PCR’lar yapıldı. Her bir geni hedef alan PCR’lar sonucu oluşan urun büyüklükleri DNA merdivenleri ile hizalandı ve uygun ürün büyüklükleri/bantları görüntülendi (Resim-1).Araştırmada değerlendirilen saha suşlarının tümü (n=20), VP6 ve NSP4 gen bolgeleri yonunden yapılan PCR uygulamaları sonucunda, ilgili gen bölgeleri için beklenen büyüklükte ürün oluşturdu (Resim-1) Resim-1: VP6 ve NSP4 gen bölgelerinin PCR görüntüsü M. DNA merdiveni, 1 ve 3: NCDV -pozitif kontrol virus , 2 ve 4: Test materyali (1-2 VP6 ve 3-4 NSP4 gen bölgeleri için spesifik primerler ile yapılan uygulama) Araştırmada kullanılan test materyallerinden (1 BRV izolatı, 19 gaita ) 18 adedinde VP4 ve VP7 gen bölgeleri hedef alınarak yapılan PCR uygulamaları sonucunda spesifik amplikonlar elde edildi. Ank-Ka-S1 ve Ank-Ka-S2 olarak adlandırılan 2 koyun orijinli rotavirus suşunun G ve P tiplendirmesi ise yapılan pek çok optimizasyon çalışmaları ve değişik PCR koşullarına rağmen gerçekleştirilemedi. PCR uygulamaları sonucunda elde edilen amplikonların sekans analizi verileri, ilgili gen bölgeleri için kendi aralarında ve Gen Bank’ ta yer alan diğer bilgiler kullanılarak analiz edildi. NSP4 Gen Bölgesi Analizi NSP4, enterotoksin salgılayan gen bölgesi olup, 6 farklı genetik grupta (A-F) değerlendirilmektedir (Khamrin ve ark. 2009). Bunlardan D,E ve F gruplarının türe spesifiklik gösterdiği belirlenmiştir (Khamrin ve ark. 2009). NSP4 grup D roraviruslar deniz memelilerinde, NSP4 grup E rotaviruslar kanatlılarda ve NSP4 grup F rotaviruslar ise domuzlarda enfeksiyon etkeni olarak belirlenmiştir. NSP4 grup A, B ve C içinde bulunan viruslar için ise farklı hayvan türleri ve insanlar uygun konakçı olarak tanımlanmıştır. Özellikle NSP4 Grup A virusların enfeksiyon spektrumu oldukça geniş olup, insan, maymun, tek tırnaklılar, sığır, koyun ve keçiler uygun türler içinde belirlenmiştir. Bu durum NSP4 gen bölgesinin türler arası bulaşma yönünden önem arz ettiğini bildirilen birçok çalışmada önemle vurgulanmaktadır (Ciarlet ve ark 2000). Bu çalışmada NSP4 gen bölgesine ilgili olarak sağlanan amplikonların sekans analizi sonuçları kullanılarak hazırlanan phylogenetik ağaç incelendiğinde (Şekil 2), farklı türlere ait rotavirus saha suşlarınının tümünün NSP4 grup A’da yer aldıkları görülmüştür. Ayrıca elde edilen dizinler, NSP4 genogrup A referenz virusu (KUN-like) ve kendi aralarında karşılaştırılmış ve bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşları dizinlerinin kendi aralarında %70.1–99.4 oranlarında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Genetik Grup A’nın (KUNlike) referans virusu olan KUN suşu (Accesion number : D88829) ile yapılan karsılaştırmada ise, örneklere ait dizinler ile saptanmıştır (Tablo 6). nükleotid düzeyinde %72.3-%91.1 oranlarında benzerlik gösterdiği 74 89 Ank-Po-C1 Ank-Ka-S2 96 Ank-Ka-S1 95 Kon-Al-C1 37 Esk-An-G2 Hu/B12/HM627551 26 72 Hu/KUN/D88829 Bo/UK/K03384 Hu/1076/U59105 82 11 53 Cap/GO34/GU937886/A Igd-Ka-C1 Ov/ORV762/EF554157 71 9 Kir-Ke-G1 65 Aks-Ko-C2 65 82 Kut-Ko-S1 Ank-Ba-C2 Bal-Ta-C1 26 14 Esk-An-G1 36 Genetik Grup A Siv-Ul-C1 84 Aks-Ko-C1 97 99 Esk-An-C1 Si/SA11/K01138 74 Bo/WC3/AY050273 Bo/NCDV/X06806 82 18 74 95 Den-Ac-C1 Sam-Ca-C1 97 34 Bo/CE-M-06-0509/GU183214 Bo/CE-M-06-0521/GU183215 Bur-Ka-C1 55 34 Ank-Ba-C1 98 91 Sam-Ka-C1 Ov/Lp14/AY219873 79 100 58 Ov/Lamb-NT/FJ031022 Gu/RioNegro/FJ347131 Eq/FI-23/AF144802 Bo/B223/AF144805 100 42 Fe/FRV-1/D89874 50 100 Hu/AU-1/D89873 Si/RRV/L41247 77 Cap/GRV/AB055968 Genetik Grup C Ca/RS-15/D88832 90 56 Ca/CU-1/AF144806 Ca/A79-10/EU708943 71 100 Ca/K9/EU708932 100 Po/CMP034/DQ534017/F Po/P21-5/DQ629927/F 45 Po/A253/AF144797 Po/A131/AF144798 64 68 Genetik Grup F Po/A34/AF165219 59 60 Po/OSU/D88831 Genetik Grup B Hu/M37/U59109 Hu/RV3/U42628 100 Hu/Wa/K02032 91 76 Hu/VA70/U83798 Mu/EW/U96335 100 Mu/EC/U96337 Genetik Grup D Av/Ty-1/AB065285 100 Av/Ch-1/AB065287/E Genetik Grup E Şekil -2: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının NSP4 gen bölgesinin filogenetik analizi Tablo-6: KUN suşu ile çalışmadaki virusların nukleotid düzeyindeki yüzde farklılıkları VP6 gen Bölgesi Analizi VP6 gen bölgesi 6. Segment tarafından kodlanır ve transcripsiyonda görev yapar. Ayrıca yapisal ve immunolojik role de sahiptir. Grup spesifik antijenik determinant olan bu gendeki farklılıklara gore rotaviruslar 7 gruba ayrilir (A-G). Genellikle mutasyonel açıdan korunmuş bir gen olduğundan rotavirus tanısında kullanılan bir bölgedir (Iturzia-Gomara ve ark 2002). Bu çalışmada VP6 gen bölgesi için elde edilen ürünlerin dizin analizi verileri kullanılarak yapılan phylogenetik değerlendirmede, saptanmıştır. saha suşlarının tümünün VP6 genotip I2’de yer aldığı 57 22 Bo/CE-M-06-509/GU183242 Bo/CE-M-06-521/GU183241 Den-Ac-C1 27 Bo/WC3/AF411322 64 36 Bo/UK/X53667 Hu/B12/HM627546 57 Bo/RF/K02254 48 87 Sam-Ka-C1 Bo/NCDV/AF317127 12 Bo/BRV033/AF317126 73 85 Bo/B223/AF317128 Ov/ORV762/EF554152 51 19 96 27 Ov/Aragon/FN675938 Aks-Ko-C2 Bal-Ta-C1 Bur-Ka-C1 19 91 26 Hu/US1205/AF079357 Cap/GO34/GU937881 Aks-Ko-C1 34 87 Siv-Ul-C1 77 50 Sam-Ca-C1 I2 Hu/I321/X94618 Gu/RioNegro/FJ347126 24 100 79 Eq/H-2/D00324 Eq/FI-23/D82971 Hu/S2/Y00437 22 Ov/Lp14/L11595 100 21 Ov/Lamb-NT/FJ031028 Kir-Ke-G1 Hu/1076/D00325 98 81 68 32 Kon-Al-C1 Ank-Ba-C1 51 Ank-Ka-S2 61 66 Igd-Ka-C1 Ank-Ba-C2 96 49 Ank-Po-C1 Kut-Ko-S1 Esk-An-C1 22 Esk-An-G1 39 64 Esk-An-G2 44 88 Ank-Ka-S1 Si/SA11/M27824 99 74 Po/A131/AF317124 Eq/H-1/AF242394 99 Po/A411/AF317125 I5 Po/CN86/U10031 100 96 Eq/FI-14/D00323 Eq/HO-5/D82973 I6 Po/Gottfried/D00326 49 Hu/116E/U85998 98 Hu/RV3/U04741 65 I1 Hu/Wa/K02086 32 74 Hu/E210/U36240 I7 I4 Şekil-3: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının VP6 gen bölgesinin filogenetik analizi Mu/EW/U36474 Av/PO-13/D16329 VP4 ve VP7 Gen Bölgesi Analizi Kullanılan saha viruslarından ishalli kuzuya ait olanlar 2 adedi (Ank-Ka-S1 ve Ank-Ka-S2) hariç diğer örneklerin PCR ve takiben alınan sekans analiz verileri değerlendirildiğinde; Sığır orijinli örneklerde VP7 gen bölgesi analizine göre G6, G10 VP4 gen bölgesi analizine göre P[1], P[5] ve P[11] tipleri, Koyun orijinli örnek de VP7 gen bölgesi analizine göre G8 VP4 gen bölgesi analizine göre P[1] genotipi Keçi orijinli örneklerde VP7 gen bölgesi analizine göre G6 ve G8 , VP4 gen bölgesi analizine göre P[1] genotipi varlığı saptandı. Bu sonuçlara göre sığır örneklerinde G6 genotipinin (%64.2, 9/14), G10 genotipine göre (%35.75, 9/14) daha yaygın olduğu; P tiplerinin dağılımının ise P[1], P[5],P [11] için sırasıyla %35.7 (5/14), %35.7 (5/14), %28.5 (4/14) olduğu saptandı. Sığır orijinli saha suşlarının G ve P tip kombinasyonları değerlendirildiğinde en sık saptanan kombinasyonların G6P[1] (%28.5, 4/14) ve G6[5] (%28.5, 4/14) olduğu, bunları G10P[1] (%21.4, 3/14) kombinasyonunu izlediği saptandı. Bunlardan başka G6P[11], G10P[1] ve G10P[5] genotiplerinin her birinin aynı oranda ( %7.1,1/14) varlığını saptandı. Koyun örneklerinden yalnızca biri VP4 ve VP7 yönünden değerlendirilebildiği halde, keçi örneklerinin tümü ilgili gen bölgeleri yönünden değerlendirildi ve keçilerde G6 yada G8 ile kombinasyon halinde P[1] genotipli rotavirus identifiye edildi. Araştırmada kullanılan rotavirus saha suşlarının her birisi için G ve P tiplendirme sonuçları Tablo-3’de sunuldu. Tablo -3 : VP7 ve VP4 gen bölgeleri yönünden elde edilen genotipler. Sıra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 İl Ankara (Polatlı) Konya (Altınova) Bursa (Karacabey) Ankara Bala) Samsun (Karaköy) Iğdır (K. Karabekir) Samsun (Çatalçam) Sivas (Ulaş) Balıkesir (Tahirova) Aksaray (Koçaş) Eskişehir (Anadolu) Denizli (Acıpayam) Küthya Kırklareli Ankara (Kazan) Eşkişehir (Anadolu) Kod No Ank-Po-C1 Kon-Al-C1 Bur-Ka-C1 Ank-Ba-C1 Ank-Ba-C2 Sam-K-C1 Iğd-Ka-C1 Sam-Ça-C1 Siv-U1-C1 Bal-Ta-C1 Aks-KoC1 Aks-Ko-C2 Esk-An-C1 Den-Ac-C1 Küt-Ko-S1 Kır-Ke-G1 Ank-Ka-S1 Ank-Ka-S2 Esk-An-G1 Esk-An-G2 Yıl 1997 1997 2000 2001 2007 2006 2003 2006 200 2008 2005 2008 2008 1997 2008 2007 2009 2009 2009 2009 Sekans sonucunda saptanan Genotipler VP7 VP4 G6 P5 G6 P5 G10 P5 G6 P1 G6 P1 G10 P1 G6 P1 G10 P11 G10 P1 G6 P5 G6 P11 G10 P11 G6 P1 G6 P5 G8 P1 G8 P1 * * * * G6 P1 G6 P1 Tür Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Sığır Kuzu Oglak Kuzu Kuzu Oglak Oglak VP7 Gen Bölgesi Analizi Dünyada bugüne kadar 27 tane G tip tespit edilmiştir (Matthijnssens ve ark. 2011). Sığırlarda sıklıkla saptanan G genotip G6 ve G10 olarak bilinmektedir. Bununla birlikte G8 genotipin son yıllarda sığırlarda varlığı saptanmıştır (Fukai ve ark 2004). Bu çalışmada G6 olarak tiplendirilen viruslar, Ghosh ve ark (2007) tarafından bildirilen G6’nin kendi içinde 5 alt gruba ayrılması gerektiğini ve böylece türler arası nakillerin daha rahat açığa çıkarılabileceğini önerisi de dikkate alınarak, hazırlanan phylogenetik agaç incelenerek değerlendirildiğinde, bir keçi (Esk-An-G1) ve bir sığır şusu (Aks-Ko-C1), MC27 benzeri grupta yer aldığı saptandı. Diğer G6 genotip virusların ise Ghosh ve ark (2007) tarafından önerilen 5 grubun dışında bir grup oluşturdukları görüldü. Şekil-4: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının VP7 (G6 Tipler) gen bölgesinin filogenetik analizi Bu çalışmada, VP7 (G) tiplendirme çalışmaları sonucunda 2 adet G8 tipe sahip saha suşu identifiye edilmiştir (Tablo 3). Bu saha suşlarının (Kir-Ko-S1 ve Kir-Ke-G1) şusu, Sharma ve ark.’nın (2009) önerdiği G8 tiplendirmesi örneği dikkate alınarak yapılan pilogenetik analizi Şekil 5’de sunuldu. Bu analiz değerlendirildiğinde saptanan 2 saha virusunun birbirine genetik olarak yakın olduğu, buna karşın Genbank’ta verileri bulunan koyun saha suşları ile farklı subgruplarda yer aldıkları saptandı. G8 genotipinin türler arası bulaşma ve yanlış konak secimi noktasında tanımlandığı birçok çalışma bulunmaktadır. Nitekim Ghosh ve ark. (2011) tarafından bildirilen çalışmada Kenya’da asemptomatik çocuklardan tespit ettikleri B12 suşunun (G8P[1]) full genom analizinin yapıldığı ve virusun gevişgetiren hayvanlar kaynaklı bir rotavirus olduğu, dolayısıyla türler arası nakil oluştuğu bildirilmiştir. Chitambar ve ark’da (2011) sığırlarda tespit ettikleri G8P[14] genotipli rotavirus suşlarının filogenetik analizi sonucunda, sözkonusu saha suşlarının sığır-insan rotavirus arasındaki gen değişiminden oluşan bir virus olduğunu, G genotipin sığır, P genotipin ise insan rotavirus orijinli olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada sığırlarda G8 genotip belirlenmezken, koyun ve keçilerden G8 genotipli rotavirus tespiti yapılmıştır. Literatür bilgiler ve Türkiye’de özellikle küçük aile işletmelerinin yapısı da dikkate alınarak, söz konusu suşların hayvan-insan rotaviruslarının segment değişimi sonucu oluşmuş olabileceği olasılığı değerlendirilebilir. Bununla birlikte Türkiye’de insanlarda G8 genotipli rotavirus varlığının sorgulandığı/bildirildiği bir çalışma bulunmaması yanı sıra, izolatların full genom analizleri yapılmadığından bu yaklaşım ancak bir olası değerlendirme niteliğindedir. Şekil-5: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının VP7 (G8 Tipler) gen bölgesinin filogenetik analizi G10 genotipli rotavirus yalnızca sığırlardan sağlanan örneklerde saptanmıştır. Bilindiği kadarıyla literatür verilerde de koyun ve keçilerden sözkonusu genotipli virus tespiti bulunmamaktadır. Sözkonusu virusların VP 7 gen bölgesi ürünlerinin dizin analiz sonuçları Esona ve ark. (2011) tarafından bildirilen filogenetik ağaç model alınarak Şekil-6’da sunulmuştur. Şekil 6 incelendiğinde bu çalışmada saptanan G10 genotipli 5 saha suşunun tümünün G10 genotipli referenzvirus B223’ünde içinde yer aldığı L5’de yer aldığı görülmüştür. Bu noktada, Samsun’dan tespit edilen bir saha suşunun (Sam-Ca-C1) diğer 4 ünden genetik olarak daha uzak olduğu ve bu suşun insan orijinli rotavirus suşu olan Hu/I321/L07658 ile nükleotid düzeyinde %92.5 yakınlık gösterdiği saptanmıştır. Şekil-6: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının VP7 (G10 Tipler) gen bölgesinin filogenetik analizi VP4 Gen Bölgesi Analizi VP4’te şimdiye kadar 35 tip tespit edilmiştir (Matthijnssens ve ark. 2011). Bu projede saptanan P genotipler ise P[1], P[11] ve P[5] olarak identifiye edilmiştir. Koyun ve keçi orijinli rotavirus suşları P[1] genotipli olarak identifiye edilirken, sığır orijinli rotavirus suşlarının P[1] (%35.7), P[5] (%35.7) ve P[11] (%28.5) genotipli olduğu saptanmıştır. Şekil 7 incelendiğinde ve nükleik asid benzerlikleri değerlendirildiğinde, koyun, sığır ve keçi orijinli P[1] genotiplerin önemli ölçüde benzerlik gösterdiği görülmektedir. 100 82 Hu/Wa/M96825/P8 Hu/RV-5/M32559/P4 100 Po/Gottfried/M33516/P6 Po/4F/L10359/P19 59 Den-Ac-C1 Bur-Ka-C1 84 36 Kon-Al-C1 89 72 Ank-Po-C1 Bal-Ta-C1 40 100 59 Bo/DijonA030/06/GU259591/P5 Bo/CIT-A99/GQ414745/P5 Bo/61A/D13396/P5 Po/4S/L10358/P5 36 14 P[5] Bo/V1005/X79795/P5 8 18 41 9 Bo/CJN-M/D16351/P5 Bo/KJ75/DQ494408/P5 Bo/VMRI/U53923/P5 Bo/WC3/AY050271/P5 26 0 Bo/CP-1/AF448851/P5 53 99 Bo/UK/M22306/P5 Eq/H-2/L04638/P12 93 Hu/69M/M60600/P10 90 Mu/EB/L18992/P16 Mu/EHP/U08424/P20 0 Si/TUCH/AY596189/P24 5 Hu/Ecu534/EU805773/P28 13 Ov/Lp14/L11599/P15 35 99 0 Ov/LAMB-NT/FJ031027/P15 Po/61-07/FJ492835/P32 Po/134-04-15/DQ061053/P26 67 Po/A46/AY050274/P13 73 0 100 La/229-01/AF526375/P22 Po/A34/AY174094/P23 Bo/Dai-10/AB513836/P33 Po/FGP51/AB571047/P34 49 8 99 Po/344-04-1/DQ242615/P27 96 Si/RRV/M18736/P3 13 Cap/GRV/AB055967/P3 0 Si/SA11/M23188/P2 Bo/Hg18/AF237665/P21 Eq/L338/D13399/P18 1 Hu/B12/HM627545/P1 46 99 Bo/A5/D13395/P1 Cap/GO34/GU937880/P1 67 Gu/Arg/RioNegro/1998/FJ347125/P1 10 98 98 Kir-Ke-G1 Kut-Ko-S1 23 HU/HMG035/AF361438/P1 Ov/Aragon/FN675939/P1 42 Si/PTRV/FJ422134/P1 41 97 31 Bo/O-AGENT/DQ838596/P1 Environment/AF045228/P1 65 Bo/KJ44/DQ494407/G5P1 32 Po/66-1/FJ870285/P1 34 31 8 66 P[1] Bo/CHLY/FJ969816/P1 Bo/BRV033/U62155/P1 18 Bo/NCDV/AB119636/P1 Po/11-1/FJ807880/P1 65 Sam-Ka-C1 32 Ank-Ba-C2 59 Igd-Ka-C1 12 Ank-Ba-C1 11 Esk-An-G2 11 Esk-An-G1 64 25 Esk-An-C1 Po/OSU/X13190/P7 Bo/AzuK-1/AB454420/P29 Hu/Dhaka6/AY773004/P25 Hu/K8/D90260/P9 99 Bo/Sun9/AB158430/P14 77 Cap/Cap455/AY128709/P14 89 100 70 18 Ov/ORV762/EF554151/P14 Bo/CE-M-06-521/GU183235/P11 Bo/CE-M-06-509/GU183236/P11 4 Bo/B223/D13394/P11 4 Bo/A44/D13392/P11 1 Aks-Ko-C1 5 Sam-Ca-C1 Aks-Ko-C2 4 43 6 Siv-Ul-C1 Gir/GirRV-2/EU548033/P11 P[11] Bo/CIT-RA83/EU164421/P11 27 Bo/XJX-07/EU828785/P11 94 Bo/B11/AY047488/P11 4 Bo/K33/D14367/P11 5 96 100 Bo/KK3/D14367/P11 Bo/RUBV319/EF199510/P11 Hu/116E/L07934/P11 78 25 Ch/Ch-661G1/EU486962/P31 Ch/Ch-2G3/EU486956/P30 100 Bo/993-83/D16352/P17 61 Tu/03V0002E10/EU486958/P35 Şekil-7: Bu çalışmada kullanılan rotavirus saha suşlarının VP4 gen bölgesinin filogenetik analizi IV. Sonuç ve Öneriler Rotaviruslar segmentli genoma sahip viruslardır. Her bir segmentin bir proteini kodlamasından dolayı genom kodlanırken ayrılıp tekrar toplanma sırasında ve iki farklı virusun tek bir hücreyi enfekte etmesi durumunda çeşitli kombinasyonlarda subgruplar oluşabilir. Örneğin rotaviruslar, VP6 geni yapısına göre 7 farklı grup (A,B,C,D,E,F,G) ve NSP4 geni yapısına göre de 7 genotip (A-G) içinde değerlendirilirler (Estes 2001). Rotaviruslarda genetik çeşitliliğin nedenleri temelde sekans varyasyonu, genetik re-arrangement ve genetik reassortment olarak 3 başlık altında incelenebilir. Sekans varyasyonu, rotavirusların replikasyon sırasında viral genom kodlanırken kullandığı RNA ya bağlı RNA polimeraz enziminin mutasyon oluşturma ya da yanlış okuma yüzdesinin fazla olmasından kaynaklanır. Bu durum her bir replikasyonda bir nükleotid için 5x10-5 olarak bildirilmekte olup, bu oran dünya genelinde çeşitli coğrafyalarda rotavirusların gösterebileceği çeşitlilik düzeyi konusunda fikir vermektedir. Genetik rearrangement, muhtemelen replikasyon sırasında polimeraz pozitif veya negatif ipliğin sentezi aşamasında gelişen intramoleküler rekombinasyon sonucu gelişen, kısmi olarak duplike segmentlerin oluşumudur. Genetik reassortment ise, iki virusun aynı anda bir hücreye girmesi durumunda, virusların replikasyon sonrası toparlanmaları aşamasında segment değiştirmesi olayıdır. Bu durum farklı virusların oluşumuna yol açar. Bu durum aynı türün farklı genotipli virusları (örneğin sığır G6 ve G10) arasında olabileceği gibi, farklı türlere ait rotaviruslar (örneğin sığır G10 ve insan G1) arasında da oluşabilir. Bildirilen nedenlerle farklılaşan rotaviruslar, hastalığın patogenezi ve epidemiyolojisinde önemli role sahiptirler. Özellikle segment değişimine (reassortment) bağlı olarak çok büyük bir kaçış mekanizması oluşmaktadır ki, bu durum hastalığın kontrolü için aşı uygulanması yönünden (aşı suşu seçimi, ticari aşı tercihlerinin belirlenmesi gibi) büyük önem taşımaktadır (Iturzua Gomara ve ark. 2003). Mutasyon mekanizmalarına bağlı olarak oluşan farklılaşmalar sonucu ortaya çıkan yeni saha suşları nedeniyle sorgulanması gereken bir diğer önemli konu ise türler arası nakil olasılığı ve dolayısıyla rotavirusların zoonotik potansiyelidir (Midgley ve ark 2011, Martella ve ark 2010). Nitekim uygun koşullarda, rotavirus reassortment populasyonunun tehlikeli olacağı birçok araştırmacı tarafından bildirilmiştir. Banerjee ve ark ,2007 genetik karakterizasyonunu yaptıkları 2 insan orijinli rotavirus saha suşundan aldıkları verileri ve >6 ay çocuklarda enfeksiyonun asemptomatik doğasına bakarak, bu suşların zoonotik enfeksiyon nedeni olduğu tezini kuvvetle savunmuşlardır. Araştırıcılar hayvan rotaviruslarının bağırsakta zayıf replikasyonunun asemptomatik ya da hafif enfeksiyona yol açtığını, virus saçılımının da dolayısıyla düşük olduğunu ve insan-insan bulaşmasının böylece sınırlanıyor olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte mix rotavirus enfeksiyonlarının sıkça geliştiği, segment değişimlerinin de bunun sonucunda sıkça oluştuğu düşünüldüğünde, gelişecek yeni suşun global olarak tehlikeli bir enfeksiyon yaratmasının mümkün olduğu bildirilmektedir. Özellikle gelişmiş ülkelerde asemptomatik çocukların, farklı rotavirus saha suşları arasında segment değişimleri (reassortment) için bir anlamda hazırlayıcı faktör olarak değerlendirilebileceği ve bu nedenle özellikle insanlarda oluşabilecek büyük salgınlar bakımından potansiyel rezervuar olan evcil hayvanlara ilgili epidemiyolojik ve moleküler çalışmaların yapılması gereğine dikkat çekmişlerdir (Adah 2001, Ball ve ark. 2005, Deepa ve ark 2007). Benzer olarak, El-Attar ve ark. (2001) Rotavirus PP1suşunun domuzlarda patojenik olmasına karşın, sığırlarda hastalık oluşturmadığını ve bu virusun domuz VP4 ve NSP4 ile sığır NSP1 geninen sahip, G3 genotipli domuz-sığır reassortmenti olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar NSP4’ün konakçı-tür spesifik enfektiviteye ve hastalığa yol açtığını, bu nedenle PP-1 suşunun domuz orijinli NSP4 içerdiğinden, domuzda klinik tablo oluşturmasına karşın sığırda oluşturmadığını; domuz ve sığır rotaviruslarının farklı 2 genotipte (A ve B) olmaları nedeniyle, bunun biyolojik özelliklerindeki farklılığa da işaret ettiğini bildirmektedirler. NSP4 yanısıra, G ve P kombinasyonları da bağışıklıkta önemli olduğundan, saha suşlarında G ve P genotipleri ile NSP4 ilişkisi bağışıklık, VP6 genotip ile NSP4 ilişkisi etkenin biyolojik özellikleri ve dolayısıyla enfeksiyonun patogenezine ilişkin değerlendirmeler yönünden önem taşımaktadır. Nitekim NSP4 genotipi ile VP6 gen bölgesinin sekans analizi verileri birlikte değerlendirildiğinde, genellikle SGI ile NSP4 genotip A ve SGII ile NSP4 B arasında ilişki varlığı bildirilmiştir (Fukai ve ark 1999). Benzer olarak bu çalışmada saptanan tüm rotavirus suşları NSP4 genotip A ve SGI içinde klasifiye edilen VP6 I2 içinde identifiye edilmiştir. Türkiye’de rotavirus nedenli buzağı enfeksiyonlarına ilgili birçok çalışma (Alkan ve ark. 2010, Burgu ve ark 1995, Özkul ve ark 2002) bildirilmiş olmakla birlikte, genetik karakterizasyonlarına ilgili olarak bilindiği kadarıyla sadece Alkan ve ark; 2010 tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada bulunmaktadır. Bu çalışmada, sığır orijinli rotavirusların dizin analizi sonucunda da Türkiye’de sığırlarda 2 farklı G (G6 ve G10) ve 3 farklı P genotip (P1,P5, P11) varlığı saptanmıştır. Bu noktada koyun ve keçiler için yalnızca P1 genotip varlığı dikkat çekicidir. G genotipler yönünden değerlendirildiğinde sığır orijinli virusların aksine koyun ve keçilerde G8 varlığı saptanmıştır. G8 genotipin literatürler incelendiğinde keçiler için ilk kez identifiye edilen bir genotip olması, koyunlar için ise bilindiği kadarıyla İspanya’da (Aragon suşu) bildirilen tek bir çalışmanın (Galindo-Cardiel ve ark. 2011) varlığı vurgulanmaya değer görülmüştür. Her ne kadar sözkonusu türler için ya da türlerarası nakil olasılığının sorgulanması noktası, türlere ait materyal sayıları çok yüksek olmasa da, veriler enfeksiyonun Türkiye’de epidemiyoloji, özellikle virus-duyarlı konakçı sorgulanması, türlerarası nakil olasılığı, ülkemizde hayvan orijinli rotavirusların zoonotik potansiyeli, vb. noktalarda planlanması gereken birçok çalışmaya ilgili önemli ipuçları ve soru işaretlerini ortaya konulmuştur. Aşılama çalışmaları sonucunda, aşılanan annelerden doğan yavruların enfeksiyona yakalanma oranlarının önemli ölçüde azaldığı bildirilmiştir (Kohara ve ark 1997). Bu noktada birçok çalışmada aşı suşlarının seçiminin önemi üzerinde durulmuş ve saha suşlarının G ve P serotipleri belirlenerek (Gulati ve ark. 1999), benzer serotiplerin aşı suşu olarak seçildiği aşıların kullanımının önemine dikkat çekilmiştir. Lu ve ark.(1994) BRV’un P serotip farklılıklarının değişik düzeyde çapraz reaksiyona neden olduğunu ve aşı suşundan farklı P tipi BRV ile enfeksiyonun gelişmesinde, aşılanmış annelerden doğan buzağılarda enfeksiyona karşı maternal bağışıklığın başarısızlığının sözkonusu olabileceğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar Amerika Birleşik Devletleri’nde en azından 20 yıldan bu yana BRV Lincoln suşunu (G6:P[1]) içeren aşılar kullanılmasına rağmen yenidoğanlarda enfeksiyonun varlığının sürmesinin, aşı-saha suşu serotipleri farklılıklarından kaynaklandığını bildirmişler ve bu aşıların kullanıldığı 2 farklı işletmedeki buzağılardan sağlanan BRV’ların P geni farklılığını göstermişlerdir. Bu çalışma verileri, daha önce Alkan ve ark. 2010 tarafından sunulan araştırma verileri ile birlikte değerlendirildiğinde, Türkiye’de ticari olarak sunulan ve BRV NCDV suşu içeren aşılara alternatif olarak, saptanan yerel rotavirus suşlarını büyük oranda içerecek ve farklı genotip kombinasyonlarına sahip rotaviruslar ile hazırlanması muhtemel aşıların geliştirmesi yönünde araştırmalar yapılması gereğini düşündürmüştür. Tüm bu bilgiler ışığında; • Türkiye’de farklı hayvan türlerine ait rotavirusların genetik karakterizasyonu sonucunda 3 farklı G (G6,G8 ve G10) tip ve 3 farklı P (P[1], P[5] ve P[11]) tip varlığı tespit edilmiştir. • Sığır rotavirus suşları değerlendirildiğinde G6, G10 ve P[1], P[5] ve P[11]) varlığı, koyun rotavirus suşlarında ise G6,G8 ile P[1] genotip kombinasyonlu rotavirusların varlığı saptanmıştır. Karakterizasyonu yapılan bir koyun rotavirusu ise G8 P[1] olarak identifiye edilmiştir. Bununla birlikte türlere ait materyal sayıları sınırlı olduğundan sözkonusu türler için farklı genotip kombinasyonlarının varlığı olasılığının bulunması olasıdır. • G8 P[1] kombinasyonu koyunlar için yakın zamanda İspanya’da bildirilmiş olmakla birlikte, bu G ve P gentipler/genotip kombinasyonu keçiler için ilk kez bildirilmektedir. • Koyun ve keçilerde G8 genotip tespiti, sözkonusu genotipin zoonotik potansiyeline ilgili birçok bildirim de dikkate alınarak, insanlarda söz konusu genotipin sorgulanması önerilmektedir. • Bu çalışmada saptanan rotavirusların tüm gen analizi yapılmamıştır. Özellikle koyun ve keçi orijinli G8 genotipli virusların tüm genom analizi türler arası nakil olasılığı yönünden değerlendirilmelidir. • Türkiye’de var olan ticari aşıların içerdiği rotavirus suşları ile izole edilen saha suşlarının niteliği düşünüldüğünde, yerel suşlar kullanılarak hazırlanacak aşılanan alternatif olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir. VI. Kaynaklar Adah M I., Wade A., Tanıguchı K. (2001). Molecular Epidemiology of Rotavirus in Nigeria: Detection of Unusual strains with G2P[6] and G8P[1] Specificities J.Clin Microbiol, 39: 3969-3975, Alkan F. (1998) Buzağı İshallerinde Rotavirus ve Coronavirusların Rolü, Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 45:29-37 Alkan F., Ozkul A., Oguzoglu T.C., Tımurkan M.Ö., Çalışkan E., Martella V., Burgu I. (2010) Distribution of G (VP7) and P (VP4) genotypes of group A bovine rotaviruses from Turkish calves with diarrhea, 1997-2008. Vet Microbiol Volume 141, Issues 3-4, 24 March 2010, 231-237 Ball JM., Mitchell DM., Gibbons TF., Parr RD (2005). Rotavirus NSP4: a multifunctional viral enterotoxin. Viral Immunol 18: 27-40. Banerjee I., Iturrıza-Gomara M., Rajendran P., Prımrose B., Ramanı S., Gray JI. Brown DW., Kang G. (2007) Molecular characterization of G11P[25] and G3P[3] human rotavirus strains associated with asymptomatic infection in South India. Journal of Medical Virology 79(11):1768-1774 Burgu İ., Akça Y., Alkan F., Özkul A., Karaoğlu T. (1995) Yenidoğan İshalli Buzağılarda Rotavirusların Elektron Mikroskopi (EM), Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) ve Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) Teknikleri ile Çabuk Teşhisi ve Antijenik Karakterizasyonu. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 42:491-498 Chitambar SD, Arora R, Kolpe AB, Yadav MM, Raut CG (2011) Molecular characterization of unusual bovine group A rotavirus G8P[14] strains identified in western India: emergence of P[14] genotype. Vet Microbiol. 24;148(2-4):384-8 Ciarlet M, Liprandi F, Conner ME, Estes MK (2000) Species specificity and interspecies relatedness of NSP4 genetic groups by comparative NSP4 sequence analyses of animal rotaviruses. Arch Virol 145: 371–383. Das, B. K., J. R. Gentsch, H. G. Cicirello, P. A. Woods, A. Gupta, M. Ramachandran, R. Kumar, M. K. Bahn, and R. I. Glass. (1994). Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India. J. Clin. Microbiol. 32:18201822 Deepa R. ; Durga Rao C. ; Suguna K. ;(2007) Structure of the extended diarrhea-inducing domain of rotavirus enterotoxigenic protein NSP4 . Archives of virology 152(5):847-59 El-Attar L., Dhaliwal W., Howard C. R., and J. C. Bridger (2001) Rotavirus Cross-Species Pathogenicity: Molecular Characterization of a Bovine Rotavirus Pathogenic for Pigs. Virology, 291: 172-182. Estes MK (2001) Rotavirus and their replication, p.1747-1785.In: D.M. Knipe, and P.M. Howley (Ed.), Fields Virology, 4th ed., Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa. Esona MD, Banyai K, Foytich K, Freeman M, Mijatovic-Rustempasic S, Hull J, Kerin T, Steele AD, Armah GE, Geyer A, Page N, Agbaya VA, Forbi JC, Aminu M, Gautam R, Seheri LM, Nyangao J, Glass R,Bowen MD, Gentsch JR. (2011) Genomic characterization of human rotavirus G10 strains from the African Rotavirus Network: relationship to animal rotaviruses.Infect Genet Evol. , 11(1):237-41. Fukai K., Sakai,T., Hirose,M., Itou,T. , (1999). Prevalence of calf diarrhea caused by bovine group A rotavirus carrying G serotype 8 specificity. Vet.Microbiol, 66,301-311 Fukai K, Saito T, Inoue K, Sato M. (2004) Molecular characterization of novel P[14],G8 bovine group A rotavirus, Sun9, isolated in Japan. Virus Res. 15;105(1):101-6. Galindo-Cardiel I, Fernández-Jiménez M, Luján L, Buesa J, Espada J, Fantova E, Blanco J, Segalés J, Badiola JJ. (2011) Novel group A rotavirus G8 P[1] as primary cause of an ovine diarrheic syndrome outbreak in weaned lambs Vet Microbiol. 5;149(3-4):467-71 Gentsch JR, Glass RI, Woods P, Gouvea V, Gorziglia M, Flores J, Das BK, Bhan MK. (1992). Identification of group A human rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 30: 1365–1373 Ghosh, S.. Varghese V, S. Samajdar,M. Sinha, TN. Naik, N. Kobayashi, (2007) Evidence for Bovine Origin of VP4 and VP7 Genes of Human Group A Rotavirus G6P[14] and G10P[14] Strains, J. of Cli. Mic., , p. 2751–2753 Ghosh S, Gatheru Z, Nyangao J, Adachi N, Urushibara N, Kobayashi N. (2011) Full genomic analysis of a G8P[1] rotavirus strain isolated from an asymptomatic infant in Kenya provides evidence for an artiodactyl-to-human interspecies transmission event. J Med Virol. ;83(2):367-76. Gulatı Rb., Nakagomi O., Koshimura Y., Nakagomi T., Pandey R. (1999). Relative Frequencies Of G And P Types Among Rotavirus From Indian Diarrheic Cow And Buffalo Calves. J.Clin. Microbiol 37: 2074-2076; Gouvea, V., C. Ramirez, B. Li, N. Santos, L. Saif, H. F. Clark, and Y. Hoshino. (1993). Restriction endonuclease analysis of the vp7 genes of human and animal rotaviruses. J. Clin. Microbiol. 31:917-923 Gouvea V, Santos N, M. do C Timenetsky (1994) Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. Clin Microbiol 32:1338-1340 J Gouvea V, Glass RI, Woods P, Taniguchi K, Clark HF, Forrester B and Fang ZY (1990) Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acids from stool specimens. J Clin Microbiol 28: 276-282 Iturizza-Gomara M, Cubitt D, Desselberger U, Gray J. (2001) Amino acid substitution within the VP7 protein of G2 rotavirus strains associated with failure to serotype. J Clin Microbiol 39:3796–3798 Iturriza-Gomara, M.,Wong,C., Blome,S., Desselberger,U., Gray J.(2002). Molecular characterization of VP6 genes of human rotavirus isolates: Correlations of genogroups with subgroups and evidence of independent- segregation. J of Virology. 76: 6596-6601. Iturriza-Gomara, M., Anderton E., Kang G., GallimoreC., Phillips W., Desselberger U and Gray J (2003). Evidence for genetic linkage between the gene segments encoding NSP4 and VP6 proteins in common and reassortant human rotavirus strains J Clin Microbiol 41: 3566-3573. Khamrin P, Maneekarn N, Peerakome S, Malasao R, Thongprachum A, Chan-It W, Mizuguchi M, Okitsu S, Ushijima H. (2009) Molecular characterization of VP4, VP6, VP7, NSP4, and NSP5/6 genes identifies an unusual G3P[10] human rotavirus strain.J Med Virol. ;81(1):176-82. Kohara,J., T. Hirai, K. Mori, H. Ishizaki, and H. Tsunemitsu.(1997). Enhancement of passive immunity with maternal vaccine against newborn calf diarrhea. J.Vet.Med.Sci. 62: 219-221. Lu W ; Duhamel E D., Benfield,A.B., Grotelueschen D.M. (1994). Serological and genotypic characterization of group A rotavirus reassortments from diarrheic calves born to dams vaccinated against rotavirus. Vet Microbiol, 42,159170 Matthijnssens J, Ciarlet M, McDonald SM, Attoui H, Bányai K, Brister JR, Buesa J, Esona MD, Estes MK, Gentsch JR, Iturriza-Gómara M, Johne R, Kirkwood CD, Martella V, Mertens PP, Nakagomi O,Parreño V, Rahman M, RuggeriFM, SaifLJ, SantosN, SteyerA, TaniguchiK, PattonJT, DesselbergerU, VanRanstM,(2011)Uniformity of r otavirus strain nomencuature proposed bythe Rotavirus Classification Working Group (RCWG). Arch Virol. ;156(8):1397-413. Martella V, Bányai K, Matthijnssens J, Buonavoglia C, Ciarlet M. (2010) Zoonotic aspects of rotaviruses. Vet Microbiol. 27;140(3-4):246-55. Midgley SE, Hjulsager CK, Larsen LE, Falkenhorst G, Böttiger of rotavirus group A in Danish adults. Epidemiol Infect. 27:1-5 B (2011) Suspected zoonotic transmission Özkul A., Yeşilbağ K., Karaoğlu T., Burgu İ. (2002) Electrophoretypes of Bovine Rotaviruses Detected in Turkey Turk. J. Vet. Anim. Sci.,26:359-362 Sharma S, Paul VK, Bhan MK, Ray P. (2009) Genomic characterization of nontypeable rotaviruses and detection of a rare G8 strain in Delhi, India. J Clin Microbiol. 47(12):3998-4005. Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599 VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları Proje sarf malzeme kalemi, hizmet alımı ve ve seyehat kalemi olmak üzere toplam 45.000 TL ile desteklenmiş olup, bütçenin 43.162, 92 TL’si kullanılmıştır. Yapılan harcamalara ilişkin detaylar aşağıdaki tablo’da sunulmuştur. Sıra Harcama Tipi 1 Malzeme Alımı 2 Malzeme Alımı 3 Malzeme Alımı 4 Hizmet Alımı 5 Seyahat (Malatya) 6 Seyahat (Bursa) TOPLAM Tarih 10.12.2009 10.12.2009 28.06.2010 23.11.2010 28-31.10.2010 10-12.12.2010 Tutar 21.248,50 TL 16.951,90 TL 2.996 TL 1.500 TL 299 TL 167,52 TL 43.162,92 TL b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) Timurkan M.O., Alkan F., Genetic characterization of Rotavirus strains from diarrheic calves housed in the five different regions of Turkey, 4th European Virology Congress, 7-11 April 2010, Cernobbio, Como, Italy (Poster Sunum) Alkan F., Timurkan M.O., Martella V. Bir İşletmede Sığır Rotavirus Enfeksiyonunun Dinamiği (2005-2008) 5-7 Ekim 2010, IX.Ulusal (Uluslararası Katılımlı) Veteriner Mikrobiyoloji Kongresi Girne/Kıbrıs (Sözlü Sunum)
