Slayt 1 - Kök Hücre Sempozyumu
advertisement
Mezenkimal Kök Hücre İzolasyon Teknikleri ve İmmünolojik Parametreler Noushin Zibandeh, Ph.D Candidate 6. Kök Hücre sempozyumu 5-6 Mayıs 2017 Marmara Üniversitesi Spor Bilimleri Fakültesi Anadolu Hisarı Yerleşkesi İÇERİK Mezenkimal Kök Hücre (MKH) ve İmmünmodülasyon Adipoz, Dental Dokulardan ve Kemik İliğinden Kök Hücre İzolasyonu Farklı Dokulardan ve Kandan Lenfosit İzolasyon Tekniği MKH ve Lenfosit Ko-kültürü (Hücre Kültürü) Flowsitometri Analizleri MKH’lerin GFP İle İşaretleme Tekniği MEZENKİMAL KÖK HÜCRELER (MKH) İlk kez Friedenstein ve arkadaşları tarafından 1974 yılında izole edilmişlerdir. Fibroblastoid görünümlüdür. Kemik iliği, yağ dokusu, tendonlar, plasenta, kordon kanı, ve dişten temin edilebilmektedirler. Non-homojen bir topluluktur. MEZENKİMAL KÖK HÜCRELER (MKH) - + Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği Kriterleri (ISCT) MKH CD105, CD73 , CD90, CD146, CD29 CD45, CD34, CD14, CD19, CD11b Kondrojenik, Adipojenik ve Osteojenik Plastik yüzeylere yapışma özellikleri • Yüksek farklılaşma potansiyelleri ile birlikte immünsüpresif özellikleri DC MKH Hücre hücre kontağı Mediyatörler NK B T MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN İMMÜNMODÜLASYONDAKİ ETKİSİ MEZENKİMAL KÖK HÜCRELER ve ANTİJEN SUNAN HÜCRELERİN ETKİLEŞİMİ MKH kaynağının laboratuara getirilmesi ve izolasyon yapılması Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı ve hasta bireylerden doku ve kan alınması Adipojenik Doku ve kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi İstatistiksel Analiz Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi MKH İZOLASYONUNDA KULLANILAN BESİYERİ İÇERİĞİ Minimum Essential Medium (MEM-) Fetal Bovine Serum (FBS) Penisilin/Streptomisin Büyüme faktörleri (FGF, IGF,…) %10 %1 5ng/ml CMEM BESİYERİ İÇERİKLERİ – İnorganik Tuzlar – Aminoasitler – Vitaminler – Glukoz, D-Glukoz, HEPES, Piruvik asit, Phenol Red (indikatör), L-glutamin pH: 7.3-7.6 Farklı Oranlarda DENTAL KÖK HÜCRELER (DKH) ADİPOZ DOKUDAN KÖK HÜCRE İZOLASYONU Kollajenaz eklenir ve 14 saat 37C de inkübe edilir. %40’lık FBS /DMEM /P S ile sulandırılır ve ekilir. %10FBS içerir ve 800gde10d k santrifüj edilir. Pellet iki kere PBS ile yıkanılır ve 400gde 10dk santrifüj edilir. Pellet 160mM NH4cl de resüspanse edilir ve 10dk oda ısısında bekletilir. Pellet PBSde resüspanse edilir. 70µm ve 40µm ‘lik filtrelerden geçirilir. SIÇAN KEMİK İLİĞİNDEN KÖK HÜCRE İZOLASYONU 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MKH İZOLASYON TEKNİKLERİ A C B D A) P0- 3.gün: 20X B) P1- 3.gün: 20X C) P2- 3.gün: 10X D) P3- 3.gün: 10X Mezenkimal kök hücrelerinin P0, P1, P2 ve P3 deki morfolojik görünümü. PASAJLAMA %10 FBS İLE İNAKTİVASYON HÜCRE DONDURMA HÜCRE DONDURMA HÜCRE ÇÖZDÜRME HÜCRE ÇÖZDÜRME VERİMLİ MKH İZOLASYONU İÇİN İnokülasyon; 5x103 hücre/cm2 Doku kaynağına uygun tipte yıkım enzimi/süre Kök hücre gelişimine uygun besiyeri seçimi Uygun büyüme faktörleri Kontaminasyondan koruma MKH kaynağının laboratuara getirilmesi ve izolasyon yapılması Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı ve hasta bireylerden doku ve kan alınması Adipojenik Doku ve kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi İstatistiksel Analiz Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi Farklılaşma (Differentiation) • Osteojenik Stimülasyon • Kondrojenik Stimülasyon • Adipojenik Stimülasyon Progenitör hücrelere dönüşme potansiyelleri değerlendirilir KÖK HÜCRELERİN FARKLILAŞMASI MKH’lerin %10 Formaldehid fiksasyon ve boyama işlemi sonrasında ışık mikroskobu görüntüleri KÖK HÜCRELERİN KARAKTERİZASYONU MKH kaynağının laboratuvara getirilmesi Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı ve hasta bireylerden doku ve kan alınması Adipojenik Doku ve kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi İstatistiksel Analiz Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi Dokudan PBMC İzolasyonu PERİFERİK KANDAN PBMC İZOLASYONU 1- Sağlıklı bireylerin veya hastalardan venöz kan alımı 2- Venöz kanın PBS ile dilüe edilmesi (1/1 v/v) 3-Dilüe edilmiş kanın fikol üzerine yayma işlemi PERİFERİK KANDAN PBMC İZOLASYONU 4- 2000 rpm /20 dk santrifüj edilir. 5- Buffy coat toplanır. PERİFERİK KANDAN PBMC İZOLASYONU 5- 2 kez PBS ile yıkama işlemi 6- Hücre pelletin CRPMI ile çözülmesi ve hücre sayımı. Bireylerden venöz kan alınması Lenfosit Venöz kandan PBMC izolasyonu yapılması CFSE İşaretlendi CFSE İşaretlenmedi Ko Kültürlerinin yapılması Uyarım /3 gün CD Mix* / IFN-γ MKH Proliferasyon analizi Fas/FasL analizi CD4+FoxP3+ T regülatör hücre analizi * CD Mix: anti CD2- anti CD3- anti CD28 ** CFSE: Karboksifloresan süksinimidil ester Sitokin analizi proliferasyon CFSE** MKH kaynağının laboratuvara getirilmesi Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı bireylerden venöz kan alınması Adipojenik Venöz kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi İstatistiksel Analiz Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi MKH ve LENFOSİTLERİN Ko-KÜLTÜRÜ 2 gün önce 48 kuyucuklu plaklara ekilir. MKH hücreleri üzerine izole edilen lenfosit hücreleri her kuyuda 5x105 olacak şekilde 500 μl hücre kültür solüsyonu ile birlikte eklenir. Lenfosit MKH MKH kaynağının laboratuvara getirilmesi Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı bireylerden venöz kan alınması Adipojenik Venöz kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi İstatistiksel Analiz Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi Flow Sitometri Hücre yüzeyinde bulunan çeşitli markerlar Hücre içi çeşitli faktorlerin gösteriminde Hücreler tarafından sekrete edilen sitokinler DNA araştırmalarında SUNULMASI ve VERİ YORUMLAMA Tek parametreler histogram olarak görüntülenebilir 5.49% IC 97.43% CD146 FITC Çift parametre verileri nokta kullanılarak iki boyutlu olarak görüntülenebilir. Süt Dişi Kaynaklı Mezenkimal Hücreler Astım Tanısı Almış Hastaların Lenfosit Proliferasyonunu Baskılar. SONUÇLAR SHED (+) SHED (-) Lenfosit CFSE Astım 64±7 SHED (-) 52±9.5 SHED (+) Kontrol 54.±1 46±13. P < 0.01 CFSE FITC SONUÇLAR Süt Dişi Kaynaklı Mezenkimal Hücreler Astım Tanısı Almış Hastaların Lenfosit Apoptozunu Baskılar SHED (-) Astım Hastası SHED (+) 44.90 84.22 24 ±16 7.7±9 Kontrol 80.88 9.2±2 6±3 Fas CD95 SONUÇLAR Süt Dişi Kaynaklı Mezenkimal Hücreler Astım Tanısı Almış Hastaların Lenfosit Apoptozunu Baskılar SHED (+) SHED (-) Astım Hastası 23.56 37.43 67±18 63±13 30.6 3 19.70 Kontrol 72±4 66±5 FasL CD178 SONUÇLAR Süt Dişi Kaynaklı Mezenkimal Hücreler Astım Tanısı Almış Hastaların ve Kontrollerin CD4+ FoxP3+ Hücre Sayısını Arttırır SHED (+) SHED (-) 3±1 5±1 Foxp 3 Astım Hastası 10±2 3 Kontrol CD4 MKH kaynağının laboratuvara getirilmesi Akım sitometrik analizlerin yapılması CD90, CD146, CD73, CD105, CD29 CD34, CD28, CD14, CD25,CD45 Farklılaştırılmasının yapılması Osteojenik Kondrojenik Sağlıklı bireylerden venöz kan alınması Adipojenik Venöz kandan PBMC izolasyonu yapılması Ko Kültürlerinin yapılması Lenfosit hücrelerinin proliferasyon analizi Lenfosit hücrelerinin Fas/FasL analizi Lenfosit hücrelerinin CD4+FoxP3+ analizi Lenfosit hücrelerinin sitokin analizi İstatistiksel Analiz Sitokin Analizi MKH’ LERİN Green Fluorescent Protein(GFP) İşaretlenmesi MKH’ LERİN Green Fluorescent Protein(GFP) İşaretlenmesi 1. Hücreler GFP işaretlemeden iki gün önce 25’lik flasklara ekilir.(%70-%90 konfluent). *5 × 104 –2 × 105 hücre her 10 µL Neon® Tip. 5 × 105 –2 × 106 hücre her 100 µL Neon® Tip için. 2. Flask içinde bulan besiyeri aspire edilir ve yapışan hücreler 2 kez PBS(Ca2+ and Mg2+içermeyen) ile yıkanılır. Hücreler Trypsin/EDTA veya TrypLE Express ile tripsine edilir. Hücre suspansiyonu 2 kere PBS(Ca2+ and Mg2+içermeyen) ile yıkanır. PBS aspire edilir ve hücreler R bufferda resuspanse edilir. 1*106 hücre için 1µl GFP konulur. 3. 4. 5. 6. A C B Dental Pulpa MKH D GFP-Dental Pulpa MKH DENEY • Anestezi indüksiyonu – Ketamin ve klorpromazin • Çekal ligasyon perforasyon – 20G • 0.3 cc PBS içinde 1x106 DF-MKH • Kuyruk veni DENEY GRUPLARI DF-MKH DF-MKH CLP Sakrifikasyon Saat 0 4 24 Deney Hayvanı: Sprague Dawley erkek sıçan n=38 Grup I. Sağlıklı n=4 Grup II. Sağlıklı+ DF-MKH n=4 Grup III. CLP* n=10 Grup IV. CLP uygulaması+ 0. saatte DF-MKH** n=10 Grup V. CLP uygulaması+ 4. saatte DF-MKH n=10 *CLP: Çekal Ligasyon ve Perforasyon 0. saat ** DF-MKH: Dental Folikül Mezenkimal Kök Hücresi ANALİZLER: IL-10 ve TNF-α CD4+CD25+Foxp3+ T Hücre ileal doku histopatolojisi IN VIVO ÇALIŞMALARDA GFP İŞARETLİ MKH’ LERİN KULLANIMI Görüntüleme KONTROL CLP +4.SAAT Tunç AKKOÇ Deniz GENÇ Muazzez GÖKALP Yazgül DURAN Kamil Göker
