fatma oguz savran

İmmünolojik Açıdan
Transplantasyon Öncesi
Olmazsa Olmazlar
Dr. Fatma Savran Oğuz
İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi
Doku Tipleme Laboratuvarı
Sunum Planı
• İmmün yanıt
• HLA alelleri
• Anti HLA antikorları
– CXM (CDC-CXM, Flow CXM)
– PRA
– Luminex
– Virtual XM
• Non HLA antikorları
21. yy da Bireysel Tedavi
21. yüzyılda transplantasyonun önündeki en büyük engel transplante organın sağ
kalımını sınırlayan « immun yanıt»tır.
Donor spesifik antikorların varlığı (DSA) antikor ilişkili rejeksiyonu başlatan ve
allograft sağ kalımı etkileyen ana faktördür .
İmmün Tanıma
HLA moleküllerince sunulan
yabancı peptidin T hücrelerince
tanınmasıdır.
–TCR
–Yabancı peptid
–MHC molekülü
hücresel hem de hümoral immün cevabı
ortaya çıkarırlar.
• T lenfositlerin tam olarak aktive
olabilmesi için, antijen sunan hücre
yüzeyinde bulunan,
• MHC/antijen kompleksinin, T cell
reseptör (TCR)/CD3 tarafından
tanınması ve ko-stimulatör yolakların
aktive olmaları gereklidir .
Ch. 17
İmmün Tanıma II
T hücreleri ve ASH arasındaki etkileşim;
B7
Hücre yüzey
CD40
molekülleri
CD28
CD11a/CD18
ICAM-1
İntersellüler
adezyon
molekülleri
Ligand-reseptör çifti ko-stimulatör
olarak görev görür.
B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur.
CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive
eder
• Bu aktivasyon T hücre çoğalması,
sitotoksik lenfositlerin oluşumu ve
lenfokin/sitokinlerin üretimi ile
sonuçlanarak immun reaksiyonları
potansiyalize eder
İmmun Yanıtın İnhibisyon ve
Regülasyonu;
•
•
•
•
-TCR sinyalizasyonu inhibe ederek,
- IL-2 üretimini bloke ederek,
-T hücre siklusunu baskılayarak,
-CD4+ CD25+ regülatör T lenfosit (Treg)
oluşumunu sağlayarak ,
• -T hücre anerjisine ve T hücre
apoptozisine yol açarak sağlanır.
HLA Molekülleri
HLA antijenlerinin temel rolü :
- öz tanıma
- sağkalım
Serolojik tanımlama:
Antijen grupları, antikorlarla verdikleri reaksiyon
değerlendirilerek belirlenir.
Moleküler tanımlama:
Aleller
dizilimlerindeki (sekans) benzerliklere göre
gruplanır. Bu dizilim serolojik reaksiyonlar ile de ilişkilidir.
HLA Tiplendirme Yöntemleri
• Düşük rezolüsyonlu
– Allel grubunu belirler
– ör: HLA-A*01
• Orta rezolüsyonlu
– Sonuçta birkaç allel seçeneği birlikte verilir
– ör: HLA-A*01:01/01:02/01:03
• Yüksek rezolüsyonlu
– Allelik düzeyde tiplendirme
– ör: HLA-A*01:01
Ön ek ile gen ayrım çizgisi
Null”(eksprese edilmeyen ) bir
allel
Alan ayırıcısı
ayırıcı
HLA ön
eki
GEN
Kodlanmayan bölgeler
deki Farklılıklar
Allel grubu
Spesifik HLA proteini
Sinonim mutasyonu olan allel
• HLA gen bölgesi yüksek oranda polimorfik
bir bölge olup, Sınıf I HLA alleleri (n=8.124)
ve sınıf II HLA alleleri (n= 2409) olmak
üzere toplam 10.533 farklı alel içermektedir
(www.hla.alleles.org, 2013).
• HLA allellerinin sıklıkları ve dağılımları
popülasyonlar arasında, etnik kökene göre
farklılık gösterir.
Farklı HLA proteinleri
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DR
HLA-DQ
HLA-DP
2313
3011
1985
1850
5995
480
• Pekçok hasta HLA uyumsuz veriden nakil olmaktadır
• Her uyumsuz HLA antijeni antikor oluşumuna yol açmaz
• graft rejeksiyonuna neden olmaz
1. non-immunogenik HLA uyumsuzluğunu ön görebilmek mümkün müdür?
2. Özellikle sensitize hastalar için kabul edileblir veya edilemez uyumsuzlukları
antikor testleri yapmadan tespit etmek mümkün müdür?
Türkiye’deki sağlıklı bireylerle yapılan
çalışmalarda, en sık rastlanan doku
grupları
HLA-A;
HLA-B;
HLA-DRB1;
A2, A24 ve A3
B35, B51, B44
DR11, DR4 ,DR13
• Bazı doku grupları toplumlarda yaygın, bazıları
nadir rastlanan bir kalıtım şekli gösterir
HLA Alel Sıklıkları
9,72
40
17,93
13,53
9,55
HLA-DQB1*02:01
35
HLA-DQB1*03:01
30
HLA-DRB1*07:01
25
HLA-DRB1*11:01
9,95
20
30,17
15
10
5
0
HLA-DRB1*11:04
11,18
HLA-C*04:01
20,65
19,4
10,3
HLA-C*07:01
13,21
HLA-B*35:01
HLA-B*51:01
HLA-A*24:02
HLA-A*02:01
Her bir HLA antijeni, polimorfik amino asid
residüleri tarafından tanımlanan epitopları
sunar ve bunlara karşı da antikor oluşur.
Anti-HLA antikoru
anti-HLA-A1
HLA-A1
HLA-A2
HLA-A3
Anti-HLA: HLA antijenine karşı oluşmuş antikor.
Antijen havuzu, fenotip paneli=Panel reaktif antikor (PRA)
Spesifik bir donöre ait hücreler = Cross-match
Cross-match
DSA: Donör spesifik antikor
PRA testi
Antikor testleri
Bir hastanın antikor durumundaki değişikliği
tespit etmenin en iyi yolu
hastadan her ay kan alıp,
antikor testi yapmaktır.
Anti-HLA antikor testi için önerilen aralıklar,
3 ayda bir ya da 6 ayda bir
Hastalar, tercihen diyalizlerinin ertesi günü olacak şekilde,
6 aylık aralıklarla
anti-HLA antikor tayini için
kan vermek üzere yönlendirilmelidir.
Hastaya kan takılması
halinde HLA laboratuarı
mutlaka bilgilendirilmelidir.
Kan takıldıktan 1 ay sonra antikor testi için
kan verilmelidir.
Örnek verme esnasında,
Enfeksiyon olması testi etkiler.
Nakil sonrası dönemde,
anti-HLA antikor tayini
pek çok laboratuarda rutin bir uygulama
olmamakla birlikte,
merkezler özellikle nakil sonrası
1., 7.,14.,21.,28. gün, 3.ay , 6. ay ve 12. aydaki
serum örneklerini toplamak konusunda
hassas olmalılardır.
Anti HLA antikor tayini ve CXM
yöntemleri
• Hücresel yöntemler
– CDC
– Flow sitometri
• Solid faz immünoassay (soluble HLA molekülleri solid
yapıda matrikse bağlıdır)
– ELISA
– Luminex (C4 d assay, C1 q assay)
• Luminex teknolojisi düşük düzeydeki HLA
spesifik antikor tayininde hem CDC hem de
flow sitometriden daha sensitiftir
XM
Serolojik Yöntem ( Mikrolenfositotoksisite )
Flow-Sitometri
ELISA
CDC-XM
Yöntem olarak Serolojik HLA tiplendirilmesindeki ile aynıdır
Alıcının serumu bu kez vericinin lenfositleri ile inkübe edilir
DTT’li ve DTT’siz olarak iki ayrı plak hazırlanır
DTT IgM antikorlarını uzaklaştırır
Serolojik Yöntem
Hasta Serumu
+
Donör Lenfositleri
+
Kompleman
+
Boya , Formaldehid
DEĞERLENDİRME
SEROLOJİK YÖNTEM
OTO XM
MAJOR
DTT’li XM
NC ; IgG ; IgM
Komplemansız
CDC-XM, nakil sonrası
saatler/günler
içerisinde meydana gelen ve
allogreft rejeksiyonu
ile greft kaybı açısından
artmış risk ile ilişkili olan
düşük seviyedeki DSA’ları
tespit etmek için
yeterli hassasiyete sahip değildir.
Gebel HM et al. Am J Transplant, 2003
Flow Sitometri Cross-Match
Daha hassas olan
flow sitometri cross-match (FC-XM),
bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde
kullanılan hücre tabanlı
mevcut en iyi test olarak
kabul edilmektedir.
Neden FCXM?
•
•
•
•
Düşük düzeydeki HLA Sınıf I antikorlarını
Sınıf II antikorlarını
Antikorun hedef hücresini T- XM ve B XM
Tüm IgG alt gruplarını saptar.
• Ig-G Antikorlar alt grupları vardır:
• IgG1 ve 3 kompleman aktivasyonunu güçlü
• IgG2 ve 4 zayıf aktive ederler.
• 1. ve 3. grup IgG reaktif özellikli
• 2. ve 4. grup IgG tolerans regüle edici
antikorlar denilir.
Flow XM
• Alıcının serumu ile inkübe edilen verici
lenfositlerine önce B ya da T hücresine
spesifik floresan işaretli marker eklenir
daha sonra 2. bir floresan boyaya sahip
anti Ig G ilave edilir
T FCXM (+) olan testte
IgG-FITC histogramının
negatif ve pozitif
kontrolün IgG-FITC
histogramları ile
karşılaştırması
---- Negatif kontrol,
--- Pozitif kontrol, ---CM
T hücre ve B hücre pozitif –kontrendikasyon
anti sınıf I HLA antikorlarını gösterir; anti sınıf II HLA
antikoru da var olabilir?
T hücre pozitif- kontrendikasyon
Yalnızca B hücre pozitifliği-tartışmalı
- Sınıf II HLA-DSA
- Düşük seviyede Sınıf I HLA-DSA
- Enfeksiyon varlığı (1 ay sonra test tekrarlanır)
- HLA dışı antikorlar
- Spesifik olmayan bağlanmalar (yanlış
pozitiflik)
-Otoantikorlar (grefte zarar vermezler)
Flow Sitometrik XM reaksiyon paternleri
T hücre
B hücre
Yorumlama
Negatif
Negatif
HLA antikoru YOK veya çok düşük titre
Negatif
pozitif
Öncellikle Sınıf II antikoru
Negatif
Zayıf pozitif
Zayıf Sınıf I veya II antikoru
pozitif
pozitif
Kuvvetli Sınıf I antikoru veya Sınıf I ve
Sınıf II birlikte
pozitif
Negatif
non-HLA reaksiyonu ?
Transplantation Immunology methods and protocols 2013
Solid Faz Immunoassay-Luminex
Test serumu önce sınıf I
ve sınıf II HLA antijeni
kaplı mikroboncuklarla
inkübe edilir
Test serumundaki
mevcut HLA antikorları
boncukların üzerindeki
antijenlere bağlanır
Non HLA antikorlar ve
immün kompleksler
Luminex sisteminde tespit
edilmez.
DSA saptanması
• Tek antijen boncuk (SA bead) dayalı Solid faz
yöntemleri
• Virtual Cross Match uygulaması
• SA bead’ ler ile saptanan tüm DSA’ lar klinik
etkisi ??
• DSA’ ların patojenitesi arasında farklılık varsa
Zararlı / Zararsız ayırımı nasıl yapılacak?
• Fonksiyone graft
• Rejeksiyon
• Graft kaybı
Öngörü ?
• DSA karakterizasyonu yapılabilir mi?
• Kompleman bağlayıcı DSA
• IgG alt sınıflaması
• Çalışma tasarımları ve sonuçlardaki heterojenite
nedeni ile bu tekniklerin klinik uygulamalarda
nasıl kullanılacağına dair bir konsensus yok
Amico P. American Journal of Transplantation 2015
Luminex Modifikasyonları
• C4d assay
– Kompleman fikse eden ve etmeyen antikorların
ayrımında kullanılır.
– Kompleman aktivasyonu gerekir ve kompleman
regüle edici faktörlerden etkilenir
– CRP ligandlarına bağlandıktan sonra, kompleman 1 q'yu aktive eder, böylece klasik yoldan
kompleman aktivasyonu gerçekleşebilir . CRP aynı zamanda kompleman aktivasyonunu regüle
eden inhibitör protein olan faktör H'yi de aktive edebilmektedir .
– C4d+ antikorların varlığının böbrek ve kalp graft ömrü
ile ilişkili olduğunu gösteren yayınlar mevcut
– C4d antikorlarının böbrek graflerinde AMR ile ilişkisi
??
– De nova DSA kötü graft survi ilişkisinin MFI ve C4d
den bağımsız olduğu gösterilmiş
Luminex Modifikasyonları
• C1q assay
– Komplemana bağlanan ve klasik yolağı aktive
etme yeteneğine sahip antikorlar saptanır.
Kompleman aktivasyonu gerekmez
– Kompleman regüle edici faktörlerden
etkilenmez.
Standart miktarda hC1q hasta serumuna eklenir; sonra SAB’ler
eklenir; en son PE konjuge anti hC1q antikorları eklenir
Luminex Modifikasyonları
• C1q assay
– Daha çok IgG antikoru saptar (CDC’ den )
– Kompleman fikse eden IgM’ leri de saptar.
Kardiyak ve renal transplant rejeksiyon ve C1q antikor
ilişkisini gösteren yayınlar var.
Transplantasyon sonrası De novo DSA ile kötü
graft sağkalım ilişkisi
HLA uyumu graft rejeksiyonu sonrası yüksek
sensitizasyonu önler
Uygun olmayan Antijenler
• Anti-HLA antikorlarının tespitin de tek HLA
molekülleri ile kaplı solid faz immün (SFI)
test lerin kullanıma girmesi antikor tespitinde
öz güllüğü ve hassasiyeti artırmıştır.
Solid Faz İncelemeler ile anti HLA antikorları
(tek antijen) saptanır
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
(Acceptable mismatch-EUROTRANSPLANT)
Bir hastanın (özellikle yüksek
oranda sensitize hastaların)
hiç HLA antikoru oluşturmadığı
HLA antijenlerinin belirlenmesidir.
Eurotransplant’ta
HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ lokusları için
kabul edilebilir uyumsuzluklar
belirlenmektedir.
Acceptable mismatch
Kabul edilebilir uyumsuzluklar
HLA: A1, A2, B7, B18
acceptable mismatch B18
pozitif
negatif
PRA %92
HLA: A1, A24, B7, B8
Hasta HLA: A1, A2, B7, B8
acceptable mismatch A24
Kabul edilebilir uyumsuz antijenler
Kabul edilebilir uyumsuz antijenler hastanın serumunun
reaksiyon vermediği, yani antikor oluşturmadığı antijenlerdir.
A2, A11, B7, B39, CW4
%PRA
• Yüksek oranda sensitize hastalar, %85 ve
üzeri oranda panel reaktif antikora sahip
hastalar olarak tanımlanır.
• Eurotransplant Kalite Kontrol Programı
aynı serumun %PRA değerinin farklı
laboratuvarlar arasında %5-80 değişiklik
gösterdiğini,
• HLA antikor spesifisitesinin ise oldukça
uyumlu olduğunu ortaya koymuştur.
Paneldeki hücrelerin
%85’i ile pozitif veren
Yüksek oranda sensitize hasta
Virtual PRA
Donör popülasyonundaki antijen frekansına göre
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
X
Yüksek oranda sensitize hastalar: PRA %80-85
VPRA- cPRA –sanal PRA
Sensitizasyon derecesini tanımlamanın en iyi şekli, bir
hastanın HLA antikorlarının bir donör popülasyonun da ki
hedef antijenlerin frekansına göre değerlendirilmesidir ki,
buna “sanal (virtual) PRA” denmektedir
(%PRA= % popülasyon reaktif antikorlar).
Doxiadis IIN, Claas FHJ.Current Opinion Org Transplant, 2009
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
Bir hastanın anti-HLA antikoru
geliştirdiği allellerin gen frekanslarının
bilinmesi ile geleneksel PRA değerinden
daha doğru bir şekilde anti-HLA
reaktivitesini yansıtan ‘(virtual) PRA
yüzdesi’ hesaplanabilmektedir.
‘Gerçek PRA hesaplama Programına’
http://eurotransplant.nl/cms/index.php
adresinden erişilebilmektedir.
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
http://eurotransplant.nl/cms/index.php
Flow sitometri cross-match (FC-XM),
bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde
kullanılan hücre tabanlı
mevcut en iyi test olarak
kabul edilmektedir.
!!!
Anlamlı olmayan antikorların,
hücre yüzeyine
özgül olmayan bağlanmaları
nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar
ortaya çıkabilir
!!!
Wen R et al. Kidney Int, 2006
Yeni teknikler; Cross-match sonuçlarının
doğru bir şekilde öngörülmesini sağlama
potansiyeline sahiptir.
VIRTUAL CROSS-MATCH BİR ÖNGÖRÜDÜR
Alıcının önceden karakterize edilmiş
antikor spesifitelerine dayanarak,
nihai cross-match sonuçlarının tahmin edilmesidir.
Virtual Cross-Match
Tek antijen boncuklar kullanılarak
yapılan HLA- antikor testlerinden elde edilen
ayrıntılı HLA spesifitelerinin,
potansiyel bir donörün HLA doku tipi
ile karşılaştırılarak, ayrıntılı HLA spesifisiteleri
ve buna bağlı olarak kabul edilebilir/kabul
edilemez antijenlerin tanımlanarak, potansiyel bir
donörün HLA fenotipine göre
bu donörle yapılacak
nihai cross-match sonucunun öngörülmesine
VIRTUAL CROSS-MATCH denir.
Hasta doku tiplemesi
HLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP
Antikor tarama
negatif
pozitif
PRA 0
Sensitize değil
Luminex/Flow tek antijen boncuklar
HLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP
Donör HLA tiplemesi
HLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP
Kabul edilemeyen antijenlerin
belirlenmesi
VIRTUAL CROSS MATCH
Virtual Cross-Match
AKTÜEL CDC-XM --------------vXM
Bunun sebebi, CDC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,
vXM için kullanılan antikor testlerininkinden
düşük olmasıdır.
KORELASYON OLDUKÇA KÖTÜDÜR
Vaidya S et al. Transplantation, 2006
Nikaein A et al. Transplantation 2009
Virtual Cross-Match
AKTÜEL FC-XM --------------vXM
Bunun sebebi, FC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,
vXM için kullanılan antikor testlerininkine
benzer olmasıdır.
KORELASYON >%85
Vaidya S et al. Transplantation, 2006
Nikaein A et al. Transplantation 2009
Nakilden 10 önce CDC XM ve Flow XM analizi yapılmalı
CDC (pozitif) hiperakut rejeksiyon
Flow XM (pozitif) graftı 1 yıl içine kaybetme riski var
ÖNERİLER
• Transplantasyon öncesi en az bir kez solid faz
immunoassay ile anti HLA sınıf I ve II antikorları
araştırılmalıdır.’
• ‘HLA-immünize hastalarda en az bir kez SAB (single
antigen bead) immunoassay uygulanmalıdır (özellikle
Cw,DQA,DPA ve DPB’ye karşı gelişen ve diğer
yöntemlerle gösterilemeyen antikorlar için) ‘
• ‘SPI yöntemle hücre bazlı yöntemlerle desteklenmeli
ve SPI ile ölçülen antikor düzeyinin pozitif cross
match’e yol açıp açmayacağı değerlendirimelidir’
• ‘Luminex teknolojisini kullanırken antijen yoğunluğu ya
da boncuklar üzerindeki antijenlerin denatürasyonu gibi
teknik faktörlerin sonuçları etkileyebileceği göz önünde
bulundurulmalıdır
PRETRANSPLANTASYON GRUBU
ÖNERİLERİ
– Antikor ve CXM sonuçlarına göre hastanın risk kategorisi
belirlenmelidir
– Doğru CXM sonuçları doğru HLA tiplendirmesi ile ilişkili olduğundan
donörün HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADRB4,
HLA-DRB5, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, ve HLA-DPB
tiplendirmesi yapılmalıdır
– CDC ile saptanmış DSA ve pozitif CXM (en yakın tarihli serumda)
varlığında AMR ve graft kaybı riski yüksek olacağından
transplantasyondan kaçınılmalıdır
– DSA pozitif ancak CDC CXM negatif hastalar yüksek riskli kabul
edilmelidirler ancak transplantasyona kontrendikasyon sayılmamalıdır
– Eğer SAB ile tüm sınıf I ve II antikorlar negatifse prospektif CXM
yapılmadan transplantasyon yapılabilir
– Kalp ve akciğer nakillerinde DSA pozitifliğinden kaçınılmalıdır (erken
akut rejeksiyon riski); karaciğer, ince barsak ve adacık hücre
nakillerinde DSA varlığı risk olarak algılanmalıdır
– HLA antikorlarının varlığı farklı zamanlarda alınan 2 serum örneğinde
teyit edilmelidir
POST TRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ
– De novo DSA gelişimini takip edebilmek için tüm donörlerin DNA’sı
ve alıcının pretransplantasyon serumu saklanmalıdır
– Düşük riskli hastalarda (nonsensitize, ilk transplantasyon)
• Transplantasyon sonrası 3-12. aylar arası en az 1 kez DSA
bakılmalı
• Tedavi değişikliği planlanması, tedaviye uyumsuzluk şüphesi,
graft disfonksiyonu gibi durumlarda DSA bakılmalı
• DSA pozitif ise BİYOPSİ yapılmalı
– Orta risk grubu
( Önceden DSA + ancak şu an -)
• İlk 1 ay içinde DSA---------biyopsi
– Yüksek risk grubu (DSA+/XM -)
• Transplantasyondan sonraki 3 ay içinde biyopsi ve DSA takibi
– Çok yüksek risk (Desensitize edilmiş)
• Yakın DSA takibi ve 3 ay içinde biyopsi
Non HLA antikorları
• MICA antikorları??
• Angiotensin II tip I reseptör aktive edici IgG
• Self antijenlere karşı gelişen antikorlar
(Tubulin, Kollajen, Myosin, Vimentin )
• Anti-peroksizomal trans 2 enoly coA redüktaz
Endotel prekürsör hücreler ile FLOW XM
Cylex ImmunoKnow Cell
Function Assay
• CD4+ Hücre aktivitesini ölçmek
• Hücrenin bazal ATP ve uyarı sonrası ATP’ sini
ölçüyor
Berlung D. Transp Immunol 2011
Gelecek
•
•
•
•
Hücre içi sitokinler
Tolerojenik Dendritik Hücreler
T supresör hücre uyarımı
Transkriptomik çalışmaları, ekspresyon
analizleri, RNA dizileme
• HLA tetramer boyama ile HLA spesifik
B hücre saptanması
HLA
TEŞEKKÜRLER