Materyal ve Metod

ÖZEL EGE LİSESİ
FARKLI BİTKİ TÜRLERİNİN İNSAN PROSTAT KANSERİ (PC3),
İNSAN GÖĞÜS KANSERİ (MCF7) ve FARE FİBROBLAST (NIH-3T3)
HÜCRELERİNDEKİ SİTOTOKSİK, APOPTOTİK, YARA İYİLEŞTİRİCİ
ETKİLERİ ve FARKLI BAKTERİ TÜRLERİNDEKİ ANTİMİKROBİYAL
ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ:
DİLA YURT
EZGİ ŞEN
2013
İZMİR
İÇERİK LİSTESİ
Sayfa
PROJENİN AMACI
3
1. GİRİŞ
3
2.YÖNTEM
4
2.1. Bitki ekstrelerinin hazırlanması
4
2.2. Hücre kültürü
6
2.3. Sitotoksisite belirlenmesi
6
2.4. Apoptoz analizi
7
2.5. Yara iyileşmesi denemesi
7
2.6. Antioksidan aktivite tayini
8
2.7. Antimikrobiyal aktivite tayini
8
3.SONUÇLAR VE TARTIŞMA
9
3.1. Sitotoksisite
9
3.2. Apoptoz
11
3.3. Yara iyileşmesi
16
3.4. Antioksidan aktivite
17
3.5. Antimikrobiyal aktivite
18
4.GENEL DEĞERLENDİRME
18
5.TEŞEKKÜR
19
6.KAYNAKLAR
19
2
PROJENİN AMACI
Günümüzde bitkisel ekstreler farklı kullanım amacı için dünya çapında pek çok
laboratuvarda araştırılmaktadır. En önemli araştırma alanları
kanser tedavisinde
kullanılabilirlik, antimikrobiyal, antimitotik, antioksidan, zirai amaçlı insektisit olarak etkileri,
gıda
paketlemesinde
koruyucu
etkileri
ve
ayrıca
AIDS
hastalığının
tedavisinde
kullanılabilirliktir. Günümüzde onay almış onlarca bitkisel kaynaklı gıda takviyesi eczanelerde
bulunmaktadır. Türkiye florası çok sayıda tıbbi ve endemik bitkiye sahip olduğu için bu
konuda önemli bir potansiyele sahiptir. Bu projede aktarlardan temin edilen hodan (Borago
officinalis), papatya (Matricaria chamomilla), enginar (Cynara cardunculus), , ballıbaba
(Lamium galeobdolon), labada (Rumeoc patienta) bitkileri, karanfil (Syzygium aromaticum)
bitkisinin tohumları ve ayrıca taze olarak toplanan hayıt (Vitex agnus-castus) bitkisinin yaprak
ve tohumlarının antikanserojen, apoptotik, antioksidan, yara iyileştirici potansiyelleri ve
antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
1.GİRİŞ
İnsanoğlu bitkileri çok farklı amaçlar için varoluşundan beri kullanmaktadır.
Günümüzde çok sayıda bitkisel kökenli bileşik önemli ilaçlar arasında sayılmaktadır. Bilinen
en eski ağrı kesici sögüt ağacı kabuğundan elde edilen, tarihi Sümer yazıtlarına kadar
dayanan asetilsalisilik asit adıyla bilinen aspirindir. İlk olarak Alman kimyager Felix Hoffmann
tarafından izole edilmiştir (1). Bilinen diğer bir örnek olan kinin ise Amazon’da yetişen
Cinchona cinsi bitkilerin kabuğundan elde edilmiştir ve günümüzde bu bitkisel alkoloid yapay
olarak
sentezlenerek
ilaç
haline
getirilmiştir.
(2).
1967
yılında
ise
Monroe
E.
Wall ve Mansukh C. Wani, Taxus brevifolia bitkisinin kabuğunda simbiyotik yaşayan bir
mantarın sentezlediği antimitotik taksol bileşiğini izole etmiştir. Bileşik günümüzde akciğer,
rahim, göğüs kanseri olmak üzere pekçok kanser türünün tedavisinin yanısıra, AIDS
hastalarında görülen bir kanser türü olan Kaposi Sarkom’ un tedavisinde de kullanılmaktadır.
(3,4). Günümüzde antitümör ve apoptotik etkisi kanıtlanmış pekçok bitkisel kökenli bileşik
bulunmaktadır. Örneğin Betula alba bitkisinden izole edilen betulinik asit pekçok kanser
türünde etkinliği test edilmiş ve etkin dozları 1-15 μg/ml aralığında bulunmuş olan bitkisel
kökenli bir bileşiktir. (5). Camptothecin ise Camptotheca acuminata bitkisinden elde edilen bir
başka antikanser aktiviteye sahip bileşiktir ve geleneksel Çin tıbbında kullanılan bir bitkidir
(6,7).
FDA (Food and Drug Administration) tarafından onay almış gut, behçet hastalığı,
akdeniz anemisi için ilaç olarak piyasada bulunan diğer önemli bir bitkisel bileşik ise
kolçisindir ve Colchicum autumnale bitkisinin çiçeğinden elde edilir. Aynı zamanda
3
Topoizomeraz I enzimini inhibe ederek mitozu durdurduğu için antikanser potansiyeline
sahiptir (8).
Bitkilerin önemli bir özelliğide antioksidan aktiviteleridir. Antioksidan aktiviteye sahip
bileşikler hücrede oksidasyon sonucu oluşan serbest radikalleri inhibe ederek oksidatif stresi
ortadan kaldırır. Bu mekanizmada oluşan aksama hücrenin ölümüne veya DNA hasarı
sonucu yaşıyan organizmada kansere sebep olabilir. Bilinen en eski antioksidan zeytinyağı
ve kırmızı şaraptır. Kırmızı üzüm çekirdeğinde bulunan resveratrol bileşiğinin çok güçlü
antioksidan ve antikanserojen etkisi vardır (10). Ayrıca yeşil çayın da güçlü bir antioksidan
etkisi olduğu kanıtlanmıştır (11).
Pekçok yararlı etkinin yanısıra bitkisel bileşiklerin yara, yanık iyileştirici ve
antimikrobiyal etkileri araştırılmaktadır. Yapılan çalışmalarda Aleo vera’nın özellikle
yanıklarda çok etkin olduğunu ve kollejen üretimini arttırdığı aynı zamanda yeni sentezlenmiş
kollojenlerin bağ yapmasını sağlayan lizis oksidaz enziminin miktarını arttırdığı kanıtlanmıştır
(12). Gingko biloba ve Centella asiatica bitkilerinin ise in vivo modellerde yara iyileşmesini
epitelizasyon sürecini kısaltma yoluyla hızlandırdığı tespit edilmiştir (13).
2.YÖNTEM
2.1.Bitki Ekstrelerinin Hazırlanması
Hodan (Borago officinalis), papatya (Matricaria chamomilla), enginar (Cynara
cardunculus), karanfil tohumu (Syzygium aromaticum), ballıbaba (Lamium galeobdolon),
labada (Rumeoc patienta) bitkileri aktardan kuru olarak temin edildi. Hayıt (Vitex agnuscastus) bitkisi tohum ve yaprakları Urla bölgesinden toplandı ve 35ºC de etüv içinde
karanlıkta kurutuldu (Resim 1).
Resim 1. Hayıt bitkisi tohumlarının toplanması
4
Bitki örnekleri öğütüldükten sonra katı/sıvı oranı 1:10 olacak şekilde % 70’lik etanol
solusyonu içinde 37ºC de 180 rpm 2 saat inkübatörde (SARTORIUS, CERTOMAT BS-1)
çalkalandı. Süre sonunda örnekler filitreden geçirilerek katı bitki kısmından ayrıldı ve oda
sıcaklığında, 5000 rpm’de 5 dakika santrifüjlenerek muhtemel kalıntılar çöktürüldü(Resim 2,
Resim 3).
Resim 2. Etanol içeren bitki özütü örneklerinin
süzülmesi
Resim 3. Kuru bitkilerin öğütülmesi
Ekstre içindeki etanol döner buharlaştırıcıda (HEILDOPH) 37ºC’de uzaklaştırıldı ve
liyafilizatör (Labconco-Freezone 6) ile kurutuldu. Kurutulan örnekler deneme zamanına kadar
-20ºC de saklandı. Tüm bitki ekstreleri dimetilsülfoksit içinde çözüldü, 0,2 mikronluk enjektör
filtrasyonu yapıldı ve her deneme öncesinde taze olarak hazırlandı.(Resim 4)
Resim 4. Etanolün döner buharlaştırıcıda özütlerden
uzaklaştırılması
5
2.2.Hücre Kültürü
İnsan prostat kanser (PC3) hücre hattı % 5 fetal bovine serum (FBS), 50 µg/ml
gentamisin içeren Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) besiyerinde, insan göğüs
kanseri (MCF7) hücre hattı % 10 fetal bovine serum (FBS), 50 µg/ml gentamisin içeren
Roswell Park Memorial Institude-1640 (RPMI-1640) besiyerinde, fare fibroblast hücre hattı (
NIH-3T3), % 5 fetal bovine serum (FBS), 50 µg/ml gentamisin içeren Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (DMEM) besiyerinde 37ºC de, % 5 CO2 and % 89 nemli inkübatörde kültüre
edildi, % 80-85 yoğunluğa ulaştıklarında pasajlandı. Denemelerde 5-20. pasajlar kullanıldı.
2.3.Sitotoksisite Belirlenmesi
Hücre canlılığının ve bölünmesinin inhibisyonu MTT (3-{4,5-dimetiltiyazol-2yl}-2,5difenil tetrazolyum bromid) (Sigma Chemical Co.) metodu ile belirlendi. Kısaca; her kuyucuğa
1.104 hücre 95µl besiyeri içinde, 96 kuyucuklu plağa inoküle edildi. Ekstrelerin son
seyreltmesi test kuyucukları %1 DMSO içerecek şekilde DMEM içinde hazırlandı. 24 saat
sonra bitki ekstreleri 500 µg/ml, 400 µg/ml, 300 µg/ml, 200 µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml ve 1
µg/ml konsantrasyonlarında üç tekrarlı olarak eklendi. Tüm negatif kontrollerin %1 DMSO
içermesi sağlandı. Hücre canlılığı 24, 48, 72 saatlik zaman dilimleri için belirlendi. Her zaman
diliminin bitiminden 4 saat önce kuyucuklar, önceden 37ºC’ye ısıtılmış PBS ile, ekstrelerin
ölçümde renk girişimi vermemesi amacıyla bir kere yıkandı. MTT stok solüsyonu (5mg/ml)
tam besi yeri içinde 1:10
oranında seyreltilerek test kuyucuklarına eklendi. İnkübasyon
periyodunun bitiminden 30 dakika önce plaklar, formazan kristallerinin kazara kaybını
önlemek amacıyla 1800 rpm’de, oda sıcaklığında, 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant
uzaklaştırıldı. Plaklar, kuyucuklara 100µl DMSO eklenmesinin ardından 5 dakika süreyle 150
rpm’de çalkalandı. Optik yoğunluk mikroplaka okuyucuda (THERMO, VARIO SKAN FLASH)
540 nm’de belirlendi. Sonuçlar yüzde canlılık olarak değerlendirildi ve GraphPad Prism 6
programında ST50 değerleri bulundu. .
Resim 5. Hücre kültürü çalışması ve sitotoksisite belirlenmesi.
6
Resim 6. MTT metodu ile sitotoksisite belirlenmesi
2.4.Apoptoz Analizi
Bileşiklerin apoptotik etkilerini araştırmak için 1900µl hücre süspasiyonu 6 kuyucuklu
hücre kültürü kaplarına kuyucuk başına 1x106 hücre, FBS ve gentamisin içeren besiyeri
içinde ekildi. İnokülasyon sonrası hücrelerin yüzeye tutunabilmesi için 24 saat kültüre edildi.
Bitki ekstreleri dimethyl sulfoxide (DMSO) içinde çözüldü, final konsantrasyonları kuycuklarda
200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml ve 1 µg/ml olacak şekilde eklendi. Bütün kuyucuklarda %1
DMSO konsantrasyonu yapılan dilüsyonlarla sabitlendi. Hücreler ekstreler ile 48 saat
muamele edildi ve süre sonunda apoptotik etkileri üreticinin talimatları doğrultusunda
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen) kullanılarak belirlendi. Veriler akış
sitometre (FacsCanto A, BD Biosciences) cihazı kullanılarak toplandı. PI and Annexin VFITC boyalarının ışımalarını tespit etmek amacı ile yesil solid state 488 lazer eksitasyon için,
556/LP ve 585/40 filtre konfigürasyonu PI verisini toplamak için, 502/LP ve 530/30 filtre
konfigürasyonu FITC verisini toplamak için kullanıldı. İnkübasyon suresinin sonunda
apoptotik hücre yüzdesi belirlendi.
2.5. Yara İyileşmesi Denemesi
Ekstrelerin yara iyileşmesi üzerine etkileri in vitro olarak 3T3 fibroblast hücre hattı
kullanılarak denendi. 100 % metanol ile yıkanmış ve otoklavlanmış steril lameller 6 kuyucuklu
plağa koyuldu ve hücreler her kuyucukta 5.105 hücre olacak şekilde lamellerin üzerine
inoküle edildi. 18 saat inkübasyon sonunda lamellere bağlanmış ve yaklaşık %90 yoğunlukta
olan monolayer üzerinde yaklaşık 1 mm açıklıkta 3 doğrusal yara 200 mL’lik steril tip
kullanılarak oluşturuldu. Kuyucuklardaki besiyeri ve yara açma işlemi sonucu oluşan hücresel
debri uzaklaştırıldı ve bir kez PBS ile yıkamanın ardından taze besiyeri ve DMSO içinde
çozünmüş ekstreler 300 µg/ml, 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml ve 1 µg/ml olacak şekilde
7
eklendi. Negatif kontrollere de aynı işlemler uygulandı ve tüm kuyucukların %1 DMSO
içermesi sağlandı. 0, 24 ve 48 saat inkübasyon sonunda kontrol ve deneme kuyucuklarında
oluşturulan yaraların kapanma miktarları faz kontras mikroskobunda (OLYMPUS-CKX41)
görüntülendi ve Olympus DP2-BSW programı kullanılarak ölçeklendirildi.
2.6. Antioksidan Aktivite Tayini
Bileşiklerin antioksidant aktiviteleri R. E. ve arkadaşlarında (9) anlatılan yöntem ile
belirlendi. ABTS, 7 mM konsantrasyonlu ABTS radikali oluşturacak şekilde 2,45 mM
potasyum persülfat çözeltisi içerisinde çözülerek deney öncesi 12-16 saat karanlıkta, oda
sıcaklığında tutuldu. Deneme esnasında 2mL ABTS çözeltisi optik yoğunluğu 700±20
absorbans olacak şekilde PBS içerisinde hazırlanarak üzerine DMSO içinde %1’lik çözeltisi
halinde hazırlanan 20µl ekstre eklendi ve 734 nm’de 15 dakika boyunca ölçüm yapılarak oda
sıcaklığında absorbans değerleri toplandı. Standart referans olarak etanol içinde çözülen
Trolox 0,04 µmol, 0,035 µmol, 0,030 µmol, 0,025 µmol, 0,02 µmol, 0,015 µmol, 0,01 µmol ve
0,005 µmol değerlerinde kullanıldı. Antioksidan aktivite mikromol Trolox/gram olarak ifade
edildi.
2.7. Antimikrobiyal Aktivite Tayini
Özütlerin antimikrobiyal aktiviteleri Escherichia coli ve Staphylococcus aureus türleri
için saptandı. Bir gün öceden S. aureus tryptik soy agar, E. coli nutrient agar üzerine 37 C de
büyütüldü ve elde edilen koloniler 10 ml 0,9% luk peptonlu su içinde süspanse edildi.
Bakteriyel süspansyon 0,5 McFarland (S. aureus için 5x107 CFU/ml, E. coli için 5x107)
değerinde hazırlandı. S. aerous tryptik soy broth içinde E. coli nutrient broth içinde analiz
edildi.170 µl broth 96 kuyucuklu plağa eklendikten sonra son dilisyonu broth içinde
hazırlanmış ekstreler kuyucuklarda final konsantrasyonları 2000 µg/ml, 1750 µg/ml, 1500
µg/ml, 1000 µg/ml, 750 µg/ml ve 500 µg/ml olacak şekilde 10 µl eklendi. Son olarak 20 µl
bakteri süspansiyonu koyulup bekletilmeden 37ºC de 24 saat süresince mikroplate
okuyucuda (Varioscan Flash, Thermo) inkübe edildi. Kuyucukların absorbans değerleri 600
nm de 15 dakikada bir belirlendi. Gentamisin sülfat pozitif kontrol olarak 250 µg/ml, 100
µg/ml, 50 µg/ml, 30 µg/ml, 10 µg/ml, 1µg/ml ve 0,1 µg/ml konsantrasyonlarda denendi.
Minimum inhibisyon konsantrasyonu büyümenin olmadığı en düşük konsantrasyon olarak
belirlendi.
8
Resim 7. Ölen bakteri hücrelerinin
belirlenmesi için boya enjekte edilmesi
3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
3.1. Sitotoksisite
Yapılan sitotoksisite denemelerinde PC3 hücre hattı üzerinde 24, 48 ve 72 saat
inkübasyon sonunda hodan bitkisinin özütü denenen dozlarda etki göstermemiştir. Hayıt
bitkisinin yaprak ve tohumunun özütleri bu hücre hattı üzerinde en yüksek sitotoksik etkiyi
göstermiştir. Hayıt tohumu için ST50 (sitotoksik 50) değerleri inkübasyon periyotları sonunda
sırasıyla 63,39 µg/ml, 59,06 µg/ml ve 124,7 µg/ml, hayıt yaprağı için 137,4 µg/ml, 66,17
µg/ml ve 81,91 µg/ml bulunmuştur. Enginar bitkisinin özütü her 3 gün için yaklaşık 140 µg/ml
konsantrasyonda ST50 değerlerini verirmiş ve karanfil bitkisinin özütü inkübasyon süresi
uzadıkça artan bir etki göstemiş ve üç gün için sırası ile ST 50 değerleri 253 µg/ml, 150 µg/ml
ve 119 µg/ml olarak bulunmuştur. Ballıbaba bitkisinin ve papatya bitkisinin özütleri için ST50
konsantrasyonları 300 µg/ml’in üzerinde bulunmuştur. Labada bitkisinin özütü ise sadece 48
saat inkübasyon sonunda ST50 değeri 51,73 µg/ml olarak bulunmuştur (Tablo 1).
MCF 7 hücre hattı üzerinde hodan bitkisinin ve ballıbaba bitkisinin özütleri test edilen
dozlarda etki göstermemiştir, hayıt tohumu özütü 71,55 µg/ml, 66,3 µg/ml ve 98,75 µg/ml
ST50 değerleri ile en yüksek sitotoksik aktiviteyi göstermiştir. Hayıt yaprağı özütü için ST50
değerleri 104,8 µg/ml, 90,22 µg/ml ve 142,6 µg/ml, labada bitkisinin özütü için 120,3 µg/ml,
538,9 µg/ml ve 223,9 µg/ml olarak bulunmuştur. Karanfil bitkisinin özütü PC 3 hücrelerine
benzer etki göstermiş ve ST50 değerleri inkübasyon süresi uzadıkca 254,8 µg/ml
konsantrasyondan 197,1 µg/ml ve 113,4 µg/ml değerlerine düşmüştür (Tablo 2).
9
NIH-3T3 hücre hattı üzerinde ballıbaba bitkisinin özütü toksik etki göstermemiş,
enginar, hodan, hayıt tohumu ve hayıt yaprağı özütleri için ST50 değerleri yaklaşık 100 µg/ml
civarında bulunmuştur. Labada özütü için ST50 konsantrasyonları 212,8 µg/ml, 165,4 µg/ml
ve 157 µg/ml, papatya için 94,92 µg/ml, 104,8 µg/ml ve 193,3 µg/ml bulunmuştur. Karanfil
özütünün diğer hücre hatlarında olduğu gibi inkübasyon süresi uzadıkça sitotoksisitesi
artmıştır. ST50 değerleri 395,6 µg/ml, 215,3 µg/ml ve 108,3 µg/ml olarak bulunmuştur (Tablo
3).
Tablo 1. Özütlerin PC 3 hücre hattı üzerine 24 saat, 48 saat ve 72 saat inkübasyon sonunda
sitoksik etkileri (sitotoksik 50: %50 hücre ölümünün gerçekleştiği konsantrasyon)
24 saat
Enginar
Hayıt Tohum
Hayıt Yaprak
Labada
Papatya
Hodan
Karanfil
Ballıbaba
48 saat
2
sitotoksik 50
149 µg/ml
63,39 µg/ml
137,4 µg/ml
335,7 µg/ml
387,1 µg/ml
R
0,74
0,99
0,95
0,4
0,93
253 µg/ml
451,8 µg/ml
0,95
0,85
72 saat
2
sitotoksik 50
R
140,6 µg/ml
0,91
59,06 µg/ml
0,99
66,17 µg/ml
0,9
51,73 µg/ml
0,9
342,9 µg/ml
0,98
sitotoksisite yok
150 µg/ml
0,96
322,2 µg/ml
0,92
sitotoksik 50
138,2 µg/ml
124,7 µg/ml
81,91 µg/ml
380,4 µg/ml
322,7 µg/ml
R2
0,92
0,97
0,9
0,6
0,93
119 µg/ml
300,2 µg/ml
0,94
0,76
Tablo 2. Özütlerin MCF 7 hücre hattı üzerine 24 saat, 48 saat ve 72 saat inkübasyon
sonunda sitoksik etkileri (sitotoksik 50: %50 hücre ölümünün gerçekleştiği konsantrasyon)
24 saat
Enginar
Hayıt Tohum
Hayıt Yaprak
Labada
Papatya
Hodan
Karanfil
Ballıbaba
48 saat
2
sitotoksik50
194,4 µg/ml
71,55 µg/ml
104,8 µg/ml
120,3 µg/ml
353 µg/ml
R
0,84
0,98
0,9585
0,5378
0,98
245,8 µg/ml
0,64
72 saat
2
sitotoksik 50
R
165,9 µg/ml
0,92
66,3 µg/ml
0,98
90,22 µg/ml
0,9764
438,9 µg/ml
0,6286
367 µg/ml
0,98
sitotoksisite yok
197,1 µg/ml
0,88
sitotoksisite yok
10
sitotoksik 50
152,4 µg/ml
98,75 µg/ml
142,6 µg/ml
223,9 µg/ml
303,9 µg/ml
R2
0,93
0,96
0,9557
0,8111
0,95
113,4 µg/ml
0,97
Tablo 3. Özütlerin 3T3 hücre hattı üzerine 24 saat, 48 saat ve 72 saat inkübasyon sonunda
sitoksik etkileri (sitotoksik 50: %50 hücre ölümünün gerçekleştiği konsantrasyon).
24 saat
Enginar
Hayıt Tohum
Hayıt Yaprak
Labada
Papatya
Hodan
Karanfil
Ballıbaba
sitotoksik 50
117,4 µg/ml
85,48 µg/ml
87,93 µg/ml
212,8 µg/ml
94,92 µg/ml
97,29 µg/ml
395,6 µg/ml
48 saat
R2
0,94
0,91
0,98
0,96
0,9
0,99
0,81
sitotoksik 50
R2
80,14 µg/ml
0,96
91,28 µg/ml
0,99
87,09 µg/ml
0,97
165,4 µg/ml
0,96
104,8 µg/ml
0,93
109,7 µg/ml
0,99
215,3 µg/ml
0,83
sitotoksisite yok
72 saat
sitotoksik 50
82,85 µg/ml
104,2 µg/ml
118 µg/ml
157µg/ml
193,3 µg/ml
99,19 µg/ml
108,3 µg/ml
R2
0,96
0,97
0,98
0,89
0,93
0,99
0,88
3.2. Apoptoz
Günümüzde doğal bileşikler ilaç geliştirilmesi ve yeni ilaçların bulunmasıyla ilgili
çalışmalarda artan bir öneme sahiptir ve ayrıca bulunan antikanser ajanların çoğu doğal
kökenlidir. Doğal bileşiklerin antikanser aktiviteleri kanser hücrelerinde hücre ölümü yoluyla
apoptozu tetikleyebilmelerine bağlıdır.
Yapılan denemelerde PC3 kanser hücre hattında 48 saat inkübasyon sonunda hayıt
bitkisinin tohumu ve yaprağının özütleri 200 μg/ml ve 100 μg/ml dozlarında %90’nın üzerinde
apoptotik etki göstermiştir. Enginar özütü 200 μg/ml ve 100 μg/ml dozlarında canlı hücre
yüzdesi 12,3 ve 35,6 olarak bulunmuştur 50 μg/ml ve 1 μg/ml dozları aktivite göstermemiştir.
Karanfil özütü 200 μg/ml konsantrasyonda nekroza neden olurken 100 μg/ml dozunda toplam
%63,8 apoptoza % 10,6 nekroza neden olmuş diğer dozları etkin bulunmamıştır. Hodan
bitkisi denenen dozlarda aktif bulunmamış papatya özütü ise sadece 200 μg/ml dozunda
aktivite göstermiş, canlı hücre yüzdesi 55,8’e gerilemiş %23,2 apoptoz %21 nekroza sebep
olmuştur. Hodan ve papatya özütleri denenen dozlarda apoptotik etki göstermemiştir. (Tablo
4, Şekil 1)
MCF 7 hücre hattı üzerinde sadece hayıt bitkisinin tohumunun özütü etkinlik
göstermiştir fakat apoptoza değil nekroza yol açmıştır (Tablo 5, Şekil 2).
11
Tablo 4. Özütlerin PC 3 hücre hattı üzerine apoptotik etkileri.
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
hayıt yaprak
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
2,9
3,5
90,5
87,4
86,5
2,9
62,6
31,6
2,9
67,1
26,5
1,2
2,6
5,7
0,3
5,6
6,5
0,6
6,8
6,1
enginar
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
12,3
35,6
95,7
82
86,5
6,5
69,7
11,4
3,5
39,8
21,2
0,7
0,7
2,8
1
10,7
6,4
0,6
6,8
6,1
karanfil
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
54,1
25,7
92,2
88,7
86,5
7,2
17,9
20,8
23,4
40,4
10,6
0,4
0,5
6,9
0,5
7,1
3,7
0,6
6,8
6,1
hodan
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
80,6
89,2
95,1
79,7
86,5
1,1
9
9,3
0,9
5,1
4,8
0,7
0,7
3,5
0,7
14,6
5
0,6
6,8
6,1
papatya
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
55,8
83,3
93,9
80,3
86,5
1
22,2
21
0,5
7,2
9
0,6
0,9
4,6
0,7
10,3
8,8
0,6
6,8
6,1
hayıt tohum
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
0,3
0,5
64,4
81,3
86,5
0,1
99,4
0,2
0,2
98,8
0,5
0,7
2,8
32,1
0,6
12,4
5,6
12
0,6
6,8
6,1
Tablo 5: Özütlerin MCF 7 hücre hattı üzerine apoptotik etkileri.
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
canlı
erken
apoptoz
geç apoptoz
nekroz
hayıt yaprak
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
76,9
83,7
73,2
77,7
85,6
1,9
4
17,2
0,8
1,1
14,4
0,4
4,4
22
0,4
2,6
19,2
0,4
1,8
12,3
enginar
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
82,1
89,5
77,9
72,2
85,6
0,9
5
12
0,4
2,6
7,5
0,4
5,6
16,1
0,7
5,1
22
0,4
1,8
12,3
karanfil
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
78
85,8
79
72,1
85,6
4,5
8
9,5
0,8
3,8
9,6
0,5
5
15,5
0,7
5,2
22,1
0,4
1,8
12,3
hodan
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
72
71,8
76,4
72,7
85,6
0,7
7,5
19,8
0,6
11,9
15,7
0,5
5,4
17,8
0,4
6,3
20,6
0,4
1,8
12,3
papatya
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
88,2
85,7
79
71,5
85,6
0,3
4,8
6,7
0,5
2,9
11
0,5
5,5
14,9
0,2
1,7
26,6
0,4
1,8
12,3
hayıt tohum
200 μg/ml 100μg/ml 50 μg/ml 1 μg/ml control
9,4
20
58,3
76,4
85,6
0,6
17,7
72,4
0,3
6,3
73,4
0,3
2
39,4
0,2
0,2
23,3
13
0,4
1,8
12,3
hayıt yaprak
enginar
canlı
Şekil 1. Özütlerin PC3 hücre hattı üzerine apoptotik etkileri
14
karanfil
erken apoptoz
geç apoptoz
hodan
dozlar (µg/ml)
nekroz
papatya
hayıt tohum
control
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
etki (%)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
hayıt yaprak
enginar
canlı
Şekil 2. Özütlerin MCF 7 hücre hattı üzerine apoptotik etkileri
15
karanfil
erken apoptoz
geç apoptoz
hodan
dozlar (µg/ml)
nekroz
papatya
hayıt tohum
control
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
1 μg/ml
50 μg/ml
100μg/ml
200
μg/ml
etki (%)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
3.3. Yara İyileşmesi
Memeli derisinde oluşan yaranın iyileşmesi kompleks bir prosestir ve genel olarak
inflamasyon, yeni dokunun formasyonu ve yeniden modellenmesini içerir. Dokunun uygun
yapısını oluşturabilmek için hücreler epidermal, fibroblast, trombosit kaynaklı, endoteliyal
büyüme faktörleri gibi düzenleyici faktörler kontrolünde bölünmeye başlarlar ve boşluğu
kapatmak üzere yaraya doğru yönelirler. Parankimal hücreler farklılaşıp olgunlaştıktan sonra
orjinal dokunun yerini alırlar (13).
Monolayer hücrelerde hücre-hücre arası kontağın bozulması büyüme faktörleri ve
sitokinlerin yara kenarındaki konsantrasyonlarının artmasına neden olur ve bu durum
bölünme ve migrasyonun artmasını sağlar (14). Yapılan denemelerde ilk 24 saat içinde
kontrol kuyucucuklarındaki yara açıklıkları 1 mm’den 445,07 μm ye düşmüştür. Enginar
bitkisinin özütünün yara iyileşmesi üzerine 24 saat sonunda hiçbir dozda etkinliği
bulunmamış, 300 ve 200 μg/ml dozları toksik etki göstererek hücre morfolojisini bozarak
bağlandıkları yüzeyden kalkmalarına sebep olmuştur.
Hayıt tohumunun özütü 300 ve 200 μg/ml dozlarında toksik etki göstermiş sadece 1
μg/ml konsantrasyonda yara açıklığını 221,89 μm’ye düşürmüştür. Hayıt bitkisinin yaprağının
özütü 300 ve 200 μg/ml dozlarında kontrolün altında iyileşme göstermiş ve sırasıyla 759,89
μm, 529,42 μm olarak kalmıştır. Diğer dozlar anlamlı bir iyileşme göstermemiştir.
Hodan bitkisinin özütü en iyi iyleşmeyi 200 μg/ml konsantrasyonda vermiştir, kullanılan en
yüksek doz kontrol ile karşılaştırıldığında toksik etki göstermemiştir.
Karanfil bitkisinin özütü 300 ve 200 μg/ml dozlarında iyileşmeyi yavaşlatmış. Fakat
100 ve 50 μg/ml dozlarında etki göstermemiştir. 1 μg/ml dozunda ise yara açıklığının 246,87
μm’ye düşmesini sağlamıştır.
Labada bitkisinin özütü 300 μg/ml, 200 μg/ml ve 100 μg/ml dozlarında 24 saat
sonunda iyileşmeye sebep olmasa da 50 ve 1 μg/ml dozlarında yara açıklığını sırasıyla
180,82 μm ve 153,28 μm’ye düşürmüştür.
Ballıbaba bitkisinin özütü 24 saat sonunda sadece en düşük konsantrasyonda etkinlik
göstermiş ve yara açıklığını 282,31 μm’ye düşürmüştür.
48 saat sonuda kontrol kuyucuğunda oluşturulan yara 240,31 μm iken hodan bitkisi ve
labada bitkisi özütlerinin 1 μg/ml konsantrasyonunu içeren kuyucuklarda oluşturulan yaralar
tümüyle kapanmıştır. Ayrıca hodan bitkisinin özütünün uygulandığı tüm kuyucuklardaki yara
açıklıkları kontrole göre daha iyi iyleşme göstermiştir. Labada bitkisinin özütü 100 μg/ml ve
50 μg/ml dozlarında da tümüyle iyileşme sağlamış olmasına rağmen 300 μg/ml ve 200 μg/ml
dozları kontrolün iyileşmesine ulaşamamıştır.
Papatya bitkisinin özütü en iyi etkiyi 1 μg/ml dozunda göstermiş diğer dozlar ve yara
89,15 μm’ye düşmüştür. Diğer dozlar aynı etkinliği göstermemiştir. Ballıbaba, karanfil,
16
enginar, hayıt yaprağı ve hayıt tohumunu özütleri 48 saat sonunda denenen dozlarda anlamlı
bir iyileşmeye sebep olmamıştır (Tablo 6).
Tablo 6 . Yara açıklıkları (µm), t: toksik etki
24 saat
100
50
µg/ml
µg/ml
Kontrol
445,07
Hodan
443,14
141,50
161,41 165,17
Ballıbaba
276,40
318,59
430,72 317,95
Karanfil
754,57
749,33
460,49 487,91
Labada
476,26
546,79
336,01 180,82
Enginar
t
t
691,89 338,45
Hayıt yaprak
759,89
529,42
427,73 431,25
Hayıt tohum t
t
659,51 465,44
Papatya
504,42
412,05
258,36 423,68
300
µg/ml
200
µg/ml
48 saat
100
50
1
µg/ml
µg/ml
µg/ml
240,31
242,91
119,96
79,40
88,96 119,00
0,00
282,31
291,57
144,48
202,43 145,31 143,02
246,87 t
804,15
337,91 235,25 227,24
153,28
544,50
391,10
0,00
0,00
0,00
503,02 t
t
399,92 313,78 271,63
337,34
650,09
684,40
183,61 301,85 232,84
221,89 t
t
663,41 386,59 188,97
210,51
366,25
337,67
119,03 202,99 89,15
1
µg/ml
300
µg/ml
200
µg/ml
3.4. Antioksidan Aktivite
Antioksidan bitkiler günümüzde insan sağlığını koruma ve özellikle kanseri önleme
amaçlı kullanılmaktadır. Denenen özütler içinde labada bitkisinin özütü ve karanfil bitkisinin
özütü en yüksek antioksidan aktiviteyi sırası ile 8704 micromol T/g ve 8246 micromol T/g
olarak göstermiştir. Hodan bitkisinin özütü 2914 micromol T/g, hayıt yaprak özütü 2540
micromol T/g, hayıt tohum özütü 1977 micromol T/g, papatya bitkisinin özütü 1789 micromol
T/g ve ballıbaba bitkisinin özütü 1562 micromol T/g antioksidan aktivite göstermiştir. En
düşük aktiviteyi 663 micromol T/g değeri ile enginar bitkisinin özütü göstermiştir. (Tablo 7)
Tablo 7. Antioksidan aktivite (mikromol TROLOX /g)
Bitki
Hodan
Ballıbaba
Karanfil
Labada
Enginar
Hayıt yaprak
Hayıt tohum
Papatya
Antioksidan
Aktivite
2914 micromol T/g
1562 micromol T/g
8246 micromol T/g
8704 micromol T/g
663 micromol T/g
2540 micromol T/g
1977 micromol T/g
1789 micromol T/g
17
3.5. Antimikrobiyal Aktivite
Yapılan denemelerde bitki özütleri denenen konsantrasyonlarda E. coli üzerinde
antimikrobiyal aktivite göstermemiştir. S. aureus üzerinde ise sadece labada bitkisinin özütü
1500 µg/ml konsantrasyonda bakterinin üremesini inhibe edebilmiştir. (Tablo 8)
Tablo 8. Özütlerin antimikrobiyal aktiviteleri
Hodan
Ballıbaba
Karanfil
Labada
Enginar
Hayıt yaprak
Hayıt tohum
Papatya
Gentamisin sülfat
S aureus
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
1500 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
1 µg/ml
E coli
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
>2000 µg/ml
1 µg/ml
4. GENEL DEĞERLENDİRME
Denemeler sonunda kanser hücreleri üzerinde en iyi sitotoksik ve apoptotik etkiyi
hayıt bitkisi tohumu ve yaprağının özütleri ile enginar ve karanfil bitkileri göstermiş olmasına
rağmen MCF7 hücre hattında sadece hayıt tohumu etki göstermiştir. Fakat bu hücre hattında
ölüm apoptoz ile değil nekroz ile olmuştur. Daha kapsamlı bir şekilde bu özütler diğer kanser
türleri ve ayrıca dayanıklı kanser türleri üzerinde de denenmeli ve aktiviteleri belirlenmelidir.
Yara iyileşmesi denemelerinde en aktif özüt labada bitkisine ait olarak bulunmuştur ve aynı
zamanda tek antimikrobiyal aktivite gösteren bitki de labadadır. Ayrıca hodan bitkisi de yara
iyileşme testlerinde tüm dozlarında etki göstermiş fakat en iyi etkiyi 1 µg/ml değerinde
vermiştir. Papatya ise bir diğer etkin özüt olarak bulunmuştur. Fakat yara iyileştirici etkisi
daha düşük dozlarda denenmelidir.
İlaçlar sadece bir tek kimyasaldan oluşurlar fakat tıbbi bitkilerden elde edilen kaba
ekstreler 400’den fazla bileşik içerebilirler. Bu sebep ile bu kimyasal karışımın içinde bulunan
aktif madde yada maddelerin öncelikle ayrıştırılarak saflaştırılması, tanımlanması ve spesifik
biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi gerekmektedir. Bu aşamadan sonra etkin bileşenler
potansiyellerine göre değerlendirilmelidir. Özellikle labada ve hodan bitkilerinde buılunan aktif
bileşenler yara iyileştirici özellikleri nedeniyle yara bantlarında ve tıbbi yara pomatlarında
kullanılabilir. Yüksek antioksidan etki gösteren bitkiler gıda takviyesi olarak kullanılabilirler.
18
Türkiye’nin tıbbi ve endemik biki potansiyeli ekonomik anlamda bu araştırmalar
kapsamlandırılarak değerlendirilmelidir.
5. TEŞEKKÜR
Laboratuvar çalışmalarımız sırasında bize destek veren, bilgi ve deneyimlerini
paylaşan İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Biyoteknoloji ve Biyomühendislik Uygulama ve
Araştırma Labratuvarında görevli Uzman Özgür Yılmazer’ e teşekkür ederiz. Bize
danışmanlık yapan Bilim Kurulu Eş Başkanımız Ayşe Türker’e, Biyoloji Öğretmenimiz İlkem
Sönmez’ e ve bizi bilimsel çalışmalara teşvik eden ve bu konuda her türlü desteği veren okul
yöneticilerimize teşekkürlerimizi sunarız.
6. KAYNAKLAR
1. Sneader, W., “The discovery of aspirin: a reappraisal”, BMJ, 2000; 321: 23–30
2. World Health Organization., "Guidelines for the treatment of malaria". World Health
Organization. Retrieved 10 August 2009
3. Goodman J., Walsh V., “The story of Taxol: nature and the politics in the pursuit of an anticancer drug”. Cambridge: Cambrice University Press, 2001
4. Sgadari C., Toschi E., Palladino C., Barillari G., Carlei D., Cereseto A., Ciccolella C.,
Yarchoan R., Monini P., Stürzl M., Ensoli B., “Mechanism of Paclitaxel Activity in Kaposi's
Sarcoma” , J Immunol ,2000; 165:509-517
5. Fulda S., “Betulinic Acid for Cancer Treatment and Prevention”, Int. J. Mol. Sci., 2008 9,
1096-1107
6. Pommier Y, Redon C, Rao VA, Seiler JA, Sordet O, Takemura H, Antony S, Meng L, Liao
Z, Kohlhagen G, Zhang H, Kohn KW. “Repair of and checkpoint response to topoisomerase
I-mediated DNA damage.” Mutation Research 2003:532 173–203
7. Pramod T. J., Frank A. F. , Randolph J.K., Orr M.S., Gewirtz D.A. “Induction of DNA
Damage, Inhibition of DNA
Synthesis, and Suppression of c-myc Expression by the
Topoisomerase I Inhibitor, Camptothecin, in MCF-7 Human Breast Tumor Cells”,
Biochemical Pharmacology1998, 55:1263–1269
19
8. Subramanian N., Sundaraganesan N., Sudha S., Aroulmoji V., Sockalingame G.D.,
Bergamin M., “Experimental and theoretical investigation of the molecular and electronic
structure of anticancer drug camptothecin”, Spectrochimica Acta Part A; 2011: 78:1058–1067
9. Roberta R.E., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice Evans C.,
“Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay” Free
Radical Biology and Medicine, 1999; 26: 1231–1237
10. Kaindl U., Eyberg I., Rohr-Udilova N. ,Heinzle C., Marian B., “The dietary antioxidants
resveratrol and quercetin protect cells from exogenous pro-oxidative damage”, Food and
Chemical Toxicology, 2008, 46:1320–1326
11. Lambert J.D., Elias R., “The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea
polyphenols: A role in cancer prevention” , Archives of Biochemistry and Biophysics, 2010:
501;5–72
12. Chitra P., Sajithlal GB., Chandrakasan G. “Influence of Aloe vera on collagen turnover in
healing of dermal wounds in rats”. Ind J of Exp Biol.1998;36:896-901
13. Sabale P. , Bhimani B., Prajapati C. , Sabale V.,“An overview of medicinal plants as
wound healers” Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2012, 2 (11);43-150
14. Fronza M, Heinzmann B, Hamburger M, Laufer S, Merfort I. “Determination of the wound
healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts”.J.
Ethnopharmocology, 2009:126:463-467
20