TÜRKİYE BİLİMSEL VE
advertisement
TÜRKİYE BİLİMSEL VE TEKNİK ARAŞTIRMA KURUMU THE SCIENTIFIC AND TECHNICAL RESEARCH COUNCIL OF TURKEY Küçük hücreli akciğer kanseri hücrelerinde c-myc onkogeninin antisens oligonükleotidlerle baskılanması Sağlık Bilimleri Araştırma Grubu Health Sciences Research Committee KÜÇÜK HÜCRELİ AKCİĞER KANSERİ HÜCRELERİNDE C-MYC ONKOGENİNİN ANTİSENS OLİGONÜKLEOTİDLERLE BASKILANMASI PROJE NO: SBAG-1949 Prof. Dr. WAYNE CRISS Dr. CAFER SAYILIR EKİM 2000 ANKARA ÖNSÖZ “Küçük hücreli akciğer kanseri hücrelerinde c-myc onkogeninin antisens oligonükleotidlerle baskılanması” başlıklı projemiz, gen tedavisinin bir türü olan antisens oligonükleotidlerle onkogenlerin baskılanması konusunda in vitro bir deney sistemi kurmayı ve bu deney sisteminde antisens oligonükleotidlerin bazı etkilerinin incelenmesini amaçlamıştır. Çalışma, c-myc onkogeni amplifiye olan ve olmayan iki tip küçük hücreli akciğer kanseri hücresinde gerçekleştirilmiştir. Kültür ortamında yetiştirilen hücrelerde c-myc antisens oligonükleotidlerin hücre çoğalmasına ve c-myc protein ekspresyonuna olan etkileri değerlendirilmiştir. Yeni bir teknolojiyi kullanıma sokmuş olan projenin, bu konuda yapılabilecek klinik çalışmalara öncülük edeceği umulmaktadır. Bu proje, TÜBİTAK tarafından 1.000.000.000 TL ile desteklenmiş iki yıllık bir projedir. İÇİNDEKİLER Metin Öz 1 Abstract 2 Giriş 3 Genel Bilgiler 3 Gereç ve Yöntemler 5 Bulgular 7 Tartışma ve Sonuç 9 Kaynaklar 11 Tablolar Tablo I. Sens ve antisens oligonükleotidlerin SCLC hücre çoğalmasına etkileri 7 Tablo II. Sens, antisens oligonükleotidlerin ve poliamin ilaçların SCLC hücrelerinde Myc protein ekspresyonuna etkileri 8 Tablo III. Poliamin ilaçlarla kombine edilen antisens oligonükleotidlerin SCLC hücre çoğalmasına etkileri 8 Ek (Makale) Ataç B, Sayılır C, Demirpençe E, Criss W. Polyamine drug inhibition of a small cell lung cancer cell line NIH-H82 with amplified myc oncogene. Turkish J Cancer 30(3):97-103, 2000. BİBLİYOGRAFİK BİLGİ FORMU 1- Proje No: SBAG-1949 2- Rapor Tarihi: 10 Ekim 2000 3- Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri: 1 Ekim 1998-1 Ekim 2000 4- Projenin Adı: Küçük hücreli akciğer kanseri hücrelerinde c-myc onkogeninin antisens oligonükleotidlerle baskılanması. 5- Proje Yürütücüsü ve Yardımcı Araştırıcılar: Prof. Dr. Wayne Criss (yürütücü) Dr. Cafer Sayılır 6- Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Sıhhiye, 06100 Ankara 7- Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi: TÜBİTAK Atatürk Bulvarı No:221 Kavaklıdere, 06100 Ankara 8- Öz (Abstract): Hücre çoğalmasını ve yaşam süresini kontrol eden proto-onkogen niteliğinde bazı genlerde modifikasyonların meydana gelmesi kanserleşme sürecini başlatmaktadır. Protoonkogen niteliğindeki genlerden biri olan c-myc normalde bir transkripsiyon faktörünü kodlamaktadır. Bu proto-onkogenin modifiye olduğu kanserler daha agresif büyüme gösterir, daha kolay metastaz yapar ve tedavilere direnç gösterirler. Son yıllarda genlerin hedeflendiği yaklaşımlar (gen tedavisi) kanserde de yerini bulmaktadır. Bunlar arasında onkogenlerin antisens oligonükleotidlerle baskılanması rasyonel bir yaklaşım olarak ön plana çıkmaktadır. Antisens oligonükleotidler mRNA’ya komplementer olarak sentezlenen oligonükleotidlerdir ve mRNA’ya bağlanarak translasyonunu önlerler. Bu projenin amacı antisens oligonükleotidlerin kullanılmasına yönelik in vitro bir deney sisteminin kurulması ve bu sistemde antisens oligonükleotidlerin bazı etkilerinin incelenmesidir. Çalışmada iki tip insan kaynaklı akciğer kanseri hücresi kullanılmıştır. Bunlardan NCIH82 serisinde c-myc onkogeni amplifiye olmuş, NCI-H209 hücre serisinde ise c-myc onkogeni amplifiye olmamıştır. Her iki hücre serisinde de hücre çoğalması c-myc antisens oligonükleotidleri ile doz-bağımlı olarak baskılanmış, NCI-H82 serisinde baskılanmanın daha belirgin olduğu gözlenmiştir. Aynı hücreler üzerinde kontrol olarak kullanılan sens oligonükleotidlerin ise hücre çoğalmasına hiç bir etkileri olmamıştır. NCI-H82 hücrelerinde antisens oligonükleotidler c-myc protein ekspresyonunu baskılamış, NCI-H209 hücrelerinde ise zaten düşük düzeyde olan c-myc proteini hemen hemen aynı düzeyde kalmıştır. Çalışmada ayrıca bazı poliamin ilaçların antisens oligonükleotidlerle kombine etkilerine bakılmış, c-myc protein ekspresyonu üzerine herhangi bir etkileri olmayan ancak hücre çoğalmasını başka mekanizmalarla baskılayan bu ilaçların, antisens oligonükleotidlerin hücre çoğalmasını baskılayıcı etkilerini arttırdıkları görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, gen tedavisi, c-myc, antisens oligonükleotidler 9- Proje ile ilgili Yayın/Tebliğlerle ilgili Bilgiler Ataç B, Sayılır C, Demirpençe E, Criss W. Polyamine drug inhibition of a small cell lung cancer cell line NIH-H82 with amplified myc oncogene. Turkish J Cancer 30(3):97-103, 2000 10- Bilim Dalı: Doçentlik B. Dalı Kodu: ISIC Kodu: Uzmanlık Alanı Kodu: 11- Dağıtım (*): Sınırlı Sınırsız 12- Raporun Gizlilik Durumu: Gizli Gizli Değil ÖZ Hücre çoğalmasını ve yaşam süresini kontrol eden proto-onkogen niteliğinde bazı genlerde modifikasyonların meydana gelmesi kanserleşme sürecini başlatmaktadır. Protoonkogen niteliğindeki genlerden biri olan c-myc normalde bir transkripsiyon faktörünü kodlamaktadır. Bu proto-onkogenin modifiye olduğu kanserler daha agresif büyüme gösterir, daha kolay metastaz yapar ve tedavilere direnç gösterirler. Son yıllarda genlerin hedeflendiği yaklaşımlar (gen tedavisi) kanserde de yerini bulmaktadır. Bunlar arasında onkogenlerin antisens oligonükleotidlerle baskılanması rasyonel bir yaklaşım olarak ön plana çıkmaktadır. Antisens oligonükleotidler mRNA’ya komplementer olarak sentezlenen oligonükleotidlerdir ve mRNA’ya bağlanarak translasyonunu önlerler. Bu projenin amacı antisens oligonükleotidlerin kullanılmasına yönelik in vitro bir deney sisteminin kurulması ve bu sistemde antisens oligonükleotidlerin bazı etkilerinin incelenmesidir. Çalışmada iki tip insan kaynaklı akciğer kanseri hücresi kullanılmıştır. Bunlardan NCIH82 serisinde c-myc onkogeni amplifiye olmuş, NCI-H209 hücre serisinde ise c-myc onkogeni amplifiye olmamıştır. Her iki hücre serisinde de hücre çoğalması c-myc antisens oligonükleotidleri ile doz-bağımlı olarak baskılanmış, NCI-H82 serisinde baskılanmanın daha belirgin olduğu gözlenmiştir. Aynı hücreler üzerinde kontrol olarak kullanılan sens oligonükleotidlerin ise hücre çoğalmasına hiç bir etkileri olmamıştır. NCI-H82 hücrelerinde antisens oligonükleotidler Myc protein ekspresyonunu baskılamış, NCI-H209 hücrelerinde ise zaten düşük düzeyde olan Myc proteini hemen hemen aynı düzeyde kalmıştır. Çalışmada ayrıca bazı poliamin ilaçların antisens oligonükleotidlerle kombine etkilerine bakılmış, Myc protein ekspresyonu üzerine herhangi bir etkileri olmayan ancak hücre çoğalmasını başka mekanizmalarla baskılayan bu ilaçların, antisens oligonükleotidlerin hücre çoğalmasını baskılayıcı etkilerini arttırdıkları görülmüştür. Anahtar sözcükler: akciğer kanseri, gen tedavisi, c-myc, antisens oligonükleotidler. 1 ABSTRACT Oncogenic modifications in proto-oncogenes which are directly involved in cell proliferation, play a major role in oncogenesis. c-myc is a proto-oncogen that normally codes for a transcription factor. Cancers that have modified c-myc are more aggressive in growth characteristics, more easily metastasize, resist apoptosis and become resistant to chemotherapies. Recently, targeting genes (gene therapy) with oligonucleotide drugs has become a choice of therapy in cancer. Among those, use of antisense oligonucleotides appears to be a rational approach. Antisense oligonucleotides are synthesized complementary to mRNA and they inhibit its translation by forming a duplex structure with mRNA. The aim of this present study is to establish an in vitro experimental system to use antisense oligonucleotides and to evaluate some of their effects in this system. Two human small cell lung carcinoma cell lines were used in this study. In NCI-H82 cell line c-myc oncogene is amplified, and in NCI-H209 cell it is not amplified. Antisense cmyc oligonucleotides inhibited cell growth in both cell lines in a dose-dependent manner. The inhibition was more important in NCI-H82 cell line. Sense oligonucleotides that have been used as control, had no effect on cell growth. Antisense c-myc oligonucleotides inhibited Myc protein expression in NCI-H82, whereas no effect was observed in NCI-H209 cells which already have low Myc levels. Some polyamine drugs, which can inhibit cell growth without affecting Myc expression, were also used in combination with antisense oligonucleotides and an additive inhibitory effect was observed. Key words: lung cancer, gene therapy, c-myc, antisense oligonucleotides. 2 Giriş Kanser etyopatogenezinde genetik değişiklikler önemli yer tutmaktadır. Hücre çoğalmasını ve yaşam süresini kontrol eden bazı genlerde modifikasyonların meydana gelmesi kanserleşme sürecini başlatmaktadır. Multifaktöryel bir hastalık olan kanserin tedavisinde çok çeşitli uygulamalar yer almıştır. Son yıllarda kanserde gen tedavisinden de bahsedilmekte, değişik yaklaşımlar denenmektedir. Bu projenin amacı, kültürdeki kanser hücreleri üzerinde antisens oligonükleotidlerin etkilerinin incelenmesine yönelik bir deney sisteminin kurulması ve böylece bu yaklaşımın in vitro koşullarda uygulamaya konmasıdır. Genel Bilgiler İnsan hücresinde bulunan yüzbinlerce genden bir kısmı proto-onkogen (ras, myc, fos, jun, src gibi), veya tumor baskılayıcı gen (Rb-retinoblastoma, p53 gibi) niteliğindedir (1). Bu genler doğrudan hücre çoğalması ve hücrenin yaşam süresini kontrol eden proteinleri kodlarlar. Proto-onkogenlerin ekspresyonu genelde büyüme faktörleri gibi hücre çoğalmasını uyaran sinyallerle artarken, tümor baskılayıcı genlerin hücre çoğalmasını negatif kontrol edici özellikleri vardır (1-4). Belirli kanser tiplerinde bu genlerden bir ya da bir kaçı onkojenik bir modifikasyona (ör. amplifikasyon veya delesyon) uğramış olabilir. Bu şekilde modifikasyona uğramış olan bir proto-onkogen, onkogen adını alır. Örneğin, normalde bir transkripsiyon faktörünü kodlayan myc onkogeni, bazı meme, akciğer, mide, kolon, rectum kanserleri ile lenfoma ve lösemilerde modifiye olmuştur (5-9). Bu kanserler daha agresif büyüme gösterirler ve daha kolay metastaz yaparlar. Apoptozise ve radyoterapi, kemoterapi gibi tedavilere direnç gösterirler. Dolayısıyla prognozları daha kötüdür. Değişik kromozomlar üzerindeki genlerden çok sayıda Myc proteini kodlanmaktadır. Ancak esas olarak üç major myc geni vardır (c-myc, L-myc, N-myc)(3). Her birinin gen yapıları ve transkripsiyon kontrol mekanizmaları birbirine benzemekte, protein ürünleri de % 3 80-90 oranında homoloji göstermektedir. Myc proteinleri DNA’ya bağlanabilen nükleer transkripsiyon faktörleridir ve hücre siklusunu, proliferasyonu ve apoptozisi kontrol eden genlerin transkripsiyonunu düzenlerler (8-12). Bu üç myc geninden her biri değişik akciğer kanseri tiplerinde modifiye olmuş şeklde bulunabilir (5). Pek çok gelişmiş ve sanayileşmiş ülkede akciğer kanseri, kanser ölümlerinin en başta gelen sebebidir. Bunlar arasında mortalitesi en yüksek grubu ise küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) oluşturmaktadır. Multifaktöryel bir hastalık olan kanserin tedavisinde bu güne kadar değişik yaklaşımlar kullanılmıştır. Son yıllarda oligonükleotid ilaçlarla genlerin hedeflendiği yaklaşımlar (gen tedavisi) kanserde de yerini bulmaktadır (13-14). Değişik tipte oligonükleotidler kullanılarak yapılabilen tedaviler arasında onkogenlerin antisens oligonükleotidlerle baskılanması, özgüllüğü ve hedefin çok iyi tanımlanabilir olmasıyla rasyonel bir yaklaşım olarak çıkmaktadır (15-18). Antisens oligonükleotidler mRNA dizisine komplementer olarak hazırlanan oligonükleotidlerdir. Bunlar mRNA’ya bağlanarak çift iplikçik oluşturmakta ve mRNA’nın ribozoma yerleşmesini önleyerek protein sentezini translasyon aşamasında inhibe etmektedirler. Antisens oligonükleotidlerle yapılan çalışmalarda sıklıkla kullanılan gen gruplarından biri myc gen grubudur (19-23). c-myc geni, gen ekspresyonunun antisens oligonükleotidlerle inhibisyonu amacıyla ilk hedeflenen genlerdendir. Daha çok lenfoma ve lösemilerle yapılan çalışmalarda, in vitro ve in vivo koşullarda c-myc geni baskılanarak hem hücre proliferasyonu inhibe edilmiş, hem de hastalığın prognozu açısından olumlu gelişmeler (blast krizlerinin azalması ve yaşam süresinin uzaması vb) kaydedilmiştir. 4 Gereç ve Yöntemler Hücreler: Çalışmada iki tip insan kaynaklı küçük hücreli akciğer kanseri hücresi kullanılmıştır. Bunlardan NCI-H82 serisinde c-myc onkogeni amplifiye olmuş, NCI-H209 hücre serisinde ise c-myc onkogeni amplifiye olmamıştır. Hücreler American Type Culture Collection’dan elde edilmiş ve Şap Enstitüsü’nde dondurularak saklanmıştır. Gerektikçe hücrelerin çözülüp çoğaltılması yoluyla Şap Enstitüsü’nden hizmet alımı yapılmıştır. Hücreler 25 mM Hepes içeren RPMI-1640 besiyerinde, % 10 fötal dana serumu katkısıyla çoğaltılmışlardır. Haftada iki kez pasaj yapılmıştır. Oligonükleotidler: Fosforotioat kimyasal modifikasyonunu taşıyan sens c-myc (5’-ATG CCC CTC AAC GTT-3’) ve antisens c-myc (5’-AAC GTT GAG GGG CAT-3’) oligonükleotidleri kullanılmıştır. Oligonükleotidler Genomed AŞ’ne ısmarlanmış, Makro Sağlık Ürünleri AŞ (İzmir) aracılığıyla DNAgency (ABD) firmasından ithal edilmişlerdir. Oligonükletidler besiyerinde çözülmüştür. Poliamin ilaçlar: İki poliamin sentez inhibitörü (DFMO ve metilGAG) ve iki poliamin analoğu (BEPUT ve BE4-4-4-4) kullanılmıştır. İlaçlar besiyerinde çözülüp 0.22 μ filtreden geçirilerek hücrelere eklenmiştir. Hücre çoğalmasının izlenmesi: Hücreler altı kuyucuklu hücre kaplarına ekildikten sonra besiyerine antisens, sens oligonükleotidler ve/veya poliamin ilaçlar eklenmiş ve 24 saatlik inkübasyondan sonra (daha önce yapılan çalışmalar bu hücrelerin ilk 24 saatte en hızlı çoğaldıklarını göstermiştir) hücreler toplanmıştır. Hücre miktarı DNA bağlayan bir floresan boya olan DAPI kullanılarak hücresel DNA üzerinden izlenmiştir. Myc protein ekspresyonunun izlenmesi: Antisens, sens oligonükleotidler veya poliamin ilaçlar eklenmiş hücrelerden protein ekstraksiyonu yapılmış ve spesifik Myc antikoru kullanılarak Western blotting yöntemi ile Myc proteini tespit edilmiştir. İlk antikoru tanıyan ikinci bir antikora bağlı enzimatik yolla kemilüminesans üreten bir sistemle protein bandları 5 florometrik yöntemle ölçülebilir hale getirilmiştir. Western blotting yöntemi Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim uygulanmıştır. 6 Dalı Araştırma Laboratuarı’nda Bulgular Her iki hücre serisinde de hücre çoğalması c-myc antisens oligonükleotidleri ile dozbağımlı olarak baskılanmış, NCI-H82 serisinde baskılanmanın daha belirgin olduğu gözlenmiştir. Aynı hücreler üzerinde sens oligonükleotidlerin ise hücre çoğalmasına hiç bir etkileri olmamıştır (Tablo I). Tablo I. Sens ve antisens oligonükleotidlerin SCLC hücre çoğalmasına etkileri NCI-H82 NCI-H209 Kontrol 82,2 50,3 1 ng sens c-myc 84,3 55,8 10 ng sens c-myc 87,4 70,1 100 ng sens c-myc 86,8 84,9 1 ng antisens c-myc 77,5 47,3 10 ng antisens c-myc 41,6 36,7 100 ng antisens c-myc 10,1 28,9 Sonuçlar μg DNA/ml kültür ortamı olarak verilmiştir. NCI-H82 hücrelerinde antisens oligonükleotidler Myc protein ekspresyonunu hücre çoğalmasına ile aynı oranda baskılamış, NCI-H209 hücrelerinde ise diğer hücre tipine göre zaten düşük düzeyde olan Myc proteini miktarında ancak yüksek antisens dozunda bir azalma meydana gelmiştir (Tablo II). Çalışmada ayrıca bazı poliamin ilaçların antisens oligonükleotidlerle kombine etkilerine bakılmış, c-myc protein ekspresyonu üzerine herhangi bir etkileri olmayan (Tablo II) ancak hücre çoğalmasını başka mekanizmalarla baskılayan bu ilaçların, antisens oligonükleotidlerin hücre çoğalmasını baskılayıcı etkilerini arttırdıkları görülmüştür (Tablo III). 7 Tablo II. Sens, antisens oligonükleotidlerin ve poliamin ilaçların SCLC hücrelerinde Myc protein ekspresyonuna etkileri. NCI-H82 NCI-H209 Çoğalma Protein Çoğalma Protein Kontrol 92,4 7,2 43,2 1,1 10 ng sens c-myc 95,2 8,7 55,4 4,7 100 ng sens c-myc 99,1 9,8 73,8 7,2 10 ng antisens c-myc 42,6 3,3 39,2 1 100 ng antisens c-myc 5,5 0,2 29,7 0,2 1 μg DFMO 72,3 7,1 31,6 1,2 1 μg metilGAG 74,8 7,4 35,8 1,1 1 μg BEPUT 40,8 7 27,2 1,2 1 μg BE4-4-4-4 32,5 7,3 24,4 1,3 Sonuçlar hücre çoğalması için μg DNA/ml kültür ortamı olarak, protein miktarı için de bantların florometrik ölçümü olarak (arbitrer ünite) verilmiştir. Tablo III. Poliamin ilaçlarla kombine edilen antisens oligonükleotidlerin SCLC hücre çoğalmasına etkileri. NCI-H82 NCI-H209 Kontrol 88,9 55,5 Antisens c-myc 37,1 32,3 DFMO 59,1 47,3 26 27,2 MetilGAG 63,1 42,3 Antisens c-myc+metilGAG 24,2 31,1 BEPUT 37,1 36,8 Antisens c-myc+BEPUT 1,3 34,5 BE4-4-4-4 28,2 30,1 Antisens c-myc+BE4-4-4-4 1,4 38,7 Antisens c-myc+DFMO Sonuçlar μg DNA/ml kültür ortamı olarak verilmiştir. 8 Tartışma ve Sonuç Bu çalışmada, iki tip SCLC hücresi üzerinde c-myc antisens oligonükleotidlerinin etkisi değerlendirilmiştir. Bu hücrelerden birinde (NCI-H82) c-myc geni 25 kez amplifiye olmuş, dolayısıyla Myc protein ekspresyonu da aynı oranda artmıştır. İkinci hücre tipinde ise (NCIH209) c-myc amplifikasyonu yoktur. c-myc antisens oligonükleotidleri her iki hücre tipinde de doz-bağımlı olarak hücre çoğalmasını inhibe etmiştir. Ancak inhibisyon oranı iki hücre tipinde farklıdır. Antisens oligonükleotidler NCI-H82 hücrelerinin çoğalmasını % 87 oranında baskılarken NCI-H209 hücrelerinin çoğalmasını % 42 oranında baskılamışlardır. c-myc geninin ürünü olan Myc proteini, hücre çoğalmasında önemli rolü olan bir transkripsiyon faktörüdür (5-9) ve NCI-H209 hücrelerinde de normal miktarda bulunmaktadır. O nedenle, bu hücrelerde de inhibisyon görülmüş fakat oranı NCI-H82 hücrelerine göre düşük olmuştur. Bunun sebebi NCI-H82 hücrelerinde hücre çoğalmasının, neredeyse tamamen (ekspresyonu normalden 25 kez fazla olduğu için) Myc proteininin kontrolünde olmasıdır. Antisens oligonükleotidlerle Myc sentezi engellendiğinde, hücre çoğalması da büyük oranda baskılanmaktadır. Aynı deney sisteminde sens oligonükleotidlerin hiç bir baskılayıcı etkisi görülmemiştir. Oligonükleotidler yüksek oranda negatif yük taşıyan moleküller oldukları için, hücre içinde çok çeşitli hedefleri olabilmekte ve buna bağlı nonspesifik etkileri ortaya çıkabilmektedir (1720). Bu nedenle sens oligonükleotidler kontrol amacıyla kullanılmalıdır. Deneylerimizde sens oligonükleotidlerin inhibitör etkilerinin olmaması, antisens oligonükleotidlerin etkisinin spesifik olduğunu göstermektedir. Antisens oligonükleotidlerin hücre çoğalmasını baskılayıcı etkilerinin spesifik olduğunun anlaşılmasından sonra, Myc sentezindeki azalmayı görmek için Western blot yöntemi ile Myc düzeylerine bakılmıştır. NCI-H82 hücrelerinde, hücre çoğalmasının inhibisyonuna paralel oranda Myc proteini de azalmıştır. NCI-H209 hücrelerinde ise ancak 9 yüksek doz antisens oligonükleotid kullanıldığında protein miktarındaki azalma belirgin olmuştur. Ancak hücre çoğalması ile karşılaştırıldığında protein miktarındaki azalmanın daha önemli olduğu görülmektedir. Bu sonuçlar da NCI-H82 hücrelerinde kontrolün bütünüyle Myc proteininde olduğunu, NCI-H209 hücrelerinde ise başka kontrol mekanizmalarının da çoğalma üzerine etkili olduğunu düşündürmektedir. Bu deneyde ilginç olarak sens oligonükleotidler NCI-H209 hücrelerinde Myc düzeylerini arttırmıştır. Bunun bir açıklaması sens oligonükleotidlerin mRNA’yı stabilize edici etkisi olabilir. Bu çalışmada ayrıca antisens oligonükleotidlerle kombine olarak bazı poliamin ilaçların etkileri incelenmiştir. Poliamin ilaçların Myc protein ekspresyonuna hiç bir etkisi olmadığı gösterilmiştir. Poliaminlerin kazein kinaz II (CKII) enzimini aktive edici etkileri vardır (24). Myc proteini de CKII’nin substratlarından biridir (25). Dolayısıyla poliaminlerin Myc ekspresyonuna değil ama fonksiyonuna etkileri vardır. Gerek poliamin sentez inhibitörü olan, gerekse poliamin analoğu olan ilaçlar, antisens oligonükleotidlerle beraber verildiklerinde oligonükleotidlerin hücre çoğalmasını baskılayıcı etkilerini arttırmaktadırlar. Farklı mekanizmalarla inhibisyon yapan bu ilaçlar arasında bir sinerji olduğundan söz edilebilir. Sonuç olarak bu çalışma, yurdumuzda ilk kez fosforotioat antisens oligonükleotidlerin in vitro etkilerinin incelenmesini gerçekleştirmiştir. c-myc antisens oligonükleotidlerinin SCLC hücre çoğalması üzerine spesifik baskılayıcı etkileri olduğu gösterilmiş ve bu etkinin cmyc amplifikasyonu olan hücrelerde Myc sentezindeki azalma ile doğru orantılı olduğu izlenmiştir. Ayrıca, başka bir mekanizma ile etki gösteren ilaçların, antisens oligonükleotidlerin etkisini arttırdığı da görülmüştür. Bu çalışmanın, bu konuda in vitro ve in vivo koşullarda yapılabilecek diğer çalışmalara öncülük edeceği düşünülmektedir. 10 Kaynaklar 1. Hesketh R., Myc oncogene. in The Oncogene Facts Book. ed: Hesketh, R. Academic Press, New York (1995), p:201. 2. Kelly K., Regulation and expression of c-myc in normal and malignant cells, Ann Rev Immunol, 1986; 4: 317-338. 3. Zimmerman K., Alt F.W., Expression and function of Myc family genes. Crit Rev Oncogenesis, 1990; 2: 75-95. 4. Criss W.E., Onkogenler ve Gen Tedavisi, Güneş Kitabevi, Ankara (1996). 5. Prins J. et al, The myc family of oncogenes and their presence and importance in small cell lung cancer and other tumor types, Anticancer Res, 1993; 13: 1373-1386. 6. DePinho R.A., Myc family of oncogenes in the development of normal and neoplastic cells, Adv Cancer Res, 1991; 57: 1-46. 7. Marcu K.B. et al, Myc function and regulation, Ann Rev Biochem, 1992; 61: 809-860. 8. Henriksson M., Lüscher B., Proteins of the myc network: essential regulators of cell growth and differentiation, Adv Cancer Res, 1996; 68: 109-172. 9. Lemaitre JM. et al, Myc in the control of cell proliferation and embryonic development, Adv Cancer Res, 1996; 70: 97-139. 10. Blackwell T.K. et al, Sequence-specific DNA binding by the c-Myc protein, Science, 1990; 250: 1149-1151. 11. Amati B. et al, Oncogenic activity of the c-Myc protein requires dimerization with Max, Cell, 1990; 72: 233-245. 12. Petropoulos C.J. et al, Comparative analysis of the structure and function of the chicken cmyc and v-myc genes: v-myc is a more potent inducer of cell proliferation and apoptosis than c-myc, Oncogene, 1996; 12: 1611-1621. 11 13. Brunton V.G., Workman P., Cell signaling targets for anti-tumor drug development, Cancer Chemother Pharmacol, 1993; 32: 1-19. 14. Skorski T. et al, Antisense oligonucleotide combination therapy of CML blast cells in SCID mice, Blood, 1996; 88: 1005-1012. 15. Dosaka-Akita H. et al, Inhibition of proliferation by L-Myc antisense DNA for the translational inhibition site in human small cell lung cancer, Cancer Res, 1995; 55: 15391546. 16. Anderson W.F., Gene therapy, Scientific American, 1995; 131: 124-128. 17. Calabretta B. et al, Prospects for gene directed therapy with antisense oligonucleotides, Cancer Treatment Rev, 1993; 19: 169-179. 18. Gibson I., Antisense approaches to gene therapy of cancer, Cancer and Metastasis Rev, 1996; 15: 287-299. 19. Cooke S.T., Bennett C.F., Progress in antisense oligonucleotide therapeutics, Ann Rev Pharmacol and Toxicol, 1996; 36: 107-129. 20. Agrawal S., Antisense oligonucleotides towards clinical trials, TIBTECH, 1996; 16: 376387. 21. Calabretta B., Skorski T., Targeting c-myc in leukemia, Anticancer Drug Design, 1997; 12: 373-381. 22. Skorski T. et al, Antisense oligonucleotide combination therapy of primary chronic myelogenous leukemia blast crisis in SCID mice, Blood, 1996; 88: 1005-1012. 23. Citro G. et al, c-myc antisense oligonucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vitro and in nude mice, Cancer Res, 1998; 58: 283-289. 24. Leroy D. et al, Chemical features of the protein kinase CK2 polyamine binding site, Biochemistry, 1997; 36: 1242-1250. 12 25. Luscher B., Myc oncoproteins are phosphorylated by casein kinase II, EMBO J, 1989; 8: 1111-1119. 13
