İmmünohematolojik testler

Temel Đmmünohematoloji
ve
Đmmünohematolojik Testler
Prof.Dr. Bülent Eser
Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi,
Hematoloji Bilim Dalı
Đmmünoloji ve Đmmünohematoloji
Đmmünoloji bağışıklık sisteminin yapısını ve
fonksiyonlarını inceleyen bilim dalıdır.
Đmmünohematoloji ise başta eritrositler olmak
üzere kan hücreleri ile bağlantılı bağışıklık
olaylarını, özellikle antijen-antikor
reaksiyonlarını inceler.
TABLE 1-1 NOBEL PRIZES FOR IMMUNOLOGIC RESEARCH
Year Recipient
1901 Emil von Behring
1905 Robert Koch
1908 Elie Metchnikoff
Paul Ehrlich
1913 Charles Richet
1919 Jules Bordet
1930 Karl Landsteiner
1951 Max Theiler
1957 Daniel Bovet
1960 F. Macfarlane Burnet
Peter Medawar
1972 Rodney R. Porter
Gerald M. Edelman
1977 Rosalyn R. Yalow
1980 George Snell
Jean Dausset
Baruj Benacerraf
1984 Cesar Milstein
Georges F. Köhler
Niels K. Jerne
1987 Susumu Tonegawa
1991 E. Donnall Thomas
Joseph Murray
1996 Peter C. Doherty
Rolf M. Zinkernagel
Country
Germany
Germany
Russia
Germany
France
Belgium
United States
South Africa
Switzerland
Australia
Great Britain
Great Britain
United States
United States
United States
France
United States
Great Britain
Germany
Denmark
Japan
United States
United States
Australia
Switzerland
Research
Serum antitoxins
Cellular immunity to tuberculosis
Role of phagocytosis (Metchnikoff) and
antitoxins (Ehrlich) in immunity
Anaphylaxis
Complement-mediated bacteriolysis
Discovery of human blood groups
Development of yellow fever vaccine
Antihistamines
Discovery of acquired immunological
tolerance
Chemical structure of antibodies
Development of radioimmunoassay
Major histocompatibility complex
Monoclonal antibody
Immune regulatory theories
Gene rearrangement in antibody production
Transplantation immunology
The specificity of the cell-mediated
immune response
Đmmün Sistem (Bağışıklık Sistemi)
● Bağışıklık sistemlerini uyaran ve canlı için
kendinden olmayan tüm moleküllere "antijen"
veya "immunojen" denir.
● Vücut tabakalanmış bir savunma sistemine
sahiptir. Öncelikle fiziksel olarak yabancı
antijenlerin içeri girmesini engeller.
● Antijen vücuda girerse diğer katmanlar
antijenlerin eliminasyonunu sağlar.
Đmmün Sistem Organ ve Dokuları
Primer lenfoid dokular
- Kemik iliği
- Timus
Sekonder lenfoid doku ve organlar
- Karaciğer
- Lenf nodları
- Dalak
- Gastrointestinal sistemde ve akciğerde yerleşen
diğer lenfoid dokular.
Bağışıklık Sistemi
İnsanda bağışıklık, iki farklı sistem halinde incelenir:
Doğal bağışıklık: Doğuştan var olan bir sistemdir.
Edinilmiş bağışıklık: Sonradan geliştirilen bir
bağışıklık sistemidir. Özellikle gelişmiş canlılarda
bulunur. Hedef antijene özel yanıt oluşturulur.
Doğal Bağışıklık Sistemi
Edinilmiş Bağışıklık sistemi
Her antijene karşı yanıt
standarttır
Antijene özel yanıt
oluşturulur. Antijene göre
yanıt oranları değişebilir.
Yanıt çok hızlı gelişir, dakikalar Yanıt yavaş gelişir. Oluşması
içinde yanıt gözlenebilir.
günler alabilir.
Bir hafıza yoktur. Antijenle
tekrar karşılaşmada yanıt
artmaz.
Hafıza geliştirilir. Antijenle
tekrar karşılaşmada artan
oranda ve hızlı yanıt oluşur.
Hemen hemen bütün canlı
türlerinde bulunur.
Sadece omurgalılarda bulunan
bir sistemdir.
DOĞAL (INNATE) ĐMMÜNĐTE
1) Vücuda antijenin girmesini engelleyen fiziksel bariyer:
- Sağlam deri ve müköz membranlar
- Vücut sekresyonları
- pH (ör: mide)
- Enzimler.
2) Organizma içine giren yabancı maddelerden
korunmayı sağlayan mekanizmalar:
- İnflamasyon,
- Fagositozla hücresel savunma
- Kompleman kaskadı ile humoral savunma.
HÜCRESEL ELEMANLAR
Lökositler (beyaz kan hücreleri)
- Monositler ve makrofajlar
- Nötrofiller
Fagositler
- Eozinofiller
- Dendritik hücreler
- Bazofiller
- Doğal öldürücü hücreler (NK)
- Mast hücreleri
Kompleman Sistemi
● Yirmiden fazla farklı protein içerir ve patojenlerin
antikorlarla öldürülmesini tamamlayıcı (komplemanter)
yeteneğinden dolayı bu şekilde isimlendirilmiştir.
● Komplemanlar antikorla etkileşime girdikten sonra
aktive olurlar. Biri aktive olduktan sonra diğerlerini de
aktifleştirmek suretiyle bir kaskad oluşur.
● Sonuçta damarsal geçirgenliği arttırır ve patojenlerin
yüzeylerini kaplayarak (opsonizasyon) onları yıkım için
işaretler. Komplemanın kalıntıları ayrıca hücre zarlarını
yırtmak suretiyle (lizis) hücreleri doğrudan da öldürebilir.
Kompleman Sistemi
● Diğer taraftan vücutta kompleman sisteminin lizis
fonksiyonunu engelleyen bir sistem de mevcuttur.
CD55 (DAF: Decay accelerating factor)
CD59 (MIRL: membrane inhibitor of reactive lysis)
Bunların eksikliğinde kompleman bağımlı lizis artar.
(PNH CD55 ve CD59 eksikliğiyle giden bir hastalıktır
ve hemolizle seyreder.)
Edinilmiş (Adaptive) Đmmünite
● Aynı etkenle yeniden karşılaşma durumunda vücut
daha özel ve daha etkili bir savunma sistemi geliştirir.
Bu sistem edinilmiş immün sistem olarak
isimlendirilir.
● Edinilmiş immünitede T hücre adaptasyonuyla
hücresel savunma ve B lenfositlerinin adaptasyonu
ve antikor yapımı ile humoral savunma sistemi
oluşturulur.
LENFOSĐTLER
● Edinilmiş bağışıklık sisteminin ana hücreleri
lenfositlerdir. B ve T hücreleri lenfositlerin kemik
iliğindeki hematopoetik kök hücrelerinden köken
alan iki temel tipidir. B hücreleri humoral bağışıklık
yanıtını oluştururken, T hücreleri hücresel bağışıklığı
oluştururlar.
● "MHC" olarak bilinen reseptör kombinasyonlarıyla
antijenler işlenip, antijen sunan hücreler tarafından
sunulduktan sonra T hücreleri, patojenler gibi
kendinden olmayan hedefleri tanırlar.
T LENFOSĐTLER
T lenfositleri kanda dolaşan lenfositlerin
çoğunluğunu (yaklaşık % 80'ini) oluştururlar. T
lenfositlerin iki ana alt tipi bulunur;
● Öldürücü (sitotoksik) T lenfositler (CD8 pozitif)
● Yardımcı (helper) T lenfositler (CD4 pozitif)
Normalde CD4/CD8 oranı 1.5/1’dir.
Öldürücü (Sitotoksik) T hücreleri
Öldürücü T hücresi, yüzeylerinde
yabancı ya da anormal moleküller
taşıyan diğer hücrelere doğrudan
saldırır.
● Öldürücü T hücreleri virüslerle
veya diğer patojenlerle enfekte olmuş
ya da işlev göremeyen veya
hasarlanmış hücreleri öldürürler
CD8
Yardımcı (Helper) T hücreleri
Yardımcı T hücreleri,
Savunma sistemindeki diğer
hücreleri yönlendirerek bağışıklık
yanıtını kontrol ederler.
Sitokin sinyalleri ile;
● Makrofajların mikrobisidal
fonksiyonunu arttırır.
● Öldürücü T hücrelerini uyarır.
● Antikor üreten B hücrelerinin
etkinleştirilmesini sağlar.
CD4
B lenfositler ve Antikorlar
● Bir B hücresi bir patojeni, yüzeyindeki antikorlara
özgü yabancı antijenler bağlandığında tanımlar.
● Etkin B hücresi aktifleşip bölünmeye başladığında,
ürünleri (plazma hücreleri), antijenleri tanıyan
antikorların milyonlarca kopyalarını salgılar.
● Bu antikorlar antijeni bağlar ve
onları kompleman sisteminin ya da
fagositlerin işlev görmesi için işaretler.
Antikorlar
Antikorlar Y şeklindedir ve ağır zincir ve hafif zincir
olmak üzere 2 çift protein zincirinden oluşurlar. Ağır ve
hafif zincirler üzerinde, değişken (V/variable) ve sabit
(C/constant) bölgeler bulunur.
Değişken bölge, antijeni
tanıyan kısmı oluşturmak
üzere özelleşmiştir ve bir
çift halinde bulunur.
Kan Bankacılığı ve Transfüzyonda
Đmmünohematolojinin Kullanımı
Zeta Potansiyel
● Normalde eritrositlerin yüzeyinde negatif bir
elektrostatik yük bulunur. Đki eritrositi birbirinden
uzaklaştıran bu negatif yüke “zeta potansiyeli”
denir.
● Bir immünglobulin molekülünün iki eritrosit
arasında köprü kurabilmesi için bu elektrostatik
gücü yenmesi gerekir.
Kan Bankacılığı ve Transfüzyonda
Đmmünohematoloji
● Kan bankacılığında immünolojik mekanizmalardan
antijen-antikor reaksiyonu en çok kullanılan
reaksiyondur.
● Vücutta dolaşan veya kan ürünlerinde bulunan
çeşitli antikorlar ayrıca transfüzyon reaksiyonlarının
gelişmesinde (hemoliz gibi) veya transfüzyon
etkinliğini değiştirmede (alloimmünizasyon gibi)
önemli rol oynarlar.
Doğal antikorlar
● Kişinin kendi eritrositlerinde bulunmayan eritrosit
antijenlerine karşı, herhangi bir immünizasyon
sonucu oluşmamış antikorlara doğal antikorlar adı
verilir.
● Bu antikorlar hemen daima eritrositlerin
karbonhidrat yapısındaki antijenlerine yöneliktir
(ABH, MN, P, Lewis, I ve i gibi).
● Genellikle IgM sınıfındandırlar ve bu nedenle de
plasentadan geçemezler.
Đmmün antikorlar
● Eritrositlerin protein yapısındaki antijenlerine
yöneliktir (Rh, Kell, Kidd, Duffy gibi). Kişinin kendi
eritrositlerinde bulunmayan eritrosit antijenleri ile
karşılaşması sonucu oluşurlar.
● Örneğin anne ile fetus arasındaki kan grubu
uyuşmazlıkları (örnek; Rh uyuşmazlığı) bu
immünizasyondan sorumludur. IgG sınıfı olmaları
nedeniyle plasentadan geçebilirler.
Komplet ve inkomplet antikorlar
● Đzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri
kümeleştirebilen antikorlara “komplet antikorlar”,
kümeleştiremeyenlere ise “inkomplet antikorlar” adı
verilir.
● IgM komplet antikor olup pentamer yapısındadır ve 5
bağlanma bölgesi mevcuttur. IgM zeta potansiyelinin
üstesinden gelerek eritrositleri aglütine eder. IgG’nin ise
iki antijen bağlanma yeri vardır. IgG inkomplet
antikordur ve aynı ortamda eritrositleri aglütine edemez.
Đnkomplet
antikorlar
Komplet
antikorlar
IgM
Alloantikorlar
● Eritrosit antijenlerine karşı immünizasyon sonucu
oluşan immün antikorlar, “alloantikor” ve
“otoantikor” olmak üzere ikiye ayrılırlar.
● Bir türde (örneğin; insan) aynı genetik lokus
tarafından denetlenen farklı (allelik) antijenlere
“alloantijen” denir. Bu antijenlere karşı gelişen
antikorlar alloantikorlardır.
● Feto-maternal kan grubu uyuşmazlıklarında ve kan
grubu uygun olmayan kan transfüzyonlarından sonra
alloimmünizasyon söz konusudur.
Otoantikorlar
● Otoantikorlar ise bireyin kendi antijenlerine karşı
geliştirdiği antikorlardır. Otoimmun hemolitik
anemiler buna bir örnektir.
● Kan bankacılığı açısından önemi ise bu antikorların
aynı türdeki hemen hemen tüm bireylerin eritrosit
antijenleri ile reaksiyon vermesidir. Bu durum kan
grubu saptamada ve karşılaştırma testlerinde sorun
oluşturur.
ANTİJEN-ANTİKOR
REAKSİYONLARININ KAN BANKASI
TESTLERİNDE KULLANIMI
Antijen-antikor reaksiyonlarının aşamaları
● Birinci aşamada, alınan kan örneklerinin
karıştırılmasından sonra antijen ve antikorlar
karşılaştıktan sonra birbirlerine yapışırlar. Bu olay
çok hızlı gerçekleşir ve gözle görülmez.
● İkinci aşamada, bu reaksiyonun görünebilir
olmasını sağlamak için bazı yöntemler kullanılır:
- İnkübasyon
- Santrifügasyon
Hemaglütinasyon
● Eritrosit antikoru ve antijeninin aynı ortamda
muamelesi sonrası oluşan eritrosit kümeleşmesine
aglütinasyon veya hemaglütinasyon denir.
● Kan gruplarının doğal antikorları daha önce
anlatıldığı gibi IgM yapısında komplet antikorlar
olduğundan zeta potansiyelin üstesinden gelerek
ilave bir işleme gerek olmaksızın aglütinasyona yol
açabilir.
● Bazen antikor-antijen reaksiyonu aşırıdır ve lizisle
sonlanır. Yani hemoliz oluşabilir.
Sensitizasyon
● IgM antikorların aksine IgG yapısındaki antikorlar
zeta potansiyelini yenebilecek kapasitede değildir.
Bu yüzden antijeni sadece sensitize eder,
aglütinasyona yol açmaz.
● Ancak ortama ilave edilen sığır serum albümini
veya papain ve bromelin gibi proteolitik enzimlerin
etkisiyle zeta potansiyeli azaltmak suretiyle
aglütinasyon sağlanabilir.
Antijen-Antikor Reaksiyonunu
Etkileyen Faktörler
Eritrositler arasındaki elektrik itme gücü (zeta
potansiyel)
Antikorlarda reaktif bölgeler arasındaki uzaklık
IgM antikor moleküllerinin uzunluğu 300 Å:
Hemaglütinasyon
IgG antikorlarının uzunluğu 120 Å: Sensitizasyon
Uygunluk derecesi: Antijen-antikor reaksiyonu
anahtar-kilit modeli gibi çalışır. Uygunluk derecesi
reaksiyonu belirginleştirir.
Antikor afinite ve aviditesi
● Monovalan bir antikorun tek antijenik
determinanta bağlanma kuvvetine afinite,
● Çok değerlikli antikorların, çok değerlikli
antijenlerle bağlanma kuvvetleri toplamına ise
avidite (fonksiyonel afinite) adı verilmektedir.
- Bağlanma bölgesi daha fazla olan IgM bağlanma
bölge sayısı daha az olan IgG antikorlarına göre daha
sıkı bir bağ oluşturur.
Antijen-Antikor Reaksiyonunu
Etkileyen Faktörler
Antijen ve antikorların konsantrasyonları: Antijen
ve antikor konsantrasyonunun birbirine uygun
olması reaksiyonun daha belirgin olmasını sağlar.
Đyonik kuvvetin etkisi: Normal serum fizyolojik
solüsyonu reaksiyonu arttırmaz. Reaksiyonları
arttırmak isteniyorsa düşük iyonik güçteki salin
solüsyonları (LISS) kullanılmalıdır. LISS test için
gerekli inkübasyon zamanını azaltır ve antikorların
antijene tutunma oranını arttırır.
Antijen-Antikor Reaksiyonunu
Etkileyen Faktörler
Zaman etkisi: En uygun inkübasyon zamanı üretici
firma önerisi ve daha önceki test örneklerinden
edinilen tecrübeye göre ayarlanmalıdır (15-30 dk.)
Sıcaklık etkisi: Soğuk aglütininler en iyi +20C ile
+100C arası sıcaklıklarda reaksiyon oluştururlar.
Diğer taraftan IgG yapısındaki antikorların çoğu ise
+370C’de hızla reaksiyon oluştururlar.
pH’nın etkisi: Antijen-antikor reaksiyonu oluşması
için optimal pH 6.5 ile 7.0 arasıdır.
Komplemanın rolü
Hemolizin testinde immün ABO antikorlarının
varlığını araştırmada, ayrıca direkt ve indirekt
antiglobulin testinde kompleman varlığı bu
testlerin doğruluğunu etkiler.
Komplemanın Laboratuar Testlerine
Katılımını Etkileyen Faktörler
Kimyasallar: Komplemanların reaksiyona katılması
için en uygun kan örneği pıhtılaşmış örnektir.
● EDTA ve sitrat kalsiyumu bağlayarak kalsiyum
düzeyini azaltır.
● Azalmış kalsiyum düzeyi kompleman
aktivasyonunu engeller.
● Eğer antikoagülan olarak heparin kullanılıyorsa
kompleman aktivitesini etkilemez.
Komplemanın Laboratuar Testlerine
Katılımını Etkileyen Faktörler
Kimyasallar: Test için bulundurulan eritrosit
örnekleri çeşitli solüsyonlarla muamele edilip
saklanarak daha uzun süre muhafazası sağlanır. Fakat
diğer taraftan bu kimyasal maddeler anti-kompleman
etki gösterirler. Bu nedenle eğer hemolizin testi için
bu eritrositler kullanılacaksa test öncesi salinle
yıkanmalı ve resüspanse edilmelidir.
Komplemanın Laboratuar Testlerine
Katılımını Etkileyen Faktörler
Zaman ve ısı: Kompleman reaksiyonları ısıyla
ilişkilidir. Yüksek ısılarda reaksiyon azalır. Serum
örnekleri +20C ile +100C arası sıcaklıklarda
saklanırsa kompleman aktivitesi 24 saat devam
ederken -180C veya daha düşük sıcaklıkta muhafaza
edilirse kompleman aktivitesi haftalarca sürebilir.
Kalitatif ve kantitatif aglütinasyon testleri
● Kalitatif testler antijen veya antikorun var olup
olmadığını belirler.
● Kantitatif testler ise farklı dilüsyonlar sonrası
(sulandırma oranları) hangi dilüsyon oranında
antikorun antijenle reaksiyon oluşturabildiğini
gösterir. Örneğin sırasıyla 1/16 ve 1/32 dilüsyonda
reaksiyon gözlenip 1/64 dilüsyonda reaksiyon
gözlenmemesi durumunda antikor titresi 32 olarak
değerlendirilir.
Etiketli antikorların kullanımı
Antijen-antikor reaksiyonunu göstermenin başka bir
yolu da önceden etiketlenmiş bilinen bir antikorun
reaksiyonu göstermede kullanılmasıdır. Bu şekilde
yapılan test yöntemleri;
● ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay),
● RIA (Radioimmunoassay) ve
● Đmmünofloresan yöntemleridir.
İmmünohematolojik testler
Günlük pratikte kullanılan başlıca immünohematolojik
testler:
● ABO ve Rh kan grubu tayini
-İleri (forward) ve ters (reverse) gruplama
● Antikor tarama ve tanımlama testleri
● Çapraz karşılaştırma
● Direkt ve indirekt Coombs testleri
TEŞEKKÜRLER