gıda biyoteknoloji-7

5.11.2015
• Mikrobiyal gelişme ve ürün oluşum kinetiği
ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ-4
1
• M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları çevreye
bağımlı olarak meydana gelir.
• Mikroorganizma gelişmesi genellikle hücre
• Bu nedenle gelişme ve ürün oluşumunu anlayabilmek
için mikrobiyal metabolizmanın düzenlenmesiyle
fiziksel ve kimyasal çevre arasındaki ilgiyi anlamak
gerekir.
kitlesi veya hücre sayısındaki artışın 2 katına
ulaşması için geçen zaman olarak tanımlanır.
Buna jenerasyon süresi (ikilenme süresi-
• Gelişme kinetiği: mikroorganizmaların üremesini ve
ürün oluşturmasını matematiksel bağlantılarla
tanımlar.
doubling time) denir.
Mikroorganizmaların büyüme eğrisi
• M.o’ların büyümesi belirli kurallara uyar. Bu
nedenle bazı koşullar altında inkübasyon
sonunda beklenen hücre sayısı ve biyokitle
miktarı hakkında önceden tahminde
bulunulabilir.
• Kesikli bir
sistemde
m.o’ların
gelişmesi
şekildeki gibi
olur.
• Bakteriler, mayalar ve küflerin birçoğunun
büyümesinde ayrı ayrı fazlar (üreme eğrisi)
vardır
5
1
5.11.2015
A) Lag faz
Bu fazda hiç hücre bölünmesi olmaz ve
bu faz ilk hücre bölünmesi
gerçekleşinceye kadar devam eder.
• Aşılanan hücre sayısında hiçbir
değişiklik olmaz. Besi ortamından su
ve substratlar alınıp RNA, ribozom ve
protein (özellikle enzim)
biyosentezinde kullanılır.
• Bu nedenle hücre çoğalması olmadığı
halde biyokütle artar.
• Bu fazın süresi, aşı kültürü miktarına,
aşı materyalinin yaşına, substratın
uygunluğuna bağlıdır.
C) Eksponansiyel
(logaritmik) faz
Büyüme hızı pratikte sabittir
ve maksimuma ulaşmıştır.
B) Uyum (adaptasyon) ve
hızlanma (asselerasyon)
fazı
Bu fazda hücre çoğalması başlar ama
yavaş tır. Artış eksponansiyel
değildir.
• DNA miktarı artar enzim sentezi
devam eder. Hücrlerdeki RNA
miktarında önemli artış olur.
• Genellikle A ve B fazları birlikte
değerlendirilir.
D) Geçiş fazı
Bu fazda hücre çoğalma hızı sürekli azalır.
Fakat global olarak düşünüldüğünde
hücre sayısı ve biyokitle artışı devam
eder.
RNA’ya kıyasla DNA sentezi
daha fazladır. M.o
gelişmesinin sınırlayan
hiçbir faktör yok
• Hücre çoğalması kolaylıkla
hesaplanabilir.
• Logaritmik fazdan üreme hızının düşük
olduğu geçiş fazına geçmenin başlıca
sebepleri:
 Toksik metabolik ürünlerin oluşması
 Substratın tükenmesi
 Viskozite artışı ile oksijen alımının
zorlaşması
Bu fazda değişik yaşlarda hücreler bulunur
E) durağan faz (stationary
phase)
F) Azalma ve ölüm fazı (lethal
faz)
Bu fazda yeni oluşan hücre sayısı ile ölen
hücre sayısı dengelenmiştir. Toplam
hücre sayısı sabit kalır.
Ölen hücrelerin sayısı yeni oluşan
• Metabolizma anabolizmadan
katabolizmaya dönmüştür.
m.o’ların ölüm hızları arttığı için
• Biyosentezler daha çok sekonder
metabolit üretimine yöneliktir.
hücrelerden fazladır.
zamanla konsantrasyonlarında
azalma olur.
Spesifik gelişme hızı (-) olur
• Sekonder metabolit üretimi
amaçlanıyorsa bu fazın mümkün olduğu
kadar uzun sürmesinde yarar vardır.
2
5.11.2015
Spesifik (özgül) gelişme hızı (μ):
•
•
•
Birim zamanda toplam hücre sayısına kıyasla hücre miktarındaki artıştır.
μ= 0.6 g m.o 1 saat sonunda 1.6 g olmuş demektir. (biyokitle miktarında % 60 artış
olmuştur) birimi=1/h ; h-1
M.o’lar logaritmik evrede üstel çoğalırlar. Buna göre logaritik evredeki m.o gelişme
hızı:
• Problem: Bir maya fermentasyonunda inokülasyonun 6. saatinde ve 8.
saatinde alınan örneklerde yapılan ölçümlerde biyokitle miktarları sırası ile
3.5 ve 5.4 g/L olarak ölçülmüştür. Bu mikroorganizmanın özgül gelişme
hızını hesaplayınız.
dN
dx
= μN
= μx
dt
dt
N=hücre sayısı
Hücre sayısının deneysel olarak belirlenmesi zor olduğundan hücre
büyümesi biyokitle artışı olarak hesaplanır.
lnx2/x1
μ=
∆t
(1)
μ= spesifik üreme hızı
X1= hücre kons (g/L)
t= süre (saat)
M.o’ların üreme eğrileri ile spesifik üreme hızlarının
bağlantısı
• Lag fazda μ=0
• Uyum fazında sürekli artar
• Logaritmik fazda sabittir ve
μ=μmax
• geçiş fazında azalmaya
başlar
• Durağan fazda sıfıra yakındır
İkilenme (jenerasyon) süresi (generation doubling time)
(td)
• M.o konsantrasyonunun iki katına çıktığı süredir
lnx2/x1
μ=
∆t
Denkleminde
yerine konulursa
ln2
(2)
td=
μ
• Problem: Belirli kültür koşullarında spesifik
gelişme hızı μ= 0.524 h-1 olan bir
mikroorganizmanın ikilenme süresini
hesaplayınız.
• M.o’lar için tipik gelişme hızı değerleri
μmax
Jenerasyon süresi
(h)
Bakteri
0.69-3.0
1-0.25
Maya
0.34-0.6
2-1.15
Küf
0.1-0.34
6.9-2
3
5.11.2015
Monod eşitliği
Bazı bakterilerin çeşitli substratlar üzerindeki ikilenme süreleri
Bakteri
substrat
jenerasyon süresi
(dakika)
Escherichia coli
Glikoz
17
Bacillus megaterium
Sakkaroz
25
Streptococcus lactis
Süt
26
Streptococcus lactis
Laktoz broth
48
Lactobacillus acidophilus
Süt
66-87
• Spesifik gelişme hızı ile substrat kons arasındaki ilişki
Kesikli kültürlerde gelişme hızı substrat konsantrasyonundaki değişime bağlıdır. Gelişme hızı
kimyasal reaksiyonların hızına benzer şekilde ortamdaki kimyasal maddelerin
konsantrasyonlarının bir fonksiyonudur
Gelişme hızı ile substrat kons arasındaki bu matematiksel ilişki Monod (1949) modeliyle ifade
edilir.
(3)
Ks = μ= ½ μmax olduğunda substrat
konsantrasyonuna eşit olan sabit değer (mg
/L) Doymuşluk sabiti
μ= spesifik gelişme hızı
μmax= maksimum spesifik gelişme hızı
• Monod kinetiği ile belirlenen iki önemli parametre
µm ve Ks değerleridir, ancak bunlar yukarıdaki
grafikten doğru saptanamazlar. Bu nedenle daha
doğru ve tekrarlanabilir µm ve Ks değerleri elde
etmek için Monod eşitliği modifiye edilerek
Lineweaver-Burk grafiği oluşturulmuştur.
• Ks (doymuşluk sabiti)
• Ks ne kadar küçükse substrat o kadar hızlı
kullanılıyor demektir
• Ks değeri büyükse substrat kullanımı da
yavaştır
• Monod eşitliğinde her iki tarafın da tersi alınırsa;
1/µ = Ks/µm.1/[S] + 1/µm
eşitliği elde edilir.
(4)
22
• Bu eşitliğe göre, 1/[S] değerlerine karşı 1/ µm
değerleri ile oluşturulan doğrusal grafiğin Y
eksenini kestiği nokta 1/ µm , X eksenini kestiği
nokta ise -1/Ks değerini, doğrunun eğimi (tg a )
ise Ks/ µm değerini verir.
14
12
1/μ
Verim katsayıları
• M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları biyodönüşüm
işlemleridir. Burada biyodönüşümü besleyen kimyasal besin
maddeleri hücre kitlesi ve metabolitlere dönüşür.
• Besin maddeleri ve enerji kaynakları ile oluşan hücre kitlesi ve
ürünler arasındaki bağlantıları açıklayabilmek için verim
etkinliğin bilinmesi gerekir.
10
8
Eğim=Ks/μm
• Bu biyodönüşümler tüketilen her birim besin maddesine
karşılık oluşan ürün veya hücre kitlesi olarak verim katsayıları
şeklinde kantitatif olarak hesaplanabilir.
6
4
-1/Ks
1/μm
2
0
-4
-2
-2
-4
0
2
1/S
4
6
23
4
5.11.2015
Verim katsayıları
• Hücre verim katsayısı: Tüketilen her birim
substrata karşılık oluşan birim biyokitle
Yx 
s
dx x  xo

ds so  s
(5)
• Ürün oluşum verim katsayısı: Tüketilen her
birim substrata karşılık oluşan ürün miktarı
Yp 
s
dP P  P0

ds s0  s
(6)
Teorik verim
• Yukarıda açıklanan verim değerleri gözlemlenen (gerçekleşen)
verim değerlerini ifade eder
• Substrat üzerinden hücre kitlesi veya ürünlerin teorik
verimlerini de hesaplamak mümkündür.
• Örneğin : etil alkol fermentasyonunda
•
C6H12O6
2C2H5OH + 2CO2
(180g)
•
• Pratikte substratın bir kısmı hücre kitlesi
oluşmu ve enerji bir kısmı da diğer yan
ürünlerin oluşumunda kullanıldığı için
belirtilen teorik verim elde edilemez. Ancak
çok yaklaşılabilir. Örn etil alkol üretiminde
teorik verimin % 90-95’ine ulaşılabilir.
(92 g)
100 g glikozdan 51.1 g etil alkol oluşur
Substrat dönüşüm oranı
• Gerçekleşen verimin teorik verime oranı ile % verim
hesaplanır
% verim
=
Gerçekleşen verim
*100
Teorik verim
Substratın % kaçının kullanıldığını gösterir.
(7)
(Başlangıç subs miktarı – kalan substrat)
Substrat dönüşümü % =
* 100
başlangıçtaki subs. miktarı
• Bu değer denemeleri planlamada ve sonuçları yorumlamada
standart bir ölçü olarak kullanılır
(S1- S2)
Substrat dönüşümü % =
* 100
(8)
S1
5
5.11.2015
Sürekli Kültürde Hücre Çoğalması ve Verim
Hesapları
• Problem: S. cerevisiae ile glikozdan etil alkol üretiminin
yapıldığı bir çalışmada 48 saatlik fermentasyon sonucunda
aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir
Glikoz
Biyokitle
Etil alkol
Başlangıç
200g
0.5
0.8
Toplam Fermenter Hacmi = VR
Sivi Hacmi = V
F
So
Xo = 0
Po = 0
48h
16 g
4.8
83
F
S
X
P
• Sürekli kültürlerde substrat çözeltisi sabit bir
debide (F) reaktöre verilir ve reaktördeki sıvı
hacminin değişmemesi için reaktör sıvısı aynı
debi ( F) ile dışarı alınır.
S,X,P
• Sürekli bir mikrobiyal kültürde gelişme uzun
süre korunabilir.
O O
O
Gaz Girisi
Buna göre;
a) ürün oluşum verimini
b) biyokitle verimin
c) % verimi
d) substrat dönüşüm oranını hesaplayınız
µ
• Ayrıca, hücre konsantrasyonu, özgül gelişme
hızı, substrat ve ürün konsantrayonu gibi
kültür koşullarının zamana bağlı olarak
değişmediği yatışkın bir durum elde edilmiş
Verilen besiyerindeki hücre konsantrasyonu (g/L)
-1
Mikroorganizmanın çoğalma hızı (h )
olur.
kd
Mikroorganizmanın ölüm hızı (h-1)
F
Taze besiyerinin fermentere akış hızı (L/h)
V
Fermenterdeki sıvı hacmi (L)
X
Fermenterdeki hücre konsantrasyonu (g/L)
X0
32
• Sürekli kültürde işleme kesikli kültürdeki gibi başlanır.
Gelişmeyi sınırlayan substratın konsantrasyonu gelişmeyi
sınırlayacak düzeye düşmesine izin verilir. Daha sonra rezevr
kabından düşük hızda besi ortamı kültü kabına pompalanır. Bu
aşamada m.o gelişmeyi sınırlayan substratın besleme hızı
tarafından kontrol edilebilen ölçülerde gelişir.
• Reaktör içerisindeki ortamın reaktörün dışına alınması
suretiyle kültür hacmi sabit düzeyde tutulur. Gelişme hızı
reaktöre giren ortamın hızına aynı zamanda da dışarıya çıkan
kültür ortamının hızına bağlıdır. Böylece biyoreaktör içindeki
biyokitle oranı sabit kalır.
Sürekli kültür sistemleri
• Çeşitli tiplerde sürekli kültür istemleri mevcuttur. En yaygını
kemostattır.
• Kemostat: sürekl sistemlerde substrat besleme hızı kültür
ortamının kimyasal bileşimine göre (örn. Glikoz) ayarlanıyorsa
buna kemostat denir.
• Türbidiostat: kültür ortamının optik yoğunluğunu ölçmek
suretiyle biyoreaktör içindeki hücre konsantrasyonu esas
alarak ayarlanıyorsa buna da tübidiostat denir.
33
34
(9)
(11)
Giren
substrat
(10)
Çıkan
substrat
Gelişme
için
kullanılan
substrat
Ürün için
kullanıla
n
substrat
Eşitlik
düzenlenirse
D: Seyrelme hızı (dilüsyon hızı
Ortam besleme hızının ortam
hacmine bölümü
35
Muhafaza
enerjisi
Substrat
birikimi
(12)
36
6
5.11.2015
(13)
(15)
(16)
(14)
(17)
37
38
Problem:
sürekli kültürde glukoz temelli bir
substrattan maya üretilmektedir. Bu koşullarda mayanın
µmax’ı 0.6 h-1 , Ks değeri ise 0.1 g/L dir. Beslemedeki
glukoz konsantrasyonu 20 g/L; kemostat ise 0.5
dilüsyon hızında çalıştırılmaktadır.
- Yatışkın koşullarda reaktörden çıkan sıvıdaki glukoz
konsantrasyonunu bulunuz
- Bu sistemde hücre verim katsayısı Yx/s : 0.45 ise
biyokitle konsantrasyonunu hesaplayınız.
39
40
7