ilaç uygulanan domuzların postmortem organ ve kemiklerinde ilaç
advertisement
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ADLİ TIP ANABİLİM DALI İLAÇ UYGULANAN DOMUZLARIN POSTMORTEM ORGAN VE KEMİKLERİNDE İLAÇ DAĞILIMININ BELİRLENMESİ İsmail Ethem GÖREN ADLİ TIP TEZLİ YÜKSEK LİSANS PROGRAMI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Mete Korkut GÜLMEN ADANA - 2015 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ADLİ TIP ANABİLİM DALI İLAÇ UYGULANAN DOMUZLARIN POSTMORTEM ORGAN VE KEMİKLERİNDE İLAÇ DAĞILIMININ BELİRLENMESİ İsmail Ethem GÖREN ADLİ TIP TEZLİ YÜKSEK LİSANS PROGRAMI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Mete Korkut GÜLMEN Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından TF2013YL14 Nolu proje ile desteklenmiştir. ADANA-2015 KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR VE DESTEKLEYEN KURULUŞLAR Tez çalışmamda bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, tez danışmanlarım Sayın Prof. Dr. Mete Korkut GÜLMEN’eve Sayın Doç. Dr. Nebile DAĞLIOĞLU’na, Anabilim dalı hocalarım Sayın Prof. Dr. Ahmet HİLAL, Sayın Prof. Dr. Necmi ÇEKİN ve Sayın Prof. Dr. Benhan ALPER’e, Laboratuvar çalışmalarında desteğini esirgemeyen Sayın Pınar EFEOĞLU’na, Deneysel uygulamalarda önemli katkıları bulunan Sayın Doç. Dr. Yusuf Kenan DAĞLIOĞLU’na ve ÇÜTF-DETAUM çalışanlarına, TF2013YL14 no’lu Yüksek Lisans Tez Araştırma Fonu ile tezin gerçekleştirilmesinde katkıda bulunan Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu’na teşekkür ederim. Saygılarımla İsmail Ethem GÖREN iii İÇİNDEKİLER Sayfa No KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR VE DESTEKLEYEN KURULUŞLAR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi TABLOLAR DİZİNİ vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ viii ÖZET ix ABSTRACT x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Adli Bilimlerin Tarihçesi ve Gelişimi 3 2.2. Adli Toksikoloji 4 2.2.1. Postmortem Toksikoloji 6 2.2.2. Postmortem Toksikoloji Örnekleri 6 2.3. Farmakoloji 8 2.3.1. Farmakodinamik 8 2.3.2. Farmakokinetik 9 2.3.2.1. İlaçların Absorpsiyonu 9 2.3.2.2. İlaçların Dağılımı 12 2.3.2.2.1. Postmortem Redistribüsyon (Yeniden Dağılım) 14 2.3.2.3. İlaçların Biyotransformasyonu 14 2.3.2.4. İlaçların İtrahı (Atılımı) 15 2.4. Kemik Anatomisi 17 2.5. Kemikte İlaç Dağılımı 19 2.6. Kemikten İlaç İzolasyonunun Teknikleri 21 2.6.1. Pasif Solvent Ekstraksiyonu (PSE) 22 2.6.2. Microwave-Assisted Ekstraksiyon (MAE) 22 iv 2.6.3. Ultrasonik Solvent Ekstraksiyonu (USE) 3. GEREÇ VE YÖNTEM 23 25 3.1. Hayvan Modeli 25 3.2. Deneysel Çalışma Yeri 26 3.3. Değerlendirilen İlaçlar 27 3.4. Alınan Örnekler, Toplanması ve Saklama Koşulları 28 3.5. Toksikolojik Analiz 29 3.5.1. Deneylerde kullanılan malzemeler 29 3.5.1.1. Kullanılan kimyasal maddeler 29 3.5.1.2. Kullanılan araç ve gereçler 29 3.5.2. Örneklerin Hazırlaması ve Ekstraksiyon Aşaması 30 3.5.2.1. Kan Örneğinin Hazırlanması 30 3.5.2.2. Organ Örneklerinin Hazırlanması 31 3.5.2.3. Kemik Örneklerinin Ekstraksiyonu 32 3.5.3. LC-MS/MS Çalışma Şartları 34 3.5.4. Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması 36 4. BULGULAR 38 5. TARTIŞMA 47 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 51 7. KAYNAKLAR 53 8. ÖZGEÇMİŞ 62 v ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 2.1. Kemik dokusunun enine kesiti. Şekil 3.1. Cesetlerin gömülme işlemi. Şekil 3.2. Kan için ekstraksiyon algoritması. Şekil 3.3. Organlar için ekstraksiyon algoritması Şekil 3.4. Kemik için ekstraksiyon algoritması Şekil 3.5. Kanda amitriptyline analizi için oluşturulan kalibrasyon eğrisi. Şekil 3.6. Kemik dokusunda atenolol analizi için oluşturulan kalibrasyon eğrisi. Şekil 4.1. Sakrifiye işleminden sonra toplanan ilk periferal kandaki ilaç konsantrasyoları (ng/ml). Şekil 4.2. 3. grup, postmortem 72. saatte toplanan karaciğer örneğinde saptanan pheniramine ve venlafaxine’nin kromatogramı. Şekil 4.3. Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında tramadol, ketamine, escitalopram ve diazepam’ın dağılım grafiği (ng/g). Şekil 4.4. Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında atenolol, imipramine, sertraline ve venlafaxine’nin dağılım grafiği (ng/g). Şekil 4.5. Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında amitriptyline, pheniramine ve diclofenac’ın dağılım grafiği (ng/g). Şekil 4.6. Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda morphine, amitriptyline, escitalopram ve diazepamın dağılım düzeyi (ng/g). Şekil 4.7. Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda sertraline, pherimanine, venlafaxine ve atenolol’ün dağılım düzeyi (ng/g). Şekil 4.8. Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda ketamine ve tramadol’ün dağılım düzeyi (ng/g). Şekil 4.9. Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre ketamine düzeyleri (ng/g). Şekil 4.10. Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre atenolol düzeyleri (ng/g). Şekil 4.11. Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre venlafaxine düzeyleri (ng/g). Şekil 4.12. Taze kemik örneklerinindeki ilaç konsantrayonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). Şekil 4.13. 5. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç konsantrasyonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). Şekil 4.14. 10. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç düzeylerinin ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). Şekil 4.15. Taze, 5. ve 10. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç konsantrayonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). vi 18 26 31 32 33 37 37 3638 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 44 45 45 46 TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No Tablo 3.1.İlaçlar, toksik konsantrasyonları ve dozları. 27 Tablo 3.2.LC-MS/MS analiz gradient programı. 34 Tablo 3.3.Seçilen ilaçların analizi için oluşturulan LC-MS/MS cihazının MRM parametreleri. 35 Tablo 4.1.Postmortem karaciğerde belirtilen zaman aralıklarında ölçülen ilaç konsantrasyonları (µg/g). vii 39 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CE Collision Energy CXP Collision Exit Potential DP Declustering Potential ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EP Entrance Potential g Gram GI Sindirim Sistemi Kg Kilogram L Litre LC-MS/MS Likit Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresi MAE Microwave-Assisted Ekstraksiyon µg Mikrogram ng Nanogram ml Mililitre N Normal pH Ortamdaki hidrojen konsantrasyonunun negatif logaritması pKa Asidik iyonlaşma sabitesinin negatif logaritması PSE Pasif Solvent Ekstraksiyonu SPE Solid Phase Extraction (Katı Faz Ekstraksiyonu) USE Ultrasonik Solvent Ekstraksiyonu viii ÖZET İlaç Uygulanan Domuzların Postmortem Organ ve Kemiklerinde İlaç Dağılımının Belirlenmesi Adli toksikolojik analizler, ölümün nedenini ve mekanizmasını belirlemede kullanılan en önemli araçlardan bir tanesidir. Zehirlenmelere bağlı ölüm olgularında geleneksel olarak kan ve idrar gibi vücut sıvıları incelenmektedir. Fakat ölümden belirli bir süre geçtikten sonra otoliz/putrefikasyon nedeniyle çürüyen ve iskeletleşmiş cesetlerde, bu örnekler analiz için uygun değildir. Böyle durumlarda, yapısal bütünlüğünü korumuş olmak kaydıyla, visseral doku ve kemik örnekleri, toksik madde ve ilaç zehirlenmesi olgularının toksikolojik analizinde alternatif birer örnek olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, farklı sınıflardan oluşturulan ilaç gruplarının domuzlara uygulanarak, domuzlardan çürümüş-kokuşmuş halde örneklendirilen visseral dokularda ve gömülü halde örneklendirilen kemiklerde miktarsal tayin yapılması ve çürüme ve gömülmenin, elde edilen organ ve kemiklerde biriken ilaç düzeyi üzerindeki etkisinin saptanması amaçlanmıştır. Biri kontrol olmak üzere (n=4+1) her bir domuza farklı sınıflardan oluşturulan ilaç grupları; katılar gastrointestinal ve sıvılar intravenöz yolla olmak üzere toksik dozda uygulandı. Domuzlar, propofol verilerek sakrifiye edildi ve hemen taze periferal kan, organ ve kemik örnekleri alındı. Çürümenin 24., 48., 72. ve 96. saatlerinde organ örnekleri alındıktan sonra toprak altınagömülen cesetten, gömülmenin onuncu ayına kadar belirli aralıklarla feth-i kabir işlemi yapılarak kemik örnekleri alındı. Örnekler, uygun yöntemlerle analize hazır hale getirildikten sonra LC-MS/MS cihazı ile analiz edildi. Elde edilen bulgular gösterdi ki, postmortem redistribüsyon gibi henüz tam olarak açıklanamayan ve toprak altında cesedin maruz kaldığı bilinmeyen mekanizmalar nedeniyle dekompoze ve gömülü cesetlerden farklı zaman aralıklarında toplanan organ ve kemik dokularındaki ilaç düzeyleri değişkenlik arz etmektedir ve kanın uygun olmadığı koşullarda toplanan bu örnekler kandaki ilaç konsantrasyonlarını öngörmek için kullanışlı değildir. Anahtar Sözcükler: Adli Toksikoloji, Postmortem, Kemik, İlaç, Feth-i kabir ix ABSTRACT Determination of Drug Distribution in Postmortem Tissues and Bones of Pigs Administered Drugs Forensic toxicological analysis is one of most important tools in elucidating manner and cause of death. Traditionally, body fluids such as blood and urine are investigated in cases of intoxication and poisoning-related deaths. However, their samples are often no longer available for toxicological analysis in skeletonized and decomposed corpse due to autolysis/putrification after the burial time and a certain period from death time. In such cases, bones and visceral tissues that preserve structural integrity might be useful as alternative samples for toxicological analysis of toxic and drug poisoning cases. In this study, by administering drug groups selected from various drug classes to domestic pigs, we aimed to make quantification of drugs in putrefieddecomposed visceral tissues and in buried bones and determine the effect of burial on levels and distribution of drugs in tissues and skeletal tissues. Drug groups at toxic dose level to each pig including negative control (n=4+1) were administrated respectively from pills (capsules and tablets) by gastrointestinal and from solutions by intravenous administration. Peripheral blood, organ and bone samples was collected from pigs sacrificed by administering propofol at overdose drug level to pigs after 4 hour in order to allow for distribution and absorption of drugs. After organ samples were collected at postmortem 24th, 48th, 72nd and 96th hours, bone samples from corpses buried below soil ground at 5th and 10th months of the burial time by making exhumation. All samples were analyzed using LC-MS/MS after making sample preparation using appropriate methods. These data indicate that drug levels in organ and bone samples collected from decomposed and burial corpses at different time intervals vary because of unknown mechanisms exposed of the corpse below ground and completely yet unexplained such as postmortem redistribution and these samples collected under conditions in which blood is not appropriate for forensic toxicological analysis is not uniformly useful for predicting blood concentration of drugs. Key words: Forensic Toxicology, Postmortem, Bone, Drug, Exhumation x 1. GİRİŞ Adli toksikoloji, zehirlenme olgularıyla ilgili hukuksal problemlerin çözümüne katkıda bulunan adli bilimlerin bir dalıdır. Uygulamalarında, analitik metotlarla ileri enstrümantal cihazlar kullanarak klinik ya da adli olgulardan postmortem veya antemortem olarak alınan biyolojik örneklerde toksik maddelerin saptamasına ve nedenetki arasındaki ilişkilerinin belirlenmesine yönelik çalışır1,2. Kaza, suiistimal, intihar veya suikast orijinli zehirlenme olguları, adli olarak kabul edilip, ölüm nedeninin ve mekanizmalarının ortaya konması gerekmektedir. Birçok etkenin sebep olabileceği zehirlenmelerin önemli bir kısmı, ilaç zehirlenmeleridir ve bu zehirlenmeler, önemli bir mortalite oranına sahiptir3. Bu tür olgularda otopsi işlemi yapılması gereklidir. Postmortem toksikolojik analizlerde genellikle zehirlenme ile ilişkilendirilen ana ilaç ya da farmakolojik aktif metabolitinin varlığını ve miktarını belirlemek için kan, idrar, vitröz humor gibi biyolojik materyaller tercih edilmektedir1,4. Fakat postmortem intervale bağlı olarak otoliz/putrefikasyon nedeniyle bu vücut sıvıları ana ilaç veya farmakolojik aktif metabolitinin analizi için uygun olmamaktadır. Dokular da yine çürümenin belirli bir evresine kadar örneklendirilebilir ve elde edilen örnekler ilacın varlığını saptamaya izin verebilir5. Çürümenin ilerleyen dönemlerinde bulunan ve otopsisi yapılmadan gömülen cesetlerin toksikolojik incelemesinde kıl ve tırnak gibi keratinik matrisler de örnek olarak kullanılabilmektedir6,7. Fakat gömülen cesetlerde kıl ve tırnağın keratinik yapıda olması nedeniyle mikrobiyolojik ataklara direnç gösterememesi, bu örneklerin toplanmasını mümkün kılmamaktadır8,9. Gömülen cesetlerde ilacın varlığını ve miktarını tanımlayabilmek için en uygun materyal, çok uzun zaman aralıklarına kadar yapısal bütünlük ve ilaç stabilizasyonu sağlayabilen kemik dokularıdır10. Gömülen bir cesette kemik dokularının örneklenmesi için feth-i kabir otopsisi yapılmalıdır. Feth-i kabir, postmortem inceleme için cesedin mezardan çıkarılması işlemidir11,12. Gerekli işlemlerden geçirilmeden defnedilmiş cesetler; yanlış kimliklendirme, ölüm sebebi hakkında yeni bilgilerin elde edilmesi, ölüm sebebi hakkında bazı iddiaların ortaya atılması ve ailenin isteği gibi sebeplerle mezardan çıkarılabilir13,14. Ülkemizde, Ceza Muhakemesi Kanunu’na15 göre; mahkeme veya savcılık kararları sonucunda başlatılan adli tahkikat ile feth-i kabir otopsisi yapılan 1 olgular mevcuttur16-19. Bu olgulardan intoksikasyon şüphesi bulunanların ölüm nedeninin belirlenmesinde ciddi zorluklar ve çıkmazlar yaşanmaktadır. Literatürde farklı ilaçların farklı kemik tiplerinde dağılım düzeyleri araştırılmışsa da henüz bu konu tam olarak anlaşılamamıştır. İskelet dokularında farmakolojik ya da yasal olmayan ilaçların konsantrasyonunu yorumlamak sınırlı referans seviyesi nedeniyle tartışmaya açıktır. Bu alanda yapılacak kapsamlı araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, insanların farmakolojik analoğu olarak tanımlanan domuzlara5 uygulanmak üzere sekiz sınıfa ait on dört adet ilaç, gruplandırılarak seçilmiştir. Bu seçim, bize çoklu ilaç intoksikasyonu sunmaktadır. Çalışmanın temel amacı, adli toksikolojik analizlerde kullanılan geleneksel örneklerin analiz için uygun olmadığı çürümenin ve gömülmenin belirli evrelerinde örneklendirilen organ ve kemik dokularında ilaç düzeyinin belirlenebilirliğinin ortaya konmasının yanı sıra, elde edilen verilere göre çürümenin ve gömülmenin, doku ve kemik örneklerindeki ilaç düzeyine etkisinin saptanmasıdır. 2 2. GENEL BİLGİ 2.1. Adli Bilimlerin Tarihçesi ve Gelişimi Adli bilimler, hukuki sorunların çözümü için çeşitli bilimsel disiplinlere ait bilgi ve metodoloji uygulamalarını temsil eder20,21. Tarihsel gelişimi incelenecek olursa, başlangıçta “adli tıp” ya da “adli bilimler” gibi kavramların varlığı hiç kuşkusuz söz konusu değildi. Adli tıbba ait ilk gelişmeler Eski Mısır, Babil, Roma, Çin, İran, Yunanistan ve Mezopotamya uygarlıklarında başladığı ve gelişerek bugüne kadar geldiği kabul edilmektedir. Orta çağdan itibaren özellikle Avrupa’da adli tıbbı ilgilendiren önemli hukuksal düzenlemeler yapıldığı görülmektedir. 19. yüzyılın sonlarından itibaren bilim, teknoloji ve hukuk alanındaki gelişmelerle birlikte modern adli bilimlerin temelleri atılarak ayrı bir bilim haline gelmiş ve Avrupa ve Amerika’da adli bilimler ile ilgili birçok kuruluş ve organizasyonun ortaya çıkmasına yol açılmıştır. Bilim ve teknolojinin gelişimiyle beraber, hukuk problemlerinin farklı ve ayrıntılı bir biçimde çözülmesi ve bu problemlerin çözümünde günümüzdeki mevcut uzmanlıkların yeterli olmaması, adli bilimlerin alt dallara ayrılma gerekliliğini doğurmuştur. Bugün adli bilimler şemsiyesi altında, adli toksikoloji, patoloji, hemogenetik, klinik adli tıp, psikiyatri, psikoloji, mühendislik, odontoloji, entomoloji, antropoloji, arkeoloji, palinoloji gibi pek çok uzmanlık alanı mevcut olup, adli bilimler temelinde hukuka yardımcı olmaktadırlar20-22. Adli bilim uzmanlarının rutin uygulamalarında en çok karşılaşılan sorun, adli ölümlerin nedeninin ve mekanizmasının aydınlatılmasıdır. Bu noktada, yapılan otopsiler, en sık başvurulan uygulamalardır. Fakat otopsi uygulanarak ölümün nedeninin ve mekanizmasının aydınlatılması her zaman olanaklı değildir. Bilhassa patolojik bulgulara rastlanmayan ani-beklenmedik şüpheli ölüm olguları, çözümsüz kalarak ciddi sorun oluşturmaktadır. Bu konudaki doğru karar adli tıp hekimi ve adli toksikoloğun ortak çabası ile ortaya çıkabilir. Bir ölüm sebebi olarak zehirlenme, cesetten alınacak materyalde toksik madde gösterilmeksizin ortaya konamaz. İlaç ve zehirlerin birçoğu, vücutta karakteristik değişimlere yol açmadığından, toksik incelemeden kaçınıldığında ya ölüm sağlam bir kanıt olmaksızın zehirlenmeye bağlanır, ya da zehirlenme kaynaklı bir ölüm başka bir sebebe bağlanır. Ölümün doğrudan 3 zehirlenmeye bağlı olmadığı birçok durumda bile adli toksikoloji adalete çok kıymetli bulgular sunabilir: Trafik kazası kurbanlarında alkolün varlığı, zorlamalı bazı ölümlerde psikoaktif ilaçların mevcudiyeti, saldırgan ve tutarsız davranan kişilerde alkol, narkotik ilaçlar, halusinojenlerin gösterilmesi kıymetlidir. Bunun aksine, bazı olgularda toksikoloji sonuçlarının negatif çıkması da ölen kişi hakkındaki bazı iddiaların çürütülmesine yarayabilir. Benzer biçimde, ilaçlarını düzenli alması gereken bazı hastalarda, örneğin epilepsi hastalarında, kanda olması gereken ilaç konsantrasyonunun bulunmayışı, kişinin bir nöbet geçirerek öldüğü varsayımını güçlendirebilir23. 2.2. Adli Toksikoloji Toksikoloji, sözlük anlamı ile “toksik madde-zehir bilimi” demektir. Toksik maddelerin kaynaklarını, fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini, biyotransformasyon ve akümülasyonularını, etki mekanizmalarını, letal ve toksik dozlarını, nicel, nitel ve risk analizlerini, standardizasyonunu, izolasyonunu ve zehirlenmelerin tedavilerini uğraş alanı içerisine alan bilim dalıdır24. Adli toksikoloji, zehirlenme olgularında maruz kalınan kimyasal maddenin nedenetki arasındaki ilişkilerini saptayan ve bu olgularda hukuka yardımcı olan adli bilimlerin bir dalıdır. Bu konuda sorumlu ve uzman kişi adli toksikologdur. Adli toksikolog’un en önemli görevi, otopsiden alınan biyolojik materyalde ilaç veya toksik maddelerin kalitatif ve kantitatif analizini yapmak ve analitik bulgular sonucunda teşhis edilen kimyasal maddenin neden-etki arasındaki ilişkileri saptayarak ölüm nedeni olup olmayacağı yorumunu yapmaktır1,23,24. Toksik madde biliminin çalışmaları 18. yüzyılın başında başlamasına rağmen, zehir ve zehirlenme kavramlarından tarih boyunca söz edilmiştir. Örneğin, Antik Mısır ve Grek yazıtlarında besin ve bitkinin neden olduğu zehirlenmeler rapor edilmiştir. Grekler, devlet destekli idamda baldıran zehrini kullanmışlardır. Sokrates’in idamı, bunun en ünlü örneğidir. Orta çağ boyunca Avrupa’da opiyum, arsenik ve hidrojensiyanit zehirlenmeleri rapor edilmiştir. Bu devirde yaşayan Paracelsus (1493 1541), her maddenin birer zehir olduğunu, ilaçla zehiri ayıranın doz farkı olduğunu belirtmiştir. 4 1814’de Fransa’da Sorbon Üniversitesi adli tıp başkanı, M.J.B. Orfilla, zehirleri sistematize ve kategorize etmiştir. Traité des Poisons ou Toxicologie Generale adlı kitabında zehirleri ve toksik etkilerini sekiz sınıfa ayırmıştır. Ayrıca, postmortem örneklerden arseniği izole etmiş, absorbe edilen ya da kana giriş yapmış olan zehrin toksik etkilerini ortaya koymuştur. Orfilla ile adli toksikolojinin temelleri atılmış ve ölümle sonuçlanan intoksikasyon olaylarında kimyasal analizin yasal bir delil olarak sunma gerekliliği belirtilmiştir. 1851’de Jean Servais Stas, biyolojik örneklerden alkadoidlerin ekstraksiyonu için etkili bir metot geliştirmiştir. Bu metot, özellikle postmortem örneklerde nikotinin saptanmasında kullanılmıştır. Daha sonra F.J. Otta tarafından yapılan birkaç modifikasyondan sonra bu metod, Stas-Otta metodu olarak anılmış ve bugüne kadar gelmiştir. Amerika’da adli toksikoloji ile ilgili ilk çalışmalar Cornell Üniversitesi Tıp Fakültesi Kimya Profesörü Rudelph A. Witthaus tarafından yapılmış ve ABD’de meşhur morfinle zehirlenme olgularında analizler yaparak bu yeni bilime dikkat çekmiştir. 1918 yılında New York’ ta kurulan medical examiner ofisi içerisinde yer alan toksikoloji laboratuvarı Amerika’nın ilk adli toksikoloğu olan Alexander Gettler tarafından 41 yıl yönetilmiş ve ülkedeki ilk adli toksikolog jenerasyonunun eğitimini üstlenmiştir. 1949 yılında Amerikan Adli Bilimler Akademisi, adli bilimlerin her dalına destek vermek ve geliştirmek amacıyla kurulmuştur. Daha sonra adli toksikologların oluşturduğu birçok ulusal ve uluslararası organizasyonlar, örneğin 1960’da, The International Association of Forensic Toxicologists (Uluslararası Adli Toksikologlar Birliği) kurulmuştur. Bugün bu birliğin bin dörtyüzün üzerinde üyesi bulunmaktadır. Türkiye’de adli toksikoloji yönündeki incelemeler ve bilimsel araştırmalar, Adli Tıp Kurumu Kimya İhtisas Daire Başkanlıkları ve üniversite bünyelerinde yer alan adli toksikologlar tarafından yapılmaktadır. Adli toksikoloji araştırmaları üç alana ayrılmaktadır. 1. Postmortem toksikoloji: İntoksikasyon ölümlerinde herhangi bir kimyasal maddenin ölüme sebebiyet verip vermediğinin veya katkıda bulunup bulunmadığının ortaya konmasıdır. 5 2. İnsan performans testleri: Sürücülerin alkol ve psikoaktif ilaçların, sporcuların da doping ilaçlarının etkisinde olup olmadığının saptanması amaçlanır. Davranışsal toksikoloji olarak da isimlendirilebilir. 3. Adli ilaç testleri: Yasal olmayan uyutucu, uyuşturucu ve uyarıcı ilaçların analizlerini kapsamaktadır1,25-28. 2.2.1. Postmortem Toksikoloji Adli toksikolojik olguların birçoğu, zehirlenme ölümlerinin araştırılmasıdır. Postmortem toksikoloji, alkol, ilaç veya diğer toksik maddelerin ölüme sebep olup olmadığının ya da ölüme katkıda bulunup bulunmadığının saptanmasında kullanılır 26. Ani beklenmedik, ölüm olgularında, araştırmacılar sık sık otopsi materyalinde şüphelenilen bileşiğin var olup olmadığının kanıtlarına ihtiyaç duyarlar. Öncelikle adli toksikolog, örnekte şüphelenilen bileşiğin var olup olmadığını saptamak için ön izleme testi uygular. Bu test sonucunda pozitif sonuçlu numunelere doğrulama testi uygulandıktan sonra kantitasyon işlemi ile örnekteki madde miktarı saptanır. Bu işlem, söz konusu olgunun maruz kaldığı ilaç veya toksik maddenin dozunu (terapötik, toksik, letal vs.) belirlemede büyük önem taşır27,29. 2.2.2. Postmortem Toksikoloji Örnekleri Postmortem toksikolojik analiz için otopside toplanan konvansiyonel örnekler, kan, idrar, vitröz humor, gastrik içerik, safra gibi sıvı örneklerin yanısıra karaciğer, böbrek ve dalak gibi organlardır. Analiz için incelenen ilk örneklerden bir tanesi kandır. Kan örneklemesi, genellikle bir şırınga ve büyük ölçekli bir iğne yardımıyla yapılır. Kan örneği otopsiye başlamadan önce femoral veya jugular venlerden ve kalpten alınır. Kalp kanı alınırken sağ ve sol taraftan alınmalıdır 1,2. Hızlıca metabolize olan bir takım toksik maddeler, idrarda kanda olduğundan daha yüksek miktar saptanabilir. Bu yüzden postmortem idrar örneği alınırken dikkat edilecek en önemli husus alınabilen tüm idrarın alınmasıdır. İlaç, alımından günler sonra idrarda bulunabilir. Renk testleri ve immunoassay analizlerinde örnek hazırlama işlemi yapmaksızın hızlıca çalışılabilir. 6 Kana ek olarak tüm postmortem olgularda vitröz sıvısı toplanmalıdır. Anatomik olarak izole bir yerde bulunur ve iyi bir stabiliteye sahiptir. Diğer örneklere göre kokuşmadan en az etkilenir. Özellikle etanol analizinde postmortem kan etanol konsantrasyonunu yorumlamada oldukça kullanışlıdır. Safra, kompleks ve analiz için değerli bir sıvıdır. İdrar olmadığında analiz için kullanışlıdır. Safra kesesinden elde edilir. Çünkü narkotikler ve benzodiazepinler gibi belli ilaçlar safrada daha yoğun halde bulunabilir. Bu yüzden tüm uygun olgularda safra toplanmalıdır. Gastrik içerik, gastrointestinal yolla alınan ilaç veya toksik maddelerin analizinde kullanılabilir. Homojen olmadığı için tüm içerik alınıp analiz edilmelidir. Karaciğer,ilaç metabolizasyonunu sağlayan enzimlerin çoğunun bulunduğu ve ana metabolizasyon bölgesi olduğu için ilaçlar ve metabolitlerinin konsantrasyonu, karaciğerde kandan daha yüksek miktarda bulunmaktadır. Doz yorumlaması ve kaybı yaşanan olgularda analizin doğru yorumlanması için kullanılacak ilk örnek karaciğerdir. Örneklendirilirken sağ lobun iç kısımlarından örnekleme yapılmalıdır. İnce barsaktan ilaç difüzyonu olabileceğinden sağ lobtan derin doku alınması önerilir2. Beyin, merkezi sinir dokularında biriken halojenik hidrokarbonlar, antidepresanlar ve narkotikler gibi lipofilik maddelerin ilk hareket yeri olduğu için ilaç ölçümlerinde kullanışlı bir materyaldir. Akciğer,uçucu madde analizlerinde kullanışlıdır. Kalp ve dalak,postmortem redistribüsyon araştırmalarında diğer organlarla birlikte örneklendirilmektedirler.İleri derecede çürümüş ve iskeletleşmiş cesetlerde yukarıda bahsedilen dokular, putrefikasyon ve otoliz sebebiyle çürümenin belirli bir evresinden sonra örneklendirilmeleri, analiz için uygun değildir29-32. Kıl ve tırnak, adli toksikolojik analizlerde uzun süredir kullanılan keratinik yapıda alternatif birer materyaldir. Keratinik matrislerde biriken belirli ilaçlar belirli bir süreye kadar ilaç stabilizasyonu sağlayabilirler. Maruziyetten uzun süre sonra ilaç veya toksik maddeyi akümüle ederek retrospektif deteksiyon penceresi sunar. Tekrarlı ve kronik ilaç kullanımı veya tek seferlik toksik madde maruziyetini aydınlatmada kullanışlıdır. Antidepresanlar, opiyatlar, kannabinoidler ve halisünojenler gibi ilaçların kıl ve tırnakta saptandığı çalışmalar mevcuttur1,29-34. Keratinik matrisler, spesifik mikrobiyolojik ataklara oldukça dirençsiz olduğu için belirli bir süre sonra gömülen cesetlerden örneklendirilmeleri mümkün değildir 8,9. 7 Dokularda biriken ilaç ya da toksik maddenin tanımlanabilmesi için ceset üzerindeki leş yiyen böcekler ve larvalar da örneklendirilebilir. Bununla ilgili özellikle morfin, eroin, kokain, opiatlar, barbituratlar, clomipramine, amitriptyline, diazepam, methadon, metamphetamine, malathion gibi ilaçların saptanmasına yönelik çalışmalar yapılmıştır. Larvalar ilacı hızlıca elimine ettiği için örneklendirmeden hemen sonra analizi yapılmalıdır35. Gömülü halde iskeletleşmiş cesetlerin ölüm nedenini ve yöntemini tanımlayabilmek amacıyla yapılan adli toksikolojik analizler için elde edilebilen en uygun materyal, çok uzun periyotlara kadar ilaç stabilizasyonu ve yapısal bütünlük sağlayan kemik dokularıdır10. 2.3. Farmakoloji Farmakoloji, sözlük anlamı ile ilaç bilimi demektir. İlaç ile biyolojik sistemlerin etkileşmesinin incelenmesi, farmakolojinin uğraş alanını oluşturur. Farmakolojinin ana konusunu oluşturan ilaç, geniş anlamlı bir terimdir. İlaç, bir anlamıyla, tıpta kullanılan ve biyolojik etkinliği olan (biyoaktif) saf bir kimyasal maddeyi ya da ona eşdeğer olan bitkisel veya hayvansal kaynaklı, standart miktarda aktif madde içeren bir karışımı ifade eder. İlaçlar oral yolla veya intravenöz, intramuskular, subkütan, lokal, inhalasyon ve sublingual gibi non-gastrointestinal yolla parenteral olarak uygulanabilir. Vücut ile ilacın müşterek etkileşimi, farmakolojide iki sınıfta incelenir: farmakodinamik ve farmakokinetik. Adli toksikologlar, ilacın toksisitesini değerlendirmek ve olgu üzerinde güvenilir sonuç vermek için yaşayan insanlar ve onların biyotransformasyonları ile ilaç etkileşimleri hakkında bilgi sahibi olmalıdırlar33,36-38. 2.3.1. Farmakodinamik Farmakodinamik, ilacın vücuttaki aksiyon mekanizması, medikal kullanımı ve yan etkileriyle ilgilenir. Bazı ilaçlar, belirli taşıma prosesi ve enzimler için inhibitor görevi görürken birçok ilaç, hormonlar ve nörotransmitterler gibi endojen kimyasallara normal olarak yanıt veren reseptörlerin inaktivasyonu ya da aktivasyonuyla etkilerini ortaya çıkarırlar36. 8 2.3.2. Farmakokinetik Farmakokinetik, ilacın vücuttaki absorpsiyonu, dağılımı, metabolizması ve atılımı ile ilgilenir. İlaçların belirli bir organı veya dokuyu etkileyebilmeleri için o etki yerine belirli bir konsantrasyon eşiğini aşacak miktarda ulaşmaları gerekir. Etki yerine ulaşımın ilk kademesini ilacın, vücutta uyguladığı yerden absorpsiyonu yani emilmesi, ikinci kademesini ise ilacın dolaşan kandan dokulara dağılımı oluşturur33,36. 2.3.2.1. İlaçların Absorpsiyonu İlacın uygulandıkları yerlerden kan dolaşımına geçmesine absorpsiyon veya emilim denir. İlaçlar, canlı organizmaya başlıca deri, akciğer, gastrointestinal sistem ve enjeksiyonyolları ile girerler. İlaçların absorpsiyon hızları giriş yollarına göre farklılık göstermektedir. Aynı maddenin çeşitli yollardan absorpsiyonu sonucu oluşan toksik etki intravenöz, inhalasyon, intraperitonal, subkutan, intramuskular, intradermal, oral ve cilt yolu sırasında olmak üzere azalır. Bu yollardan giren ilaçların etkilerini göstermesi için birçok biyolojik membranları geçerek dolaşım sistemine ve oradan da etki yerlerine taşınmaları gerekmektedir. Bu nedenle giriş yollarına bağlı olarak aynı madeninin toksistesi farklılık göstermektedir. Bu membranlar, deri hücrelerinde olduğu gibi birçok hücrelerden oluşan kalın bir tabakayı, akciğer ve gastrointestinal yolda görüldüğü gibi ince bir hücre tabakasını veya canlı ve cansız protoplazmayı içerir. Membranların yapısının, protein tabakası ile sıkı sıkıya bağlanmış bimoleküler lipit tabakalarından oluştuğu gözlenmiştir. Biyolojik membranlardaki lipitlerin başlıcası fosfolipitler ve kolesteroldür, daha az miktarda da sfingolidler vardır. İlaçların organizmadaki biyolojik etkileri sadece maddenin toksik özellikleri ile ilgili değildir. Sayısız faktörler toksik etkinin şiddeti, cevabın süresi üzerinde etkilidir. Giriş yollarına göre ilacın absorpsiyonu değişik dokulardan olmaktadır. Örneğin, gastrointestinal absorpsiyonda ilaç, intestinal lümenden epitel hücrelerine geçer. İntrasellüler (hücre içi) taşınma ile basement mebranını ve propriayı geçerek kan ve lenf kapilerlerine girer. Buradan da etki yerine taşınır. İlaç, burada kapilerden önce etkileşim alanına (interstisyel alan) taşınır. Çeşitli mebranları geçerek etki yeri olan spesifik 9 reseptör enzim veya sinir membranı ile reaksiyona girer. Sonuçta beklenen etki gözlenir. Biyolojik etkinin şiddeti ve niteliği herşeyden önce etki yerindeki miktarı ile ilişkilidir (doz-cevap ilişkisi). Ancak absorpsiyon hızı ve miktarını etkileyen, organizmadaki dağılımı, metabolizma (biyotransformasyon hızı), atılım hızı, pKa değeri, bulunduğu bölgenin pH değeri ve mide asitlerindeki stabilitesi gibi birçok faktör vardır. Büyük moleküllü ilaçların absorpsiyon hızı genellikle küçük moleküllü olanlardan daha yavaştır. Ancak bazen ufak moleküllü ilaçlar, yapımları sırasında etki sürelerini uzatmak için inert maddelerle birleştirilerek absorpsiyonları yavaşlatılır. İlacın hücre membranının lipid ortamında çözünme eğiliminin ölçüsü: (lipid/su) partisyon katsayısıdır. Bu katsayı ne kadar büyükse hücre membranından absorpsiyon hızı o kadar fazladır. Ortamın pH’ına bağlı değişebilir. İlaçların sulu ortamdaki noniyonize (iyonize olmamış) fraksiyonları lipofiliktir. Asidik ilaçlar asidik ortamda, bazik ilaçlar bazik ortamda non-iyonize haldedirler, yani absorpsiyonları daha fazladır. Solüsyon halindeki ilacın absorpsiyonu, süspansiyon veya emülsiyonlardan daha hızlıdır. Tablet, draje gibi katı farmasötik şekildeki ilaçların absorpsiyonundan önce bunların ilk olarak parçalanması (disintegresyan) ve daha sonra da bu parçaların mide barsak sıvılarında çözünmesi (dissolüsyon) gereklidir. İlacın uygulandığı yerdeki konsantrasyonu yüksek olursa absorpsiyonu genellikle hızlı olur. İlaç ne kadar geniş yüzeye uygulanmış ve bu yüzey ne kadar geçirgen ise absorpsiyon hızı o kadar fazla olur. Cilt mukozalara göre daha az geçirgendir. İnce barsak mukozası, ağız mukozası, mide ve rektum ilaca daha geniş yüzey sunar ve oralardan absorpsiyon genellikle daha hızlıdır. Emilim, asidik ve bazik ilacın iyonizasyon formuna da bağlıdır. Henderson-Hasselbach denklenmelerin (Denklem 2.1, Denklem 2.2), ilacın ne kadarının absorbe olacağını saptamak için kullanılır. Asidikler için: pH= pKa + [iyonize] / [iyonize olmamış] (Denklem 2.1) Bazikler için: pH= pKa + [iyonize olmamış] / [iyonize] (Denklem 2.2) Kimyasal maddenin bulunduğu çözeltinin pH'sı, çözünmüş maddenin pKa'sına eşit olduğunda iyonlaşmış madde konsantrasyonu, iyonlaşmamış madde konsantrasyonuna 10 eşittir. Zayıf bir elektrolit yapısında olan toksik bir maddenin iyonlaşmamış şekli lipidde çözünür (hidrofobik özellik) ve hücre membranından difüze olabilir. Bu nedenle zayıf asit maddeler asit ortamda, zayıf bazik maddeler bazik ortamda kolayca difüzyona uğrayabilirler. Salisilik asit, asetil salisilik asit, benzoik asit gibi zayıf asitlerin (pKa’ları 3-4.2 arasında değişir) kuvvetli asit ortamda (pH 1-3 arasında) iyonlaşmamış şekillerinin oranı %90 iken, pH 7’de bu değer %0,1 civarına düşer, yani hemen hemen tamamen iyonlaşırlar. İlaçlar membranlardan dört ana mekanizma üzerinden geçerler. Pasif difüzyon: bu mekanizma, toksik maddelerin absorpsiyonunda en önemli yol olarak kabul edilmektedir. Kimyasal madde basit difüzyon ile mebranı geçer. Burada hücre içi ile hücre dışı arasındaki konsantrasyon farkı rol oynar. Lipofilik maddeler membranı daha kolay geçer ve membranın diğer tarafındaki sulu faza difüze olurlar. Enerji ve taşıyıcı gerekmez. İyonize bileşikler membranın yapısındaki lipid ve proteinlerle iyonik etkileşime gireceğinden difüzyonları zorlaşır ve hücre ortamının pH’sından etkilenirler. Filtrasyon (Süzülme): Membran gözenekleri içerisinde bulunan sulu fazlarda çözünen hidrofilik küçük moleküller bu gözeneklerden geçebilir. Bu olaya “filtrasyon” denir. Filtrasyonu sağlayan kuvvet osmotik veya hidrostatik basınçtır. Membran gözenekleri dokulara göre değişiklik göstermektedir. Özel taşınma: Basit difüzyon veya filtrasyon ile membranı geçemeyen, lipid çözünürlüğü yüksek ve büyük molekül ağırlıklı maddelerin hücre membranını özel bir mekanizma ile geçtiği kabul edilir. Suda çözünebilen maddeler taşıyıcı proteinle taşınıyorsa bu proses“kolaylaştırılmış difüzyon” adını alır ve bu mekanizma için enerji gereksinimi yoktur. Sodyum ve potasyum gibi inorganik iyonlar hücre membranını “aktif transport” yoluyla geçerler. İlaç, düşük konsantrasyonda bulunduğu ortamdan yüksek konsantrasyonda olduğu ortama doğru yani konsantrasyon gradientine karşı veya iyonize atom kendisini çeken elektriksel alandan iten alana doğru (elektrokimyasal gradiende karşı) taşınır. Difüzyonun aksine daha düşük konsantrasyonlu ortamdan, daha yüksek konsantrasyonlu ortama taşındığı için bu olay enerji gerektirir. Endositoz: Sıvılar için pinositoz, katılar için fagositoz denilen bu özel mekanizmada, hücre membranından çıkan uzantılar ilaç veya toksik maddeyi sarar ve 11 hücre içine çeker. Yüksek molekül ağırlıklı ve kolloid yapılı bileşikler ancak bu şekilde hücre membranını geçebilirler36,38. 2.3.2.2. İlaçların Dağılımı Dağılım, maddelerin vücudun bir parçasından diğer parçasına transferi olarak ifade edilir. Absorpsiyon sonucu kana giren ilaç molekülleri, dokularda kapilerlerden damar dışına çıkmak suretiyle önce interstisyel sıvıya dağılırlar. Bazı ilaçlar oradan hücrelerin içine de geçerler. İlacın kandan dokuların veya organların içine dağılmasına farmakokinetik dilinde yayılma (invasion) adı da verilir. Bu yayılma dokularda biriken ilaç miktarının bir fonksiyonudur. Başlangıçta kandaki ilaç konsantrasyonu dokulardan daha yüksektir. Konsantrasyon farkından dolayı ilaç kandan ayrılacak ve çevredeki hücrelere girecektir. Absorpsiyonu etkileyen faktörlerden bazıları dağılımı da etkiler. Daha lipofilik bir ilacın dokulara taşınması daha kolay olacaktır. Buna örnek olarak barbiturat sınıfından olan tiyopental ve pentbarbital gösterilebilir. İki ilaç arasındaki molekül yapısında sadece bir fark vardır. Tiyopentalin halka yapısında C=S bağı varken, pentobarbital C=O bağına sahiptir. Bu farklılık tiyopentalin daha lipofilik olmasını sağlar. Bu yüzden tiyopental, beyne pentobarbitalden daha hızlı dağılır. Bu aksiyon pentobarbitalin neden sedatif hipnotik bir ilaç olarak kullanıldığını; tiyopentalin de neden anestezik bir ajan olarak kullanıldığını açıklar. Lipofilik faktörle ilişkili diğer bir parametre pH’dır. Membranlara giren ilaçlar iyonize olmamış formdadır. Bu şekilde dokulara girerler. İlacın kandan dokulara geçişini, plazma proteinlerine bağlanması da etkiler. Albumin majör bağlanma proteinidir ve plazma konsantrasyonu yaklaşık 40 g/L’dir. Albumin tercihen asidik ilaçlara ve kısmen bazik ilaçlara bağlanır. Alfa-1 asit glikoprotein bir diğer önemli plazma proteinidir. Tercihen zayıf bazik ilaçlara bağlanır. Plazma konsantrasyonu değişken olmakla birlikte yaklaşık 0.7 g/L’dir. Bu majör proteinlere ek olarak lipoproteinler ve globülinler ilaçlara bağlanmaya son derece uygun yapıdadırlar. Bağlanmayan ve serbest haldeki bir ilaç kandan ayrılıp dokulara gireceğinden dolayı ilacın plazma proteinlerine bağlanması ilaç dağılımını sınırlandırır. 12 Serbest haldeki bir ilaç farmakolojik etki göstermek için reseptörlere bağlanabilir. Diğer yandan ilaç-protein kompleksi, kapilerlerden ayrılamayacak kadar büyük olduğu için plazma proteinlerine bağlanan ilaç kanda sınırlı kalacak dağılımı sınırlandırılacaktır. Bağlanan ilaç dokularla etkileşime geçemeyeceği için bahse konu olan bölgede farmakolojik etki gözlenmeyecektir. Potansiyel ilaç etkileşimleri, proteine yüksek oranda bağlanma eğilimi bulunan birçok ilacın aynı anda uygulandığı durumlarda meydana gelebilir. Eğer bir ilacın protein bağlanma oranı düşükse serbest ilaç formu ortamda daha çok bulunur ve bu formdaki ilaçlar dokulara girmeye uygun olur. Böylece ilacın farmakolojik aktivitesi veya toksisitesi beklenmedik bir şekilde artabilir. İlaçlar, değişken derecelerde vücut sıvılarına dağılırlar. Ortalama 70 kg ağırlığındaki bir erkeğin intraselüler ve extraselüler sıvı olarak ikiye ayrılan vücut sıvısı 42 L’dir. 42 L’nin yaklaşık 27’si intraselüler sıvıdır. Kalan 15 L, plazma ve kanda bulunan interstisyel, serebrospinal ve GI sıvısından oluşmaktadır. İlaçlar toplam vücut sıvılarının hepsine dağılabilir veya hiçbirine dağılmayabilir. Bu durum, farmakokinetiğin temel kavramlarından olan dağılım hacmini (VD) ortaya çıkarmıştır. VD= D / C (Denklem 2.3) BuradaD ilacın vücuttaki toplam miktarı (doz), C ise ilacın kandaki konsantrasyonu anlamına gelmektedir (Denklem 2.3). Dağılım hacmi, ilacın lipofilitesi, pKa’ sı plazma proteinlerine ve dokularına bağlanmasının bir fonksiyonudur. Alkol gibi hidrofilik ilaçlar, büyük çoğunluğu vücut sıvılarına dağılanlar ve salisilik asite ve asetaminofen gibi güçlü bir şekilde plazma proteinlerine bağlananların dağılım hacmi 1’den küçüktür. Çoğu psikoaktif ilaçlar lipofiliktir ve beyin gibi yağlı dokulara dağılırlar. Bu yüzden dağılım hacimleri 1’den büyüktür. Örneğin fenisiklidinin dağılım hacmi 5.5-7.5 L/kg aralığındadır. VD, teorik bir değer olduğu için total vücut sıvılarından çok daha yüksek değerde bulunabilir. Örneğin trisiklik antidepresanlar 13 karaciğerde daha spesifiktir. Bir ilacın dağılım hacmi, kişinin yaşı, cinsiyeti, klinik öyküsü ve vücut yapısının bir fonksiyonu olarak değişkenlik gösterebilir. Beyin yüksek oranda perfüze bir doku olmasına rağmen, ksenobiyotiklerin geçişini sınırlandırabilen benzersiz özelliklere sahiptir. Bu özellikler beyinde koruyucu bir mekanizma olarak kullanılır. Beyin kapilerlerinin endotel hücreleri diğer dokulardaki endotel hücrelerine toplu sıvı akışını sınırlandırır. Ayrıca beyinde organik asit ve bazların difüzyonunu yavaşlatan gliyal hücrelerin bir tabakası mevcuttur1,33,36-40. 2.3.2.2.1. Postmortem Redistribüsyon (Yeniden Dağılım) Vücuttaki ilaçların birikim yeri zamanla değişebilir. İlk toplanma yeri, bu alandaki kan akımının fazla olması, dokunun ilaç moleküllerine karşı olan yüksek permeabilitesi ve ilacın hemen uygun bir bağlanma bölgesine (protein, doku komponenti veya uygun başka bir biyomolekül) gelmesi ile ilgilidir. Kandaki postmortem ilaç konsantrasyonları ölümden sonra ilacın hareketi nedeniyle antemortem konsantrasyonlarını her zaman yansıtmayabilir. Bu kavram postmortem redistribüsyon olarak tanımlanır. Yüksek dağılım hacmine sahip (VD>3 L/kg), lipofilik ve bazik ilaçların konsantrasyonlarında büyük değişimler meydana gelebileceği tahmin edilebilir. Farklı bölgelerden alınan postmortem kan örneklerindeki ilaç konsantrasyon farklılıkları lüteratürde değerlendirilmiştir. Bölgelere bağlı farklılıklar major organlardan vasküler yolla veya pasif difüzyonla sellüler seviyede postmortem redistribüsyondan veya ölüm zamanında ilaç yada toksik maddenin dağılımın tamamlanmasından kaynaklanabilir. Postmortem redistribüsyonun mekanizması komplikedir ve henüz yeterince anlaşılamamıştır34,41-44. 2.3.2.3. İlaçların Biyotransformasyonu İlaçlar vücutta uygulandıkları andan itibaren çeşitli enzimlerin etkisine maruz kalırlar. İlaçların enzimlerin etkisi ile vücutta kimyasal değişikliklere uğramasına biyotransformasyon (ilacın metabolize edilmesi veya metabolizasyonu) denir. İlaçların metabolizasyonu, büyük çoğunluğu karaciğerde bulunmak üzere diğer dokularda bulunan enzim ve biyolojik katalistler tarafından gerçekleştirilir33. Biyotransformasyon sonucu ilaçlar genellikle daha az etkili veya etkisiz bileşikler haline getirilir. Bu yüzden 14 biyotransformasyona, biyoinaktivasyon veya detoksikasyonda denir. Bazen ilaçlar biyotransformasyon sonucu daha etkili (kodein’in morfine, difenoksilatın difenoksin’e dönüşümü) ve/veya daha toksik (metil alkolün formaldehid ve formikaside, asetaminofen’in N-asetil-p-benzokinonimin’e dönüşümü) bileşikler haline dönüşürler. Biyotransformasyon sonucu ilaçlar daha polar hale gelirler, lipid/su partisyon katsayıları azalır ve suda çözünürlükleri artarak vücuttan daha kolay atılırlar. Vücutta sadece ilaçlar değil, diğer bütün kimyasallar da biyotransformasyona uğrar. Besinle alınan doğal bileşikler dışında kalan ve çeşitli yollardan vücuda giren kimyasal maddelere, ilaçlar dahil, ksenobiyotikler denir. Bazen, etkisiz bir bileşik vücutta biyotransformasyonsonucu etkili hale getirilir. Metabolik aktivite iki genel fazda sınıflandırılır; Faz I ve Faz II metabolizması. Bu enzimatik olaylar 4 ana grupta toplanabilir: 1) Oksidasyon, 2) İndirgenme (redüksiyon), 3) Kopma, 4) Konjügasyon. Bunlardan ilk üçüne Faz I reaksiyonları denir. Fonksiyonel grupların enzimatik transformasyonları tarafından karakterize edilir. Faz I enzimlerinin en yoğun çalışılan grubu sitokrom P450 mono-oksijenazdır. İlk ikisinde, ksenobiyotik molekülündeki bir kimyasal grubun genelde daha polar bir gruba dönüşmesi söz konusudur. Üçüncüsünde esterleşme veya eterleşme sonucu maskelenmiş bir polar grup, vücutta molekülden ayrılması sonucu serbest radikalik formda bulunur. Konjügasyon, bir sentez reaksiyonudur. Faz II reaksiyonu adı da verilir. İlaç molekülü ile asetat, glukoronat, sülfat ya da glisin gibi endojen bir madde arasında konjügasyon reaksiyonu meydana gelir. Karaciğer ve diğer dokularda bulunan konjügasyon enzimleri, ilaç molekülünün bu endojen maddelerle birleşmesini sağlayarak itrahı kolay, suda çözünebilen metabolit formlarına dönüştürür. Bu enzimlerden mikrozomal glukoronosil transferaz hariç büyük çoğunluk sitoplazmada yer alır. Konjüge edilmiş ilaç metabolitlerinin çoğunluğu farmakolojik olarak inaktiftir36,40-45. 2.3.2.4. İlaçların İtrahı (Atılımı) Vücutta metabolize edilen ilaçlar çeşitli şekillerde atılırlar: 1. Karaciğerden safra içine atılım: Bazı ilaçlar ve bunların metabolitleri (özellikle konjugasyon ürünleri) karaciğer hücreleri tarafından safra içine atılarak feçes içinde itrah edilirler. İnce barsağa gelen bu ilaçlardan bazıları da buradaki enzimler tarafından 15 hidrolize edilerek serbest hale getirilen aktif ilaç tekrar emilir ve genel dolaşıma geçer (enterohepatik siklüs). Bazı ilaçlar karaciğer hücresinden safraya basit difüzyonla geçerken, bazıları da aktif transportla (tetrasiklinler, eritromisin estolat) geçer. İlk-geçiş (first eliminasyonları pass)/presistemik (metabolizma veya eliminasyon: hepatik Karaciğerden ekstraksiyonu yüksek) ilk geçiş ilaçların absorpsiyonları tam olsa bile sistemik dolaşıma geçen miktarları düşüktür. Bunun pratik önemi vardır. Çünkü daha yüksek dozlarda ilaç kullanmak gerekebilir ve bu eliminasyon bireysel genetik farklılıklar gösterebilir. Çeşitli faktörler hepatik eliminasyonu etkileyebilir. Bunlardan biri de yaşlanmadır. Yaşlanma ile karaciğer fonksiyonlarında görülen değişiklikler bazı ilaçların hepatik eliminasyonunu etkileyebilir. 2. Böbreklerden atılım: Böbreklerden ilaçların ve metabolitlerinin itrahı esas olarak üç şekilde olur: a. Glomerüler filtrasyon (GF): Kinetik olarak bir pasif difüzyon olayıdır. Glomerül membranı plazma protein moleküllerinden daha küçük molekülleri geçirir. Sadece plazmadaki serbest ilaç fraksiyonu filtrasyona uğrar. İlaçların glomerüler filtrasyon hızı glomerüler kan akımı ile doğru, ilaçların plazma proteinlerine bağlanma miktarları ile ters orantılıdır. İnülin sadece GF ile atıldığından, GF hızını saptamak için kullanılır. b. Tübüler sekresyon (salgılanma): Bir aktif transport olayıdır ve proksimal tübülus hücreleri içinde olur. Salgılamaya plazmadaki bağlı fraksiyonda katıldığından kapasitesiGF’den daha fazladır. Tübülüs hücrelerinde anyonik (asidik) ve katyonik (bazik) ilaçlara özgü iki ayrı taşıyıcı molekülleri vardır. Benzer yapıdaki ilaçlar aynı taşıyıcı molekülleri için yarışacaklarından birbirlerinin atılımlarını azaltırlar. c. Tübüler reabsorpsiyon: Distal tübüllerde meydana gelir. Esas olarak bir geri alım yani itrahı azaltan bir olaydır. Pasif difüzyonla olur. 3. Akciğerlerden Atılım: Gazlar ve uçucu maddeler kandan alveol boşluğuna pasif difüzyonla geçer ve buradan ekspirasyon sırasında dışarı atılırlar. (halotan, azot protoksid). Bunlar küçükmoleküllü, non-elektrolit, ve lipid/su partisyon katsayısı yüksek maddelerdir. 4. Salya içinde itrah: İyodürler, bromürler ve lityum gibi bazı ilaçlar tükrük bezlerinden pasifdifüzyonla salya (tükrük) içine geçerek onun içinde atılırlar. 16 5. Süt içinde itrah: İnsan sütü plazmaya göre daha asidik olduğundan, emzirenannenin aldığı bazı bazik (alkali) ilaçlar iyon tuzağı mekanizmasıyla sütte toplanıp buradan atılırlar ve bu yolla da bebeğe geçebilir1,33,36-40. 2.4. Kemik Anatomisi İnsan iskeleti, organları koruma ve iç destek sağlama görevi gören 206 kemikten oluşan metabolik aktif organdır. Kemik, vücudu oluşturan dokular arasında en sert olanıdır. Kemik, mekanik ve metabolik özellikleri nedeniyle vücutta çift yönlü bir role sahiptir.Organizmada gerçek anlamda organları koruma ve destek görevi yapan dokudur. İkincil bir fonksiyonu ise asidoza karşı savunma hattı görevi görür. Kemik iliğiyle beraber vücut ağırlığının yaklaşık % 14’ünü oluşturan iskelet dokuları, ilaçlar, metaller ve toksik maddelerin absorpsiyonu için potansiyel olarak büyük bir yüzey alanına sahiptir. Ayrıca organizmanın kalsiyum depolarıdır. Kalsiyum bakımından doymuş olduklarından serttir. Sert olmalarına rağmen kıkırdak dokusundan farkları, damar içermeleridir. Kemiğin enine kesiti incelendiğinde dış ve iç yüzeyleri bir zarla örtülüdür. Bunlardan dıştakine; periosteum, iç yüzeydekine; endosteum denir. Bu zarlar düzensiz sıkı bağ dokusundan yapılmışlardır. Periosteumun hemen altında dış halkasal sistem yer alır. Endosteumun hemen üstünde ise iç halkasal sistem bulunur. 17 Şekil 2.1. Kemik dokusunun enine kesiti. Kemik dokusu, inorganik tuzlarla sertleşmiş “osein” denen bir ara madde ile bunun içinde biçimlerine uygun boşluklara yerleşmiş kemik hücrelerinden ibarettir. Kemik hücreleri sitoplazmik uzantılarla birbirine bağlı zarsız, yıldızsı hücrelerdir. Bu doku yapısında çeşitli tipte hücreler bulunur. En çok bulunan hücre tipi osteosittir. Osteositler, kalsium hidroksit (Ca(OH)2) ile kalsiyum fosfat (Ca3(PO4)2)’ın kombinasyonuyla oluşan yüksek derece kristalize hidroksiapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) maddesinden meydana gelen mineralize ekstraselüler sıvılar tarafından sarılmıştır. Diğer yandan osteoblastlar, osteoklastlar ve diğer hücreler, kemiğin yüzey alanında bulunur. Osteoblastlar, bazı bölgelerde elastik yapı çoğunlukla sert ve katı dokuları oluşturan kemik matrikslerini üretirler. Kalsiyum tuzlarının birikmesiyle kireçlenmiş kemik matrisi içinde hapsolan osteoblastlara osteosit denir. Dolayısıyla osteositler tamamen olgunlaşmış kemik hücreleridir. Kemik yapısında osteositlerin doldurdukları küçük boşluklara lakun denir. Lakunlardan yer yöne olmak üzere ince kanalcıklar çıkar. Bunlara kanaliküller adı verilir. Bu kanalcıklar komşu lakunlerinki ile birleşerek kanalcık sistemini oluştururlar. Bu sistem, oksijenin, besin ve atıkların difüzyonunu ve ilaç ve metabolitlerinin kemik matriksi içerisinde depolanmasını sağlar46-49. 18 Kemikler insan vücudunda 4 farklı şekilde bulunurlar: uzun, kısa, yassı ve düzensizdir. Ayrıca iki farklı formda bulunur: kompakt ya da yoğun kemik olarak bilinen kortikal ve trabeküler ya da süngerimsi (spongiyöz) adı verilen kansellöz kemik. Yapısal ve fonksiyonel olarak iki form arasında farklılıklar mevcuttur. Kompakt kemik toplam kemik ağırlığının % 80’ini oluşturan ve koruyucu ve mekanik fonksiyonlara ve çok küçük poroziteye (% 5-30) sahiptir. Kompakt kemik, lamel denilen kalsifiye ekstraselüler matriksin konsantrik halkalarında düzenlenmiş haldeki havers sistemi veya osteon diye bilinen yapılar tarafından oluşmaktadır. Her bir lamel, içerisinden kan damarları ve sinirler bulunan kemik içerisine uzanan bir havers kanalını çevreler. Kemik iliğiyle beraber kemikteki kan akış hızı 200-400 ml/dakika aralığına kadar ulaşabilmektedir. İlaçlar bu sayede kemik dokusuna taşınırlar. Kansellöz kemik, osteonlardan ziyade düzensiz bir biçimde ağızlaşan kemik trabeküllerinden oluşur. Bu görünümü ile süngere benzer. Trabeküllerde bulunan kemik lamelleri birbirine paralel seyreder. Trabeküllerin aralarında birbiriyle ilişkili labirent gibi düzensiz boşluklar vardır. İçleri kemik iliğiyle doludur. Bunlar gerekli olan maddeleri kemik iliğindeki damarlardan kanaliküller vasıtasıyla sitoplazmik uzantıları ile alırlar. Kemik iliği, medüllar boşlukta bulunur ve kırmızı ve sarı ilikleri barındırır. Kemik iliği, yüksek damar ağına ve lipofilik karaktere sahip olması nedeniyle ilaç deposu vazifesi görebilir46-52. Winek ve ark., yaptıkları çalışmada53 plazma ve kemik iliğinde ilaç düzeyi arasında bir kolerasyon saptamıştır. Örneğin, kemik iliğinde desipramine düzeyinin artması, aynı zamanda plazmadaki düzeyin de artması anlamına gelmesi, kemik iliğinin kanın uygun olmadığı durumlarda toksikolojik analiz için alternatif bir örnek olarak kullanılabileceğini göstermektedir. 2.5. Kemikte İlaç Dağılımı Literatürde, iskelet dokularında (kemik ve kemik iliği) ilaç dağılımı üzerinde yapılan birçok çalışma bulunmasına rağmen bu konu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. İlacın kemik dokusundaki kesin lokasyonu, seyri ve yönelimi hala karakterize edilememiştir. Kemiğin morfolojik ve fizyolojik aktivitesindeki heterojenitesi nedeniyle kemikte ilaçların birikimi homojen değildir. Bir hipoteze göre, ilaçlar osteositlere ulaşmak için kanalikül içerisindeki kan damarlarından besin ve oksijenle birlikte 19 transfer olarak sistemik sirkülasyon yoluyla kemik dokusuna girerler52. Ölümden sonra kemik, ilaçları yakalayan gözenekli bir kutu vazifesi görecektir. İlaçlar lipit yapısında bir matriks olması ve yüksek vaskülaritesi nedeniyle kemik iliğinde de akülüme olabilirler. Postmortem kemik iliği ilaçların bulunduğu alan kemiğin farklı bölgelerinde sarılarak iskeletleşme boyunca dehidrate olacaktır. Sonunda organların sıvılaşması ve dekompozisyonu boyunca kemiğe komşu bulunan yumuşak dokulardaki ilaçlar ve metabolitleri nihayet salıverilecek ve kemiğin yüzeyinde depozite edilecektir. Bir kemikte ve farklı kemiklerdeki ilaçların dağılımı araştırılan farklı çalışmaların sonuçları ve ilaç recovery (geri kazanım)’sindeki düzeyler farklılık göstermektedir 54-57. Son maruz kalım zamanı, ilaç uygulanma frekansı, kemik tipi ve ilaç veya metabolitinin fizikokimyasal ve farmakolojik karakteristiği gibi birçok faktör, kemik ve kemik iliğinde ilaç ve metabolitinin dağılımını etkileyebilir. Bazı bileşikler kemikte akümüle (birikme) olmayabilir veya kısa yarılanma ömrüne sahip olması, polaritesi, proteine bağlanma kapasitesi nedeniyle diğer bileşikler gibi kandan kemiğe kolaylıkla transfer olamayabilir. Literatürde, içerisinde antidepresanlar, benzodiazepinler, opiyatlar, antipsikotikleri ve diğer birçok ilacın kemikte saptanabileceğini gösteren çalışmalar mevcuttur58-70. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), sıvı ve gaz kromatografi ile tandem kütle spektrometre ve diğer detektörlerin kombine edildiği cihazlar kullanılarak analizler yapılmıştır. In vitro çalışmalar, kanda saptanan birçok ilacın kemik örneklerinde de saptandığını ve bazı olgularda ilaçların yalnızca kemikte saptandığını göstermiştir. Postmortem kemikte ilaçların saptanması ile ilgili McGrath’ın çalışmasının sonuçlarında ilaçlar, kanda kemikten daha iyi saptandı ve yüksek kan konsantrasyonları her zaman kemikte yüksek konsantrasyonları sağlamadı. Fakat belirli ilaçlar (nortramadol, cocaethylene and quinine) kemikte en yüksek seviyede saptandı59. Yapılan çalışmalar gösterdi ki aynı cesetten toplanan kan ve kemik örneklerinin sonuçları her zaman uyum içinde değildir. Bazı ilaçlar kanda saptanabiliyorken kemikte saptanamamış ve bazıları da kemikte saptanıyorken otopside alınan kanda saptanamamıştır. Bu durum daha önceki maruz kalımdan kaynaklı kemikte absorbe edilen ilaçlar için sürpriz değildir. Kemikte ilacın alıkonma süresi bilinmemekle birlikte 20 kemiğin yıkımın oldukça yavaş olması ilacın alıkonma süresinin uzun olduğu hakkında bilgi verebilir. 2.6. Kemikten İlaç İzolasyonunun Teknikleri Örnek hazırlama bir analizin en önemli ve en çok zaman alan aşamasıdır. Analizin seçiciliği ve duyarlılığını artırmak için örneklerin temizlenmesi, konsantre edilmesi, dilüe edilmesi ve ekstraksiyonu için çok farklı teknikler mevcuttur. Kemikte ilaç ve metabolitlerinin birikimi ve dağılımı henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle kemikte ölçüm ve geri kazanım (recovery) hesapları yapmak zordur ve karakterizasyonu şuan için çok zayıftır. Ayrıca, iskelet dokusu gibi katı matrislerden ilaç ekstraksiyonu vücut sıvılarına göre bu matrislerin heterojen katı yapısı nedeniyle oldukça komplekstir. Sonuç olarak ekstraksiyon aşamasına geçmeden örneğin homojenize edilmesi ve analitin izole edilmesi için ekstra bir aşama gerekir. Ayrıca örnekteki çevresel bileşenlerin yüksek seviyede olması bu doku tipinde matriks etkisi gözlenmesine neden olur. İskelet dokularından ilaç ve metabolitlerin analiz edilmesi için farklı izolasyon teknikleri denenmiştir. Literatürdeki ilk metod, 1982’de Terazana ve Takatori tarafından tahmini postmortem intervali 2-5 yıllarında gömülü cesetlerden alınan humerus kemikleri üzerinde geliştirilmiştir71. Bir diğer yöntem asit dijesyon yöntemidir. Bu yöntemde kemiğin demineralizasyonunu sağlamak amacıyla 1 g toz haline getirilmiş kemiğe 16 ml 3 N HNO3 eklenerekoda sıcaklığında 18 saat bekletilir ve elde edilen süpernatant analiz edilir. Raikos ve ark., 1 yıl gömülü kalmış fatal zehirlenme olgusundan elde ettikleri bir femur kemik örneğinde opiyat sınıfı ilaçların saptamasını yapmıştır62. Soxhlet ekstraksiyon metodu da bu amaçla kullanılmış literatürdeki bir diğer ekstraksiyon yöntemidir. 1985’te Benko, zehirlenme sonucu ölen 10 kişinin cesetlerinden kemik dahil multiple organlardan amobarbital ve glutethimide ilaçlarının ekstraksiyonunu yapmıştır. Kemik örneği, soxhlet ekstraksiyon düzeneği ile pH 3 % 96’lık metanol çözeltisinde 1 saat bekletilerek çalışılmıştır72. 21 2.6.1. Pasif Solvent Ekstraksiyonu (PSE) Son on yılda iskelet dokularından ilaç ve metabolitlerinin izolasyonu için en geniş çaplı uygulanan metodtur. Literatürde birçok ilaç çeşidini ekstrakte etmek için bu tekniğin kullanıldığı çalışma mevcuttur46,54-56,59,61,73-75. Pasif solvent ekstraksiyonu (PSE) katı bir matriksle sıvı bir solvent arasındaki difüzyon üzerine kurulmuştur. PSE’ de ısı, damar içeren matrikse transfer edilir. Isı matriksde desorpsiyonu sağlayarak bileşenler solvente difüze olurlar ve çözünmeye başlarlar. Elde edilen süpernatant toplanır ve analiz edilir. Pasif solvent ekstraksiyonunu etkileyen parametreler, ekstraksiyon zamanı, solvent seçimi, sıcaklık, kütle ve partikül boyutudur. Bu ekstraksiyon metodunda genellikle 50 ºC sıcaklıkta ve 12-72 saat zaman aralıklarında çalışılmaktadır. Bu metod literatürde ilk olarak insan femur kemiğinde ilaçların analizi için McIntyre ve ark., tarafından kullanılmıştır. İçerisinde antidepresanlar, antipsikotikler ve benzodiazepinlerden toplam 12 ilaç saptanmıştır46. Kemikte arsenik, merkür ve kurşunun saptanması ve toprak, sediment gibi çevresel örneklerden pestisitlerin ekstrakte edilmesi için bu metodlar kullanılmıştır. Ayrıca saç ve diş gibi diğer matrislerin analizini yapmak için de bu yöntemler modifiye edilmiştir. Asit dijesyon, soxhlet ve standart pasif ekstraksiyon yöntemleri sınırlı analitik verimliliği ve uzun inkübasyon süresi gibi dezavantajlara sahiptir72, 76-78. 2.6.2. Microwave-Assisted Ekstraksiyon (MAE) Farklı amaçlar için mikrodalga teknolojisiyle geliştirilen cihazların ekstraksiyon amaçlı kullanıldığı literatürdeki ilk çalışmalardan bir tanesi 1986’da Geyde ve ark., tarafından gerçekleştirilmiştir79. Toprak, besinler ve tohumlardan yağların ve pestisitlerin ekstraksiyonu için mikrodalga teknolojisini kullanmışlardır. 1994’te LopezAvila ve ark., laboratuvar amaçlı kullanılan mikrodalga fırında organik kirleticilerin ekstraksiyonunu gerçekleştirmiştir80. O günden bu yana MAE pestisit ve herbisitlerin, aromatik hidrokarbonların, nötral ve bazik kirleticilerin, sedimentlerin ve atmosferik partiküllerin ekstraksiyonunda kullanılmaktadır81-83. MAE, çevresel analizler, tıbbi ve farmasötik kimya ve yiyecek endüstrisinde uzun süredir kullanılmasının yanında adli toksikoloji alanında henüz yenidir 57,69,86-88. Bu alanda yayınlanmış birkaç çalışma mevcuttur. Franke ve ark., organik solventlerle 22 birlikte MAE kullanarak 22 pozitif otopsi olgusunun serum örneklerinden ekstrakte edilen ilaçların geri kazanımını kabul edilebilir aralıkta yapmayı başarmıştır84. Watterson ve ark., toz haline getirilmiş kemikten ilaçların ekstraksiyonu için MAE’nin kullanıldığı çalışmalar yayınlamışlardır57,69. Saçta kokain, benzolecgonine, 6-MAM, morfin ve kodeinin saptanması için mikrodalga enerjisinin kullanıldığı başka bir çalışma da mevcuttur85. Literatürde iskelet dokularından ilaç saptaması için MAE’nin kullanıldığı birkaç çalışma daha mevcuttur. Bunlardan bir tanesi, meperidine uygulanan ratların iskelet dokularında bu ilaçın saptanmasını konu alan hayvansal bir çalışmadır86. MAE’nin SPE ile kombine edilerek kullanıldığı en son yayınlanan çalışmalarda colchine ve metabolitinin iskelet dokularında saptaması yapılmıştır87. Bir diğer çalışmada ketamin ve metabolitlerinin iskelet dokusundan MAE kullanılarak ekstraksiyonu yapılmıştır88. MAE’nin dezavantajlarına değinilecek olursa, kapalı damar sistemi nedeniyle soğuma süresi, yüksek maliyet ve sıcaklığı oluşturabilmek için mikrodalga enerjisini absorbe edebilen matriksler ve solventlerin kullanımını gerektirir89. 2.6.3. Ultrasonik Solvent Ekstraksiyonu (USE) Ultrasonik dalga mekanizması, güçlü zelzele ve erozyonların olduğu 1894’te Sir John Thornycroft ve Sydney W. tarafından keşfedildi ve ilk olarak yeni yüksek hızlı British Navy gemisinin test edilmesinde kullanıldı. 1927’de Alfred L. Loomis sonokimyanın beklenmedik etkilerini çalıştı. Sonokimya,çeşitli deneyimlerle 1980’li yıllara kadar gelişerek, karıştırma ve homojenizasyon amaçları için kullanıldı ve birçok bilimsel araştırmada yerini aldı90-92. Bugün ultrasonik teknolojisinin kullanıldığı cihazlar kimya, medikal ve endüstri alanını da kapsayan farklı alanlarda uygulanmaktadır. Örneğin kimya alanında reaksiyon hızlandırıcı, sıvıların degaz işlemi, nebulasyon, yıkama, türevlendirme ve ekstraksiyon amaçlı kullanılmaktadır93. Ultrasonik solvent ekstraksiyonu adli toksikolojideki yeni uygulamalardan bir tanesidir. Kemikten ilaç ve metabolitlerinin USE ile ekstrakte edildiği bir uygulama şuan için bulunmamaktadır. Literatürde USE’nin toprak örneklerinden pestisit 23 izolasyonu ve kıl örneklerinden ekstrakte edilen ilaçların analizi için kullanıldığı çalışmalar mevcuttur94-96. USE yüksek ekstraksiyon ve analitik verimlilik sağlamasının yanında geleneksel ekstraksiyon metodlarına göre oldukça basit, ucuz, ve çevre dostudur. Ayrıca yüksek verimlilik sağlayan alternatif bir tekniktir91,97. Bu teknik daha az hacimli ekstraksiyon solventi ve zaman gerektirir. Düşük sıcaklık ve basınçta çalıştığı için MAE ve soxhlet ekstraksiyonuna nazaran daha az zararlı/agresif bir tekniktir. Hassas ve ısıya dayanıksız bileşiklerin moleküler bozunmasını minimize eder. MAE’nin aksine ekstraksiyon için solvent kullanımı sınırsızdır98.Tüm bu avantajların yanında USE’nin ekstraksiyon uygulamalarındaultrasonik enerjinin üretimi ve dağılımındaki değişkenlik nedeniyle tekrarlanabilirlik sorunları yaşanmaktadır99. 24 3. GEREÇ VE YÖNTEM Deneysel bir hayvan çalışması olan bu çalışmanın gerçekleştirilebilmesi için öncelikle Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezi (ÇÜTF-DETAUM) Yerel Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır. Daha sonra TF2013YL14 no’lu proje önerisine Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi bütçesinden parasal destek sağlanmıştır. Bu çalışma için biri kontrol olmak üzere beş adet domuz (Sus Domestica) kullanıldı. Sekiz farklı sınıfa ait ilaçlar, gruplandırılarak, sıvı olanlar intravenöz yoldan, katılar suda çözünerek gavaj ile oral yoldan seçilen domuzlara uygulandı. Deney hayvanlarının sakrifiye işlemi, dağılımın gerçekleşmesi için dozdan yaklaşık dört saat sonra yüksek doz propofol verilmek suretiyle gerçekleştirildi. Ölümden hemen sonra kan, organ ve kemik örnekleri alındı. Uygun çalışma alanına getirilen cesetlerden postmortem 24, 48, 72 ve 96. saatlerde organ örnekleri alındı. Daha sonra temiz bezlere sarılan cesetler bir metre derinliğindeki mezarlara gömülerek üzerleri 50 cm toprak ile örtüldü. Postmortem 5. ve 10. aylarda mezarlar açıldığında cesetlerin iskeletleşmiş oldukları görüldü ve üst, toraks ve alt ekstremiteden kemik örnekleri alındı. Alınan tüm örneklere uygun yöntemler belirlenerek homojenizasyon ve ekstraksiyon işlemleri uygulandı. Elde edilen numunelerin toksikolojik analizi, Çukurova Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi Enstrümantal Analiz Laboratuvarı’nda bulunan Likit Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) cihazı ile gerçekleştirildi. 3.1. Hayvan Modeli Bu çalışma için uygun model evcil domuzdur (Sus Domestica). Domuzlar, çoklu doku örneklemesine ve yüksek seviye ilaç uygulanmasına imkân vermeleri ve insanlarla karşılaştırılabilir büyüklükte olmaları sebebiyle seçildi. Ayrıca, özellikle gastrointestinal ve kardiyovasküler fizyolojileri insanlara oldukça benzerdir. Bu çalışmada biri negatif kontrol olmak üzere 5 adet deney hayvanı cinsiyete bakmaksızın seçildi ve yaklaşık 68 kg (55-82 kg) olarak tartıldı. Domuzlar Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezi’nden temin edildi. Seçilen ilaç gruplarından tablet 25 ve kapsüller ezilerek 500 ml suda çözündü ve gavaj ile gastrointestinal yoldan hayvanlara uygulandı. Sıvı olanlar şırınga yardımıyla intravenöz yoldan uygulandı. 3.2. Deneysel Çalışma Yeri Bu çalışmanın deneysel kısmı, 2013 yazı ile 2014 kışı arasındaki süre içerisinde gerçekleştirildi. ÇÜTF-DETAUM domuz barınağından seçilen deney hayvanları dozlamadan önce, çalışma alanına transfer edildi. Öncelikle, seçilen ilaç grupları içerisinden opioid sınıfı ilaçlar sedatif ve analjezik etki göstermesi, böylece diğer ilaç kokteyllerinin gavaj ile daha rahat uygulanması amacıyla her bir hayvana uygulandı. Tüm ilaç grupları uygulandıktan ve deney hayvanları sakrifiye edildikten sonra cesetlerin mikroorganizmalar, sinekler ve böceklere maruz kalması için uygun bir çalışma alanına transfer edilerek belirlenen zaman aralıklarında organ örnekleri toplandı. Daha sonra cesetler, bezlere sarıldı. Daha önce herhangi bir işleme tabi tutulmamış bir alanda açılan yaklaşık bir metre derinliğindeki mezara konulan cesetlerin birbirine kontamine olmasını engellemek amacıyla aralarına uygun boyutta tahta konuldu ve 50 cm toprak örtülerek yan yana gömüldü (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Cesetlerin gömülme işlemi. 26 3.3. Değerlendirilen İlaçlar Bu çalışmada, değerlendirilen ilaçların seçim kriterleri (Tablo3.1), dağılım hacmi ve yarılanma ömrü gibi önemli parametrelerden ziyade kokuşma ve çürüme boyunca ilacın kimyasal stabilitesi, insanda ölüme neden olma veya katkıda bulunabilmesidir. Çürüme nedeniyle bu ilaçların karaciğerde stabil kalıp kalmadığı literatürdeki ilgili çalışmalarda değerlendirilmiş ve moleküler yıkımda payı olan üç önemli kriter bulunmuştur: “anaerobik amaçlar için uygun oksijen, bağlanabilecek stabil sülfür varlığı ve aynı aril nükleusunda -OH ve -NH2 grubu bulunan aminofenol yapısı.”100, 101. Tablo3.1. İlaçlar, toksik konsantrasyonları ve dozları Grup 1 Sınıf İlaç Opioid TCA SSRI BDZ Morphine (iv) Amitriptyline Citalopram Diazepam VD 3.0-5.0 15 12-16 0.5-2.5 Toksik Kons. > 0,2 mg/L > 5 mg/L > 0,5 mg/L > 5 mg/L Doz (mg) 54.4 5100 476 510 Toplam: 6140.4 2 Opioid Fentanyl (iv) 4 > 0,003 mg/L 0.816 SSRI Sertraline 20 > 1 mg/L 1360 TCA Imipramine 18 > 2 mg/L 2448 Toplam: 3808.816 3 Opioid Ketamine (iv) 4 > 1,5 mg/L 408 Antihistamine SSRI Pheniramine 2 > 2 mg/L 272 Venlafaxine 4-12 > 7 mg/L 3808 Toplam: 4488 4 Opioid Tramadol 3 > 1 mg/L 204 NSAID Diclofenac Na (iv) 1.4 > 6 mg/L 571.2 ß-Blocker Hypnotic Atenolol 0.5 - 1.5 > 35 mg/L 2380 Zopiclone 1.3-1.9 > 0,6 mg/L 61.2 Toplam: 3216.4 TCA, trisiklik antidepresan; SSRI, selektif seratonin gerialım inhibitörü; BDZ, benzodiazepin; NSAID, non steroidal antienflamatuar; iv: intravenöz yoldan uygulanan ilaçlar; VD: dağılım hacmi (L/Kg); Her bir ilacın miktarı:Doz (mg) = Toksik Kons. x Ağırlık x VD; Ağırlık = 68 kg, Toksik Konsantrasyon= minimum değerler listelendi ve VD listelenen değerlerin ortalamasıdır (26, 102,103). 27 Hayvanlara uygulanmak üzere seçilen ilaçlar farmasötik formülasyon olarak eczaneden temin edilen uygun kapsül, tablet ve solüsyonlardan hazırlandı. Kapsül ve tabletler 500 ml suda sonikasyon ile çözüldü/emülsifiye edildi. Sıvı olanlar (morphine, fentanyl, ketamine, diclofenac) intravenöz yoldan uygulandı. Opiyat analjezik ilaçlar, hayvanlarda ağrı ve huzursuzluğu azaltmak/gidermek amacıyla her bir ilaç grubunda bulunmaktadır. İlaç konsantrasyonları, insanlar için tahmin edilen toksik seviyeye ulaşacak değerde hazırlandı104. Toksik seviye, ekstrakte edilen doku ve kemiklerde ilacın saptama ihtimalini yükseltecek ve hayvanlar için analjezi ve sedasyon sağlayacaktır. Tek bir hayvana, seçilen tek bir ilaç grubu uygulandı. Seçilen spesifik ilaç grupları, ilaç sınıfı, yaklaşık 68 kg ağırlığındaki hayvan için hesaplanan toksik konsantrasyonlar ve doz miktarları Tablo3.1 de listelenmektedir. 3.4. Alınan Örnekler, Toplanması ve Saklama Koşulları Bu çalışma, 2013 yazı ile 2014 kışı arasında gerçekleştirildi. Verilen ilaçların kısmi mide boşaltımı, absorpsiyonu, dokulara dağılımı ve metabolizmasının tamamlanması amacıyla dozlamadan yaklaşık 4 saat beklendikten sonra yüksek doz propofol, intrakardiyak yoldan uygulanarak hayvanlar sakrifiye edildi. Ölüm anında hemen 8-9 ml hacimde ilk periferik kan ve yaklaşık 10 gram kadar karaciğer, kalp, böbrek, dalak ve beyin dokusu alındıktan sonra farklı anatomik lokasyonlardan (üst ekstremiteden skapula, humerus, ulna; torakstan servikal vertabra, torakal vertebra, lumbar vertebra, kaburga kemiği (rib); alt ekstremiteden ilium, femur, tibia, fibula) yaklaşık 10 gram kadar taze kemik örnekleri alındı. Daha sonra cesetler uygun çalışma alanına getirilerek postmortem 24., 48., 72. ve 96. saatlerde yaklaşık 10 gram karaciğer, kalp kası, böbrek, dalak ve beyin örnekleri alındı ve cesetler temiz kefenlere sarılarak daha önce herhangi bir muamelede bulunulmayan bir alanda açılan mezarlara gömüldü. Gömülmenin 5. ayında mezarlar açıldığında, cesetlerin iskeletleşmiş ve kas dokularının da sıvılaşmış oldukları görüldü. Aynı anatomik lokasyonlardan aynı miktarda kemik örnekleri alındı ve tekrar gömüldü. Bu işlem gömülmenin 10. ayında tekrarlandı. Tüplere ve plastik örnek kaplarına alınan tüm örnekler toksikolojik analizleri yapılmak üzere hızlıca laboratuvara götürülerek ekstraksiyon aşamasına kadar (-)20 °C de saklandı. 28 3.5. Toksikolojik Analiz 3.5.1. Deneylerde kullanılan malzemeler 3.5.1.1. Kullanılan kimyasal maddeler 1. grup ilaçlar için; Amitripyline, Diazepam, Escitalopram, Morphine referans standartları (Lipomed), 2. grup ilaçlar için; Fentanyl, Sertraline, Imipramine standartları (Lipomed), 3. grup ilaçlar için Ketamine, Venlafaxine standartları (Lipomed), Pheniramine, standartları (USP reference standart), 4. grup ilaçlar için Tramadol, Diclofenac, Zopiclone standartları (Lipomed), Atenolol standardı (Dr. Ehrenstorfer reference standarts), Morphine için morphine-d3 internal standardı, diğer ilaçlar için diazepam-d5 internal standardı (Lipomed reference standarts), Metanol (Merck), Aseton (Merck), Kloroform (Merck), Etilasetat (Merck), Amonyak (Merck), Potasyum Fosfat (Sigma), Destile su, 3.5.1.2. Kullanılan araç ve gereçler Likit Kromatografisi Tandem Kütle Spektrometri (Shimadzu CBM-20A Lite UPLC, AB SCIEX API 4000 Qtrap MS/MS), Restek Allure PFPP 5 µm Kolon (50 x 2.1 mm) Santrifüj (5500 devir/dak. – Hettich Universal 30F), Ultrasonikatör (Bandelin Sonorex) Homojenizatör (IKA Ultra turrax tube driver), Parçalayıcı-öğütücü (Qiagen TissueLyser II), OASIS HLB 3 cc, 60 mg ekstraksiyon kartuşu, 29 Katı-sıvı ekstraksiyon manifoldu (Agilent), Membran filtre (Econo filter 0,22 µm PFTE, Agilent), Vorteks (Velp Scientifica), Hassas Terazi (Mettler-Toledo), Örnek yoğunlaştırıcı (MD 200 Sample Concentrator) Tüpler (Vacutainer B-D, 10 ml’lik düz cam tüp), Vial (Agilent), Mikropipet (Axygen), Balon joje, Enjektör 3.5.2. Örneklerin Hazırlaması ve Ekstraksiyon Aşaması 3.5.2.1.Kan örneğinin hazırlanması Analiz aşamasına kadar (-)20 °C de Vacutainer B-D tüpünde bulunan 0.5 ml kan örneği düz cam tüpe alınarak üzerine 1000 ng/ml konsantrasyonda internal standart (iç standart madde) (morphine-d3 ve diazepam-d5) 25µl eklendi. Üzerine 2.5 ml distile su eklenerek vortekle karıştırılıp 3500 rpm devirde 10 dakika santrifüj edildi. Üst faz alındıktan sonra aşağıdaki ekstraksiyon algoritmasına göre katı faz ekstrasyonu (SPE) yapılarak mikrofiltreden geçirilen örnekler,oluşturulan spesifik metoda göre LCMS/MS sistemine enjekte edildi. Kan ekstraksiyonu için ekstraksiyon algoritması Şekil 3.2 de gösterilmektedir. 30 Kan Ekstraksiyonu OASIS HLB 3cc 60 mg kartuş Şartlandırma; 2ml metanol Şartlandırma;2 ml destile su 0.5 ml tam kan + 2.5 ml distile su 3500 rpm santrifüj edilir. Üst faz alınıp kartuştan geçirilir. Yıkama; % 5’lik metanol çözeltisi ile yapılır. Oda sıcaklığında 10 dk vakum altında kurutulur. Eliüent Asidik İlaçlar: Aseton/Kloroform (70:30) Bazik İlaçlar:Etil Asetat/NH4OH (98:2) Eliüent N2 altında uçurulur. 0.5 ml metanol ile çözülür ve enjeksiyon için cihaza verilir. Şekil 3.2. Kan için ekstraksiyon algoritması 3.5.2.2.Organ Örneklerinin Hazırlanması Analiz aşamasına kadar (-)20 °C de plastik kaplarda bulunan karaciğer, kalp, böbrek, dalak ve beyin örneklerinden alınan 1 gram viseral doku örneği üzerine 0.1 M pH 4.4 K2HPO4 tamponu eklenerekhomojenizatör (IKA Ultra turrax tube driver) ile homojenize edildi. Düz cam tüpe (10 ml) homojenizattan 1 ml alınarak üzerine 1000 ng/ml stok internal standart(morphine-d3, diazepam-d5) karışımdan 30 µl eklendi ve 5 ml aynı tampon çözeltisinden eklendi. Vorteks ile karıştırılıp 3500 rpm devirde 10 dakika santrifüj edildi. Alınan üst fazın Şekil 3.3 de belirtilen ekstraksiyon algoritmasına göre katı faz ekstraksiyonu yapıldı. Mikrofiltreden geçirilen ekstrakt, oluşturulan spesifik metoda göre LC-MS/MS sistemine enjekte edildi. 31 Organ Ekstraksiyonu OASIS HLB 3cc 60 mg kartuş Şartlandırma; 2ml metanol Şartlandırma;2 ml destile su Homojenizasyon; 1 gram Organ + 4 ml 0.1 M pH 4.4 K2HPO4 tamponu 1 ml homejenizat + 30 ng internal standart + 4 ml K2HPO4 tamponu 3500 rpm santrifüj edilir. Üst faz alınıp kartuştan geçirilir. Yıkama; % 5’lik metanol çözeltisi ile yapılır. Oda sıcakluğında 10 dk vakum altında kurutulur. Eliüent Asidik İlaçlar:Aseton/Kloroform (70:30) Bazik İlaçlar:Etil Asetat/NH4OH (98:2) Eliüent N2 altında uçurulur. 0.5 ml metanol ile çözülür ve 1:25 oranında dilüe edilerek enjeksiyon için cihaza verilir. Şekil 3.3. Organlariçin ekstraksiyon algoritması 3.5.2.3.Kemik Örneklerinin Ekstraksiyonu Kemik örneklerinin ekstraksiyonu ultrasonik solvent ekstraksiyonu (USE) ile katı faz ekstraksiyonunun (SPE) kombine edilmesiyle yapıldı. Analiz aşamasına kadar anatomik lokasyonlarına göre ayrılan ve (-)20 °C de plastik kaplarda saklanan kemik örnekleri çıkarılarak oda sıcaklığına gelmeleri sağlandı. Her örnek, çevresel kontaminasyonların ve üzerlerinde bulunan kas dokularının uzaklaştırılması amacıyla öncelikle bistüri yardımıyla ön temizleme yapıldı. Daha sonra ikişer defa distile su, metanol ve asetona daldırılarak 5 dakika ultrasonik banyoda bekletildi. Bir gece kurumaya bırakılan örnekler parçalayıcı-öğütücü (Qiagen TissueLyser II) cihazda toz haline getirildi. 10 ml’lik düz cam tüpe alınan 100 mg kemik örneği üzerine 30 ng internal strandart (morphine-d3, diazepam-d5) ve 2.5 ml metanol eklendi, vorteksle 32 karıştırıldı. 2 saat ultrasonik banyoda inkübasyona bırakılan örnekler 3500 rpm devirde 10 dakika santrifüj yapılarak üst faz alındı. Üst faz N2 gazı altında uçuruldu. Üzerine 125 µl Metanol/875 µl distile su eklenerek Şekil 3.4 de belirtilen ekstraksiyon algoritmasına göre katı faz ekstraksiyonu yapıldı. Mikro filtreden geçirilen ekstrakt oluşturulan spesifik metoda göre LC-MS/MS sistemine enjekte edildi. Kemik Ekstraksiyonu 100 mg öğütülmüş kemik + 2.5 ml metanol 2 saat ultrasonik banyoda inkübasyon yapılır. 3500 rpm de santrifüj edilip üst faz alınır. Üst faz N2 gazı altında uçurulur. Ultrasonik Solvent Ekstraksiyonu (USE) OASIS HLB 3cc 60 mg SPE kartuş Şartlandırma; 2ml metanol Şartlandırma;2 ml destile su Ultrasonik ekstraksiyondan çıkan tüpe; 0.125 µl metanol/0.875 µl distile su eklenerek vortekslenir. Üst faz alınıp kartuştan geçirilir. Yıkama; % 5’lik Metanol çözeltisi ile yapılır. Oda sıcaklığında 10 dk vakum altında kurutulur. Eliüent Asidik İlaçlar: Aseton/Kloroform (70:30) Bazik İlaçlar:Etil Asetat/NH4OH (98:2) Eliüent N2 altında uçurulur. 0.5 ml metanol ile çözülür ve enjeksiyon için cihaza verilir. Şekil 3.4.Kemiğin USE ve SPE ekstraksiyon algoritması 33 3.5.3. LC-MS/MS Çalışma Şartları Bu çalışmada postmortem örneklerin ekstraksiyonundan sonra elde edilen numunelerin analizleri, Shimadzu CBM-20A Ultra Flow Likit Kromatografisi UFLC, Tandem API 4000 Q TRAP Kütle Spektrometri LC-MS/MS Systems cihazı ile yapıldı. - Kolon: Restek Allure PFPP 5 µm 50 x 2.1 mm - İyon Kaynağı: Turbo Spray (Electro spray ionization) (pozitif mod) - Gaz Akışı: 20 L/dk - Sheat Gaz Sıcaklığı:450 °C - Gaz Sıcaklığı: 320 °C - Fırın (Oven) Sıcaklığı: 40 °C - Maksimum Sıcaklık: 85 °C - Kapiler Voltaj: 4500 V - Mobil Faz A: 1 L ultra saf su içerisinde 5 mM amonyum format / %0.01 formik asit. - Mobil Faz B: 1 L asetonitril içerisinde 5 mM amonyum format / %0.01 formik asit. - Analiz Süresi: 17.983 dakika - Enjeksiyon Hacmi: 20 µl - Gradient Programı: (Tablo 3.2) Tablo 3.2. LC/MS/MS analiz gradient programı. Zaman (dakika) 0.01 0.01 10 10 15 15 15 15 17.4 17.4 17.50 Total Flow Pumb B Conc. Total Flow Pump B Conc. Total flow Pump B Conc. Total Flow Pump B Conc. Total Flow Pumb B Conc. Controller Stop 0.5 10 1 90 1 90 0.5 10 0,5 10 34 Seçilen ilaçların, tanımlanabilmesi için ayrıntıları Tablo 3.3’ de verilen metoda göre MRM (Multiple Reaction Monitoring) Scheculed modukullanıldı. Tüm ilaçlar pozitif modta analiz edildi. Data verileri Analyst 1.6.2. yazılımı kullanılarak alındı. Tablo 3.3. Seçilen ilaçların analizi için oluşturulan LC-MS/MS cihazının MRM parametreleri. Product Ion (m/z) Precursor Ion (m/z) Time (msec) Compound ID (İlaç) DP (V) EP CE (V) CXP 278.06 233 8.41 Amitriptyline 1 66 10 25 8 278.06 191 8.41 Amitriptyline 2 66 10 33 14 278.06 202 8.41 Amitriptyline 3 66 10 77 16 267.1 145.1 2.48 Atenolol 1 60 10 50 15 267.1 133.1 2.48 Atenolol 2 60 10 50 15 267.1 91.1 2.48 Atenolol 3 60 10 50 15 284.95 154 5.35 Diazepam 1 76 10 37 10 284.95 192.8 5.35 Diazepam 2 76 10 45 14 284.95 91 5.35 Diazepam 3 76 10 59 6 296.15 214 6.09 Diclofenac 1 60 10 41 18 296.15 215 6.09 Diclofenac 2 60 10 35 12 325.32 109 7.37 Escitalopram 1 116 10 37 8 325.32 262 7.37 Escitalopram 2 116 10 27 6 337.1 188 7.36 Fentanyl 1 56 10 31 14 337.1 105 7.36 Fentanyl 2 56 10 55 8 337.1 102.9 7.36 Fentanyl 3 56 10 83 8 281.06 192.9 8.12 İmipramine 1 66 10 57 14 281.06 208 8.12 İmipramine 2 66 10 35 16 281.06 191.9 8.12 İmipramine 3 66 10 75 14 237.99 125 4.19 Ketamine 1 41 10 35 10 237.99 89 4.19 Ketamine 2 41 10 77 6 285.93 151.8 2.04 Morphine 1 96 10 77 12 285.93 165 2.04 Morphine 2 96 10 51 12 307.95 276.8 8.70 Sertraline 1 41 10 19 8 307.95 160.8 8.70 Sertraline 2 41 10 39 12 264.14 58.2 5.07 Tramadol 1 41 10 47 12 264.14 56.1 5.07 Tramadol 2 41 10 81 12 278.02 260.1 5.63 Venlafaxine 1 51 10 19 8 278.02 214.9 5.63 Venlafaxine 2 51 10 25 16 278.02 173 5.63 Venlafaxine 3 51 10 33 4 389.1 217.1 4.34 Zopiclone 1 60 10 50 15 389.1 245.1 4.34 Zopiclone 2 60 10 20 15 389.1 217.2 4.34 Zopiclone 3 60 10 35 15 35 3.5.4. Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması Kalibrasyon eğrisi kan, organ ve kemik örnekleri için matris etkisini yok etmek amacıyla ayrı ayrı tüm ilaçlar miks (karışım) yapılarak hazırlandı. Kan kalibrasyonu 1 ml negatif (blank) kana 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 50, 100 ng/ml konsantrasyonda kalibrasyon noktalarını oluşturmak için ilaç standart karışımı eklendikten sonra internal standart madde olarak 25 ng/ml diazepam-d5 ve morphine-d3 her bir kalibrasyon noktasına eklendi. Kalibrasyon noktalarının ekstraksiyonu yapıldıktan sonra cihaza verildi ve kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Kan örneğinde amitriptyline için kalibrasyon grafiği Şekil 3.5 de gösterilmiştir(r=0.9987). Organ örneklerinin kalibrasyonu ekstraksiyon prosedürüne göre homojenize hale getirilen negatif (blank) örneklerin içerisine 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/g konsanstrasyonda ilaç standart karşımı eklenerek hazırlandı(r=0.9982). Kemik örnekleri için negatif (blank) kemik kullanıldı. 100 mg kemik üzerine 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 2500 5000 ng/g konsantrasyonlarda ilaç standart karışımı eklendikten sonra ekstrasyon yapılarak cihaza verildi ve kalibrasyon eğrisi çizildi.Atenolol için kemik kalibrasyon eğrisi Şekil 3.6 dagösterilmiştir (r=0.9989). 36 ismailkan.rdb (amitriptyline 1): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 0,435 x + -0,151 (r = 0,9987) 44 42 40 38 36 34 A n a ly t e A r e a / I S A r e a 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Analyte Conc. / IS Conc. 65 70 75 80 85 90 95 100 Şekil 3.5. Kanda amtriptyline analizi için oluşturulan kalibrasyon eğrisi (r=0.9987). kmk070115.rdb (atenolol 1): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 0,00182 x + 0,000169 (r = 0,9989) 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 A n a ly t e A r e a / I S A r e a 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 Analyte Conc. / IS Conc. Şekil 3.6. Kemik dokusunda atenolol analizi için oluşturulan kalibrasyon eğrisi (r=0.9989). 37 4. BULGULAR Cinsiyete bakılmaksızın ve ortalama ağırlıkları 68 kg olarak biri kontrol olmak üzere seçilen 5 adet (n=4+1) domuzdan toplanan periferal (ilyak) kan, kemik ve organ dokularının analizi yapılmıştır. İlk kanda toplam 14 ilacın yalnızca 10’u saptanmıştır (Şekil 4.1). Fentanyl, sertraline, tramadol ve zopiclone ilk kanda saptanamamıştır. Postmortem organlardan 4. saatte toplanan karaciğerde morphine saptanamamıştır. Fentanylde yalnızca karaciğerde saptanabilmiş diğer visseral dokularda saptanamamıştır. Zopiclone hiçbir organ ve kemik örneğinde saptanamamıştır. 1800 1600 1660 1400 1440 1335 1200 1000 800 840 895 600 400 200 125 135 0 0 90 70 220 0 0 0 Şekil 4.1. Sakrifiye işleminden sonra toplanan ilk periferal kandaki ilaç konsantrasyoları (ng/ml). 38 XIC of +MRM (45 pairs): 278,020/260,100 amu Expected RT: 5,7 ID: venlafaxine 1 from Sample 10 (k.ciger3-3.gun) of ismail.wiff (Turbo Spray) Max. 2,6e6 cps. 5,68 2,5e6 2,4e6 2,3e6 2,2e6 2,1e6 2,0e6 1,9e6 1,8e6 In te n s ity , c p s 1,7e6 1,6e6 1,5e6 1,4e6 1,3e6 1,2e6 1,1e6 1,0e6 9,0e5 8,0e5 7,0e5 6,0e5 5,0e5 4,0e5 3,0e5 2,0e5 1,0e5 0,0 6,12 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Time, min 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 Şekil 4.2. 3. grup, postmortem 72. saatte toplanan karaciğer örneğinde saptanan pheniramine ve venlafaxine’nin kromatogramı. Tablo 4.1. Postmortem karaciğerde belirtilen zaman aralıklarında ölçülen ilaç konsantrasyonları (µg/g). Süre (saat) İlaçlar 4. saat 24. saat 48. saat 72. saat 96. saat Amitriptyline 10.6 12.8 13.3 14.4 27.8 Atenolol 460.1 483.9 489.6 497.4 531.1 Diazepam 1.68 2.59 2.68 2.95 2.62 Diclofenac 17.01 17.12 17.77 20.07 20.04 Escitalopram 1.58 1.62 2.16 2.11 2.48 Fentanyl 0 0.45 0.49 0.56 0.65 Imipramine 92.34 103.9 112.3 134.6 405.7 Ketamine 0.89 1.07 1.11 1.27 2.19 Morphine 5.49 6.74 25.1 27.4 31.99 Pheniramine 57.3 69.4 91.75 96.5 98.9 Sertraline 198.4 207.5 228.6 304.7 318.5 Tramadol 0.34 0.43 0.43 0.65 0.73 Venlafaxine 90.95 93.65 95.1 99.27 105 39 Beyin dokusunda tramadol, ketamine, escitalopram ve diazepamın dağılımı 1200 1000 800 600 400 200 0 4 24 48 72 96 Zaman (saat) Tramadol Ketamine Escitalopram Diazepam Şekil 4.3.Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında tramadol, ketamine, escitalopram ve diazepam’ın dağılım grafiği (ng/g). 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 4 24 48 72 96 Zaman (saat) Atenolol Imipramine Sertraline Venlafaxine Şekil 4.4.Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında atenolol, imipramine, sertraline ve venlafaxine’nin dağılım grafiği (ng/g). 40 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 4 24 48 72 96 ZAMAN (SAAT) Amitriptyline Pheniramine Diclofenac Na Şekil 4.5.Postmortem beyin dokusunda belirtilen zaman aralıklarında amitriptyline, pheniramine ve diclofenac’ın dağılım grafiği (ng/g). ng/g 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 4. Saat 24. Saat Morphine Amitriptyline 48. Saat Escitalopram 72. Saat 96. Saat Diazepam Şekil 4.6.Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda morphine, amitriptyline, escitalopram ve diazepamın dağılım düzeyi (ng/g). 41 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 4. Saat 24. Saat Sertraline 48. Saat Pheniramine 72. Saat Venlafaxine 96. Saat Atenolol Şekil 4.7.Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda sertraline, pherimanine, venlafaxine ve atenolol’ün dağılım düzeyi(ng/g). 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 4. Saat 24. Saat 48. Saat Ketamine 72. Saat 96. Saat Tramadol Şekil 4.8.Postmortem zaman aralıklarında toplanan böbrek dokusunda ketamine ve tramadol’ün dağılım düzeyi(ng/g). 42 250 200 150 Taze 100 5. Ay 10. Ay 50 0 Şekil 4.9.Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre ketamine düzeyleri (ng/g). 80000 70000 60000 50000 40000 Taze 30000 5. ay 10. ay 20000 10000 0 Şekil 4.10.Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre atenolol düzeyleri (ng/g). 43 200000 180000 160000 140000 120000 100000 Taze 80000 5. ay 60000 10. ay 40000 20000 0 Şekil 4.11.Belirtilen zamanlarda toplanan kemiklerin anatomik lokasyonlarına göre venlafaxine düzeyleri (ng/g). Şekil 4.12. Taze kemik örneklerinindeki ilaç konsantrayonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). 44 Şekil 4.13.5. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç konsantrasyonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). Şekil 4.14.10. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç düzeylerinin ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). 45 Şekil 4.15. Taze, 5. ve 10. ayda toplanan kemik örneklerindeki ilaç konsantrayonlarının ekstremiteye göre dağılımı (ng/g). 46 5. TARTIŞMA İlaç zehirlenmeleri önemli bir mortalite oranına sahiptir3.Zehirlenme olguları adli olgulardır ve ölümün nedeni ve mekanizmasını belirlemek çok önemlidir.Zehirlenmelere bağlı postmortem olguların toksikolojik analizlerinde kan ve idrar gibi biyolojik materyaller incelenmektedir. Fakat çürümüş ya da gömülü halde bulunan cesetlerin toksikolojik açıdan incelenmesi gerektiği durumlarda kan ve idrar gibi vücut sıvıları otoliz/putrefikasyon nedeniyle analiz için uygun değildir. Bu durumda şahsın ölüm nedenini saptanabilmesi için yapısal bütünlüğü tamamen bozulmamış haldekiorganörnekleri çalışılabilir. Organlar ileri derecede çürümüş olsa bile tam bir toksikolojik analiz ile ölüme etken faktörlerin ortaya konması gerekmektedir. Çürümenin ilerleyen dönemlerinde yapısal bütünlüğün bozulmasıyla birlikte organların örnek olarak toplanması imkânsız hale gelmektedir. Bu nedenle ilerleyen dönemlerde bile yapısal bütünlüğünü çok iyi koruyabilen kemik örnekleri, gömülü veya çürümüş halde bulunan cesetlerde ilacın varlığını saptayabilme anlamında ciddi kolaylıklar sağlamaktadır. Çünkü kemik dokuları, yapısına bağlanan ilacın stabilitesini çok uzun periyotlara kadar koruyabilmektedir10. Wyman ve ark.5yaptıkları hayvan modeli çalışmasında farklı saatlerde toplanan dekompoze domuz organ dokularında çoklu ilaç saptaması ve düzey araştırması yapmışlardır. Çalışmada dekompozisyonun ilaç düzeyine etkisi, kanın analiz için uygun olmadığı durumlarda seçilmesi gereken en uygun organ dokusunun hangisi olduğunun araştırması yapılmıştır. Organ dokularında bulunan konsantrasyonlar, dekompozisyon arttıkça genellikle artış göstermiştir. Konsantrasyondaki artış oranı tüm ilaçlar için aynı değildir. Postmortem karaciğerde saptanan bazı ilaçlarda azalma gözlenmiştir. Bu azalmanın nedeni olarak biyolojik parçalanma/bozulma ihtimali düşünülmüştür. Çalışmamızdaki amacımız kan örneğinin alınmasının uygun olmadığı çürümüş ve gömülü halde bulunan cesetlerin adli toksikolojik incelenmesinde organ ve kemik dokularında ilaç dağılımının belirlenmesidir. Çalışmamız, 2013 yazı ile 2014 kışı arasında gerçekleştirilmiştir. Hayvan modeli olarak tasarlanan bu çalışmada domuz kullanılmasının nedeni, gastrointestinal ve kardiyovasküler sistemlerinin insanlara oldukça benzerlik göstermesi ve insanlarla karşılaştırılabilir büyüklükle olmalarıdır. 47 Ayırca klinik ilaç kullanım öyküsü bilinmeyen insan modelinin aksine hayvan modelinde ilaç, doz, ölüm ve doz arasındaki süre ve postmortem çevre kontrol edilebilir önemli parametrelerdir. Tüm bunların yanında genel olarak metod geliştirme amaçlı yapılan çalışmalar hayvan modeli olarak tasarlanmıştır. Kullanılan ekstraksiyon yöntemleri negatif kontrol matriksleri üzerinden optimizasyonları ve geri kazanım hesabı yapıldıktan sonra örneklere uygulanmıştır. Sakrifiye işleminden hemen sonra toplanan ilk periferal kanda 14 ilacın yalnızca 10 tanesi saptanmıştır. Saptanamayan fentayl, sertraline, tramadol ve zopiclone’nun diğer ilaçlara göre toksik konsantrasyon ve dağılım hacmi üzerinden hesaplanan doz miktarının düşük olması bu durumun açıklaması olabilir. Elde edilen bulgular gösterdi ki; organlarda bulunan ilaç konsantrasyonları ilk periferal kanda bulunan konsantrasyonlardan daha yüksektir. Zopiclone ilk kanda saptanamamadığı gibi hiçbir dokuda da saptanamamıştır. Literatürde kana eklenen ve () 20 ºC’de saklanan zopiclone’nun stabilitesi araştırılmış ve konsantrayonda % 32-50 arasında bir azalma gözlenmiştir105. Karaciğerde en yüksek konsantrasyonda dağılım gösteren ilaç atenololdür. Fentayl karaciğer haricinde diğer organ dokularında saptanamamıştır. Böbrekteki ilaç konsantrasyonu karaciğerden yüksek bulunmuştur. Anatomik lokasyonu gereği midenin yanı sıra ince bağırsaktan difüzyon ihtimali böbrekteki ilaç konsantrasyonunun diğer organlara göre daha yüksek bulunmasının nedeni olabilir. Literatürde ratların böbrek dokusundaki postmortem ilaç konsantrasyonunun yüksek olması böbreğin anatomik lokasyonunun mide ve ince bağırsağa yakın olmasına bağlanmıştır106. İlk periferal (ilyak) kan alındıktan sonra aynı ilyak venin bozunmasıyla ikincil bir kan örneği alınamadığından dekompozisyonun artmasıyla kandaki ilaç konsantrasyonunun artıp artmadığı saptamak da mümkün değildir. İlaç konsantrasyonu, dekompoze organlarda artmaktadır. Bizim çalışmamızda da postmortem yeniden dağılım (redistribüsyon) nedeni ile organlardaki ilaç konsantrasyonu 4. saat ile 96. saat arasında artış göstermektedir (Tablo 4.1). Fakat bu çalışmanın odağı postmortem redistribüsyondan ziyade kanın toksikolojik analiz için olmadığı durumlarda, organ ve kemik dokularındaki ilaç konsantrasyonlarının araştırılmasıdır. Dekompoze olguların toksikolojik analizlerinin yorumlanması postmortem redistribüsyongibi henüz açıklığa kavuşmamış mekanizmalar nedeniyle zordur ve bu 48 durum, bulunan sonuçları yorumlanmada adli toksikologları yanıltabilir. Fakat hangi mekanizma olursa olsun dekompoze durumlarda birkaç organ dokusundaki biyolojik bozunma etkisiyle konsantasyonda azalış gözlenmesi haricinde ilaç konsantrasyonları artmaktadır. Tüm ilaçların konsantrasyonlarındaki artış oranı aynı değildir. Bu veriler, dekompoze durumlarda toplanan hiçbir organ dokusunun ilacın kan konsantrasyonunu öngörmek için kullanışlı olmadığını göstermektedir. Kemik dokuları ileri derecede çürüyen (iskeletleşmiş) cesetlerden adli toksikolojik analiz için kemik dokusunun bir diğer formu olan diş ile birlikte örnek olarak toplanabilen tek matrikstir. Birçok faktör iskelet dokularındaki ilaç düzeyini etkileyebilir. Kemik dokusunun morfolojik ve fizyolojik aktivitesindeki heterojenite nedeniyle kemikte ilaç birikimi homojen değildir. Bunun yanında ilaç uygulama yolu, dekompozisyon oranı, postmortem çevresel kondisyonlar ve bu kondisyonlara maruz kalım süresi ve kemiğin tipi gibi etkenler de potansiyel olarak kemik dokusundaki ilaç seviyesini etkileyebilmektedir. Literatürde kemik hakkındaki en erken çalışmada, 1979’da Dunnet ve ark. tarafından iskeletleşmiş bir cesetten alınan kemik örneğinde enzimatik olarak butobarbiton saptaması yapılmıştır. Bir diğer çalışma Lien ve ark. tarafından gerçekleştirilmiş, kemik talaşında hormonal antineoplastik ilaç olan tamoxifen saptaması yapılmıştır46. Toksikolojik analizde kullanılabilen bir matriks olarakkemik dokusunun uygunluğu, 2000 yılından bu yana yayınlanan çeşitli araştırmalara konu olmuştur 46, 59,65,69, 107-111 . Bu araştırmalar neticesindeki ortak bulgu,kan ve kemik arasında zayıf bir korelasyon bulunduğudur. Bu durum, toksisitenin tahmin edilmesi amaçları için kemikte ilaç ölçümlerinin kan konsantrasyon aralığıyla ilişkilendirilmesi çabasının problemli olacağı anlamına gelmektedir. Desrosiers ve ark.,60 amitripyline, citalopram ve bu iki ilacın metabolitlerinin 13 farklı kemikte dağılımını araştıran evcil domuzun kullanıldığı hayvansal bir çalışma yürütmüşlerdir. Çalışmada pasif solvent ekstraksiyon yöntemi kullanılmış en yüksek konsantrasyonlar toraks bölgesinde yer alan kemiklerde saptanmıştır. Çalışmamızda 14 ilacın farklı zamanlarda toplanan ve ekstremiteye göre ayrılan 11 farklı kemik tipinde dağılım düzeyi araştırılmıştır. Kemik dokuları sakrifiye işleminden sonra üst ekstremiteden scapula,humerus, ulna; torakstanservikal vertabra, torakal vertebra, lumbar vertebrae, kaburga kemiği (rib); alt ekstremiteden ilium, femur, 49 tibia, fibula olmak üzere analiz için örnek olarak toplanmıştır. Daha sonra gömülen cesetler, gömülmenin 5. ayında feth-i kabir yapılarak mezardan çıkarılmış ve aynı anatomik lokasyonlardan kemik dokuları toplanmıştır. Bu işlem gömülmenin 10. ayında tekrarlanmıştır. Çalışmamız neticesinde elde edilen bulgularda farklı ilaçların farklı kemiklerde farklı zaman aralıklarındaki dağılım düzeylerinde böyle geniş bir varyasyon olduğu açık değildir (Şekil 4.15). Fakat ilaçların en yüksek konsantrasyonu toraks bölgesinde tespit edilmiştir. En düşük ise alt ekstremitede bulunmuştur. Bu sonuçlar literatürle paralellik göstermektedir60.Bunun bölgesindeki yer nedeni alması özellikle ve yumuşak çürüme dokuların boyunca vücudun ilaçların gövde sıvılaşmış dokulardankemikdokularına geçmesi şeklinde yorumlanabilir.5. ayda feth-i kabir yapıldığında bu yumuşak dokular kemik üzerinde sıvılaşmış şekilde bulunduğu için buradan kemik dokularına ilaç geçişi devam ederek kemik dokularındaki konsantrasyonları arttırdığı düşünülebilir. 10. ayda toplanan iskelet dokularında ilaç konsantrasyonlarının düştüğü görülmüştür (Şekil 4.14). İlaç dağılımı, kemik tipine göre, ilacın stabilitesi, farmakokinetiği ve fizikokimyasal yapısına göre değişkenlik göstermekle birlikte kemik dokusunun toprak altında maruz kaldığı henüz açıklanmamış bilinmeyen düfizyon mekanizmaları nedeniyle bu dokulardaki elde edilen bulguların yorumlanması oldukça güçtür. Çürümüş ve gömülü halde bulunan cesetlerin toksikolojik analizinde iskelet dokularının kullanılması ile ilgili çalışmalar hala kısıtlıdır. Literatürde yapılan çalışmalarda kemik dokularında ilaç saptamasına yönelik oluşturulan standart bir yöntem bulunmamaktadır. Analiz için USE ve SPE’nin kombine edildiği ekstraksiyon yöntemi ucuz, basit ve en önemlisi yüksek ekstraksiyon verimliliğine sahip olması nedeniyle seçilmiştir. Kullandığımız yöntemde 100 mg kadar düşük miktarda (recovery ratio (geri kazanım): % 73- 120) kemik örneği kullanılması, yöntemin değeri açısından önemlidir.Ekstraksiyon solventine maruz kalan kemiğin yüzey alanlarının farklılık göstermesi veya ultrasonik solvent ekstraksiyon yönteminde ultrasonik dalga frekanslarının stabil olmaması nedeni ile laboratuvarlar arasında ilaç düzeyinde farklılıklar olmaktadır. Bu aşamada rutin toksikolojik uygulamalarda kemik çalışmaları için kantitatif sonuçlar yerine kalitatif sonuçlar verilmesinin daha uygun olacağı söylenebilir. 50 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 1. Domuz modeli olarak tasarlanan bu çalışmada, adli toksikolojik analizler için kullanılan kan ve idrar gibi geleneksel örneklerin toplanmasının uygun olmadığı dekompoze cesetlerden farklı zaman aralıklarında alınan organ ve kemik dokularında çoklu ilaç dağılım düzeyleri araştırılmıştır. 2. Cinsiyete bakılmaksızın biri negatif kontrol olmak üzere 5 adet (n=4+1) evcil domuz (Sus domestica) seçilmiştir. Her bir domuza sekiz farklı sınıftan ondört ilaç üçerli ve dörderli gruplar halinde katılar gastrointestinal kanal yoluyla, sıvılar intravenöz yolla uygulanmıştır. Dozlamadan 4 saat sonra sakrifiye edilen hayvanlardan periferal kan, karaciğer, böbrek, kardiyak kas, dalak, beyin ve ekstremiteye göre ayrılan farklı anatomik lokasyonlardan kemik örnekleri toplanmıştır. Postmortem 96., saate kadar organ örnekleri alındıktan sonra cesetler toprağa gömülmüştür. Gömülmeden 5 ve 10 ay sonra aynı anatomik lokasyolardan kemik örnekleri toplanmıştır. 3. Organlar ve kemikler için seçilen ilaçların saptanmasında en yüksek geri kazanım sağlayan uygun yöntemler (organ için SPE, kemik için SPE + USE) belirlendikten sonra toplanan organ ve kemiklere örnek hazırlama işlemleri uygulandı. Hazırlanan örnekler yüksek seçicicilik ve duyarlılığa sahip Likit Kromatografi – Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) ile analiz edildi. 4. Analiz sonucunda ilk periferal kanda 14 ilacın 10’u saptanmış, fentanyl, sertraline, tramadol ve zopiclone saptanamamıştır. Zopiclone hiçbir dokuda saptanamıştır. Organ örneklerinde 4 - 96 saat aralığında ilaç konsantrasyonları artış göstermiştir. Tüm ilaçların konsantrasyonlarındaki artış oranı aynı değildir. Bu veriler, dekompoze durumlarda toplanan hiçbir organ dokusunun ilacın kan konsantrasyonunu öngörmek için kullanışlı olmadığını göstermektedir. 5. Kemikte en yüksek konsantrasyonlar sırasıyla toraks bölgesinde ve üst ekstremitede saptanmıştır. 5. ayda toplanan kemiklerde taze kemiklere göre ilaç konsantrasyonlarında artış gözlenmiştir. 51 6. İskelet dokularında ilaç analizleri için oluşturulan standart bir izolasyon/ekstraksiyon yöntemi bulunmamakla birlikte bu konu adli toksikoloji alanında göreceli olarak henüz yenidir ve bu yüzden bu alanda daha çok araştırmaya ihtiyaç duyulmaktadır. 7. Şuan için rutin toksikolojik uygulamalarda kemik çalışmaları için kantitatif sonuçlar yerine kalitatif sonuçlar verilmesinin daha uygun olacağı söylenebilir. 8. İleriki araştırmalarda kalitatif sonuçlar verebilmek için daha fazla süre gömülü kalan cesetlerin kemik örneklerindeki ilaç veya toksik madde saptaması yapılabilir. Ayrıca kemik dokusunun bir başka formu olan olan dişte ilaç ve metabolitlerinin dağılımı araştırması yapılarak daha geniş kapsamlı çalışmalar tasarlanabilir. 52 7. KAYNAKLAR 1. Levine B. Principles of Forensic Toxicology. 2nd Ed., Washington: AACCPress, 2003; 3-44. 2. Dinis-Oliveira RJ, Carvalho F, Duarte JA, Remião F, Marques A, Santos A andMagalhães T. Collection of biological samples in forensic toxicology. Toxicol Mech Methods, 2010;20(7):363-414. 3. National Center for Health Statistics. NCHS Data on Drug Poisoning Deaths.National Center for Health Statistics. Erişim: (http://www.cdc.gov/nchs/data/factsheets/factsheet_drug_poisoning.pdf)2010. Erişim Tarihi: 20 Mart 2014. 4. Papoutsis I, Khraiwesh A, Nikolaou P, Pistos C, Spiliopoulou C and Athaneselis S. A fully valideted method for the simultaneous determination of 11 antidepressant drugs in whole blood by gas chromatograpy-mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal,2012;70:557-562. 5. Wyman JF, Dean DE, Yinger D, Simmsons A, Brobst D, Bissell M., et al. The temporal fate of drugs in decomposing porcine tissue. J Forensic Sci,2011;56(3):694-699. 6. Lendoiro E, Quintela O, de Castro A, Cruz A, Lopez-Rivadulla M and Concheiro M. Target screening and confirmation of 35 illicit and illicit drugs and matabolites in hair by LC-MSMS. Forensic Sci Int, 2012;217:207-215. 7. Palmeri A, Pichini S, Pacifici R, Zuccaro P and Lopez A. Drugs in nails: physiology, pharmacokinetics and forensic toxicology. Clin Pharmacokinet, 2000;38(2):95-110. 8. Gupta R and Rammani P. Microbial keratinases and their prospective applications: An overview. Applied Microbiology Biotechnology,2006;70(1):21-33. 9. Wilson AS. The Decomposition of Hair in the Buried Body Environment. In Tibbett M, Carter DO. Soil Analysis in Forensic Taphonomy. CRC Press, 2008;123–151. 10. Drummer OH. Drugs in Bone and Bone Marrow. In: Jenkins AJ. Drug Testing in Alternate Biological Specimens, Painesville-Ohio: Humana Press; 2007. 11. Knight B and Saukko P. Forensic Pathology. 3rd. Ed., London: Arnold, 2004; 36-39. 12. Collins KA and Hutchins GM. Autopsy Performance & Reporting. 2nd. Ed., Ilionis: College of American Pathologists, 2003;257-260. 53 13. Clark MA. Exhumations. In Froede RC. Ed. Handbook of Forensic Pathology. 2nd Ed., Ilionis: College of American Pathologists, 2003; 445-447. 14. Knigt B.Simpson’s Forensic Medicine. 11th. Ed., Arnold, London, Sidney: Auckland, 1997; 19. 15. 5271 sayılı Ceza Muhakemesi Kanunu. Ankara: Tekağaç Eylül Kitap Yayın Dağıtım Ltd. Şti., 2005. 16. Birincioğlu İ, Turan N ve Yaşar Teke H. Trabzon’da feth-i kabir otopsileri. Adli Tıp Dergisi, 2009; 23(2):11-17. 17. Demirci Ş, Doğan KH, Erkol Z ve Deniz İ. Konya’da 2001-2007 yılları arasında gerçekleştirilen feth-i kabir olgularının değerlendirilmesi. Adli Tıp Bülteni, 2008; 13(2):63-68. 18. Gök E, Baduroğlu E, Çetin S, Fedakar R ve Aliustaoğlu FS. Bursa’da otopsisi yapılan fethi kabir olgularının değerlendirilmesi. Uludağ Üniversitesi Tıp Fak Der,2013; 39(1):55-60. 19. Demirel B, Akar T, Odabaşı AB, Özdemir Ç, Bilge Y ve Işık AF. Ankara’da 1996-2003 yılları arasındaki feth-i kabir olguları. Türkiye Klinikleri J Foren Med, 2006; 2(3):53-57. 20. Ubelaker DU. Forensic Science: Current Issues, Future Directions. 1nd. Ed., Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2013; 1-2. 21. Eckert WG. Introduction to Forensic Science. 2nd. Ed., Florida: CRC Press, 2000; 11-12. 22. Koç S and Can M. Birinci Basamakta Adli Tıp. 2. Baskı, İstanbul: İstanbul Tabip Odası, 2011; 14. 23. Poklins A. Forensic Toxicology. In: Eckert WG, Introduction toForensic Sciences. 2nd Ed., Florida: CRC Press, 1997. 24. Vural N. Toksikoloji. Ankara: Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları, 2005. 25. Jickells S and Negruzs A. Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. 1nd Ed., London • Chicago: Pharmaceutical Press, 2008. 26. Moffaf AC, Osselton MD and Widdop B. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. 4th Ed., London • Chicago: Pharmaceutical Press, 2011. 27. Skopp G. Preanalytic Aspect in Postmortem Toxicology. Forensic Sci Int, 2004;142:75-100. 28. Mottram D. Drugs in Sport. 4 Ed., Taylor and Francis Group, 2005. 54 29. Koski A. Interpretation of Postmortem Toxicology Results.Academic Dissertation,Department of Forensic Medicine University of Helsinki, Finland, 2005. 30. Karch SB. Postmortem Toxicology of Abused Drugs.Florida: CRC Press, 2008. 31. Rohrig TP and Hicks CA. Brain tissue: a vivble postmortem toxicological specimen. J Anal Toxicology, 2015;39:137-139. 32. Palmeri A, Pichini S, Pacifica R, Zuccaro P and Lopez A.Drugs in nails: Physiology, pharmacokinetics and forensic toxicology. Clin Pharmacokinet, 2000;38(2):95-110. 33. Kayaalp SO. Tıbbi Farmakoloji. 8. Baskı, Ankara: Hacettepe-Taş Kitapçılık Ltd. Şti., 1998;4344. 34. McIntyre IM and Mallett P. Sertraline concentrations and postmortem redistribution. Forensic Sci Int, 2012;233:249-352. 35. Dayananda R and Kiran J. Entomotoxicology. Int J Medical Tox Forensic Med, 2013;3(2):7174. 36. Rang HP, Dale MM, Ritter JM and Moore PK. Pharmacology. 6 Ed., Churchill Livingstone, 2007. 37. Zedeck BE and Zedeck MS. Forensic Pharmacology. Newyork: Chelsea House Publishers, 2007. 38. Brenner GM and Stevens CW. Pharmacology. 4th Ed., Philadelphia: Elsevier, 2013. 39. Ferner RE. Post-mortem Clinical Pharmacology.Br J Clin Pharmacol, 2008; 66(4):430-443. 40. Harvey RA and Champe PC. Lippincott’s Illustrated Reviews: Pharmacology. 4th Ed. Florida: Lippincott Williams & Wilkins, 2009. 41. Pélessier-Alicot AL, Gaulier JM, Champsaur P and Marquet P. Mechanisms underlying postmortem redistribution of drugs: A Review. J Anal Toxicol, 2003;27:533-544. 42. Vance CS and McIntyre IM. Postmortem tissue concentrations of olanzapine.J Anal Toxicol,2009;33:15-26. 43. Pelissier-Alicot AL, Gualier JM, Champsaur P, Marquet M. Mechanism underlying postmortem redistribution of drugs: A review. J Anal Toxicol,2003;27:533-544. 55 44. McIntyre IM and Escott CM. Postmortem drug redistribution. J Forensic Res,2012;3(6):1-2. 45. Gibson GG and Skett P. Introduction to Drug Metabolism. 3rd Ed., NelsonThornes, 2001. 46. McIntyre IM, King, CV,Boratto, M. et al. Postmortem drug analysis in bone and bone marrow. Therapeut Drug Monit, 2000;22(1):79-83. 47. Raisz LG. Physiology and pathophysiology of bone remodeling. Clin Chem, 1999;45(8):13531358. 48. Marks SC and Odgren PR. Structure and development of the skeleton. In Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA. (eds), Principles of bone biology, 1st Ed., Academic Press, San Diego, CA, 2002;3-6. 49. Rizzo DC.Fundamentals of Anatomy & Physiology. 3rd Ed., USA: Delmar, 2010:138-173. 50. Ganong WF.Review of Medical Physiology. 16th Ed. London: Prentice-Hall International Inc., 1993. 51. Martin RB, Burr RB and Sharkey NA. Skeletal Biology. In Martin RB, Burr RB and Sharkey NA (eds), Skeletal Tissue Mechanics, 1st ed, New York, NY:Springer-Verlag Press, 2007;29-41. 52. Stepensky D, Kleinberg L and Hoffman A. Bone as an effect compartment: Models for uptake and release of drugs. Clin Pharmacokinet, 2003;42(10):863-881. 53. Winek CL, Westwood S and Wahba WW. Plasma versus bone marrowdesipramine: A comparative study. Forensic Sci Int, 1990;48: 49-57. 54. Vandeni TC, Grummett SA and Watterson JH. Utility of immunoassay in drug screening in skeletal tissue : Sampling considerations in detection of ketamine exposure in femoral bone and bone marrow following acute administration using ELISA. J Forensic Sci, 2008;53(6):1474-1482. 55. Watterson, JH and VandenBoer TC. Effects of tissue type and the dose-death interval on the detection of acute ketamine exposure in bone and marrow with solidphase extraction and ELISA with LC/MS/MS confirmation. J Anal Toxicol, 2008;32(8):631-638. 56. Watterson, JH and Botman JE. Detection of acute diazepam exposure in boneand marrow: Influence od tissue type and the dose-death interval on sensitivity of detection by ELISA with liquid chromatography tandem mass spectrometry confirmation. J Forensic Sci, 2009;54(3):708714. 57. Desrosiers, NA, Betit CC and Watterson JH. Microwave-assistedextraction in toxicological screening of skeletal tissues. Forensic Sci Int, 2009;188:23-30. 56 58. Gautam L, Newland C and Cole MD. Drugs from unusual matrices: Using bone tissue as a forensic toxicology specimen. Forensic Magazine, Erişim: http://www.forensicmag.com/articles/2013/07/drugs-unusual-matrices-using-bone-tissue-forensictoxicology-specimen Erişim Tarihi:11.09.2013. 59. McGrath KK and Jenkins AJ. Detection of drugs of forensic importance in postmortem bone. Am J Forensic Med Pathol,2009;30(1):40-44. 60. Desrosiers NA, Watterson JH, Dean D, and Wyman JF. Detection of amitriptyline, citalopram, and metabolites in porcine bones following extended outdoor decomposition. J Forensic Sci, 2012;57(2):544-49. 61. Watterson JH, Donohue JP and Betit CC. Comparison of relative distribution of ketamine and norketamine in decompose skeletal tissues following single and repeated exposures. J Anal Toxicol,2012;36(6):429-33. 62. Raikos N, Tsoukali H, Njau SN. Determination of opiates in post-mortem bone and bone marrow. Forensic Sci Int,2001;123:140-141. 63. Lafreniere NM and Watterson JH. Detection of acute fentanyl exposure in fresh and decomposed skeletal tissues. Forensic Sci Int,2000;185:100-106. 64. Lafreniere NM and Watterson JH. Detection of acute fentanyl exposure in fresh and decomposed skeletal tissues part II: The effect of dose-death interval. Forensic Sci Int,2000;194:60-66. 65. Watterson JH, Desrosiers NA, Betit CC, Dean D, Wyman JF. Relative distribution of drugs in decomposed skeletal tissue. J Anal Toxicol, 2010;34;510-515. 66. Watterson JH and Donohue JP. Relative distribution of ketamine and norketamine in skeletal tissues following various periods of decomposition. J Anal Toxicol, 2011;35:452-458. 67. Watterson JH and Botman JE. Detection of acute diazepam exposure in bone and marrow: ınfluence of tissue type and the dose-ınterval on sensitivity of detection by ELISA with liquid chromatography tandem mass spectrometry confirmation. J Forensic Sci, 2009;54(3):708-714. 68. Guillot E, de Mazancourt P, Durigon M, Alvarez JC. Morphine and 6-acetylmorphine concentrations in blood, brain, spinal cord, bone marrow and bone after lethal acute or chronic diacetylmorphine administration to mice. Forensic Sci Int,2007;166:139-144. 69. Watterson JH and Desrosiers NA. Examination of the effect of dose-interval on setection of meperidine exposure in decomposed skeletal tissues using microwave-assisted extraction. Forensic Sci Int,2011;207:40-45. 57 70. Desrosiers NA and Watterson JH. The effect of burial on drug detection in skeletal tissues. Drug Test Analysis,2010;2:346-356. 71. Terazawa K and Takatori T. Determination of aminopyrine and cyclobarbital from a skeleton by radioimmunoassay. J Forensic Sci,1982;27(4): 844- 847. 72. Benko A. Toxicological analysis of amobarbital and glutethimide from bonetissue. J Forensic Sci,1985;30:708-714. 73. Horak EL, Felo JA, Jenkins AJ. Postmortem tissue distribution of olanzapine and citalopram in an overdose. American Academy of Forensic Sciences 54th Annual Meeting. Atlanta, GA. 2002. 74. Horak EL and Jenkins AJ. Postmortem tissue distribution of olanzapine and citalopram in a drug ıntoxication (Case Report). J Forensic Sci,2005;53(3):679-681. 75. McGrath KK and Jenkins AJ. Analysis of post-mortem bone/bone marrow specimens for drug of ımportance in forensic toxicology. J Anal Toxicol, 2004;29(5): 503. 76. Wohlenberg N, Lindsay T, Backer R et al.Case notes from members: Nortriptyline in maggots, muscle, hair, skin and bone in skeletonised remains. TIAFTBull. 1992;22:19-22. 77. Pellegrini M, Casa A, Marchei E. et al.Development and validation of a gas chromatographymass spectrometry assay for opiates in human teeth. J Pharmacol Biomed Anal, 2005;40(3): 662668. 78. Cattaneo C, Gigli F, Lodi F. et al.Detection of morphine and codeine in human teeth: An aid in the identification and study of human skeleton remains. JForensic Odonto-stomatol, 2003;1(1): 15. 79. Geyde R, Smith F and Westway K. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tet Lett, 1986;27(3):279-282. 80. Lopez-Avila V and Young R. Microwave assisted extraction of organiccompounds from standard reference soils and sediments. Anal Chem, 1994;66(7):1097-1106. 81. Eskilsson CS and Björklund E. Analytical-scale microwave-assistedextraction. J Chrom A, 2000;902:227-250. 82. Thompson S, Budzinski H, LeMenach K. et al.Multi-residue analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorobiphenyls, and organochlorine pesticides in marine sediments. Anal Bioanal Chem, 2002;372:196-204. 83. Lopez-Avila V and Benedicto J. Microwave-assisted extraction combined with gas chromatography and enzyme-linked immunosorbent assay. Trends Anal Chem, 1996;75(8): 334341. 58 84. Franke M, Winek CL and Kingston HM. Extraction of selected drug from serum using microwave irradiation. Forensic Sci Int, 1996;81:51-59. 85. Fernández P, Lago M, Lorenzo RA. et al. Optimization of a rapid microwave-assisted extraction method for the simultaneous determination ofopiates, cocaine and their metabolites. J. Chrom. B. 2009;877:1743-1750. 86. Watterson JH, Desrosiers NA. Examination of the effect of dose-death interval on detection of meperidine exposure in decomposed skeletal tissues using microwave-assisted extraction.Forensic Sci Int, 2011; 207:40-45. 87. Watterson JH, Imfeld AB and Cornthwaite HC.Determination of colchicine and Odemethylated metabolites in decomposed skeletal tissues by microwave assisted extraction, microplate solid phase extraction and ultra-high performance liquid chromatography (MAEMPSPE-UHPLC).J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2014;960:145-150. 88. Cornthwaite HC and Watterson JH. Microwave assisted extraction of ketamine and its metabolites from skeletal tissues. Anal Methods,2014;6:1142-1148. 89. Eskilsson CS and Bjӧrklund E. Analytical-scale microwave-assisted extraction. J Chrom A, 2000;902:227-250 90. Suslick KS. The chemical effect of ultrasound. Sci Am, 1989;260(2):80-86. 91. Luque-García JL, Luque de Castro MD. Ultrasound: a powerful toolfor leaching. Trends Anal Chem, 2003;22(1):41-47. 92. Miller-Ihli NJ. Slurry sample preparation for simultaneous multi-element furnaceatomic absorption spectrometry. J Anal At Spectrom, 1988;3(1):1414-1419. 93. Santos DJ, Krug FS, Pereira MG, et al. Currents on ultrasoundassisted extraction for sample preparation and spectroscopic analyte determination. ApplSpectros Rev, 2006;41(3):305-321. 94. Tor A, Aydin ME and Özcan S. Ultrasonic solvent extraction of organochlorine pesticides from soil. Anal Chim Acta, 2006;559: 173-180. 95. Rothe M, Pragst F. Solvent optimization for the direct extraction of opiatesfrom hair samples. J Anal Toxicol,1995;19: 236-240. 96. Schneider SI, Sibille E, Yegles M, Neels H, Wennig R, Mühe A. Time resolved analysis of risperidone and 9-hydroxy-risperidone in hair using LC/MS-MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2009;877(24):2589-2592. 59 97. Capelo JL, Maduro C, Vilhena C. Discussion of parameters associated with the ultrasonic solidliquid extraction for elemental analysis (total content) by electrothermal atomic absorption spectrometry: An overview. Ultras Sonochem, 2005;12:225-232. 98. Tian Y, Xu Z, Zheng B. et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of pomegranate (Punica granatum L.) seed oil. Ultras Sonochem, 2013;20:202-208. 99. Babic S, Petrovic M, Kaštelan-Macan M. Ultrasonic solvent extraction of pesticides from soil. J Chrom A, 1998;823:3-9. 100. Stevens HM. The stability of some drugs and poisons in putrefying human liver tissues. J Forensic Sci Soc,1984;24:577–89. 101. Butzbach DM, Stockham PC, Kobus HJ, Sims N, Byrad RW, Lokan RJ and Walker GS.Stability of seratonin-selective antidepressants in sterile and decomposing liver tissue. J Forensic Sci,2013;58:117-125. 102. Baselt RC, Cravey RH.Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. 3rded., Foster City, CA: Biomedical Pub, 2002. 103. Molina DK.Handbook of Forensic Toxicoloy for Medical Examiners.Florida, Boca Raton: CRC Press, 2010. 104. Schulz M, Iwersan-Bergmann S, Andresen H, Schmoldt A. Therapeutic and toxic blood concentrations of nearly 1000 drugs and other xenobiotics. Crit Care,2012;16(4):1-4. 105. Nilsson GH, Kugelberg FC, Kronstrand R and Ahlner J. Stability tests of zopiclone in whole blood. Forensic Sci Int, 2010;200:130-135. 106. Shiota H, Nakashima M, Terazono H, Sasaki H, Nishida K, Nakamura J, et al. Postmortem changes in tissue concentrations of triazolam anddiazepam in rats. Leg Med (Tokyo),2004;6(4):224–32. 107. Watterson JH and Cornthwaite HM. Discrimination between patterns of drug exposure by toxicological analysis of decomposed skeletal tissues. Part II: Amitriptyline and citalopram. J Anal Toxicol, 2013;37(8):565-572. 108. Delabarde T, Keyser C, Tracqui A, Charabidze D and Ludes B.The potential of forensic analysis on human bones found in riverine environment. Forensic Sci Int,2013;228:1-5. 109. Vardakou I, Athanaselis S, Pistos C, Papadodima S, Spiliopoulou C and Moraitis K. The clavicle bone as an alternative matrix in forensic toxicological analysis. J Forensic Leg Med,2014;22:7-9. 60 110. Wiebe TR and Watterson JH. Analysis of tramadol and O-desmethyltramadol in decomposed skeletal tissues following acute and repeated tramadol exposure by gas chromatography mass spectrometry. Forensic Sci Int, 2014;242:261-265. 111. Imfeld AB and Watterson JH. Influence of dose-death interval on colchicine an metabolite distribution in decomposed skeletal tissues. Int J Legal Med, 2015. 61 8. ÖZGEÇMİŞ 1988 yılında Adana’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Adana'da tamamladı. 2006 yılında Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü’nde lisans eğitimine başladı ve 2010 – 2011 öğretim yılında mezun oldu. 2012 yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Adli Tıp Anabilim Dalı’nda yüksek lisans eğitimine başladı. 62
![[The arson] Kundakçılık - Celal Bayar University, Department of](http://s1.studylibtr.com/store/data/003368817_1-1810ea17294d46264d336c5e701f7234-300x300.png)
