Doğrudan gen aktarım teknikleri

Doğrudan gen aktarım teknikleri
Niçin gen aktarımı
Tarımsal üretim
Kaliteli ürün
Dayanıklı çeşit
Klasik ıslah & genetik mühendisliği
Tarımsal üretimi artırmak
Gen aktarımının diğer hedefleri
Tahılların besin kalitesinin artırılması ve gıda dışındaki sektörler
için hammadde olarak kullanılan nişasta, protein ve yağ
kalitesinin geliştirilmesi
Bitkilerin sekonder metabolitler, antibiyotikler ve aşılar gibi
ilaç endüstrisinde kullanılan değerli maddeleri bol miktarda
üretmeleri
Toprak su, ışık ve gübre gibi ucuz gereksinimleri nedeniyle
mikroorganizmalar veya hayvan hücrelerine alternatif olarak
yabancı kaynaklı genlerin aktarılmasıyla,bitkilerde heterolog
proteinlerin üretimi
Gen aktarımının
prensibleri
Klasik ıslah
♣
Seleksiyon
Doku kültürü
♣
in vitro suz seleksiyon
♣
in vitro lu seleksiyon
Fonksiyonel olarak belirlenmiş doğal yada sentetik nükleik asit
dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği teknikleri
kullanılarak aktarılmasıdır.
Genetik transformasyon
insersiyon
entegrasyon
ekspresyon
taşınması
Yabancı nükleik asit molekülü
Genetik transformasyonda kullanılan
alıcı hücreler
Başarılı bir genetik transformasyon, aktarılacak geni kabul edip sonra
bölünme ve değişme ile tam bir bitki haline gelebilecek hedef hücrelere
bağlıdır.
Doku kültürü teknikleri kullanılarak, yaprak, gövde, hipokotil,
kotiledonlar, embriyolar, üreme hücreleri yada kallus, süspansiyon ve
protoplast kültürüne ait hücreler
1.  Alıcı hücrelerin fizyolojisi (totipotent) transformasyon ve rejenerasyon
için bir bitki hücresinin yeterlilik göstermesi, bitkinin
genotipine,fizyolojik durumuna ve gelişim evresine bağlıdır.
2.  somaklonal varyasyon: rejenerasyon sürecinde hücrelerin genetik
stabilitelerinin bozulması ve genetik varyasyonun oluşmasıdır.
promotor
Seçici işaret gen
Raportör gen
Transgenik bitki
Aktarılan nükleik asit moleküllerinin
özellikleri
Bitkilere aktarılan nükleik asit molekülleri basit yapıdadırlar.
Genellikle aktarılacak DNA parçası, aktarılmak istenen gene ilave olarak
promotorlar
Markör geni
Raportör gen
Bitkiye akatarılmak istenen genin bu gerekli dizileri içerecek hale
getirilmesi için öncelikle in-vitro rekombinasyon teknikleri kullanılarak
uygun düzenlemeler yapılır.
Promotorlar
•  Bitki virüs veya bakteri kökenli olabilirler.
•  Bazıları konstitütif (sürekli), bazılarıda doku- veya organa
spesifik etkiye sahiptirler veya ifadeleri çevre
koşullarından başlatılır.
•  En yaygın kullanılan promotor CaMV-35S dır.
Seçici işaret genleri
Bir gen aktarımı çalışmasında transformatların yabancı DNA yı almamış
doku veya hücrelerden ayırt edilebilmesi için aktarılan DNA da seçici
işaret genlerinin bulunması lazım
nptII – Neomisin fosfotransferaz – kanamisin
neomisin
paramomisin
G418
Hpt veya aphIV- Higromisin fosfotransferaz–higromisin
Herbisit
Bar- Fosfonotrisin asetil transferaz - fosfonitrisin
Raportör genler
•  Ürünü bir enzim olmalı ve konakta endojen aktiviteye sahip
olmamalı.
•  Gen veya gen ürünleri genetik ve biyokimyasal olaral iyi
karakterize edilmiş olmalı.
•  Gen ürünü farklı fizyolojik koşullarda stabil olmalı.
•  Enzimatik aktivite kolaylıkla saptanabilmeli ve ölçülebilmeli.
•  Ifadesi gen aktarımı yapılmış hücrelerde kolaylıkla
gözlenebilen bir fenotipik değişikliğe neden olmalıdır.
Gen aktarım metodları
Fiziksel
Mikroenjeksiyon
Biyolistik - gene gun/
particle bombardment
Elektroporasyon
Silica/carbon fibers
Lazer mediated
Kimyasal
PEG
DEAE-dextran
Calcium
phosphate
Artificial lipids
Proteins
Biyolojik BİTKİ
A. Tumefaciens
A.  Rhizogenes
Transformation
•  Plants - physical methods
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Microinjection
Electroporation
Biolistics - gene gun
Silica/carbon fibers
Lazer mediated
SAT
Microinjection of GOI
This electroporator is for low-current applications such as those using small
electrodes
BiYOLİSTİK / PARTİKÜL BOMBARDIMANI
Biological Transformation
♣ Agrobacterium tumefaciens &
♣ Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium
Agrobacterium (disease symptomology
and host range)
A.  radiobacter - “avirulent” species
A. tumefaciens - crown gall disease
A.  rhizogenes - hairy root disease
B.  rubi
- cane gall disease
C. vitis
- galls on grape and a few
other plant species
Otten et al., 1984
Cellular process of Agrobacterium–host interaction
Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky, 2002, Trends in Cell Biol. 12(3), 121-129
Transgenik bitkilerin üretimi
Istenilen genin klonlanması
DNA segmentinin yerleşmesi
seçici marker eklemek
Bitki hücrelerine geni aktarmak
Transgenik bitkileri seçmek
Rejenerasyon
T0 bitkilerin analizi
Morfoloji
Fizyoloji
VERİM
GUS expression
Gen expression
Seçici markörle doğrulama, Negative &
Positive kontrol
Gen aktarım yöntemlerinin
karşılaştırılması:
Agrobacterium avantaj:
-yüksek derecede etkinlik
-Uzun DNA dizilerinin aktarılabilmesi
- çoğunlukla tek yada az sayıda T-DNA
entegrasyonu
-Uygulama için özel bir donanıma ihtiyaç
yoktur.
dezavantaj:
- sınırlı konukçu alanı
- genetik bilginin sadece T-DNA aracılığıyla
aktarımı
KİMYASAL YÖNTEMLER VE
ELEKTROPORASYON:
avantaj:
-Basit kullanım
-tek denemelerde birçok örneğe uygulanabilirlik
- kimyasal yöntemler için özel bir donanıma
ihtiyaç yoktur.
dezavantaj:
- aktarılan DNA da yüksek derecede yeni
düzenlemeler görülmesi ve çok sayıda kopyanın
entegrasyonu
- Kimyasal yöntemlerle transgenik bitki
üretimi için protoplast kültürü ve rejenerasyon
sistemlerinin kurulması
-somaklonal varyasyonda artış
Mikro-enjeksiyon:
avantaj:
-genotipden bağımsız olarak kullanım
-çok çeşitli hedef ve dokulara uygulanabilirlik
- uygulamada görsel kontrol olanağı
dezavantaj:
- kompleks ve pahalı donanım gereksinimi
- başarı için deneyim gerekliliği
Biyolistik:
avantaj:
-genotipden bağımsız olarak kullanım
-farklı hedef ve dokulara uygulanabilirlik
- transgenik tahıl elde etmek için güçlü
yöntem olması
dezavantaj:
- kompleks ve pahalı donanım gereksinimi
- aktarılan DNA da yüksek derecede yeni
düzenlemeler görülmesi ve çok sayıda kopyanın
integrasyonu
Golden rice contains increased levels of pro-vitamin A .
Traditional rice is white (a).
The prototype of golden rice was developed in 2000 and is a light yellow
color (b). It contains 1.6 mg/g of carotenoid.
In 2005, new transgenic lines were developed that dramatically increased the amount
of carotenoid synthesized, making the rice a deep golden color (c).
This latest form contains 37 mg/g of carotenoid, of which 84% is b-carotene – trial