MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II
RNA Çalışmaları
Transkriptom
RNA
• Bakteri hücresinin %6’sı
• Memeli hücresinin %1.1’i
– Total 10-15µg RNA’nın
%80-85’i
rRNA
%15-20’si
tRNA ve
nukleusa ait
küçük
RNA’lar
%1-5’i
mRNA
RNA’dır
RNA
• Transkripsiyon: DNA’daki bilginin RNA’ya
aktarılması
Protein translasyonu için geçici olarak bilgi iletir.
-­‐ Tek zincirli bir polinükleotid
-­‐ Riboz seker içerir.
-­‐ DNA’daki timin yerine urasil içerir.
-­‐ Olgunlaşmış mRNA moleküllerinin 5’ ve 3’
uçları işlevsel önem taşır.
RNA
• RNA eşleniklik kuralına uygun olarak kalıp DNA zinciri
üzerinden transkribe olur.
• Genlerin büyük kısmı proteinleri kodlarken az bir kısım
gen ise transle olmayan işlevsel RNA’ları kodlar.
• Genin nükleotid dizilimi bir proteindeki aminoasitlerin
sırasını belirler. Bu dizilim proteinin şeklini, boyutunu
ve işlevini belirler.
• mRNA üçlü nükleotid grupları (kodon) halinde tRNA
antikodonunun mRNA kodonu ile eşleşmesi aracılığı ile
ribozomlarda transle olur.
RNA Çeşitleri
• mRNA; Protein kodlayan RNA
-­‐ Transkriptlerdir.
-­‐ Ökaryotlarda transkripsiyon sonrası işlemden geçirilir.
-­‐-­‐5’ ve 3’ uç modifikasyonu, intronların uzaklaştırılması
• İşlevsel/Yapısal RNA
-­‐tRNA; a.a’leri ribozomlara taşır.
-­‐rRNA; ribozomların yapısal ve katalitik bileşenleridir.
-­‐snRNA(küçük çekirdek RNA); splaysozomun yapısal ve katalitik
bileşenleridir.
-­‐snoRNA (küçük nükleolar-­‐çekirdekçik-­‐ RNA); rRNA’ların olgunlaşmasına
katılır.
-­‐scRNA; stoplazmadaki protein trafiğini yönlendirir.
-­‐siRNA (small interfering RNA); gen ifadesinin kontrolünde kullanılır.
-­‐miRNA (Mikro RNA): transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde görev
alır.
Transkripsiyon
• RNA polimeraz; RNA sentezini katalizler
-­‐ DNA zincirlerinden birini kalıp olarak kullanır.
-­‐-­‐-­‐-­‐Belirli bir gen için hep aynı zincir üzerinden
gerçekleşir.
-­‐ DNA ifade edilecek kısmı ile açılır.
-­‐ Uzayan RNA zincirinin 3’ ucuna serbest
nükleotidleri takar.
-­‐-­‐-­‐-­‐5’ den 3’ yönüne RNA sentezi
Transkripsiyon
• Transkripsiyon asimetriktir – DNA’nın yalnızca
bir zinciri “kalıp zincir”
• RNA’ya transkribe olur.
• RNA transkripti kalıp olmayan zincirle aynı
dizilime sahiptir.
• RNA yalnızca 5’ den 3’ yönüne transkribe olur.
• Kalıp zincir 3’ 5’ yönünde okunur.
RNA polimeraz
• Prokaryotlar: tek bir RNA polimeraz
– mRNA, rRNA and tRNA
– Trankripsiyon ve translasyon birbiri ile eşli gider.
• Ökaryotlar: 3 RNA polimeraz
– RNA polimeraz I: rRNA genleri
– RNA polimeraz II: mRNA
Transkriptler işlenir.
– RNA polimeraz III: tRNA, 5S rRNA
• Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon
sitoplazmada ribozomlarda gerçekleşir.
Transkripsiyon basamakları
• Başlangıç
– Genin 5’ ucundan
– RNA polimeraz promotora bağlanır.
– DNA çift zinciri ayrılır.
• Uzama
– Nükleotidler 3’ uçtan ilave olur.
– GTP’den enerjisi sağlar.
• Sonlanma
– Genin 3’ ucunda gerçekleşir.
Ökaryotik mRNA işlenmesi
• 5’ uç: şapka/capping
– 5’ uca 7-­‐methylguanosine ilavesi
• 3’ uç: poly(A) kuyruğu
– 3’uca 150-­‐200 adenin nükleotidi eklenir.
• Intron çıkarılması
– 5’GU ve 3’AG
– snRNP splaysozom katalizi sağlar.
RNA İzolasyonu
• Gen anlatımı
• Gen anlatımının analizi
• Gen anlatımının düzenlenmesi
• İşlenme
• Klonlama
çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna dayanır.
• Klonlama
çalışmalarında
cDNA
kitaplığının
kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu
için total RNA’dan mRNA izolasyonu gereklidir.
RNA Ekstraksiyonu
• Hücre çeperi ve membranının parçalanması
(LİZİS)
• Hücre lizatının santrifüjlenmesi (diğer
makromoleküllerden ayrılması)
Genomik DNA’dan ayrılması için asidik solüsyonlarla muamele
Trizol, Guanidinium HCl veya guanidinium tiyosiyanat (güçlü denaturanlar)
homojenatı, ile fenol:kloroform ekstraktı uygulanabilir.
Pürifikasyon
• RNA’nın yoğunlaştırılması
• Kalite ve saflığının tespiti
RNA İzolasyonu
• BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU, diğer moleküllerle
kontamine olmamış ve yıkılmamış RNA’ların
saflaştırılması demektir.
• Riboz rezidüleri 2’ ve 3’ pozisyonunda halkasal grup
taşıdıklarından kimyasal olarak DNA’dan daha reaktiftir
ve Rnaz ile kolayca yıkılır.
RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen RNaz’ların
RNA’yı parçalamalarıdır !!!
Ekzojen Rnaz’lar
Endojen ve Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım
Yolları;
• Endojen RNaz için;
-­‐Guanidinium isothiocyanate (GITC)
-­‐RNAzol/Trizol/Ultraspec (14M GITC and urea salts) -­‐Qiagen RNeasy – kullanılmalı
• Eksojen RNaz profilaktik tedbirlerin
kullanılması ile ortadan kaldırılabilir.
• Eksojen Rnaz kontaminasyonu en sık;
-­‐Kontamine bufferlar
-­‐Otomatik pipet uçları ile olur.
dikkatli
Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları;
• Bazı cam eşyalar %0.1 oranında çözünmüş DEPC
bulunan suda 2 h 37oC’de bekletilip steril dH2O ile
yıkanarak 15 d. otoklavlanır.
• Cam eşyalar 180oC’de 8 h, 300oC’de 4h veya
kloroform ile yıkanarakda Rnaz inaktive edilebilir.
DEPC ciddi karsinojen maddedir!!
RNA Analizi
•
•
•
•
Northern Analizi (Gen ekspresyonu için)
cDNA kütüphanesi için kaynak
RT-­‐PCR
RNase koruma metotları
Splicing defects
GEN İFADESİ
• Genom statik, transkriptom ve proteom
dinamik.
• Transkriptom ve proteom; hücre/doku’ya
özgül profile sahip.
• DNA >>>>>>RNA>>>>>> Protein
GEN EKSPRESYONU ANALİZİ
5’
3’
PROMOTOR
Reporter gene
analysis
hnRNA
exon 1
intron
exon 2
transcription
3
’
5
’
RNA processing
RNA analysis
mRNA
5
’
3
’
AAAAAA
m7GpppN
degradation
protein
mRNA Analiz Yöntemleri
• Northern Analizi (Tek gen analizi)
• RT-­‐PCR (Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir
Reaksiyonu) (Tek gen analizi)
• Mikroarray-­‐Mikroçip (Genom boyunca analiz)
Splicing defects
Northern Analizi
• Bu yöntemde DNA yerine mRNA veya viral RNA
kullanılarak işlem yürütülür.
1.RNA izolasyonu,
2. RNA’nın jel elektroforezinde yürütülmesi
3. Uygun bir membrana aktarılması
4.Membrandaki RNA’ların, radyoaktif işaretli ve tek zincirli
bir DNA prob ile melezlenmesi ve sonucun otoradyografi
veya boyamayla saptanması
Bu yöntemin avantajı, genin RNA kopyasının boyutunun
belirlenmesi ve farklı dokularda farklı RNA ürünü
olasılığının araştırılmasında kullanılmasıdır. Ancak işlem
hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas
değildir.
Northern Blotting
5 –10µg izole edilen RNA
260/280nm ~ 2.0
(c.f. DNA 1.8)
Denatürasyon için formamide ile ısıtılır.
Agaroz jel elektroforezi
Formaldehyde 0.66M/2.2mM
Glyoxal/Methyl Mercuric Hydroxide
Tuz solüsyonu kullanılarak
membrana
RNA
Blotlamazı/transfer
Northern Blotting
RNA transferi naylon yada
nitroselüloz membran/filtre
Hibridizasyon bufferı oldukça önemlidir. (Rapid Hyb ~ 1hr)
Prob (cDNA fragment/antisense RNA)
kemolimünesan yada radyoaktif olarak
işaretlenebilir. Random
işaretleme
yaygın olarak kullanılan metottur.
Northern Blotting
Ambion
RNAlater
Glyceraldehyde 3’ phosphate dehydrogenase (GAPDH),
β-actin, β2-microglobulin
Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR
• Total veya polyA RNA üzerinden
transcriptase” enzimi ile cDNA sentezlenir.
“reverse
• Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır.
• Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile
yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir.
• İşlem
hacmi
northern
mikroarraylerden düşüktür.
blot’tan
yüksek
Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR
• Genler etkilerini mRNA üretimi ile ortaya çıkarırlar.
• Normal koşullarda RNAz enzimlerinin aktivitesi ile çok
çabuk parçalandıklarından, mRNA’lar ile laboratuvar
şartlarında çalışılması oldukça güçtür. Bu nedenle
mRNA preparatları mRNA’nın DNA karşılığı olan
cDNA’ya çevrilirler ve bu halde kullanılırlar.
• RT-­‐PCR’dan mRNA veya viral RNA’nın çoğaltılmasında
faydalanılır.
• Bu PCR çeşidinde bir ters transkriptaz enzimi (RT) ve
DNA primeri kullanılır.
Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR
• RT-­‐PCR iki aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi
(ters transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA (cDNA)’nın da
standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar.
• RT-­‐PCR’da reaksiyonun ilk basamağı olan ters
transkripsiyon aşamasında kullanılan primerler (oligo dT
veya random) poliadenillenmiş bölgeye bağlanırlar. Bu
nedenle RT-­‐PCR ile 3’-­‐ poly (A) kuyruğuna sahip
mRNA’ların çoğaltma işlemleri yapılabilir.
• Primer bağlanma yerlerinin genelde transkriptin tam
ucunda olmaması nedeniyle tüm RNA molekülünün tam
kopyasının çoğu kez elde edilememesi yöntemin zayıf
yönüdür. İşlem hacmi Northern blot’tan yüksek
mikroçiplerden düşüktür.
Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR
Revers transkriptaz enzimi ile RNA DNA’ya dönüştürülür.
Oligo dT
5’
Random primers (pdN6)
5’
3’
AAAAAAA
TTTTTTT
3’
NNNNNN
Gene-specific primer
NNNNNN
5’
3’
AGCGA
*Semi-­‐quantitative PCR
*Quantitative Real-­‐Time PCR e.g. TaqMan
AAAAAAA
AAAAAAA
Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR
RT Reaksiyonu;
1 µg total RNA
500ng primer (pdN6)
0.1 mM DTT
1mM dNTPs
1U RNase inhibitor
Nuclease free H2O
Toplam
1µl 1µl 1µl 2µl 1µl
13µl
19µl –80°C 4’ ısıt, snap on ice
+ 1µl 200U MMLV – superscript (Invitrogen)
25°C – 10’
42°C – 50’
95°C-­‐2’
1-­‐20µl into 50 µl typical PCR
Reverse transcription (RT)-­‐PCR
For rare messages –other RT enzymes available
e.g. ImProm (Promega)
RT ve PCR reaksiyonu aynı tüp içerisinde gerçekleştirilebilir.
(QIAGEN OneStep RT-­‐PCR Kit)
DNA Mikroarray (DNA Mikrodizin)
• cDNA array: 500-­‐5000 bç uzunluğunda probların cam
yüzeylere basılması ile üretilir.
•
Oligo
array:
20-­‐80
bç
uzunluğundaki
oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine
immobilize edilmesi veya doğrudan çip üzerinde
sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir.
Mikroarray
• İleri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için
geliştirilmiş bir tekniktir.
• Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde mikroçipler,
Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) veya değişik (örn: hastalıklı)
ve
normal
fizyolojik
koşullardaki
modifiye
gen
ekspresyonunun (mRNA’daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde
çalışılmasını sağlar.
• Mikroçip teknolojisi ile yaklaşık 1.8*1.8 cm ebatlarındaki bir
cam üzerinde (dizi veya array) birden fazla DNA bölgesini
(neredeyse tüm bir genomunu) tek bir seferde yüksek
hassasiyette incelemek mümkündür.
• DNA mikroçipleri aktif proteinlere çevrilebilen ya da
çevrilemeyen RNA’ların saptanmasında da kullanılabilir. Bu tip
analizler ekspresyon analizi ya da ekspresyon profili
belirleme şeklinde adlandırılır.
Mikroçip yönteminin kullanım amaçları iki
hedefe yönelik olarak uygulanmaktadır.
1. Gen ekspresyon düzeyinin ve düzey farklılıklarının
ölçülmesi:
2. Genom baz dizisinin ve genomlar arası dizi
farklılıklarının ortaya konması: Tek nükleotid
polimorfizmi (single nucleotide polymorphism) gibi
teknikler ile mutasyon analizleri yapılabilmektedir. Bu
amacı gerçekleştirmek için bir gende olabilecek tüm
farklı mutasyon ihtimalleri tek bir çip ü zerinde test
edilir. SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya
hastalığa
yatkınlığa
neden
olan
genler
saptanabilmektedir.
Avantajları
• Aynı anda binlerce hatta genomdaki tüm genlerin ekspresyon
düzeyleri incelenebilmektedir.
• Belli bir hücre türünün belirli bir ortam için gen ifadesi profili
belirlenip, bu profiller farklı hücre tipleri ve/veya farklı çevre
koşullarındaki gen ifadesi profilleriyle karşılaştırılabilirler.
• Bu işlemler için yüksek kararlılık ve verim elde edebilmek
amacıyla az miktarlarda DNA örneği yeterli olmaktadır.
• Mikroçip teknolojisi sayesinde, DNA üzerindeki tek baz
değişiklikleri bile saptanabilmekte, kısa sürede ve oldukça
pratik olarak birkaç bin genin analizini yapmak mümkün
olabilmektedir.
• Otomasyona dayalı bir sistem olduğu için insan kaynaklı
hataların ortaya çıkma ihtimali de oldukça düşüktür .
Dezavantajları
• Tüm deney düzeneği nükleik asit hibridizasyon yöntemine
bağlıdır ve yüksek oranda benzerlik gösteren DNA dizileri
problem yaratabilmektedir. Bu nedenle mikroçipten elde edilen
veriler klasik gen ekspresyon analiz yöntemleriyle
doğrulanmalıdır.
• Ayrıca tüm mikroçip deneylerinin aynı hassasiyette olmayışı,
ekspresyondaki küçük değişikliklerin analizde fark edilemeyecek
boyutta olması, birbirinden farklı çipler kullanılarak yapılan
deneylerin karşılaştırılmasında yaşanan zorluklar, optimizasyon
ve standardizasyon sorunları ve herhangi bir deneyden elde
edilen sonuçları her yönüyle değerlendirebilecek biyoinformatik
programların henüz tam geliştirilememiş olması karşılaşılan
sorunlardan birkaçıdır. Bu tür sorunları çözebilmek amacıyla
Microarray Gene Expression Data Society gibi bazı yeni kuruluşlar
oluşturulmaktadır.
• Microarray’lerin gen ekspresyonu için kullanımı ile
ilgili çalışmalar ilk kez 1995’de Science Dergisi’nde
yayınlanmıştır.
39
• Microarray ile tamamlanan ilk ökaryotik genom ise
Saccharomyces cerevisiae’ ninki olmuştur ve bununla
ilgili çalışma da yine Science Dergisi’nde, 1997 yılında
yayınlanmıştır.
Bitkilerde mikroçip teknolojisi ilk defa Arabidopsis’te
40
• Mikroçip
teknolojisinin
temeli
moleküler
hibridizasyondur. Bu teknikle hazırlanan bir gen
dizisinin (prob) araştırmak istenilen örnekte (DNA, RNA
veya protein) komplementerinin olup olmamasının
bulunması esasına dayanır.
41
Mikroarray Çalışma Tekniği
1. Hedef DNA/cDNA dizilerine tamamlayıcı diziler içeren
probların immobilize edildiği mikroarray platformunun
hazırlanması veya ticari olarak temin edilmesi.
2. İncelenecek numuneden floresan ile işaretlenmiş
cDNA/DNA/cRNA’nın hazırlanması.
3. İşaretlenmiş cDNA/DNA/cRNA ile mikroçip
platformunun hibridizasyon solüsyonu içerisinde
karşılaştırılması.
Mikroarray Çalışma Tekniği
4. Yıkama sonrasında platform yüzeyinde
hibridizasyonun varlığının tarayıcı veya okuyucu
aracılığıyla analiz edilmesi ve görüntünün bir
bilgisayarda depolanması.
5. Depolanan görüntünün bir yazılım aracılığıyla
değerlendirilmesi ile mikroçip platformu üzerindeki
hangi noktalarda hibridizasyon olup olmadığının ve
niceliksel olarak düzeyinin (koyu mavi-­‐yeşil-­‐sarı-­‐
kırmızı renk yelpazesinde) değerlendirilmesi ve
yorumlanması.
• İncelenecek örnek (kan, beyin omurilik sıvısı, tümör gibi
değişik dokulardan elde edilen DNA veya RNA
molekülleri) floresans veya radyoaktif olarak
işaretlendikten sonra amaca uygun çipler ile
hibridizasyona bırakılır.
45
• Sinyallerin büyüklüğü ve lokalizasyonu bilgisayar
yardımı ile değerlendirilerek sonuca gidilir.
46
Mikroçipler; hastalıklı ve normal bir hücrede gen
ekspresyonunun karşılaştırılması suretiyle hastalık ile
alakalı genlerin belirlenmesinde kullanılabilmektedir.
47
Download

MBKY II-3 RNA Çalışmaları