YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü Çevre Mikrobiyolojisi 1

YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
UYGULAMA 6 – MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA
1. GİRİŞ
Mikroorganizmaları tanımlama yollarından birisi, onları boyayarak incelemektir.
Boyama, kimyasal bir olaydır. Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından
normal ışık mikroskobu ile görünmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta
görünür hâle getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle
boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların boyanması” denir.
2-MİKROORGANİZMALARI BOYAMA YÖNTEMLERİ
Kullanılan kimyasal boyaların ana amacı boyanan biyolojik kısımların daha net bir
şekilde mikroskobik incelemelerinin gerçekleştirilebilmesidir. Mikroorganizmaların
boyanabilmesi için mikroorganizma içeren sıvının lam üzerine bir öze yardımıyla
yayılması (smear) ve fiksasyon işleminin yapılması gereklidir.
Mikroorganizmaları boyamanın başlıca avantajları şunlardır:
 Mikroorganizmalar ve zemin arasında kontrast oluşturarak onları daha kolay
incelemek
 Bakterinin hücre duvarı, vakuolleri gibi yapılarını daha kolay incelemek
 Değişik morfolojik tipler arasındaki farklılığı ortaya çıkarmak
Boyama işleminde çeşitli boyalar kullanılır. Bunlar doğal ve sentetik boyalar olarak
ikiye ayrılmaktadır.
a) Doğal boyalar: Doğal boyalar bitkisel ve hayvansal orijinli olabilirler. Bunlardan
bitkisel orijinli olanlara hematoksilen ve orcein, hayvansal orijinli olanlara ise
carmen örnek gösterilebilir. Doğal boyalar daha ziyade histolojide kullanılmaktadır.
b)
Sentetik boyalar: Bunların sayıları oldukça çoktur. Eosin, asit fuksin, asit
pikrik, oranj gelb, eritrosin, kongo kırmızısı, light green, metilen mavisi, toluidin
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
1
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
mavisi, bazik fuksin, jansiyan viyole, azocarmen, safranin gibi birçok boya sentetik
boyalara örnek gösterilebilir. Sentetik boyalar; Ehrlich tarafından bazik, asid ve
nötr boyalar diye üç gruba ayrılmıştır. Serbest asid ve bazlar suda çok az
eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılırlar. Nötr tuzlar hem
asit köke (anion) hem de bazik köke (kation) sahiptirler.
i.
Bazik boyalar: Bazik boyaların kromofor grubu pozitif yüke sahiptir.
Yani, yukardaki açıklamanın ışığında, bu nötr tuzu meydana getiren bazik kısım
(kation , +) renkli buna karşın asid kısım (anion, -) ise renksizdir. Bu tür boyalara
katyonik boyalar da denir. (Örneğin; metilen mavisi bazik bir boyadır ve terkibi
tetramethhyl-thionin-chlorhydrate’tır.
Bu
terkipte
tetramethyl-thionin
baz’ı
hidroklorik asit ile nötr bir tuz meydana getirecek şekilde birleşmiştir. Tetramethylthionin bazı renklidir ve metilen mavisi boyasına rengini verir, anion kökü olan
hidroklorik asit ise renksizdir.) Bismarck brown y, crystal violet, methyl green,
pararosanilin ( basic fuchsin), resorcin blue diğer bazik boyalara örnek verilebilir.
Bir doğal boya olan hematoksilen de bazik boya tarzında davranır. Bakterilerin
yüzeyi negatif olduğu için ayrıca DNA’da bulunan fosfatların da negatif yüklü
olması nedeniyle katyonik özelliğe sahip olan bazik boyalarla boyanırlar.
ii.
Asid boyalar: Asid boyaların boyayıcı kısımları negatif elektriksel yüke
sahiptir. Yani burada tuzun baz kısmı renksiz asid kısmı ise renklidir. Bu tür
boyalara anyonik boyalar da denir. Asitik boyalar zemini boyamak için
kullanılmaktadır. Örneğin; sodium eozinat da eozinat negatif yüklü olup kromofor
özelliktedir. Diğer asidik boyalara acid fuchsin, anilin blue, kongo red, fast green,
light green, erytrosin, orange G, acid pikrik, Phyloxine, alizarin red S, çini
mürekkebi, nigrosin, malaşit yeşili gibi boyalar örnek gösterilebilir.
iii.
Nötr boyalar: Nötr boyalar iyonik olmayan boyalardır. Bunlar suda
çözünen renkli organik bileşiklerdir. Burada nötr tuzu meydana getiren asid ve
bazın her ikiside renklidir. Hematoloji ve mikrobiyolojide sık kullanılan bu boyalara
Giemsa boyası en güzel örnektir.Bu boyalar parazitlerin incelenmesinde , rikettsiya
ve klamidyaların boyanmasında kullanılmaktadırlar.Wright ve Leisman boyalarıda
bu tip boyalara örnektir.
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
2
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
Boyama işlemi basit boyama veya komplex boyama yöntemleri kullanılarak yapılır. Bu
uygulama dersinde basit boyama teknikleri kullanılacaktır.
3 - BASİT BOYAMA YÖNTEMLERİ
Bu yöntemlerde genellikle tek bir boya eriyiği kullanılarak boyama yapılır.
Mikroorganizmaların morfolojisinin incelenmesi amaçlanır.
Basit boyalar genellikle birçok amaç ve biyolojik materyal için kullanılabilir. Tuzla
birlikte boya veren bir pozitif iyondan meydana gelirler. Birçok basit boya negatif yüklü
hücre zarlarının boyanmasını sağlar. Fazla boya yıkanarak atıldıktan sonra mikroskop
ile inceleme gerçekleştirilebilir.
Negatif Boyama: Bu yöntemde asidik boya kullanılarak zeminin boyanması
a)
amaçlanır. Bu preparatta mikroorganizma boya almaz. Mikroorganizmanın büyüklüğü
ve morfolojisi hakkında bilgi edinmek ve spiroketler gibi zor boyanan bakterilerin
gözlenmesi amacıyla kullanılır. Çini mürekkebi ya da Nigrosin eriyiği kullanılır. Bir
damla çini mürekkebi lamın bir kenarına konur. Bir damla bakteri süspansiyonu ile
homojenize edilir ve lama yayılır. Preparat iyice kurutulur. Tespit işlemi yapılmaz ve
immersiyonla mikroskopta incelenir.
b)
Löfflerin Metilen Mavisi kullanılarak yapılan basit boyamada Corynebacterium
diphtheriae da daha koyu boyanan metakromatik cisimcikler gözlenebilir.
Herhangi bir bazik boya kullanılarak yapılan basit boyamada bakterin morfolojisi ve
büyüklüğü hakkında bilgi edinmek yanında özellikle direkt materyalden hazırlanan
preparatın incelenmesiyle materyalin uygun alınıp alınmaması hakkında da fikir
edinilir. Bol epitel hücresi varlığı materyalin uygun olmadığını gösterir. Gram boyama
kadar etkili olmasa da mikroorganizmaların morfolojisi ve mikroskop sahasındaki
dizilimi göz önüne alınarak hangi besiyerine ekim yapılacağı hakkında bilgi edinilir.
4. TEMEL BAKTERİ ŞEKİLLERİ

Kok: Küresel şekilli hücrelerdir.
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
3
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı

Basil (Çubuksu): Çubuk şekilli bakterilerdir. Kırılgan görünümlü silindir
şeklinde hücrelerdir.

Virgül: Virgül şekilli bakterilerdir. Çubuksu bakterilere benzerler ama yarım
daire kadar kıvrılmışlardır.

Spiral: Spiral şekilli bakterilerdir. Çubuksu fakat kıvrımlı ve dönüşleri olan
bakterilerdir.
Bu bakterilerin haricinde farklı veya ara formlarda görülebilir (coccobacillus, Spirochete
Aynı zamanda kok bakterilerinin çoğul formları da farklı isimler alabilir. Örneğin ip gibi
yan yana dizilen kok şekilli bakterilere streptokok denirken, kümelenen üzümsü
koklara stafilokok adı verilir.
Şekil 1- Bakterilerin Hücre Morfolojisi
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
4
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
İki tane kok bakterisinin bir arada görülmesi diplokok olarak adlandırılır. Kok şekilli
bakterilere örnek olarak Neisseria ve Branhamella cinslerinin yanı sıra (diplokok),
Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterecoccus ve Lactobacilluslar
verilebilir. Şekilsel olarak farklı kok formlarının bulunması bölünme planı ile
ilişkilendirilmektedir. İki farklı planda bölünen hücreler dörtlü sayıda tetrad adını
alırken, 8’li sayıda sarcinae olarak adlandırılmaktadır.
Çubuksu bakteriler incelendiği zaman, ikili formları diplobacilli, ya da uc uca eklenen
tipleri streptobacilli ya da yan yana gelenleri palisade olarak adlandırılır. Diphteroids,
deri ve üst solunum yolları florasında sıklıkla görülen Corynebacterium ların morfolojik
şeklidir. Esasen basit streptobacilli şeklindedirler ancak bir araya gelerek kümeler
meydana getirirler ve palisade tipli formları meydana getirirler. Virgül ve spiral şekilli
bakteriler genellikle tek bulunan hücrelerdir. Morfolojik farklılıklar genellikle yapmış
oldukları kıvrımlardan ötürüdür. Klinik mikrobiyoloji de sık görülen türlerdendirler.
UYGULAMA
Materyal:

Lam

Lamel

Pastör pipeti

Öze

İğne

Fizyolojik Serum

Metilen mavisi
Metot:

Lamların hazırlanması: Lamı hazırlamadan önce temiz olduklarından emin olun.
Temizlemek için sabun ve su ile bolca yıkayıp toz kalmayacak şekilde silerek
kurutabilirsiniz. Etil alkol sıkıp daha sonra kuruması için beklenen lamlar
kullanım için uygundur.

Lamın üzerine cama yazar kalem ile üç tane daire çizin.
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
5
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı

Smear hazırlanması: Her bir daire içerisine bir damla bakteri örneği aktarın.
Aktardığınız damlanın küçük olmasına dikkat edin. Eğer yatık agardan örnek
alıyorsanız bir damla su veya serum fizyolojik içerisine örnek aktarılabilir.

Havada örnek kurutulur. Ateşten birkaç kez geçirilen lamın üzerindeki bakteriler
cama sabitlenir.

Örneklerinin boyanması: Boyama için bir tepsi veya kutu kullanılmalıdır. Her bir
boya 1 dk boyunca lamlara uygulanır. Daha sonrasında soğuk su ile yıkanan
örnekler havada kurutulur.

Sırasıyla 4x, 10x ve 40x büyütme oranlarında mikroskopta incelenir. Gerekli
görülen örnekleri immersiyon yağı ile 100x’te incelenir.

Sonuçlar rapora kaydedilir.
Uygulama 6 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Basit Boyama
6