B - Kanunum.com

B.17 MUTAJENİTE (GENLERLE İLGİLİ MUTASYONLAR MEYDANA
GETİRME ÖZELLİĞİ) - IN VITRO MEMELİ HÜCRESİ GEN
MUTASYONU TESTİ
1. YÖNTEM
Bu yöntem OECD TG 476 In Vitro Memeli Hücresi Gen Mutasyonu Testi (1997)’nin
tekrarıdır.
1.1 Giriş
In Vitro Memeli Hücresi Gen Mutasyonu Testi gen mutasyonlarını tayin etmek için
kullanılabilir. Uygun hücre dizileri L5178Y fare lenfoma hücrelerini, CHO, CHOAS52 ‘yi ve hamster hücrelerinin V79 dizilerini ve TK6 insan lenfoblastoid
hücrelerini kapsar (1). Bu hücre dizileri arasında en yaygın kullanılanı, timidin kinaz
(TK) ve hipoksantin-guanin fosforibozil transferaz (HPRT) ve ksantin-guanin
fosforibozil transferaz (XPRT)’ın transgeninde genetik ölçüm mutasyonlarıdır. TK,
HPRT ve XPRT mutasyon testleri genetik olayların farklı spektrumlarını belirlerler.
TK ve XPRT’nin otozomal konumları X kromozomlarının HPRT lokuslarında (Bir
genin kromozom üzerinde bulunduğu bölgeye verilen ad) tayin edilmeyen genetik
olayların (örneğin büyük silinmeler (Bir tip kromozom mutasyonu sonucunda DNA’
daki bir bazın ya da bazların yok olması hali)) tayinine olanak sağlayabilir
(2)(3)(4)(5)(6).
In Vitro Memeli Hücresi Gen Mutasyonu Testinde, genel olarak kullanılan hücre
dizilerinin kültürleri veya hücre ırkları kullanılabilir. Kullanılan hücreler kültürdeki
büyüme kabiliyetleri temeline ve kendiliğinden olan mutasyon frekansının
kararlılığına göre seçilir.
In vitro içinde yürütülmüş testlerde genelde dış kaynaklı metabolik aktivasyonun
kullanılması gerekir. Bu metabolik aktivasyon sistemi, memelilerdeki in vivo
koşulları tamamen taklit edemez. Esas mutasyona sebep olma özelliğini yansıtmayan
sonuçlara sebep olabilecek koşullardan kaçınılmasına dikkat edilmelidir. Esas
mutasyona sebep olma özelliğini yansıtmayan pozitif sonuçlar, pH, ozmolalite
değişiklikleri veya yüksek düzeyde sitotoksisiteden kaynaklanabilir (7).
Bu test, olası memeli mutajen ve kanserojenlerini taramak için kullanılır. Bu testte
pozitif çıkan pek çok bileşik, memeliler için kanserojendir, ancak bu test ve kansere
sebep olma özellik (kanserojenlik) arasında tam bir bağlantı yoktur. Bağlantı kimyasal
sınıfa bağlıdır ve bu testle belirlenemeyen kanserojenler olduğuna dair giderek artan
sayıda kanıt vardır, çünkü diğer sitotoksik olmayan mekanizmalar veya bakteri
hücrelerinde olmayan mekanizmalar gibi davranırlar(6).
Bakınız Genel Giriş Kısım B.
715
1.2 Tanımlar ve birimler
İleri mutasyon: Anne ya da babaya ait tip kodlanmış protein fonksiyonlarının
enzimatik aktivite kaybına veya değişikliklerine neden olan mutant biçimine sokan
gen mutasyonu.
Baz çifti yer değiştirme mutajenleri: DNA’daki bir veya daha fazla baz çiftinin yer
değiştirmesine neden olan maddeler
Yapı kayması (frameshift) mutajenleri: DNA molekülünde bir veya daha fazla baz
çiftinin katılmasına veya eksilmesine neden olan maddeler
Fenotipik ekspresyon zamanı: değişmemiş gen ürünlerinin yeni mutasyona uğramış
hücrelerde tükenme süresi
Mutant frekansı: gözlenen mutant hücrelerin sayısının canlı hücre sayısına bölümü
Bağıl toplam büyüme: hücrelerin kontrol popülasyonlarına kıyasla belli bir zamanın
üzerinde hücre sayısındaki artıştır; negatif kontrole göre bağıl süspansiyon büyüme
ürünüyle, negatif kontrole göre bağıl klonlama verimliliğinin çarpılmasıyla
hesaplanır.
Bağıl büyüme: Negatif kontrole göre bağıl ekspresyon süresinin üzerinde hücre
sayısındaki artış.
Canlılığı sürdürme yeteneği: Ekspresyon periyodu sonrasındaki seçici koşullarda
kaplama zamanında muamele edilmiş hücrelerin klonlama verimi.
Sağkalım: muamele edilen hücrelerin, muamele süresi sonunda kaplanmış kolonlama
verimliliği; genellikle kontrol hücre popülasyonun hayatta kalmasıyla ilişkili olarak
ifade edilir.
1.3 Test yönteminin ilkesi
TK+/- ->TK-/- mutasyonu nedeniyle timidin kinazları (TK) olmayan hücreler, primidin
analoğu olan triflorotimidinin (TFT) sitotoksik etkilerine dirençlidirler. Timidin
kinaza yetkin hücreler hücresel metabolizmanın inhibisyonuna neden olan ve bir
sonraki hücre bölünmesini durduran TFT’ye duyarlıdır. Bu mutant hücreler TFT
varlığında çoğalabilirken, timidin kinaz içeren normal hücreler çoğalamazlar. Benzer
şekilde, HPRT veya XPRT içermeyen hücreler 6-tiyoguanin (TG) veya 8-azaguanine
(AG) direnç göstermeleriyle seçilirler. Herhangi bir memeli hücresi gen mutasyon
testlerinde, bir baz ya da seçiçi ajanla ilişkili bir bileşik test edilirse, test maddesinin
özellikleri dikkatlice gözden geçirilmelidir. Örneğin, test maddesinin mutant veya
mutant olmayan hücrelerdeki şüpheli herhangi bir seçici toksisitesi araştırılmalıdır.
Bu, seçici ajanla yapısal olarak ilişkili kimyasallar test edilirken seçim
sisteminin/ajanının perfonmansı teyit edilmelidir (8).
Süspansiyondaki veya tek tabakalı kültürdeki hücreler bir süre metabolik
aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda test maddesine maruz kalırlar ve
sitotoksisitenin belirlenmesi ve mutant seçiminden önce fenotipik ifadenin ortaya
çıkması için alt kültürlenirler (subcultured) (9)(10)(11)(12)(13). Sitotoksisite
716
genellikle, muamele periyodundan sonra kültürlerin bağıl klonlama verimliliği
(hayatta kalma) veya bağıl toplam büyümeleriyle belirlenir. Muamele edilen kültürler,
mutasyonların en uyguna yakın fenotipik ifadelerinin ortaya çıkması için büyüme
ortamında yeterli bir sürede, seçilen her lokus (Bir genin kromozom üzerinde
bulunduğu bölgeye verilen ad) ve hücre tipi karakteristiğinde korunmalıdır. Mutant
frekansı, mutant hücreleri tespit etmek için seçici ajan bulunan ortamda ve klonlama
verimliliğini (canlılığı sürdürme yeteneği) tespit etmek için seçici ajanın olmadığı
ortamda bilinen sayıda hücre ekilerek belirlenir. Uygun bir inkübasyon süresinden
sonra koloniler sayılır. Mutant frekansı seçici ortamdaki mutant kolonilerin sayısıyla
seçici olmayan ortamdaki kolonilerin sayısından elde edilir.
1.4 Test yönteminin tanımı
1.4.1 Hazırlıklar
1.4.1.1 Hücreler
Bu testte L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 veya TK6 hücrelerinin altklonlarını
kapsayan çeşitli mevcut hücre tipleri kullanılabilir. Bu testte kullanılan hücre tipleri
kimyasal mutajenlere karşı kanıtlanmış bir hassasiyete, yüksek bir klonlama verimine
ve kararlı bir spontan mutant frekansına sahip olmalıdır. Hücreler mikoplazma
kontaminasyonu için kontrol edilmeli ve kontaminasyon varsa kullanılmamalıdır.
Test, duyarlılığının ve gücünün önceden belirlenebileceği şekilde tasarlanmalıdır.
Hücrelerin sayısı, kültürler ve kullanılan test maddesinin konsantrasyonu tanımlanan
bu parametreleri yansıtmalıdır(14). Bu testte her aşamada kullanılan ve en az sayıdaki
hücre kullanımı uygulamasıyla sağ kalan hücreler mutant frekansına dayanmalıdır.
Genel kural, spontan mutant frekansının tersinin en az on katı hücre sayısı
kullanmaktır. Ancak en az 106 hücre kullanılması tavsiye edilmektedir. Testin tutarlı
performansını göstermek için, kullanılan hücre sistemine ait yeterli tarihsel veriler
mevcut olmalıdır.
1.4.1.2 Ortam ve kültür koşulları
Kültürlerin elde edilmesinde uygun kültür ortamı ve inkübasyon koşulları (kültür
kapları, CO2 konsantrasyonu, sıcaklık ve nem) kullanılmalıdır. Ortam, testte
kullanılan seçici sistemlere ve hücre tipine bağlı olarak seçilmelidir. Hem mutant,
hemde mutant olmayan hücrelerin koloni oluşturma kabiliyetleri ve ekspresyon süresi
boyunca hücrenin en iyi şekilde yetişmesini sağlaması açısından seçilmesi gerekli
olan kültür koşulları özellikle önemlidir.
1.4.1.3 Kültürlerin hazırlanması
Hücreler stok kültürlerden oluşturulurlar, kültür ortamlarına ekilir ve 37°C derecede
inkübasyon yapılır. Bu testte kullanılmadan önce, kültürler önceden var olan mutant
hücrelerin temizlenmesi gerekir.
1.4.1.4 Metabolik aktivasyon
Hücreler test maddesine uygun metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem
de yokluğunda maruz kalmalıdırlar. En yaygın kullanılan sistem Aroclor 1254
717
(15)(16)(17)(18) veya fenobarbiton ve ß–naftoflavon birleşimi (19)(20) enzim
indükleyici ajanlarla muamele edilen kemirgenlerin karaciğerlerinden elde edilen
kofaktör-destekli post-mitokondriyal kısımdır.
Post-mitokondriyal kısım genellikle son test ortamında %1–10 v/v, konsantrasyon
aralığında kullanılır. Metabolik aktivasyon sisteminin koşulları ve seçimi test edilen
kimyasalın sınıfına bağlı olabilir. Bazı durumlarda, post-mitokondriyal kısma ait
birden fazla konsantrasyon kullanılması uygun olabilir.
(Spesifik aktivasyon gösteren enzimleri ifade eden genetik olarak tasarlanmış hücre
dizilerini içeren içsel, endojen aktivasyon için potansiyel sağlayabilir). Kullanılan
hücre dizilerinin seçimi (örneğin test maddesinin metabolizması için sitokrom P450
izoenzim ilişkisiyle) bilimsel olarak doğrulanmalıdır.
1.4.1.5 Test maddesi/Hazırlama
Hücrelerin muamele edilmelerinden önce uygunsa, katı test maddeleri uygun
çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözünmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmedir. Sıvı
test maddeleri muameleden önce test sistemlerine doğrudan eklenebilirler ve/veya
seyreltilebilirler. Saklamanın kabul edilebilirliğini gösteren kararlılık verileri
olmadıkça test maddesinin taze hazırlanmış çözeltileri uygulanmalıdır.
1.4.2 Test koşulları
1.4.2.1 Çözücü/taşıyıcı
Çözücü/taşıyıcı, test maddesiyle kimyasal reaksiyona girmemeli ve hücrelerin
sağkalımlarıyla ve S9 aktivitesiyle uyumlu olmalıdır. Çok iyi bilinen
çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, içerikleri uyumlu olduklarını gösteren
verilerle desteklenmelidir. Mümkün olan yerlerde, sulu çözelti/taşıyıcı kullanılmasının
ilk önce göz önünde bulundurulması tavsiye edilir. Suda kararsız olan maddeler test
edilirken, kullanılan organik çözücülerde su olmamalıdır. Su, moleküler süzgeç ilave
edilerek uzaklaştırılabilir.
1.4.2.2 Maruziyet konsantrasyonları
En yüksek konsantrasyonu belirlerken dikkate alınması gereken kriterler arasında sito
toksisite, test sistemindeki çözünürlük, pH veya ozmolalite değişiklikleri vardır.
Sitotoksisite bağıl klonlama verimliliği (hayatta kalma) veya bağıl toplam büyüme gibi
hücre bütünlüğü ve büyüme için uygun gösterimler kullanılarak asıl deneyde
metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda belirlenmelidir.
Sitotoksisitenin ve çözünürlüğün bir ön deneyde belirlenmesi daha uygun olabilir.
Analiz edilebilen en az dört konsantrasyon kullanılmalıdır. Sitotoksisite olan yerlerde,
bu konsantrasyonlar, en fazla toksisiteden, en az toksisiteye ya da hiçbir toksisite
yaratmayan bir aralığa dahil olmalıdırlar, bu da genellikle konsantrasyon seviyeleri 2
ve 10 arasındakinden daha fazla olmayan bir faktörle ayrılmaları gerektiği anlamına
gelir. En fazla konsantrasyon sitotoksisiteye sebep oluyorsa, o zaman yaklaşık %1020 arasında (fakat % 10’dan az değil) bağıl sağkalım (bağıl klonlama verimliliği) veya
bağıl toplam büyüme olmalıdır.
718
Nispeten sitotoksik olmayan olan maddeler için, maksimum test konsantrasyonu
herhangi biri en düşük olacak şekilde 5 µl/ml, 5 mg/ml veya 0.01 M’dır.
Nispeten çözünemeyen maddeler, çözünebilirlik sınırlarına kadar veya bu sınırın
altındaki kültür koşullarında test edilmelidir. Çözünmezliğin kanıtı hücrelerin maruz
kaldığı en son muamele ortamında belirlenmelidir. Hücrelerin, S9, serum vs. varlığına
bağlı olarak test sistemindeki maruziyet boyunca çözünürlük değişeceğinden
uygulamanın başındaki ve sonundaki çözünürlüğün tayin edilmesi uygun olabilir.
Çözünmezlik çıplak gözle belirlenir. Çökelek, skorlamayı engellememelidir.
1.4.2.3 Kontroller
Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller, metabolik
aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda her bir deneyde de yer almalıdır.
Metabolik aktivasyon kullanıldığında, pozitif kontrol kimyasalı, mutajenik cevap
vermek için aktivasyona ihtiyaç duymalıdır.
Pozitif kontrol maddeleri içeren örnekler :
Metabolik
aktivasyonun
koşulu
Lokus
Madde
CAS No.
EINECS No.
Dış kaynaklı Metabolik
Aktivasyonun
Yokluğu
HPRT
Etil metansülfonat
Etil nitroz üre
Metil metansülfonat
62-50-0
759-73-9
66-27-3
200-536-7
212-072-2
200-625-0
Etil metansülfonat
Etil nitroz üre
62-50-0
759-73-9
200-536-7
212-072-2
3-metilkolantren
N-nitrozo dimetil amin
7,12-dimetilbenzantrasen
Siklofosfamid
Siklofosfamid
monohidrat
Benzo[a]piren
3-metilkolantren
N-nitrozo dimetil amin(S
9’un yüksek düzeyleri
için)
Benzo[a]piren
56-49-5
62-75-9
57-97-6
50-18-0
6055-19-2
50-32-8
56-49-5
200-276-4
200-549-8
200-359-5
200-015-4
62-75-9
200-549-8
50-32-8
200-028-5
TK (küçük ve
büyük
koloniler)
XPRT
Dış kaynaklı Metabolik
Aktivasyonun Varlığı
HPRT
TK (küçük ve
büyük
koloniler)
XPRT
200-028-5
200-276-5
Diğer uygun pozitif kontrol kaynak maddeleri kullanılabilir. Örneğin bir laboratuvarın
5-Bromo 2’-deoksiüridine (CAS n. 59-14-3, EINECS n. 200-415-9), dayanan tarihsel
verileri mevcutsa bu referans maddesi kullanılabilir. Mevcut olduğu durumlarda,
kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasalların kullanımı üzerinde durulmalıdır.
Negatif kontroller muamele ortamındaki çözücü veya taşıyıcıyı yalnız başına
kapsamasını ve muamele gruplarıyla aynı şekilde muamele edilmesini içermelidir.
719
Ayrıca, geçmişe dayalı kontrol verileri sağlığa zararlı veya mutajenik etkilerin, seçilen
çözücüyle uyarıldığını göstermediği sürece muamele edilmemiş kontroller de
kullanılmalıdır.
1.4.3 İşlem
1.4.3.1 Test maddesiyle muamele
Çoğalan hücreler test maddesine metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem
de yokluğunda maruz bırakılmalıdır. Maruziyet, uygun bir zaman aralığında olmalıdır
(genellikle üç-altı saat arası etkilidir). Maruziyet zamanı bir veya daha fazla hücre
döngüsü şeklinde genişletilebilir.
Test edilen her bir konsantrasyon için, ya çift sayıda ya da tek sayıda muamele
edilmiş kültürler kullanılabilir. Konsantrasyon sayısı tekli kültürler kullanıldığında,
analiz için uygun sayıda kültürleri sağlayabilmek için artırılmalıdır. (örneğin en az 8
analiz edilebilir konsantrasyon). Çiftli negatif (çözücü) kontrol kültürleri
kullanılmalıdır.
Gaz veya uçucu maddeler, kapalı kültür kaplarının içinde olduğu gibi uygun
yöntemlerle test edilmelidirler (21)(22).
1.4.3.2 Sağkalım, yaşayabilirlik ve mutant frekansı ölçümleri
Maruziyet süresinin sonunda, hücreler yıkanır ve sağkalımların belirlenmesi ve
mutant fenotipinin ifade edilmesi için kültürlenirler. Kültürlerin bağıl klonlama
verimliliğiyle (hayatta kalım) veya kültürlerin bağıl toplam büyümesiyle belirlenen
sitotoksisitenin ölçümü genellikle muamele süresi sonrasında başlatılır.
Yeni mutantların (HPRT ve XPRT’nin en az 6-8 güne, TK’nın en az 2 güne ihtiyacı
vardır) en uyguna yakın fenotipik ifadelerinin ortaya çıkmasına izin verilmesi için her
bir lokusun belirli süreye ihtiyacı vardır. Hücreler sırasıyla mutant sayısının ve
klonlama verimliliğinin belirlenmesi için seçici ajanlarının bulunduğu ve bulunmadığı
bir ortamda yetiştirilirler. (Mutant frekansını hesaplamak için kullanılan)
yasayabilirlik ölçümü ekspresyon süresinin sonunda seçici olmayan ortamda başlatılır.
Test maddesi L5178Y TK+/- testinde pozitifse, test kültürlerinin en az birinde (en
yüksek pozitif konsantrasyon) ve negatif ve pozitif kontrollerde koloni boyutuna göre
ayırma yapılmalıdır. Test maddesi L5178Y TK+/- testinde negatifse, negatif ve pozitif
kontrollerde koloni boyutuna göre ayırma yapılmalıdır. TK6TK+/- kullanılan
çalışmalarda da ayrıca koloni boyutuna göre ayırma yapılablir.
2.VERİLER
2.1 Sonuçların uygulanması
Veriler, muamele edilmiş ve kontrol kültürleri için sitotoksisite ve yaşayabilirlik
belirlemelerini, koloni sayımlarını ve mutant frekanslarını içermelidir. L5178Y TK+/testinde pozitif cevap varsa, koloniler test maddesinin en az bir konsantrasyon değeri
için (en yüksek konsantrasyon) ve negatif ve pozitif kontrollerde oluşturulan küçük ve
büyük kolonilerin kriterlerine uygun şekilde sayılırlar. Hem küçük hem de büyük
koloni mutantların molekül ve hücresel genetik özellikleri detaylı olarak
720
araştırılmalıdır. (23)(24). TK+/- testinde koloniler normal büyüme(büyük) ve yavaş
büyüme (küçük) kolonilerinin kriterleri kullanılarak sayılırlar (25). En geniş genetik
hasara sahip mutant hücrelerin ikiye katlanma zamanları uzamıştır ve bu yüzden
küçük koloniler oluştururlar. Bu hasar tipik olarak genin tamamen kaybı ile hücre
kromozomlarının gösterdiği türe has durum olarak görünen kromozom bozuklukları
aralığında yer alır. Küçük koloni mutantlarının indüksiyonu büyük kromozom
aberasyonlarını indükleyen kimyasallarla ilişkilidir (26). Daha az etkilenen mutant
hücreler ana babaya ait hücrelere benzer hızlarda büyürler ve büyük koloniler
oluştururlar.
Sağkalım (bağıl klonlama verimlilikleri) veya bağıl toplam büyüme verilmelidir.
Mutant frekansı, sağkalan hücrelerin sayısı başına düşen mutant hücrelerin sayısı
olarak ifade edilmelidir.
Her bir kültür verisi ayrı ayrı sağlanmalıdır. Ek olarak, bütün veriler tablo halinde
özetlenmelidir.
Net bir pozitif cevabın doğrulanmasına gerek yoktur. Belirsiz sonuçlar ilave testlerle,
tercihen deneysel koşullar modifiye edilerek netleştirilmelidir. Negatif sonuçların
vaka vaka doğrulanması gerekir. Negatif sonuçların teyit edilmesine gerek olmayan
durumlarda, gerekçe sağlanmalıdır. Takip eden deneylerde çalışma parametrelerinin
değişikliği, değerlendirilen koşulların aralıklarının genişletilmesi, üzerinde
düşünülmelidir. Konsantrasyon aralıkları ve metabolik aktivasyon koşulları
modifikasyon yapılabilecek çalışma parametreleri arasındadır.
2.2 Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
Pozitif sonuç tayin etmek için konsantrasyona bağlı artış veya mutant frekansında
çoğaltılabilir artış gibi, bazı kriterler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan
değerlendirilmelidir. İstatiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı
olarak kullanılabilir. İstatiksel değer pozitif bir cevap için tek belirleyici etken
olmamalıdır.
Sonuçları yukarıdaki kriterleri karşılamayan bir test maddesinin bu sistemde
mutajenik olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok çalışma açıkça pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir
durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesi hakkında net bir karar verilmesine
engel olabilir. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve
belirsiz olabilir.
In vitro memeli hücresi gen mutasyon testinden elde edilen pozitif sonuçlar, test
maddesinin kullanılan kültürlenmiş memeli hücrelerinde gen mutasyonlarını
indüklediğine işaret eder. Tekrarlanabilir pozitif bir konsantrasyon-cevap en
anlamlısıdır. Negatif sonuçlar test koşulları altında test maddesinin, kullanılan
kültürlenmiş memeli hücrelerinde gen mutasyonlarını indüklemediğine işaret eder.
721
3. RAPORLAMA
3.1 Test raporu
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Çözücü/Taşıyıcı
— taşıyıcı/çözücü seçimi için gerekçe;
— biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
Hücreler:
— hücrelerin kaynağı ve türü;
— hücre kültürlerinin sayısı;
— uygulanabiliyorsa, hücre pasajları sayısı;
— uygulanabiliyorsa, hücre kültürü elde etme yöntemleri;
—mikoplazmanın yokluğu;
Test koşulları:
— konsantrasyonlar ve içerilen kültürlerin sayısının seçimi için gerekçe, örneğin
mevcutsa, sitotoksisite verileri ve çözünürlük sınırlamaları;
— ortamın bileşimi, CO2 konsantrasyonu ;
— test maddesinin konsantrasyonu;
— taşıyıcının ve eklenen test maddesinin hacmi;
— inkübasyon sıcaklığı;
— inkübasyon süresi;
— muamele süresi;
— muamele sırasındaki hücre yoğunluğu;
— kabul edilebilirlik kriteri de dahil, metabolik aktivasyon sisteminin türü ve
bileşimi;
— pozitif ve negatif kontroller;
— ekspresyon süresinin uzunluğu (ekilen ve altkültürlenen hücre sayısı ve besleme
programı, eğer uygunsa dâhil edilir);
— seçici ajanlar;
— çalışmaların pozitif, negatif veya belirsiz olup olmadığının anlaşılma kriterleri
—canlı ve mutant hücrelerin sayılarını belirtmek için kullanılan yöntemler.
— büyüklüğü ve türü üzerinde durulan kolonilerin tanımları (uygunsa, “küçük” ve
“büyük” koloni kriterleri de dâhildir).
Sonuçlar:
— toksisite belirtileri,
—çökelti belirtileri;
— belirlenebiliyorsa, test maddesinin maruziyet süresince ozmolalite ve pH verileri;
— en az negatif ve pozitif kontroller için sayıldıysa koloni büyüklüğü;
— küçük koloni mutantlarını L5178Y TK+/- sistemiyle tespit etmek için laboratuvarın
uygunluğu, uygun yerlerde;
—doz/cevap ilişkisi, mümkün yerlerde;
— istatistiksel analiz, varsa;
— eş zamanlı negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri
722
— tarihsel negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri, aralıklar, ortalamalar ve
standart sapmalarla birlikte
— mutant frekansı.
Sonuçların tartışılması.
Sonuçlar.
4. KAYNAKLAR
1. Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987).
Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York.
2. Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical
Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.
3. Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Timidin Kinaz Locus
in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467-485.
4. Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989).
Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT
Loci. Mutagenesis, 4, 394-403.
5. Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and
the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223,
121-128.
6.
Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski,
Jr.L.F., Theiss, J. And Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation
Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on
Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.
7.
Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J.
and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A
report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.
8.
Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983).
Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S.
Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225251.
Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and
Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl
Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A
Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox
Program. Mutation Res., 196, 17-36.
9.
10. Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S.,
O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide
723
for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine
Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135- 141.
11. Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation
Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells:
Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the
Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.
12. Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and
Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced
Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced
Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.
13. Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the
L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey,
B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science
Publishers, New York, pp. 239-268.
14. Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B.
and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon
Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland,
D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.
15. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and
Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79
Chinese
Hamster
Cells
by
Mouse-Liver
Microsome-Activated
Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.
16. Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting
Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome
Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
17. Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M.
(1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma
Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108.
18. Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella
Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
19. Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G.,
Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in
In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe
Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation
Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres,
F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp.
85-88.
724
21. Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation
Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L.,
Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum,
pp. 91-103.
22. Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an
Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly
Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental
Mutagenesis, 5, 795-801.
23. Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990).
Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Timidin Kinaz Locus in
Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51-55.
24. Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T.
and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorotimidin-Resistant (TFTr) Mutants of
L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161-174.
25. Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of
Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells.
Mutation Res., 229, 89-102.
26. Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration
Frequency and Small- Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/-3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609-614.
725