Dilek Nas Tez - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi
advertisement
1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ İLAÇLARDAKİ ORGANİK SAFSIZLIKLARIN TANIMLANMASI VE TAYİNİ Hazırlayan Dilek NAS Danışman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Tezi Mayıs–2013 KAYSERİ i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Dilek NAS ii YÖNERGEYE UYGUNLUK “İlaçlardaki Organik Safsızlıkların Tanımlanması ve Tayini” adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Dilek NAS Danışman Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN iii “İlaçlardaki Organik Safsızlıkların Tanımlanması ve Tayini” adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Hazırlayan Danışman Dilek NAS Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN ONAY: Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’ nın................... tarih ve …………..……………sayılı kararı ile onaylanmıştır. …/…/…… Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan iv TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ’a, hayatım boyunca maddi ve manevi desteğini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Dilek NAS Kayseri, Mayıs 2013 v İLAÇLARDAKİ ORGANİK SAFSIZLIKLARIN TANIMLANMASI VE TAYİNİ Dilek NAS Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ ÖZET Farmasötik dünyada, ilaç maddesi dışında kalan diğer organik maddeler ya da API kalıntıları gibi istenmeyen kimyasallar ve sentez dışında ortaya çıkan maddeler, safsızlık olarak kabul edilir. Safsızlık, formülasyon sırasında ya da ilaçtaki API ya da formüle edilmiş API’nin kalitesini kaybetmesiyle oluşabilir. Bu istenmeyen kimyasal maddelerin küçük miktardaki varlığı bile, farmasötik ürünlerin etkinliğini ve güvenliğini etkileyebilir. Bir başka deyişle; safsızlık, etken maddenin ya da ilaç maddesinin saflığını etkileyen herhangi bir maddedir. Kullanım bakımından, bir ilaç maddesi safsızlık olarak üstün farmakolojik veya toksikolojik özellikleri olan bir madde içerse dahi, saflığı tehlikeye girer. GC-MS ve HPLC-MS gibi kombine analitik teknikler ilaçlardaki organik safsızlıkların (parçalanma ürünleri, yan reaksiyon ürünleri gibi) tanımlanması ve tayini için vazgeçilmez araçlardır. Anahtar kelimeler: Safsızlık, organik safsızlık, ilaç vi IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF ORGANIC IMPURITIES IN DRUGS Dilek NAS Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Analytical Chemistry Graduation Project, May 2013 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ ABSTRACT In the pharmaceutical world, an impurity is considered as any other organic material, besides the drug substance, or ingredients, arise out of synthesis or unwanted chemicals that remains with API’s. The impurity may be developed either during formulation, or upon aging of both API’s and formulated API’s in medicines. The presence of these unwanted chemicals, even in small amount, may influence the efficacy and safety of the pharmaceutical products. In other words, the impurity is any material that affects the purity of the material of interest viz. active ingredient or drug substance. From the standpoint of its usage, the drug substance is compromised in terms of purity even if it contains another material with superior pharmacological or toxicological properties. Hyphenated techniques, such as GC-MS and HPLC-MS, are inevitable tools in the identification and determination of organic impurities (degradation products, products of side-reaction etc) in drugs. Keywords: Impurity, organic impurities, drug vii İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK .................................................................................. i YÖNERGEYE UYGUNLUK......................................................................................... ii KABUL ONAY ...............................................................................................................iii TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iv ÖZET................................................................................................................................ v ABSTRACT .................................................................................................................... vi İÇİNDEKİLER ............................................................................................................. vii ŞEKİLLER LİSTESİ ..................................................................................................... ix KISALTMALAR ............................................................................................................ x 1. GİRİŞ VE AMAÇ ....................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 5 2.1. İLAÇLARDAKİ SAFSIZLIKLARIN KAYNAKLARI VE YAPISI.................... 5 2.1.1. Organik Safsızlıklar ......................................................................................... 5 2.1.1.1. Sentezde Son Ara Ürün ............................................................................ 5 2.1.1.2. Sentezdeki Tamamlanmamış Reaksiyon Ürünleri .................................... 6 2.1.1.3. Aşırı Reaksiyon Ürünleri .......................................................................... 8 2.1.1.4. Sentezde Kullanılan Başlangıç Maddesinden Kaynaklanan Safsızlıklar 10 2.1.1.5. Reaksiyon Çözücüsünden Kaynaklanan Safsızlıklar .............................. 10 2.1.1.6. Katalizör Kaynaklı Safsızlıklar ............................................................... 11 2.1.1.7. Yan Reaksiyon Ürünleri .......................................................................... 11 2.1.1.8. Parçalanma Ürünü Safsızlıklar................................................................ 13 2.1.1.9. Enantiomerik Safsızlıklar ........................................................................ 14 2.1.2. İnorganik Safsızlıklar..................................................................................... 14 2.1.3. Çözücü Kalıntısı Safsızlıklar ......................................................................... 15 2.1.4. Sıvağdaki Safsızlıklar .................................................................................... 17 2.2. ORGANİK SAFSIZLIKLARIN PROFİLİ İÇİN STRATEJİLER ...................... 19 2.2.1. Organik Safsızlıkların Belirlenmesi............................................................... 21 viii 2.2.1.1. Bilinen Potansiyel Safsızlıklar ile Bilinmeyen Safsızlıkların Kromatografik Tutunma Değerlerinin Eşleştirilmesi Yöntemi............................ 22 2.2.1.2. Safsızlık Yapılarının Belirlenmesinde Kromatografik, Spektroskopik ve Kombine Tekniklerin Uygulamaları .................................................................... 23 2.2.2. Safsızlıkların Sentezi ..................................................................................... 27 2.2.3. Safsızlıkların Kantitatif Tayini ...................................................................... 28 3. SONUÇ ....................................................................................................................... 30 4. KAYNAKLAR .......................................................................................................... 32 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 34 ix ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1. Aspirin ve içerdiği organik safsızlıkların kimyasal yapıları. ............................... 3 Şekil 2. 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ve sentezde gerçekleşen üç yan reaksiyon ...... 6 Şekil 3. Etinodiol diasetat’ın kimyasal yapısı ................................................................... 7 Şekil 4. Pipekuroniyum bromür’ün kimyasal yapısı....................................................... 7 Şekil 5. Enalapril (1a), lisinopril (2d) ve bunların dönüşümleri ....................................... 8 Şekil 6. Tolperison sentezi ve oluşan 3 safsızlık .............................................................. 9 Şekil 7. Piridinol karbamatın sentezi ve safsızlıklarının kaynakları ............................... 10 Şekil 8. Propranolol ve sentezi sırasında oluşan safsızlık (dimerik yapı) ...................... 12 Şekil 9. 2 Yan reaksiyonla 17α-etinil-17-hidroksi steroid’deki 17-hidroksi grubunun asetilasyonu ...................................................................................................... 12 Şekil 10. Danazolün oluşumu ve İsodanazol safsızlığı ................................................... 13 Şekil 11. İlaçlardaki safsızlıkların tanımlanması, yapı aydınlatması ve tayini. .............. 20 x KISALTMALAR API : Aktif İlaç Bileşeni CE : Kapiler Elektroforez CEC : Kapiler Elektrokromatografi FT-IR : Fourier Dönüşüm Kızılötesi Spektroskopisi GC : Gaz Kromatografisi HCl : Hidroklorik Asit HPLC : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi IR : İnfrared Spektroskopisi IUPAC : Uluslar Arası Saf ve Uygulamalı Kimya Birliği İTK : İnce Tabaka Kromatografisi LC : Sıvı Kromatografisi MS : Kütle Spektrometresi NaOH : Sodyum Hidroksit NMR : Nükleer Manyetik Rezonans Rf : İTK’da Yürüme Hızı SFC : Süperkritik Akışkan Sıvı Kromatografisi UV : Ultraviole 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ İlaç, tıpta kullanılan ve biyolojk etkinliği olan (biyoaktif) saf bir kimyasal maddeyi ya da ona eşdeğer olan bitkisel veya hayvansal kaynaklı, standart miktarda aktif madde içeren bir karışımı ifade eder. Dünya Sağlık Örgütü ise ilacı ‘fizyolojik sistemleri veya patolojik durumları, alanın yararı için değiştirmek veya incelemek amacıyla kullanılan veya kullanılması öngörülen bir madde ya da ürün’ olarak tanımlar (1). Etkinlik ve güvenlik ilaç tedavisinde iki önemli temel konudur. Sentetik, biyoteknolojik, farmakolojik ve klinik araştırmalarda, en etkili ilaç materyalinin ve onun optimum dozaj formunun belirlenmesinde, ilaç analisti, analitik kimyacı olarak destek vererek, dolaylı fakat çok önemli rol oynar (2). İlaç tedavisinin güvenliği iki önemli faktör ile belirlenir: • İlaç maddesinin farmakolojik ve toksikolojik profili, yani, ilaç materyalinin insan organizmasına yararlı ve advers (ters) etkileri arasındaki ilişkidir. Saf bir ilaç materyalinin ters etkileri, onun kendisine ait özelliklerinden kaynaklandığı için, ilaç analisti bu noktada ilaç tedavisinin güvenliğinin arttırılmasında çok fazla bir şey yapamaz. • Bulk ilaç materyalinde ve onun dozaj formlarındaki safsızlıkların neden olduğu ters etkiler. Safsızlıkların izlenmesi ve kontrolü dikkate alındığında analitik kimyacının ilaç tedavisinin güvenliğine katkısı açık ve ortadadır. Bu yüzden, safsızlıklar ile ilgili analitik aktiviteler modern farmasötik analizde en önemli konular anasındadır. Safsızlık, başlangıç maddesi, ortamdaki bileşenler veya yan reaksiyonlar sonucu oluşan ve orijinal ilaçla birlikle bulunabilen herhangi bir madde olarak tarif edilmektedir (3). Diğer bir deyişle, safsızlık; bir aktif ilaç bileşeninin (API) veya bir ilacın saflığını etkileyen herhangi bir madde olarak tanımlanır. “Safsızlık profili” ise ilaç hammaddelerinde ve farmasötik formülasyonlardaki organik, inorganik, sıvağ ve 2 çözücü kalıntılarının belirlenmesi, tanımlanması ve kantitatif tayinini hedefleyen bir analitik aktiviteler grubunun genel bir ismi olarak kabul edilmektedir. (2) Endüstriyel ve ilaç kontrol laboratuarlarında gerçekleştirilen analitik çalışmaların nihai hedefi, ilaç üreticilerine terapötik kulanım için yüksek kalitede ilaç üretiminde yardımcı olmaktır. Bir ilaç hammaddesi örneğinin kalitesini tanımlamanın en iyi yolu onun saflığının belirlenmesidir. Bu amaca ulaşmak iki şekilde mümkündür. Bunlar; yüksek doğruluğa ve kesinliğe sahip spesifik bir metot ile aktif ilaç bileşeninin veya onun safsızlıklarının tayinidir. İlaç analizinin ilk yıllarında, kromatografik tekniklerin henüz uygulanabilir olmadığı zamanlarda, ilaçların saflık kontrolü spesifik olmayan titrimetrik ve fotometrik metotlarla aktif ilaç bileşeninin tayinine dayanmaktaydı. Analitik cihaz teknolojisinin son birkaç on yılda muazzam gelişmesiyle ilaç materyallerinin saflığının belirlenmesi için yeni yöntemler ortaya çıkarılmaktadır. Böylece, günümüzde, spesifik olmayan tayin metotlarının hayli spesifik ve kesin metotlar (çoğunlukla HPLC) ile yer değiştirmesi sağlanarak ilaç hammaddesi materyallerinin aktif ilaç bileşeninin daha doğru ve kesin tayini mümkün olmaktadır. Buna rağmen, farmakopelerin son baskılarında uygun fonksiyonel gruplar içeren ilaç maddelerinin tayinleri hala klasik ve spesifik olmayan metotlara dayanmaktadır ve HPLC metotları sınırlı sayıda tayin için kullanılmaktadır. Bunun muhtemel iki sebebi vardır (2). Birincisi, maliyet ve harcanan zaman açısından bu iki yaklaşım arasında muazzam bir fark olmasıdır. Titrasyonlar ve spektrofotometrik ölçümler minimum maliyetle çok kısa bir süre içinde gerçekleştirilebiliyorken, bir HPLC metodu genellikle zaman isteyen sistem, uygunluk testleri, test materyalinin ve referans standardın pek çok paralel çalışmasını ve aynı zamanda pahalı ensturmentasyon, kolonlar ve çözücüler gerektirir. Diğer taraftan, tabii ki, iki yaklaşımla elde edilen sonuçların değeri spesifiklik ve doğruluk bakımından birbirleriyle karşılaştırılamaz. İkincisi, ilaç materyallerinin tayininde HPLC metotlarının, yukarıda bahsedilen analitik teknoloji gelişiminin bir sonucu olarak, genel ilerleme eksikliğinin sebebi olarak safsızlıkların incelenmesinde assay metotlarından daha büyük bir şekilde gelişim göstermesine neden olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, IUPAC’ın bahsettiği gibi, bir ilacın kalitesi (saflığı) safsızlıklarının karakterizasyonu ve kantitatif olarak tayiniyle çok daha verimli bir şekilde incelenebilir. Örneğin, bir ilaç hammaddesi materyalinin aktif 3 ilaç bileşeni yüzdesi hayli spesifik, doğru ve kesin bir metot kullanılarak %0,5 bağıl standart sapma ile %99,0 bulunur ise, saflık % 99,0 ± 0.5 dır ve tolere edilemeyen belirsizlik içerir. Aksine, safsızlıklar doğrudan tayin edilerek çok daha iyi bir şekilde karakterize edilebilirler. Analitik teknolojideki değişiklerin ve ilaç saflığı konusunda sürekli artan taleplerin bir sonucu olarak, farmasötik analizdeki düşünce şekli büyük oranda değişmektedir. Modern farmasötik analizlerde, safsızlıkların incelenmesinin önemi artarken, assay metotlarının öneminin azaldığı görülmektedir (2). En klasik ilaçlardan birisi olan aspirinin durumu (saflığı ve safsızlığı), yukarıda bahsedilen değişikliğe örnek olarak verilebilir. Farmakopelerde, aspirinin (1 nolu bileşik) saflığı (kalitesi) ve içerisindeki safsızlığı olmak üzere iki şekilde belirlenir. Saflığı, ilaç hammaddesi örneğindeki aspirinin aşırı NaOH ile reaksiyonu ve artan NaOH’in ayarlı HCl ile geri titrasyonu ile tayin edilmektedir. Safsızlığı ise, aspirinin başlıca safsızlık veya bozunma ürünü olan serbest salisilik asit (2 nolu bileşik) için bir renk testi ile belirlenmektedir. Yaklaşık 20-25 yıl önce, farmasötik analizde HPLC yönteminin kullanımının yaygınlaşmaya başlamasıyla, ilaç hammaddesi örneklerin ve aspirin tabletlerin salisilik aside ek olarak üç tane (3-5 nolu bileşikler) daha safsızlık içerdiği bulunmuştur (Şekil 1.). Bunlardan 4 nolu safsızlık bazı durumlarda %1 düzeylerine kadar ulaşmıştır (4,5). Bu safsızlıkların protein amino fonksiyonları ile reaksiyon verme özelliğinin, aspirinin alerjik etkilere sebep olmasına yol açtığı düşünülmüştür (6). Yukarıda bahsedilen safsızlıkların hepsi, aspirinin saflık tayininde kullanılan titrasyon yönteminde NaOH harcamaktadır. Bu yüzden bu safsızlıkların varlığı bu yöntemle belirlenemez (2). Şekil 1. Aspirin ve içerdiği organik safsızlıkların kimyasal yapıları. 4 Bu çalışmada, ilaç hammaddesi materyali ve farmasötik formülasyonlarda bulunan organik safsızlıkların kaynakları, tanımlanması, tayini ve karakterizasyonu için geçmişten günümüze kadar kullanılan metotlardaki gelişmeler incelenmiştir. 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. İLAÇLARDAKİ SAFSIZLIKLARIN KAYNAKLARI VE YAPISI 2.1.1. Organik Safsızlıklar İlgili, sıradan ve sentezle ilgili safsızlıklar olarak adlandırılan organik safsızlıklar, ilaç hammaddesi sentezinin çeşitli evrelerinden ve ilaç dozaj formlarının hazırlanmasından kaynaklanabilir. Sentezle veya prosesle ilgili safsızlıklar ile parçalanma ürünleri arasında net bir ayırım yapmak her zaman mümkün değildir. Parçalanma ürünleri, sentez, son ürünün izolasyonu, hammaddenin depolanması ve özellikle dozaj formlarının formülasyonu ve depolanması sırasında oluşabilir (7). Bu bölümde görüldüğü gibi safsızlıkların çoğunluğu ilacın üretim sürecinin sentetik yolağının karakteristiğidir. Burada aynı ilaç maddesinin hazırlanması için birkaç sentetik yolak vardır ve bu ilaçlardan jenerik olanların çoğu pratikte kullanılabilir. Avrupa Farmakopesi tarafından sunulan muhtemel safsızlıkların yapıları birçok durumda verilememektedir (8). Farklı sentezler diğer yapıların ortaya çıkmasına neden olabilir. Organik safsızlıkların kaynaklarına göre sınıflandırılması aşağıda verilmektedir (9). 2.1.1.1. Sentezde Son Ara Ürün Bu kategoriye giren safsızlıklar genellikle ‘olası’ ya da ‘beklenen’ safsızlıklar olarak adlandırılır. Örneğin; parasetamol sentezinde en son basamak, 4-aminofenol’ün asetilasyonudur. 4-aminofenol, Avrupa Farmakopesi’inde fotometrik olarak ölçülen, bulk ilaç hammaddesindeki olası bir safsızlıktır (8). Farmasötik açıdan birçok önemi olan 17α-etinil-17-hidroksi-steroidler, 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ile hazırlanır. Bu nedenle 17-oksosteroidler (Şekil 2.), etinilsteroidlerin olası safsızlığıdır. Steroidlerden başka bir örnek de prednisolondur. Prednisolon sentezinin son aşamasında 6 mikrobiyolojik dehidrogenasyonla yapıya (delta1) bir çift bağ girişi sağlanır. Bu nedenle prednisolonda olasılığı yüksek safsızlık 1,2-dihidro türevi olan hidrokortizon’dur (10). Şekil 2. 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ve sentezde gerçekleşen üç yan reaksiyon 2.1.1.2. Sentezdeki Tamamlanmamış Reaksiyon Ürünleri Eğer son ara ürün, iki fonksiyonel gruba sahipse ve son aşama bunların her ikisinin de aynı reaksiyonunu içeriyorsa, her zaman için olası durum bunlardan sadece birinin reaksiyona girmesi ve reaksiyonda kısmen safsızlık olarak görülmesidir. Bu tür safsızlıklar da olası safsızlıklar kategorisinde yer alır. Örneğin; etinodiol diasetat sentezlerinden birinde (Şekil 3.) etinodiolün diasetilasyonu (17α-etinilestra-4-en-3β,17diol) son aşamadır. Sekonder 3-hidroksi grubunun aktivitesi, tersiyer 17-hidroksilin aktivitesinden daha yüksek olduğu için olası (ve gerçek) safsızlık etinodiol-3-asetattır. Benzer şekilde, pipekuroniyum bromür (2β, 16β-bis-(4dimethylpiperazino)-3α, 17α- 7 diacetoksi-5α-androstane dibromür) (Şekil 4.) sentezinin son aşaması 3α, 17β-dihidroksi türevinin diasetilasyonudur ve muhtemel safsızlık da 17β-monoasetil türevidir (10). Şekil 3. Etinodiol diasetat’ın kimyasal yapısı Tamamlanmamış reaksiyon gibi safsızlık kaynakları, sentezlerin son aşamasıyla kısıtlı değildir. Örneğin; enalapril maleat ve lisonopril sentezlerinden birinde (şekil 5.) -CH2Ph yapısı -CO-Ph molekülü olarak girdirilir. Bu molekül okso grubun katalitik hidrogenasyonuyla –CH2-Ph e dönüştürülür. Azalmamış ya da kısmen azalmış okso grubu (CH(OH)-Ph), safsızlık olarak enalapril ve lisinoprilin okso ve hidroksi türevlerini oluşturur (10). Şekil 4. Pipekuroniyum bromür’ün kimyasal yapısı 8 Şekil 5. Enalapril (1a), lisinopril (2d) ve bunların dönüşümleri 2.1.1.3. Aşırı Reaksiyon Ürünleri Birçok durumda son reaksiyon basamağı yeterince seçici değildir ve ortamdaki reaktif son ara ürüne atak eder. Örneğin nandrolonun (19-nortestosteron,17β-hidroksi-estra-4en-3-on) dekanolasyonuyla oluşan nandrolon dekanoatta 4-en-3-on, bir enol ester tipi safsızlık olan estra-3,5-dien-3,17B-diol-bis-dekanoat’ı dekanoasyonla oluşturabilir. Aşırı reaksiyonlar sadece son aşamada değil, sentezin önceki aşamalarında da gerçekleşebilir. Örneğin yukarıda bahsedilen enalapril maleat ve lisinopril sentezinde – 9 CO-Ph redüksiyonu sadece tamamlanmamış reaksiyon kısmında gerçekleşmeyebilir, bunun için artı bir redüksiyon şartı aranır. Fakat bu durum da fenil halkasının hidrogenasyonuna yol açar; bu siklohekzil-enalapril ve siklohekzil-lisinopril safsızlık kaynağıdır. Aşırı reaksiyon ihtimaline başka bir örnek de redüksiyon gerektiren kompleks metal hidrürleriyle yukarda bahsedilen etinodiol, noretisteronun (17α-etinil17-hidroksi-estr-4-en-3-on) 3-okso grubunun redüklenmesiyle oluşur. Şekil 2.’de fazla reaksiyon 4-en-3-okso grubu içeren steroidlerde gösterilmiştir. 4-en-3,17-dion etinilasyonunda, etinilasyon tamamen bölge seçici değildir: 17α-etinil-17-hidroksi steroidlerin formülasyonunda safsızlığı 3,17-dietinil türevleri oluşturur (10). Aşırı reaksiyonun diğer türleri de gerçekleşebilir. Şekil 6.’da görüldüğü gibi, tolperison Mannich kondensasyonuyla hazırlanır (4-metilpropiyofenonun, 1 mol formaldehit ve piperidinle reaksiyonu). Eğer reaksiyona 2 mol formaldehit katılırsa, hidroksimetil grubu içeren bir safsızlık görülebilir. Şekil 6. Tolperison sentezi ve oluşan 3 safsızlık Diğer bir örnek de, piridinol karbamat sentezinde klorlama (klorinasyon) aşamasıdır. 2,6-lutidinin fotokataliz yoluyla klorlama reaksiyon ürünü, bis-klorometil türevidir. Bu da iki adımla sonuç ürününe dönüştürülür. 2,6-lutidinin klorlama sırasında oluşan fazla 10 reaksiyon ürünü trikloro türevidir. Şekil 7.’de gösterildiği gibi hidroksi türevi piridinol karbamatın prokürsörüdür (9). Şekil 7. Piridinol karbamatın sentezi ve safsızlıklarının kaynakları 2.1.1.4. Sentezde Kullanılan Başlangıç Maddesinden Kaynaklanan Safsızlıklar İlaç sentezindeki başlangıç maddesinin içerdiği safsızlıklar, ilaç maddesindeki safsızlıkların kaynağı olabilir. Bu durumda başlangıç maddesindeki safsızlık, aynı başlangıç maddesi gibi reaksiyon verir ve oluşan bileşikler çoğu zaman izomerik safsızlıkları oluşturur. Örneğin; 3-triflorometil-α-etilbenzhidrol (flumecinol)’deki izomerik 4-triflorometil safsızlığı, sentez başlangıç maddesi olan 3- triflorometilbromobenzen’deki 4-triflorometilbromobenzen safsızlığının bir sonucu olarak oluşmaktadır (11,12). Tolperison senteziyle ilgili başka bir örnek önceki bölümde ele alınmıştır. Eğer mannich reaksiyonunun başlangıç maddesi olan 4metilpropiyofenon, safsızlık olarak 2-metilpropiyofenonu içerirse, tolperisonun 2-metil analoğu da safsızlık olarak bulunabilir (10). 2.1.1.5. Reaksiyon Çözücüsünden Kaynaklanan Safsızlıklar Bazı durumlarda reaksiyondaki çözücü ya da çözücüdeki safsızlık, sentez sırasında başka bir safsızlığın oluşumuna yol açar. Örneğin; yukarıda bahsedilen pipekuroniyum bromürün sentezinde ilk adımlarından biri, 3β-hidroksi-5α-androstan-17-on metansülfonat’tan metansülfonik asitin katalitik eliminasyonuyla 5α-androst-2-en-17- 11 on’un oluşmasıdır. Bu reaksiyondaki safsızlık, 3β-fenil-5α-androstan-17-on olarak tanımlanmıştır. Bu deneyde çözücü karışımı, benzen ile silica ve alüminyum klorid katalizörlerini içerir. 3-fenil türev oluşumunun temel nedeni, aktif ester ve benzen arasındaki Friedel-Crafts tipi reaksiyondur (13). Yukarıda bahsedilen enalapril maleat sentezinin ilk adımı, benzen ve maleik anhidrit arasındaki Friedel-Crafts reaksiyonu ile 1-fenil-1-oksobut-2-en-4-oik asittir. Eğer benzen, reaksiyon çözücüsü olarak çok fazla kullanılırsa, söz konusu ara üründeki 4 metil türevinde toluenin izleri yer alır ve bu da son üründeki safsızlıkların kaynağı olabilir (14). Eğer diklorometan, reaksiyon için çözücü olarak seçilirse, bu çözücü Friedel –Crafts reaksiyonuyla safsızlığın yapısına katılabilir. Burada safsızlık dklorometanın ara üründeki 2 molekülün 4’pozisyonuna metilen köprüsü ile bağlanmasıyla oluşur (10). 2.1.1.6. Katalizör Kaynaklı Safsızlıklar Homojen katalizörlerin kullanımı nadir olarak safsızlıkların oluşumuna yol açabilir. Bu duruma bir örnek; mazipredon sentezinde 21. posisyondan piridinle katalizlenmesinde prednisolunun tolisasyonudur. Prednisolon-21-tosilat ara ürünündeki bir safsızlık, prednisolonun kuaterner 21-piridinyum türevi olarak bulunmuştur (15). 2.1.1.7. Yan Reaksiyon Ürünleri Olguların çoğunda, saf başlangıç maddeleri ve reaktifler kullanılıp reaksiyon koşulları dikkatli bir şekilde sağlanmış olsa da organik sentezlerin ana reaksiyonları yanında yan reaksiyonlar da kaçınılmazdır. Yeni analitik teknolojiler % 0,01 oranında bulunabilen yan reaksiyon ürünlerinin yapısını belirleyebildiği için, yan reaksiyonlar sonucu oluşabilen safsızlıklar ile ilgili tecrübeler giderek artmaktadır. İlaç maddelerinin sentezi sırasında gerçekleşen sayısız yan reaksiyon arasındaki örneklerden bazıları aşağıda verilmiştir (11). Steroidlerin 17-okso grubunun 17α-etinil-17-hidroksi steroidler’i oluşturmak üzere alkali asetiller ile reaksiyonu (aynı zamanda aşırı reaksiyon tipi yan reaksiyonunun da yer aldığı reaksiyon) Şekil 2.’de gösterilmiştir. Şekil 2.’deki reaksiyon şemasında 2 tipik yan reaksiyonlar da yer almaktadır. 12 Şekil 8. Propranolol ve sentezi sırasında oluşan safsızlık (dimerik yapı) Şekil 8.’de epimerik 17β-etinil-17-hidroksi türevi olan Propranolol ve asetilen köprülü dimerik türevinin oluşumu gösterilmiştir. Dimerik türevlerin oluşumu, diğer ilaç sentezlerinde yan reaksiyonlarda sık olarak görülür. Örneğin; bu gibi safsızlıklar Avrupa Farmakopesinde propranololün safsızlıkları arasında yer almaktadır (8). 4-Dimetilaminopiridin ile katalizlenmiş, etinodioldeki (17α-ethinilestra-4-ene-3/3,17diol))sterik olarak engellenmiş 17-hidroksi grubunun asetilasyonu ilginç bir yan reaksiyon oluşumuna örnektir. Şekil 9.’da görüldüğü gibi yan reaksiyon, 17α-etinilestra-4-en-3β,17-diol-3-asetat-17-(3’-asetoksi-2’-butenoat)’ın Z ve E izomerlerinin oluşumuna yol açar (9). Şekil 9. 2 Yan reaksiyonla 17α-etinil-17-hidroksi steroid’deki 17-hidroksi grubunun asetilasyonu 13 Yan reaksiyonlar sonucu izomerlerin oluşumu sıklıkla meydana gelmektedir. Danazol’de safsızlık olarak isodanazol oluşumu (Şekil 10.), safsızlık olarak pozisyonel izomerlerin oluşumuna tipik bir örnektir (13). Diasteromerler çoğunlukla peptid türevlerinde safsızlık olarak meydana gelir. Peptid türevlerinin ve aynı zamanda diketopiperazin türevlerinin (peptid ilaçları içinde safsızlıkların diğer önemli grubu) diasteromerleri, Avrupa Farmakopesinde enalapril ve lisinoprilin safsızlıkları olarak tanımlanmaktadır (8). Şekil 10. Danazolün oluşumu ve İsodanazol safsızlığı 2.1.1.8. Parçalanma Ürünü Safsızlıklar İlaç sentezlerinin son ürününün dönüşümü veya parçalanması, reaksiyonun son basamağında veya izolasyon, kurutma gibi işlemler sırasında meydana gelebilmektedir. Bu yüzden parçalanma ürünleri ilaçlarda bulunan safsızlık grubunda yer alır. Örneğin; Şekil 6.’da tolperisonun oluşmasını sağlayan Mannich reaksiyonu sırasında piperidin ve formaldehit, ilaç maddesinden ayrılarak (parçalanarak) 1-(4-metilfenil)-prop-2-en-1-on bileşiği oluşabilir. Papaverin sentezinin son aşamasındaki şartlarda oksitlenerek papaverinol ve papaveraldin’e dönüşebilir. Bu maddelerin miktarı saklama koşulları altında artar; bu yüzden bunlar safsızlık ve parçalanma ürünü olarak kabul edilebilmektedir (10). 14 2.1.1.9. Enantiomerik Safsızlıklar Kiral ilaçların saf enantiyomer antipodu, safsızlık olarak kabul edilebilir. Burada enantiyomerlerden birisi ilaç etken maddesi olarak kabul edilirken, diğer enantiyomer safsızlık olarak kabul edilir. Safsızlık olarak kabul edilen enantiyomerin diğer enantiyomerden ayrılması ve miktarının belirlenmesi gerekir (10). 2.1.2. İnorganik Safsızlıklar İlaçlardaki inorganik safsızlıklar için çeşitli olası kaynaklar şunlardır: • Sentetik üretim işleminin başlangıç maddeleri, reaktifleri ve çözücüleri inorganik asitlerin tuzları için kaynak olabilir (Klorürler, sülfatlar, fosfatlar vb). Aynı şekilde çeşitli ağır metaller de içerebilir. • Ağır metaller, üretim işleminde kullanılan reaksiyon kaplarından ve tüplerden de kaynaklanabilir. • İlaç hammaddelerinin kristalizasyonu ve kromatografik saflaştırmaları sırasında ilaç hammaddesi çözeltisini renksizleştirmek için sıklıkla kullanılan filtreler, süzme aparatları ve adsorbanlar ağır metallerin ve inorganik asit tuzlarının serbest hale geçerek safsızlık oluşturmasına neden olabilir. • Bazı inorganik reaktiflerin kendileri ya da dönüşüm ürünleri de olası safsızlıklardır. Örneğin; Selenyum dioksit, krom trioksit, permanganat ve civa(II) tuzları gibi yükseltgen ajanlarla yapılan oksidasyonun reaksiyon ürünlerinde selenyum, krom, manganez ya da çinkonun izleri tespit edilebilir. Lityum alüminyum hidrür ya da sodyum borhidrür gibi indirgeyici ajanların kullanımıyla son üründe alüminyum ya da bor izlerine rastlanabilir. • Paladyum ve nikel gibi heterojen katalizörler safsızlık içerebilir. Bunlar iyonize olabilir ya da reaksiyon sırasında oluşabilir. Bu da ilaç hammaddesinde safsızlık kaynağı olabilir. • İlaç maddesinin parçalanması da inorganik safsızlıklara yol açabilir (Örneğin; fosfat esterlerinin hidrolizinden fosfat tuzları oluşumu, hidrazidlerin ve hidrazonların hidrolitik parçalanmasından hidrazin oluşumu)(10). 15 2.1.3. Çözücü Kalıntısı Safsızlıklar Çözücüler ilaç endüstrisinin hemen hemen her aşamasında kullanılır. Çözücü kalıntıları, ilaç hammaddesinde ve farmasötik formülasyonlarda çoğunlukla bulunur. İlaç hammaddesindeki çözücü kalıntılarının kaynakları şunlardır: • Çözücü kalıntılarının en muhtemel kaynağı, ilaç hammaddesinin kristalizasyonunda kullanılan çözücüdür. Kristalizasyon çözücüsünün seçiminde dikkate alınması gereken birçok faktör vardır. Kristalizasyon işlemi, ilaç maddesinin geri kazanımını mümkün olduğunca en yüksek oranda sağlarken, safsızlıkların miktarını da mümkün olduğunca en düşük miktara düşürmelidir. İlaç maddesinin seçilen çözücü ile kristalizasyonu, istenen kristal morfolojisini oluşturmalıdır. Buna ek olarak, çözücü çok yüksek sıcaklığın olmadığı kurutmayla uzaklaşabilecek kadar uçucu olmalıdır. Bazı çözücülerin kristalizasyonda verimli bir şekilde kullanılabilecek olmasına rağmen, onların yüksek fiyat, sağlık veya çevresel tehlikelerinden dolayı kullanılamadığı da dikkate alınmalıdır. Bazı durumlarda, kendileri saf olmayan çözücülerin bazı karışımlarının kristalizasyon için kullanımı söz konusudur (Örneğin; petrol eterinin farklı fraksiyonları). Bazı başka durumlarda ise çözücüler safsızlık olarak uçucu bileşenler içerebilir (Örneğin; hekzanda bulunan 2-metilpentan, 3-metilpentan ve metilsiklopentan). Bunlar da ilaç hammaddesinde olası safsızlık olarak yer alır. Bu nedenle kristalizasyon için kullanılan çözücünün önce gaz kromatografisi ile dikkatli bir şekilde kontrolü yapılmalı ve bununla ilaç hammaddesindeki çözücü kalıntı profilinin tahmini yapılmalıdır. • Bazı durumlarda kristalizasyon öncesi ilaç maddesine bazı çözücülerin çok güçlü bir şekilde bağlanması, kristalizasyon sonrasında bile ilaç hammaddesinde çözücünün eser düzeylerde bulunmasına neden olabilir. Bu safsızlıklar, reaksiyonun son basamağının veya son reaksiyon basamağında kullanılan uçucu reaktiflerin çözücüsü veya uçucu ürünleri olabilir (Örneğin; asetik asit ya da trifloroasetik asit). • İlaç hammaddesinin son saflaştırma işlemi kolon kromatografisi ile olursa, kromatografide kullanılan çözücü de ortamda bulunabilir. Eğer iyon-değiştirme kromatografisi kullanılırsa yukarda bahsedilen asetik asit ve trifloroasetik asit ve uçucu reaktifler de safsızlık olarak ortamda bulunabilir. 16 • İlaç hammaddesi, uçucu bileşenleri havadan adsorplayarak bağlayabilir. Bu durum için en tipik örnek, higroskopik bileşikler için suyun safsızlık olarak bulunmasıdır. Fakat bazen en hassas analitik metotlar, kurutma, paketleme gibi işlemler sırasında ilaç maddesine temas eden havadaki uçucu safsızlıkları belirleyebilmektedir. Eğer çözücülerin miktarları ilaç hammaddesinin bütün karışımlarında stokiyometrik olarak bulunmazsa (Örneğin; 0.5, 1, 2 mol kristal suyu gibi), çözücüler X-ray, IR ve termal analiz ile karakterize edilebilir. Bulunan herhangi bir çözücü, mesala su, safsızlık olarak kabul edilir ve safsızlık miktarının sınırları farklı farmakopeler tarafından belirlenir (10). İlaç hammaddesinden uçucu safsızlıkların uzaklaştırılması için kullanılan yöntem, maddenin tercihen düşük basınç altında uygun sıcaklıkta kurutulmasıdır. Birçok durumda çözücülerin son kalıntılarını uzaklaştırmanın çok zor hatta bazen imkânsız olabileceğini belirtmek gerekir. Çok yüksek sıcaklıkta uzun süreli kurutma ilaç molekülünün parçalanmasına neden olabilir. Yükseltgen özelliğe sahip parçalanma ürünlerinin oluşmasına rağmen bu oluşum kurutmada inert atmosfer gazı kullanılarak en aza indirilebilir ya da önlenebilir. Çözücü kalıntılarının sınırları farmakopeler tarafından belirlenen sınırların altına düşürülür. Kristalizasyon için kullanılacak çözücü madde seçildiğinde çeşitli kuralların dikkate alınması önemlidir. İlaç hammaddesi için en uygun çözücüyü ve kurutma için uygun koşulları bulmak sadece araştırmanın her aşamasında analitik kimyacıların aktif işbirliği ile mümkündür (10). Katı dozaj formları çeşitli kaynaklardan meydana gelen uçucu bileşenler içerebilir, bunlar; • İlaç hammaddesinden kaynaklı çözücü kalıntıları, • Sıvağlardan kaynaklanan çözücü kalıntıları. Laktoz monohidrat stokiyometrik miktarlarda su içerirken diğerleri (örneğin nişasta) %10 kadar su içerir. • Su, alkol, 2-propanol, kloroform, diklorometan ve diğer çözücüler ıslak granülasyon teknolojilerinde kullanılır ve etkin maddelerin sıvağların toz karışımlarına püskürtme ile uygulamalarında, 17 • Aynı çözücüler film kaplı tabletlerin ve çeşitli uzun süreli salınımlı formülasyonların hazırlanmasında kullanılan çeşitli polimerik maddeleri çözmek için kullanılır. Kurutmayla uzaklaştırılan çözücüler ve bunların katı dozaj formlarındaki miktarları ilaç hammaddesinde kullanılan aynı metotlarla kontrol edilir (10). 2.1.4. Sıvağdaki Safsızlıklar İlaç endüstrisinde ilaç maddelerini farmasötik formülasyona dönüştürmede kullanılan farmasötik sıvağların tahmini sayısı yaklaşık 1000 civarındadır. Monografiler dahil başlıca farmakopeler, sıvağ olarak yaklaşık 200 madde içerir. En çok kullanılan sıvağlar; laktoz ve sükroz gibi şekerler, nişasta ve mikrokristalin selüloz gibi karbonhidrat tipi biyopolimerler, selüloz türevleri, polietilen glikol (makrojeller) gibi polimerik maddeler, polivinilpirolidon (povidon), bitkisel kökenli çeşitli yağlar, stearik asit ve onun magnezyum tuzu, kalsiyum fosfat gibi inorganik maddeler, silisik asitin çeşitli formlarıdır (10). Bu maddelerin çoğunun nispeten sadece küçük bir kısmı farmasötik örneklerin (ilaç formülasyonlarının) hazırlanmasında kullanılır: çoğu gıda ve kozmetik endüstrisinde kullanılır. Bu durumun ve sıvağların çoğunun karmaşık yapısının bir sonucu olarak sıvağların kalitesini ve özellikle saflığını belirlemek ilaç maddelerine göre çok daha zordur. Ancak, bu maddelerin farmasötik formülasyonlardaki miktarı aktif ilaç bileşeni miktarından pek çok durumda daha yüksek olduğu için bunların saflığı önemli bir konudur (16,17). Yeterince kontrol edilmeyen sıvağ maddelerinin en küçük safsızlığı bile insan organizması için tehlikeli olabilir. Safsızlıklar ilaç ürününün kararlılığını istenmeyen şekilde de etkileyebilir. Örneğin sıvağda bulunabilecek eser metaller etkin maddenin parçalanmasını katalizleyebilir. Örneğin; polietilen glikollerdeki peroksit safsızlığı, oksitlenebilen ilaçların parçalanmasına neden olabilir (18). İlaç maddelerindeki sıvağ miktarlarının düzenlenmesi yönünde büyük çabalar harcanmaktadır (19,20). Bu durum birçok konferans ve derste de ele alınmaktadır (10). Sıvağdaki safsızlıklar ve Avrupa Farmakopesine göre bunların belirlenmesinde kullanılan limitler ve metotlar çeşitli örneklerle aşağıda belirtilmiştir (8). Klorür ve 18 sülfat iyonları bazı analitik metotlar ile tayin edilmektedir. Fakat limitler ilaç maddesindeki sIvağlara göre değişebilmektedir, örneğin klorür ve sülfat sınırları sırasıyla magnezyum stearat için %0,025 ve %0,5 iken; kalsiyum fosfat için %0,15 ve %0,5’tir. Ağır metaller için limit kalsiyum fosfatta 30 ppm, magnezyum stearatta 20 ppm, hidroksietil ve hidroksipropilselülozda 20 ppm, povidonda 10 ppm’dir. Toksik metaller için limitler daha düşüktür. Örneğin; hidrojelenmiş yerfıstığı yağında nikel 1 ppm (atomik absorpsiyon spektroskopisi ile belirlenen), kalsiyum fosfatta arsenik 4 ppm’dir. Polimerik sıvağlardaki monomerlerin tespiti bu sıvağların kontrolünde önemli bir kısmı oluşturur. Örneğin; povidonda 1-vinilpirolidin-2-on HPLC (limit 10 ppm) ile tespit edilir, makrogol’de etilen oksit (1 ppm) gaz kromatografisi ile tespit edilir. Farmasötik polimerde bulunan monomerik 4,4’-metilenbissiklohekzilaminin tespiti katı faz ekstraksiyonu ile yapılır ve ekstraksiyondan sonra heptaflorobutiramide dönüştürülür ve GC-MS ile analizi yapılır. Povidonda bulunan hidrazin için limit testi onun salisilaldehitli türevinin (1 ppm) ince tabaka kromatografisine dayanır. Aldehit için belirlenen limit 500 ppm’dir (21). Hidroksipropil selüloz gibi peroksit (Hidrojen peroksit olarak ifade edilir.) içerenler için limit 400 ppm’dir (titanyum(III) klorür ile renk testi). Biyopolimerlerin patates nişastasındaki protein içeriği sülfürik asitle çözülmesi sonrası amonyak olarak tespit edilir (limit %0.1). Demir ve kükürt dioksit için izin verilen sınırlar sırasıyla 10 ppm ve 50 ppm’dir. Hidroksietilselülozun analitik incelemedeki önemli testleri, gaz kromatografisi ile etilen oksit (1 ppm) ve 2-kloroetanol’ün (10 ppm), renk reaksiyonuyla da glioksal’ın (20 ppm) belirlenmesidir. Doygun yağların analitik kontrolü, yabancı doygun asit ve sterollerin gaz kromatografisi ile tayinini içerir (10). 19 2.2. ORGANİK SAFSIZLIKLARIN PROFİLİ İÇİN STRATEJİLER İlaç maddelerindeki organik safsızlıkların kaynakları Bölüm 2.1.1.’de anlatılmıştır. İzin verilen organik safsızlık oranı pek çok durumda %0,1 iken, ilaç düzenleme otoriteleri, sentetik araştırma kimyacıları, teknolojistler ve ilaç maddesi tüketicileri bu oranı %0,1 ile % 1 arasında kabul etmektedirler (22). Şekil 11.’de ilaçlardaki safsızlık profilinin uygun mevcut metotlar kullanarak çıkarılması şematize edilmiştir. Bu şema araştırmacılara uygulamaları gereken stratejilerin ve izlenmesi gereken yolların belirlenmesinde büyük bir kolaylık sağlar. İlaçların safsızlık profili için laboratuarlarda kullanılan stratejiler farklılık gösterebilmektedir. Bütün laboratuarlarda yaklaşık aynı teknikler kullanılmasına rağmen, bu metotların kullanım sırası ve yöntemi bireysel laboratuarlarda oldukça farklı olabilmektedir. Bu farklılıklar ve zorluklardan dolayı, aşağıdaki yollar kullanılabilmektedir; • İlaçların safsızlık profilinin belirlenmesinde araştırmaların büyük bir çoğunluğu endüstriyel firmaların araştırma ve kalite kontrol laboratuarlarında yapılmaktadır. • Safsızlık profilinin belirlenmesinde kullanılan metotlar çok hızlı bir şekilde gelişmektedir. Önceleri, ilaçlardaki ana safsızlıklar klasik farmasötik araştırmalar ile belirlenmekteydi. 40-50 yıl önce bu çok zaman alıcı ve emek isteyen bir yol ile gerçekleştirilirdi. Çoğunlukla, safsızlıkların kolon kromatografisi ile ayrılması ve sonrasında günümüzdeki spektroskopik tekniklerin çok gerisinde bir spektroskopik teknikle karakterizasyonuna dayanmaktaydı. 1960’ların başlarında ince tabaka kromatografisinin (İTK) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinin (HPLC) geliştirilmesi ve yaygınlaşması, aynı zamanda 1990’lı yıllarda HPLC-MS-(MS) ve HPLC-NMR(MS) gibi kombine tekniklerin ortaya çıkmasıyla farmasötik araştırmalar, analizler ve safsızlık profilleri tamamıyla yepyeni bir statü kazanmıştır. Güçlü ayırma gücüne sahip kromatografik tekniklerin sürekli gelişen spektroskopik metotlarla on-line kombinasyonu düşük düzeydeki safsızlıkların bile çok kısa sürede ve büyük bir kesinlikle tanımlanmasını ve tayinini sağlamıştır. • Safsızlık profilinin stratejisi büyük oranda çalışmanın gerçekleştiği laboratuarın yapısına ve finansal imkânlarına bağlıdır. Farklı laboratuarlardaki en yaygın yaklaşım safsızlığın belirlenmesi ve onun muhtemel safsızlıklarla (kromatografik tutunma olarak) çakıştırılmasıdır (22). 20 İTK,HPLC (GC,CE,CEC,SFC) ile Tespit 3 Kromatografik sistemde önceki örneklerin potansiyel safsızlıklarının çakıştırılması var Tespit? yok Tanımlanamayan safsızlıklar Kromatografisiz NMR,MS UV (HPLC,CE,CEC/DAD) UV,IR (İTK spektrumu) var Yeterli bilgi? yok Yarıpreperatif İTK GC(IR)/MS HPLC’den küçük örnek HPLC(CE,CEC,SFC)/MS MS(IR) var Yeterli bilgi? yok Önerilen yapı Safsızlığın sentezi Preperatif HPLC’den (ya da İTK) örnek HPLC/NMR(MS) Kayıtla eşleştirme Safsızlıkların tespiti NMR Birleştirilmiş bilgiler UV,IR,MS,NMR Kromatografik veri Miktar tayini için metot geliştirme Şekil 11. İlaçlardaki safsızlıkların tanımlanması, yapı aydınlatması ve tayini için genel şema. 20 21 2.2.1. Organik Safsızlıkların Belirlenmesi Şekil 11.’de görüldüğü gibi safsızlık profilinde ilk adım safsızlığın tespitidir. Yüksek çözünürlüklü NMR ve kütle spektroskopisi, ilaç örneğindeki safsızlıktan parmak izi gibi bir görüntü almada önemli bir rol oynamasına rağmen, safsızlık profilinin daha sonraki aşamasında karakterize olan safsızlıklar, kromatografik (veya elektroforetik) tekniklerden biriyle tespit edilir. Bu ilk adımda bile temel olan husus ayırma yöntemlerini dikkatli bir şekilde seçmektir. Aşırı yüksek ya da düşük polarite/hareketliğe sahip safsızlıklar, güvenli bir şekilde tayin edilebilmesi için çok yavaş veya hızlı bir şekilde hareket edebilirler ve hatta böyle bir durum olmasa bile, bir safsızlığı ana bileşen ya da diğer safsızlıklardan ayırmak gerekmez. Bu nedenle görünmeyen bir tehlike vardır ve sadece bir ayırma tekniği kullanıldığında kullanılırsa ihmal dahi edilebilir. Bu yüzden safsızlık profilindeki birçok safsızlığın elde edilmesi için çeşitli mekanizmaya sahip ayırma yöntemlerinin kullanılması çok önemlidir. İnce tabaka kromatografisi (İTK) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) tekniklerinin (hem ters faz hem de normal faz modu) kullanımı zorunludur, ayrıca süperkritik akışkan sıvı kromatografisi (SFC), yüklü moleküller için kapiller elektroforez (CE), oldukça uçucu ve sıcaklığa dayanıklı materyaller için ise gaz kromatografisi (GC) yararlı veriler sağlayabilir. Tüm safsızlıkların başarılı şekilde tespit edilmesinin başka bir önemli yönü de tayinin duyarlılığıdır. Yukarıda bahsedilen yöntemler optimum şartlarda kullanıldığında %0.01 düzeyindeki bir safsızlığın tahmin edilmesi genellikle mümkündür. Aksi taktirde bu düzeylerin yükselme ihtimali artar. Örneğin; fluoreskamin ile primer amino grubunun yüksek frorosens özelliğe sahip türevini oluşturmak üzere ön-kolon türevlendirmesi HPLC sonrası zayıf oranda aktifliğe sahip safsızlıkların spektrofotometrik olarak tayin edilebilirliğini (tayin düzeyini) çok yüksek oranda geliştirmiştir (23). Araştırmanın bu aşamasında çeşitli ayırma teknikleri arasındaki bağlantıları bulmak çoğu zaman gereklidir. Bu demektir ki bu tespit için aynı safsızlığın İTK’da leke, HPLC veya GC’de de pik olarak görülmesi şarttır. İTK’da leke elüsyonu ve elde edilen çözeltinin tutunma çakıştırması için yüksek performanslı sıvı kromatografisine, gaz kromatografisi ya da kapiller elektroforez cihazına enjeksiyonu büyük teknik zorluklar olmaksızın yapılabilir. Aynı uygulama HPLC fraksiyonu için de geçerlidir. Ancak, tamponlanmış ters-faz HPLC sistemlerinin kullanılması durumunda, İTK’da plaka 22 üzerine uygulama veya gaz kromatografisinde enjekte öncesinde apolar bir çözücü ile ekstraksiyon yapmak gerekir. Sık kullanılmamasına rağmen, İTK plağı üzerine HPLC ya da GC fraksiyonlarının uygulanma sorunu çözülmüştür (26,27). Kromatografik verilerin yanında, safsızlıkların HPLC (CE, CEC)/diot-array UV spektrumuyla birlikte İTK spektrumu ya da kütle spektrumu ile tanımı, çeşitli pik ve lekelerin ardından safsızlığın tanımlanması için yararlı kanıtlar sağlayabilecek olan, on-line ya da off-line moddaki İTK, HPLC ve CE fraksiyonlarından elde edilir (22). 2.2.1.1. Bilinen Potansiyel Safsızlıklar ile Bilinmeyen Safsızlıkların Kromatografik Tutunma Değerlerinin Eşleştirilmesi Yöntemi Birçok safsızlık hakkında net bir görüntü oluşturduktan sonra bunların ele alınması ve ana bileşikten ve birbirlerinden ayrılması için uygun kromatografik (elektroforetik) metotların seçilmesi gerekir. Safsızlık profili prosedüründe bir sonraki adım bilinen potansiyel safsızlıklarla bunların tanımlanmasıdır (22). Bu aşamada başarı, analitik kimyacılar ile sentetik kimyacıların ortak çalışma güç ve düzeyine bağlıdır. Yeteri kadar çok sayıda potansiyel safsızlık örnekleri sayesinde analitik kimyacı safsızlıkları iyi bir şekilde tahmin ederler ve bu safsızlıkları ya da en azından bir kısmını tanımlarlar. Bu şekilde, kromatografik ve spektroskopik çalışma için gerekli olan zaman ve iş gücü en aza indirilir. Potansiyel safsızlıklar; ilaç materyalinin sentezindeki son ara ürünü, tamamlanmamış reaksiyon ürünü (ilaç materyali diasetattaki dihidroksi monoasetat bileşeni gibi.), aşırı reaksiyon ürünleri (ilaç materyali monoasetattaki analog durumundaki diasetat gibi.), yan ürünler (yan reaksiyon ürünleri), reaksiyonun son adımında oluşması muhtemel olan parçalanma ürünleri, izole son üründür. Sentetik kimyacılar ve teknolojistler potansiyel safsızlıklar olarak kabul edilebilen daha önceki araştırmalarından birkaç analog bileşiğe sahiptirler. Tüm bu örneklerin kimyagerler tarafından kullanılabilir olması çok önemlidir (22). Ellerinde potansiyel safsızlıkların örnekleri ile öncesinde olası safsızlıkları belirleyip sonra gerçek safsızlıkları tanımlamak ilaç analistlerinin görevidir. En kolay metot olması ve bu nedenle en yaygın kullanılan metot tutunma çakıştırmasıdır (Kayıtla eşleştirme). Analitik hedef, safsızlıkların ayrılması ve belirlenmesi olduğu durumda; eş zamanlı olarak birkaç kromatografik ve ilgili ayırma tekniğinin kullanım gerekliliği zaten önceki bölümde vurgulanmıştır. Bu aşamada sorumluluk tabi ki analitik 23 kimyacılara düşüyor: Tek bir kromatografik yönteme güvenmemek gerekir çünkü yanıltıcı olabilir. Safsızlıkları tanımlamada, tanımlama değerlerinden en az ikisi varsa kromatografik alıkonma (tutunma) zamanlarının, elektroforetik göç zamanlarının veya Rf değerlerinin başarılı sonuca ulaşmada önemli olduğu kabul edilebilir. Fakat tercih edilen üç farklı sistem, farklı ayırma mekanizmalarına dayanır. Bu deneylerde, iki kromatografik/elektroforetik metotla bulunan alıkonma/göç zamanlarını karşılaştırmak yeterli değildir: potansiyel safsızlıkların ilave edildiği ilaç örneği çözeltilerine yukarıda bahsedilen yöntemlerin uygulanması gereklidir (22). Tutunma çakışmasına (kayıtlı eşleştirme) dayalı başarılı tanımlama, potansiyel ve gerçek safsızlıkların tanımlanması için ileriki kanıtların, kolaylıkla erişilebilen spektral verilerin karşılaştırılmasına imkan vermektedir. Örneğin; HPLC ya da CE ayrımından sonrası diyot-array UV spektrumu; İTK ile ayrım sonrası UV veya floresans spektrumu (veya en azından noktaların rengi gün ışığında veya kısa veya uzun dalgaboylu UV lambası altında aynı olmalıdır. Safsızlıkların tanımlanmasının kontrolünde GC/MS ya da HPLC/MS kullanılması tanımlamada büyük ölçüde güvenirlik sağlar. Bu konuda Nicolas ve Scholz kağıt-dergileri özeldir. Çalışanlar, yeni ilaç bileşeni için araştırma sırasında sentezlenen olası safsızlıkları, gerçek safsızlıkları ve ilgili bileşenleri, HPLC diyot-array UV spektrumu (26) ve HPLC/MS/MS spektrumlarının kütüphanelaboratuarını oluşturmuşlardır. %0.01 in altındaki safsızlıkların HPLC de kayıtla eşleştirme ile safsızlıkların tanımlanmasında UV analizi ve MS/MS spektrumu büyük ölçüde katkı sağlar (27). 2.2.1.2. Safsızlık Yapılarının Belirlenmesinde Kromatografik, Spektroskopik ve Kombine Tekniklerin Uygulamaları Şekil 11.’ de görüldüğü üzere ilk spektroskopik veriler genellikle, ilaç safsızlık profilinde kromatografik ve spektroskopik tekniklerin birleşik uygulanması sırasında elde edilen safsızlıkların UV spektrumudur. Bunlara (ve aynı zamanda floresans spektrumu), safsızlıkların ayrılması için düzlemsel kromatografik teknikler kullanıldığında, spektrum alma yoluyla kolaylıkla ulaşılabilir. Düzlemsel kromatografi sonrası alınan FT-IR spektrumu safsızlık yapılarının aydınlatılması için yararlı bilgilerin bulunmasında önemli bir rol oynamıştır. Safsızlıkları ayırmak için HPLC ya da kapiller elektroforetik tekniklerden biri kullanıldığında, hızlı tarama (genellikle diyot-array) UV 24 dedektörler iyi kalitede UV spektrumları üretebilir. Gaz kromatografisi UV spektrumları eldeki ticari cihazlar ile alınamadığı durumlarda sadece ayırma tekniğidir. Safsızlıkların spektrumları ve ana bileşeni arasında bazen oldukça küçük farklar vardır ve tanısal değere sahiptir. Bazı avantajlı durumlarda bu noktada safsızlığın yapısını tahmin etmek bile mümkündür. Fakat buna ek olarak safsızlıkların kromatografik yöntemdeki davranışı UV spektrumu ile kimyagerlerin sentez prosedürü hakkında bilgiler de dikkate alınır. Pek çok durumda UV spektrumundan elde edilen bilgiler safsızlığın yapısını belirlemede yeterli bilgi vermese de, kütle ve NMR’dan elde edilen sonuçlar için faydalı ve tamamlayıcı bilgiler sağladığı için, UV spektrumunun yorumlanmasında harcanan zamana ve enerjiye değmektedir (22). Eğer UV spektrumundan elde edilen bilgiler yeterli değilse, safsızlık yapısının aydınlatılması prosedüründe genellikle bir sonraki adım safsızlığın kütle spektrumunun alınmasıdır. Bunu en verimli bir şekilde yapmanın yolu, safsızlık profili ile ilgili yeterli bir şekilde gelişmiş laboratuarlardaki mevcut imkânlarla on-line GC/MS ve HPLC/MS yöntemlerini kullanmaktır. Bu tekniklerin en büyük avantajı, %0.01 in altındaki birçok safsızlığın eşzamanlı olarak tayin edilebilmesine imkân vermesidir. GC/MS tekniğinin özel avantajı, kimyasal iyonizasyon kullanılarak molekül ağırlığının güvenilir bir şekilde belirleyebilmesidir. Daha hassas yapı değerlendirme problemlerinin çözümü için gerekli parçalanma ürünleri (fragmentler) hakkındaki bilgi elektron etki iyonizasyon tekniği kullanılarak elde edilebilir. Dezavantajı ise uçuculuk ve termal stabilite problemleri nedeniyle uygulanabilirliğinin kısıtlı olmasıdır. Eğer reaksiyonun kantitatif yapısı tespit edilebilirse, GC/MS analizinin diğer alanlarında yaygın olarak kullanılan türevlendirme reaksiyonu burada kullanılabilir. Böylece gerçek safsızlıklarla türevlendirme reaksiyonunda yan ürünlerin kafa karıştırma riski önlenir (22). HPLC/MS tekniğinin en büyük avantajları genel uygulanabilirliği ve diyot-array UV dedektörleriyle (HPLC/UV/MS) eşleşme olasılığının olmasıdır. Dezavantajı ise ilk jenerasyon cihazlar kullanılarak yumuşak iyonizasyon tekniklerinin sadece molekül ağırlığı hakkında bilgi vermesidir. Modern cihazlarda fragmentasyon (parçalanma) da elde edilebilmektedir. Safsızlık profili için en verimli cihazlar, şimdiye kadar tartışılan tüm bilgileri eşzamanlı olarak verebilen HPLC/UV/MS/MS cihazlarıdır. Bu teknikler mevcut olduğu laboratuarlarda, bu cihazların sayısı bunların kullanımıyla birlikte 25 safsızlık profili problemlerinin tamamının eş zamanlı olarak ortaya çıkmasını sağlar ve safsızlık profilinin stratejisi büyük ölçüde kolaylaştırılabilir (22). HPLC/UV/MS/MS için tarif edilen bu durum aşağı yukarı SFC, kapiller elektroforetik yöntemler, CE ve CEC ile ikame edilen HPLC nin bütün teknikleri için geçerlidir. Bu yeni tekniklerin, özellikle CEC yönteminin, ilaç safsızlık profilinde parlak bir geleceğinin olması beklenmektedir. Şekil 11.‘de görüldüğü gibi, kombine metotlara ek olarak kütle spektrumundan elde edilen bilgiler kullanılması gibi başka birçok seçenek de vardır. Doğrudan kütle spektrokopisinde numumenin ön bir kromatografik bir ayırma yöntemi uygulanmadan incelenmesi söz konusudur. Modern kombine tekniklerin bulunmadığı laboratuarlarda safsızlıkların kütle spektrumu genellikle HPLC yada İTK ile ayrılıktan sonra off-line modunda alınır. Kütle spektrometrisinin yüksek duyarlılığının bir sonucu olarak özel cihaz gerektirmez: Safsızlıklar İTK ile ayrımı sonrası doğrudan kütle spektrometrisi ile incelenebilir. Preparatif HPLC ile numunedeki safsızlığı elde etmek için gerekli araçlar yoksa uygulamalar hemen hemen HPLC ile aynıdır: Fraksiyondaki safsızlık miktarı numune inorganik tuz ya da tampon içermedikçe MS ile incelenebilir. Bu yaklaşım kombine tekniklerin kullanımda olmadığı laboratuarlarda bile bazen yararlı olabilir. Böyle bir yaklaşımla bilgi hızlı bir şekilde elde edilir. Böylece uygun sistemlerin geliştirilme ve optimize gerekliliği önlenir. Örneğin; HPLC/MS sistemlerine uygun safsızlıkların HPLC ile ayrımı (22). Bu noktada, ilaç analisti safsızlık profilinin karmaşık prosedüründe, UV, IR ve kütle spektrumundan den elde edilen bilgilere sahip olarak çok önemli bir karar vermelidir. Safsızlık için bir yapı önermeyi mümkün kılan sentetik kimya bilgisi ve ana bileşen ile ilgili safsızlığın kromatografik verileri ile birlikte bu birleştirilmiş bilginin dikkatli bir şekilde değerlendirilip değerlendirilmemesi gerektiği kararı verilmelidir. Şayet bu soruların cevabı evet ise, prosedür Şekil 11’de görüldüğü ve sonraki bölümlerde tasvir edildiği gibi işletilir (daha sonraki bölümde açıklanacaktır. Örneğin önerilen yapının sentezi) Eğer cevap hayırsa, zaman ve emek isteyen NMR çalışmaları bundan önce yapılmalıdır. Literatürde rapor edilen verilerin büyük bir kısmı ve laboratuar çalışanlarının deneyimleri çalışmanın burada sonlandırılmasının mümkün olduğunu 26 gösteriyor. Bu durumda, bazen ilgili safsızlığın tam yapısı ile ilgili belirsizlikler devam etmektedir. Bir safsızlığın kimyasal yapısının belirlenmesinde en son metot NMR spektroskopisidir. Bir ön kromatografik ayırma yapılmaksızın NMR spektroskopisinin kullanılabilirliği oldukça sınırlıdır. NMR spektroskopisi genellikle, karışımdaki bileşenlerin bir kromatografik ayırma sonrası kullanıldığı bir yapı aydınlatma aracıdır. İyi kalitede NMR spektrumu elde etmek için minimum örnek miktarının olması gerekliliği, yeni tekniklerin ortaya çıkmasını büyük oranda azaltsa da, genellikle sıradan İTK veya analitik HPLC kolonları ile ayırma sonrası safsızlıkların NMR spektrumunu almak mümkün değildir. Başka bir ihtimal ise, bu alandaki en son gelişmeleri kullanmaktır, ticari olarak elde edilebilen on-line HPLC/NMR, HPLC/NMR/MS, LC/MS/MS gibi kombine teknikleri kullanmaktır. Fakat bu teknikler, sınırlı sayıda laboratuarlarda bulunmakta ve bu teknikler ile yapılan safsızlık profili çalışmaları ile literatürde yayınlanmış makale sayısı sadece birkaç tanedir. İleriki zamanlarda bu yeni tekniklerin yaygınlaşması ve ilaçlardaki safsızlık profilinin çıkartılmasında yeni prosedurler ortaya çıkarması beklenmektedir (22). NMR spektrumu ve yukarda özetlenen çalışmalarda elde edilen diğer spektrumlarla safsızlıkların yapısı tahmin edilebilir ki edilmelidir de. Bu noktada, safsızlıkların yapısının aydınlatılması spektroskopistlerin, kromatograficilerin ve sentetik (organik) kimyacıların yakın işbirliğinden oluşan bir takım çalışması ile gerçekleştiği vurgulanmalıdır. Kromatograficilerin buradaki rolü, sadece safsızlıkların ayrılması ve tayini için sistemler geliştirmek değildir. Çalışma süresi boyunca sadece spektral veri değil, aynı zamanda İTK için Rf değerleri, HPLC ve GC için tutunma zamanları ile ilgili bilgi sağlamada çok önemli görevleri vardır. Bunların ana bileşen ve diğer potansiyel safsızlıklarla karşılaştırılması safsızlığın polaritesi hakkında faydalı veriler sağlamaktadır. Aynı zamanda, bu bilgiler safsızlığın yapısının tahmin edilmesinde önemli bir bilgi kaynağıdır. Yukarıda bahsedilen takımın bir üyesi ve ilaç sentezinin bütün yönlerine aşina olan organik kimyacının problemli durumlarda görüşünün dikkate alınması da gereklidir (22). 27 2.2.2. Safsızlıkların Sentezi Yukarıdaki bölümün son kısmında da bahsedildiği üzere safsızlık yapısının belirlenmesinde ekibin önemli bir üyesi de organik kimyacılardır. Şekil 11’de görüldüğü gibi prosedürün bir sonraki basamağında organik kimyacılar önerilen (tahmin edilen) yapıya sahip safsızlığın sentezinde önemli bir role sahiptir. Bu noktada analitik kimyacılardan oluşan takım üyelerinin de sorumlulukları olduğu vurgulanmalıdır. Önerilen yapıya sahip safsızlığın sentezlenmesi ana bileşenin sentezlenmesinden daha zordur ve bu aşamalı sentezler birkaç hafta yoğun çalışma gerektirir. Bu nedenle, özellikle karmaşık yapıların sentezinde, önce yapı son derece dikkatli ve doğru bir şeklide tahmin edilmeli sonra sentezlenmelidir. Fakat bu genel bir kural değildir. Bazı durumlarda, çalışmanın erken aşamasında yapının tahmin edilmesi sentezi kolaylaştırabilir. Çoğu durumlarda, UV ve kütle spektrumu temelinde tahmin edilen yapının sentezi, sonraki NMR çalışmaları için safsızlığın preparatif HPLC ile hazırlanmasından daha kolaydır ve daha az zamanda gerçekleşir. Safsızlık profili prosedürünün çeşitli aşamalarında nasıl ilerlendiği sorusu, durumdan duruma her noktayı dikkate alınarak ayrı ayrı cevaplandırılmalıdır (22). Safsızlığın gram skala sentezi şu şekildedir: • Sentezlenen maddenin başarılı sentezi, tüm spektroskopik ve analitik incelenmesinden sonra, ilaç maddesinde bulunan safsızlık ile sentezlenen maddenin kromatografik ve spektral eşleştirmesi yapılır. Bölüm 2.2.1.1.’de kromatografi temelinde gerçek safsızlıkların nasıl tanımlandığı ve olası safsızlıklara nasıl on-line spektral eşleştirme yapılması gerektiği ayrıntılı olarak anlatılmıştır. Aynı kurallar bu durum için de geçerlidir. Başarılı bir eşleştirme sonucunda tahmin edilen yapı belirlenir. • Sentezlenen maddeden elde edilen spektrum kalitesi genellikle, izole edilmiş küçük numune spektrumlarından ya da online modda alınmış spektrumlardan daha iyidir. Daha kaliteli olarak tanımlanmış spektrumlar ispat edildikten sonra makale ve kayıt amacıyla kullanılabilir. • Sentezlenen safsızlığın gram düzeyindeki miktarı safsızlık standardı olarak kullanılabilir. Bu safsızlık standardı kullanılarak safsızlığın kantitatif analizi için seçici 28 analitik metotlar geliştirmek mümkündür. Böyle bir seçici analitik metot analitik test protokolünün parçası haline geldiğinde, bu safsızlık standardı rutin olarak kullanılmalıdır. Sentez edilen bu standartlar ilaç endüstrisine ve ilaç hammaddesi tüketicilerine verilmesi gerekebilir. • Sentezlenen safsızlıklar toksikoloji testlerinde kullanılabilir. Büyük safsızlıkların olması durumunda, bu zorunluluktur. Bazen, safsızlıkların sentezi çok problemli olabilir, hatta mümkün olmayabilir. Böyle istisnai durumlarda sentezler safsızlık profili protokolünden ayrılabilir ve safsızlık standardı preparatif HPLC kullanılarak hazırlanabilir (22). 2.2.3. Safsızlıkların Kantitatif Tayini Safsızlıkların (özellikle parçalanma ürünlerinden kaynaklanan safsızlıkların) kantitatif tayininin doğruluğu ve güvenilirliği ve büyük oranda bir safsızlık standardının mevcut olup olmadığına bağlıdır. Farmakopeler genellikle safsızlık standartlarının bulunabilirliğini dikkate almazlar ve seçici olmayan, genel kantitatif HPLC veya yarı kantitatif İTK ve çok az sıklıkla GC metotlarının kullanımını içerirler. Sadece çok sınırlı sayıda adlandırılmış safsızlıkların belirlenmesi için spesifik metotlar kullanılır. Olguların çoğunda, safsızlıklar isimlendirilmemiştir ki böyle olsa bile seçici olmayan metotlar safsızlıkların belirlenmesi için kullanılmaktadır. Bundan dolayı yukarıda bahsedilen metotlar safsızlıkların belirlenmesi için kullanıldığında, safsızlıkların miktarı ve bunların toplamı ana bileşen olarak ifade edilebilir (22). Genel olarak bu testler ve bu şekilde elde edilen sonuçların güvenilirliği çeşitli faktörlere bağlıdır ve bunlar kabul edilebilir ya da tamamen yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. HPLC ya da İTK yöntemleri tek dalga boylu UV dedektörü ile kullanıldığında ve ana bileşen ve safsızlığın UV spektrumlarının birbirine yakın olduğunda sonuçlar kabul edilebilir ve tayin dalga boyu doğru bir şekilde seçilir. Eğer spektrumlar farklı ve dedektörün dalga boyu optimum değere ayarlanmamışsa, aynı teknikleri kullanarak hatalı sonuçlar elde edilebilir. Spektrofotometrik olarak inaktif ilaç maddesi içerisinde spektrofotometrik olarak aktif olan bir safsızlığın olması durumunda 10’lık katlık bir fazla tahmin kolaylıkla gerçekleşebilir. Aksine, ilaç maddesi spektrofotometrik olarak aktif, safsızlık inaktif olması durumunda aynı büyüklükte düşük tahmin gerçekleşebilir. 29 Aynı durum farmakopede CE ve CEC yöntemleri için de geçerlidir. İTK da eğer lekelerin görsel olarak karşılaştırılması işlemi, plakaya bu ilaçla farklı bir şekilde reaksiyona girebilecek olan bir reaktifi püskürttükten sonra yapılırsa, bu işlem sırasında ilaca ait safsızlık farklı renklerde lekelere yol açar ve bu şekilde ciddi hatalı sonuçlar elde edilebilir. GC kullanıldığında alev iyonizasyon dedektöründe safsızlığın yapısına ilgili sinyaller ve ilaç sinyalleri arasında genellikle büyük farklılıklar yoktur (22). Safsızlık standardı sentezlendiğinde bütün bu zorlukların ve belirsizliklerin üstesinden kolayca gelinebilir. Bunu başarmak için de 3 genel olasılık vardır: • Yukarıda bahsedildiği gibi, pek çok durumda ilaca ve bu ilacın safsızlığına ait dedektör sinyalleri arasında büyük farklılıklar yoktur: bağıl dedektör sinyali birim sinyale yakındır ve bu sebeple bu sinyal ihmal edilebilir. İngiliz Farmakopesine göre dedektör sinyalleri 0.8 ile 1.2 arasında olduğunda bu prensip geçerlidir. • Eğer sinyal aralığı büyük ise (ör: 0.2-5), dedektör sinyali sıkı bir şekilde belirlenmiş deneysel şartlar altında tayin edilmelidir ve bütün durumlarda bir düzeltme faktörü olarak kullanılır. Bu basit yaklaşımın avantajı metot geliştirme ve validasyonundan sonra çoğunlukla pahalı olan safsızlık standardının geliştirilen metot rutin olarak kullanıldığında gerek duyulmasıdır. • Dedektör sinyalleri arasında büyük farklılıklar olduğunda, genel olarak safsızlığın yarı kantitatif tayini İTK plaklarındaki lekelerin görünür karşılaştırmasıdır. Safsızlığın tayini için safsızlık standardı kullanılarak bir metot geliştirilmeli, valide edilmeli ve daha sonra rutin olarak kullanılmalıdır (22). 30 3. SONUÇ İlaç etken maddelerindeki (API) safsızlıklar tespit edilerek tanımlanabilmektedir. Bu safsızlıkların nitelikleri belirli bir süreçte elde edilerek değerlendirilmekte, bu da tek bir safsızlığın biyolojik güvenliği hakkında bilgi sağlamaktadır. Böylece ilaç araştırmada ilaçların safsızlık profilinin kapsamı ve gereksinimi ortaya çıkmaktadır Safsızlıkların tespiti, çeşitli kromatografik ve spektroskopik tekniklerle tek başına ya da diğer tekniklerle kombine halinde yapılır. Bu tekniklerle safsızlıkları tespit etmek ve tanımlamak için HPLC, İTK gibi farklı yöntemler kullanılır. Özellikle HPLC safsızlık profilinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Geniş aralıklı dedektör ve sabit fazın kullanıldığı HPLC’nin çeşitli uygulamaları ile duyarlı ve uygun maliyetli ayırma sağlanabilmektedir. Çeşitli düzlemsel kromatografik yöntemler arasında; HPLC ile karşılaştırıldığında düşük maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle İTK, safsızlıkların izolasyonu için en yaygın kullanılan ayırma yöntemidir. GC, çözücü kalıntılarının tanımlanmasında en çok tercih edilen yöntemlerden biridir. Kombine tekniklerin ortaya çıkışı safsızlık profilinde adeta devrim yaşatmıştır. Bu sayede sadece ayırma değil bununla birlikte safsızlıkların yapıları da belirlenebilmiştir. Bu kombine teknikler arasından ilaç safsızlık profilinde en çok kullanılan yöntemler, LC-MS-MS, LC-NMR, LC-NMR -MS, GC-MS ve LC-MS’dir. Doğru metot geliştirme ve validasyon prosedürleri safsızlık profilinin çıkarılması görevini kolaylaştırır. Kalite güvencesi, geniş bir kavramdır. Bu kavram, safsızlık profilini geniş bir alana yayar. Bir maddenin safsızlık profili incelenerek madde içinde mevcut olan safsızlıkların olası maksimum miktarı bulunabilir. İlaç maddesinde ve ürününde safsızlık seviyeleri için kuralların oluşturulması üreticiler için kalite kriterlerini belirlemektedir. Bunun önemli bir yönü de yeni bir kimyasal işletmenin safsızlık profilini yeterli şekilde göstermesi gerektiğidir. % 0.1 yeterlilik eşiği ya da bu oranın altındaki yüksek doz bileşenler için ilaç analistleri kullanılacak analitik tekniği dikkatli 31 bir şekilde düşünerek karar vermelidir. Özellikle metot geliştirme evrelerinde, kombine yöntemler gibi yüksek seçiciliğe sahip metotları kullanmak gerekli olabilir. 32 4. KAYNAKLAR 1. Kayaalp S.O. Genel Farmakoloji, Farmakokinetik ve Toksikoloji, Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji (12), 1, Prof. Dr. S. Oğuz Kayaalp, Pelikan Yayıncılık, Ankara, 2009: 704 2. Gorog S, Various Aspects of the Estimation of Impurities in Drugs, Identification and Determination of Impurities in Drugs (1), 1, Sandor Görög, Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 1-4 3. ICH Guideline: Impurities in New Drug Substances, CPMP/ICH/142/95, 1995 4. Reepmeyer J.C. and R.D. Kichhoefer, J. Pharm. Sci. 68, 1979: 1167-1169 5. Kirchhoefer R.D., Reepmeyer J.C. and Juhl W.E., J. Pharm. Sci. 69,1980: 550-553 6. Bundgaard H., J. Pharm. Pharmacol. 26, 1974: 18-22 7. Husain S. and Rao R.N., Proc. Control Qual. 10, 1997: 41-57 8. European Pharmacopoeia, 3rd edn, Council of Europe, Strasbourg ,1997 9. Gorog S., Balogh G., Csehi A., Csizor T., Gazdag M., Halmos Zs., Hegedfis B., Heronyi B., P. Horv-th and Lauko A., J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 1993: 12191226 10. Gorog S, Various Aspects of the Estimation of Impurities in Drugs, Identification and Determination of Impurities in Drugs (1), 1, Sandor Görög, Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 9-21 11. Gorog S, Lauko A. and Her~nyi B., J. Pharm. Biomed. Anal. 6, 1988: 697-705 12. Gorog S, Heronyi B. and Ronyei M., J. Pharm. Biomed. Anal. 10,1992: 831-835 33 13. Gorog S, Lauko A., Heronyi B., Georgakis A., Csizor I, Balogh G., Gy. Gfilik, S. Maho and Z. Tuba, Chromatographia 26, 316-320 (1988) 14. Gorog S, Balogh G. and Gazdag M., J. Pharm. Biomed. Anal. 9, 1991: 829-833 15. Gorog S, in Steroid Analysis in the Pharmaceutical Industry. (S. G6r6g, Ed.), Ellis Horwood, Chichester ,1989: 181-211 16. Smolinske S.C., Handbook of Food, Drug and Cosmetic Excipients, CRC 17. Fiedler H.P., Lexikon der Hilfstoffe fiir Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Editio Cantor, Aulendorf ,1996 18. McGinity J.W., J.A. Hill and A.L. La-Via, J. Pharm. Sci 64,1975: 356-357 19. Chowhan Z.T., Pharm. Technol. 19, 1995: 43-48 20. Chowhan Z.T., Pharm. Technol. 21, 1997: 56-67 21. Watson D.G., L. Li Xin, J.M. Midgley and D. Carr, J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 1999: 917-921 22. Gorog S., Identification, Structure Elucidation and Determination of Related Organic Impurities, Identification and Determination of Impurities in Drugs (1), 1, Sandor Görög, Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 67-81 23. Berridge J.C., J. Pharma. Biomed. Anal. 14,1996: 7-12 24. Hofstraat J.W., Engelsmai M. Van de Nesse R.J., Goojier C., Velthorst N.H. and U. Brinkman A.T., Anal. Chim. Acta 186,1986: 247-259 25. Banks C.T., J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 1993: 705-710 26. Nicolas E.C. and Scholz T.H., J. Pharm. Biomed. Anal. 16,1998: 813-824 27. Nicolas E.C. and Scholz T.H. , J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 1998: 825-836 34 ÖZGEÇMİŞ KİŞİSEL BİLGİLER Ad, soyadı : Dilek NAS Uyruğu : Türkiye (TC) Doğum Tarihi ve Yeri : 15 Temmuz 1989, Aksaray Medeni Durumu : Bekar E–mail : [email protected] Tel : 05055635098 EĞİTİM Derece Kurum Mezuniyet Tarihi Lisans E.Ü Eczacılık Fakültesi 2013 Lise Hazım Kulak Anadolu Lisesi 2007
