DNA Mikroarray

DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi:
Hematolojide Kullan›m Alanlar›
Tayfun ÖZÇEL‹K
Bilkent Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
DNA mikrodizilimleri DNA molekülünün incelenmesi için gelifltirilen en yeni tekniklerden biri
olarak son y›llarda t›p ve hematoloji araflt›rmalar›nda önemli bir yer edinmifltir. Gen ifade profillerinin incelendi¤i "cDNA mikrodizilimi"nin en önemli özelli¤i tek bir deney ile binlerce farkl› genin ifade profillerinin bir arada incelenmesini mümkün
k›lmas›d›r. Bu tekni¤in özünde bir cam lam veya
naylon zar üzerine k›sa ve RNA sentezinde kullan›lan yüzlerce/binlerce DNA hedef dizilimlerinin
(3’ expressed sequence tags) yerlefltirilmesi ve incelenecek cDNA’n›n floresan/radyoaktif iflaretlemenin ard›ndan yerlefltirilmifl DNA ile bir araya getirilerek iflleme al›nmas› bulunmaktad›r. Konuflmamda cDNA mikrodizilimlerinin teknik özellikleri üzerinde durmay›, dizilim üretimi, hedef DNA iflaretlemesi, görüntü analizi, veri eldesi ve biyoinformatik
yöntemleri ile sonuçlar›n de¤erlendirilmesi ve hematolojide kullan›m alanlar› konular›nda bilgi vermeyi istiyorum.
DNA mikrodizilimi teknolojisinin geliflmesi ‹nsan Genom Projesi ile yak›n bir paralellik göstermifltir. Asl›nda, genom projeleri genifl çapl› genom
araflt›rmalar›n›n baflar› ile yürütülebilmesinde ve
genlerin ifllevlerinin, çeflitli düzenleme mekanizmalar›n›n tan›mlanmas›nda h›zland›r›c› olmufl, bunun da ötesinde yeni bir çal›flma alan› olan "ifllevsel genomik" disiplininin do¤mas›na öncülük etmifltir (1). Farkl› gen ifadelerinin kapsaml› incelemesi ifllevsel genomik için bir dönüm noktas› olmufltur. Buna ba¤l› olarak, farkl› gen ifadelerinin
araflt›r›lmas› için çeflitli teknikler gelifltirilmifltir (2,
3, 4, 5, 6, 7, 8). Bir zar veya cam yüzeye cDNA’la-
r›n bir düzen içinde yerlefltirilerek incelendi¤i ilk
baflar›l› çal›flma bir bitki türü olan Arabidopsis’in
45 farkl› geninin ifadesinin toplu olarak incelendi¤ini çal›flma olmufltur (7). Daha sonra, binlerce geni içeren yüksek yo¤unluklu mikrodizilimlerin gelifltirilmesi h›zl› bir flekilde gerçekleflmifltir. Günümüzde, dünyada birçok laboratuvar cDNA mikrodizilim sistemini kurmufl ve bu tekni¤in binlerce
genin mRNA profillerini incelemekte çok faydal› oldu¤unu göstermifltir. ‹nternet kullan›m› ile bu bilgilere ulafl›labilir (Tablo 1).
Tablo 1. ‹nternet’te mikrodizilim kaynaklar›
Web sitesi
www.gene-chips.com
‹çeri¤i
Mikrodizilim teknolojisinin
temel kurallar›n›, kullan›m
alanlar›n› ve
teknik özelliklerini anlatan
çok kapsaml› bir kaynak.
http://linkage.rockefeller.edu/wli/microarray Mikrodizilim veri analizi
ile ilgili makale ve
internet sitelerine
ba¤lant› veren
bir kaynak.
http://cmgm.stanford.edu/pbrown
cDNA mikrodizilim
teknolojisini bulan
Pat Brown’un
laboratuvar›n›n ve
Stanford Üniversitesi
mikrodizilin grubunun
sayfas›.
35
ÖZÇEL‹K T.
DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›
cDNA mikrodizilimlerinin yayg›n kullan›m›nda
akademi-endüstri iflbirli¤i önemli bir yer tutmaktad›r. Her yeni teknolojide oldu¤u gibi ilgili donan›m
sistemlerinin, analitik yaz›l›m programlar›n›n, biyolojik kaynaklar›n, istatistiksel ve biyokimyasal
metodlar›n gelifltirilmesine ve standartlaflt›r›lmas›na gerek duyulmufltur. Pek çok araflt›rma laboratuvar›nda ciddi zorluklarla karfl›lafl›lm›fl olsa da,
gerekli malzemelerin güvenli bir flekilde kullan›lmas› ile çeflitli dokular aras›ndaki gen ifade profillerindeki de¤ifliklikler saptanm›flt›r. Model sistemlerde bilinen de¤iflikliklerin gözlenmesi ve yeni bulunan de¤iflikliklerin do¤rulanmas› ile bu sistemin
performans› de¤erlendirilmektedir. Bu çaban›n
esas amac›, bütün insan genlerinin mRNA ifadelerinin ayn› anda incelenmesi ve ç›kan sonuçlar›n
biyokimyasal ve hücresel biyoloji ile k›yaslanmas›n› sa¤lamakt›r.
Birkaç farkl› mikrodizilim sistemi bulunmakla
beraber hepsinin ortak bir temeli vard›r. Mikrodizilimler üç ana gruba ayr›l›r: Zar üzerine sentezlenen cDNA mikrodizilimleri (9), cam üzerine sentezlenen cDNA mikrodizilimleri (10,11), ve oligonükleotid mikrodizilimleri/DNA çipleri (12). cDNA mikrodizilimi deneyleri birkaç bölüme ayr›l›r (fiekil 1).
‹lk olarak özgün ve farkl› DNA hibridizasyon hedeflerini içeren (ki bu hedeflerin her biri tek bir geni
RNA
eldesi
Hücreler, dokular,
mikroorganizmalar
RNA
eldesi
temsil eder), yüksek yo¤unluktaki noktalama ifllemi bir mikrodizilim halinde cam bir destek üzerine
yap›l›r. Binlerce DNA noktas›n› içeren birçok dizilim sentezlenerek sonraki deneylerde kullan›labilir. Ard›ndan, her deney için floresan iflaretli cDNA
iflaretleyicileri haz›rlan›r. Bu aflama iki ayr› hücre
toplumunun mRNA eldesi ile bafllar. Daha sonra,
her bir mRNA’n›n farkl› floresan boyalar kullan›larak ayr› ayr› ters yaz›l›m› gerçeklefltirilir. ‹ki farkl›
iflaretleyici birlefltirilerek ayn› anda cDNA hedefleri ile bir araya getirilir. Daha sonra, bir lazer taray›c›s› kullan›larak ortaya ç›kan floresan ›fl›malar
tespit edilir. E¤er iki örnekten birinde herhangi bir
genin mRNA düzeyi yüksekse, daha fazla cDNA söz
konusu gen ile etkileflime girer ve o örne¤in iflaretlenmesinde kullan›lan floresan boya üstün geldi¤i
için daha fazla ›fl›ma sinyali al›n›r. Belirli bir noktada iki iflaretli örne¤in floresan yo¤unluklar›n›n
oran› taray›c› ile belirlenir (fiekil 2). Ortaya ç›kan
sonuç bir veri taban›na aktar›larak incelenir. Bu
aflamada biyoinformatik yaklafl›mlar büyük önem
tafl›maktad›r. Elde edilen verilerin incelemesi ve
birçok farkl› deneyin karfl›laflt›r›lmas› için biyoinformatik yaz›l›mlar›n kullan›m› mutlaka gereklidir.
Mikrodizilim teknolojisi, moleküler biyolojinin
hala yeni ama son derece güçlü bir araflt›rma ala-
Klonlanm›fl ve
dizi analizi
yap›lm›fl
cDNA kitapl›¤›
Nümleik
asitlerin
iflaretlenmesi
“Klon”lar›n
sentezlenmesi ve
düzenli bir dizilim
olarak haz›rlanmas›
Dizilimle
hibridizasyon
Digital görüntüleme ile
hibridizasyon sinyal
yo¤unluklar›n›n
incelenmesi
fiekil 1. Mikrodizilim teknolojisi ile gen ifade profilinin incelenmesi aflamalar›n›n flematik gösterimi.
36
XXX. Ulusal Hematoloji Kongresi
Mezuniyet Sonras› E¤itim Kursu
DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›
ÖZÇEL‹K T.
fiekil 2. GenePix 4000 taray›c›s›ndan (Axon) elde edilen cDNA mikrodizilim görüntüsü. K›rm›z› noktalar ilgili gene ait test cDNA sinyalinin
referans cDNA sinyalinden yüksek, yeflil noktalar düflük, sar› noktalar ise eflit oldu¤unu göstermektedir.
n›d›r. Hematolojide multipl miyelom, monoklonal
gammopati, kronik ve akut lösemiler, lenfomalar
gibi farkl› malign hastal›klar›n moleküler s›n›flamas›nda kullan›lmaya bafllam›flt›r. Gen ifade profillerinin araflt›r›lmas›n›n yan›nda DNA mikrodizilimleri mütasyon taramas›, genotipleme, genlerin
ve klonlar›n haritalanmas› ve kromozom mikrodelesyonlar›n›n incelenmesinde kullan›lmaktad›r.
Önümüzdeki y›llarda gen ifade profili incelemesinin hematolojik hastal›klar›n tan›s›, hastal›k alt
gruplar›n›n belirlenmesi, tedavi seçeneklerinin de¤erlendirilmesi gibi alanlarda yayg›n olarak kullan›lmas› beklenmektedir.
quencing: expressed sequence tags and human genome project. Science. 1991; 252: 1651-1656.
3.
DeRisi J., Penland J., Brown P.O., Bittner M.L., Meltzer P.S., Ray M., Chen Y., Su Y.A., Trent J.M. Use of
cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer. Nat. Genet. 1996;14: 457460.
4.
Hubank M., Schatz D.G. Identifying differences in
mRNA expression by representational difference
analysis of cDNA. Nucleic Acids Research. 1994; 22:
5640-5648.
5.
Liang P., Pardee A.B. Differential display of eukaryotic mRNA by means of the polymerase chain reaction. Science. 1992; 257: 967-971.
6.
Lockhart D.J., Dong H., Byrne M.C., Follettie M.T.,
Gallo M.V., Chee M.S., Mittmann M., Wang C., Kobayashi M., Horton H., Brown E.L. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide
arrays. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1675-1680.
7.
Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns
with a cDNA microarray. Science. 1995; 270: 467470.
8.
Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler
KAYNAKLAR
1.
2.
Collins F.S., Patrinos A., Jordan E., Chakravarti A.,
Gesteland R., Walter L. New goals for the U.S. Human Genome Project: 1998-2003. Science. 1998;
282: 682-689.
Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., Dubnick M.,
Polymeropoulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A.,
Olde B., Moreno R.F., et al. Complementary DNA se-
XXX. Ulusal Hematoloji Kongresi
Mezuniyet Sonras› E¤itim Kursu
37
ÖZÇEL‹K T.
DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›
K.W. Serial analysis of gene expression. Science.
1995; 270: 484-487.
9.
Cox J.M. Applications of naylon membrane arrays to
gene expression analysis. J. Immunol. Methods.
2001; 250: 3-13
10. Hegde P., Qi R., Abernathy K. et al. A concise guide
to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 2000;
29: 548-556.
11. van Hal N.L., Vorst O., van Houwelingen A.M. et al.
The application of DNA microarrays in gene expression analysis. J.Bi›technol. 2000; 78: 271-280.
12. Lipshutz R.J., Fodor S.P., Gengevas T.R. et al. Highdensity synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet.
1999; 21: 20-24.
38
XXX. Ulusal Hematoloji Kongresi
Mezuniyet Sonras› E¤itim Kursu