6.hafta-protoplast-kulturu ve somatik melezleme

Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR
Selülozik yapıdaki hücre çeperleri, mekanik ya
da enzimatik yollarla çıkarılmış olan hücrelere
“protoplast” denilmektedir.
Protoplast
kültürü
ise,
izole
edilen
protoplastların, hücre modifikasyonu ve somatik
hibridizasyon yöntemleriyle, bitki tür ve
çesitlerinin geliştirilmesi amacına yönelik
olarak, uygun besin ortamlarında kültüre
alınmasıdır.
Protoplastların
faktörler;
canlılığı
üzerine
Enzimin saflığı
Kültür ortamının ozmotik basıncı
etki
eden
Bir bitkinin hücre, doku, organ, meristem veya
embriyo gibi çeşitli parçalarından yeni bitki
veya
bitkiler
elde
edilmesine
bitki
rejenerasyonu denir.
In vitro şartlarda tek hücreden yeni bitki elde
edilmesine totipotansi, böyle bir hücreye de
totipotent hücre denir.
Bitkilerde hücre duvarı hücre için mekanik bir
sınır ve destek olarak görev yapmakta, ozmotik
değişiklikler sonucu hücrenin patlamasını ve
mikroorganizmaların hücreyi enfekte etmesini
engellemektedir.
Hücre duvarı hücrenin büyüklüğünü, şeklini ve
dengesini belirler.
Selüloz
Hemiselüloz
Pektik maddeler
Eksplant kaynakları
Donör bitki materyalinin ön muamelesi ve yetiştirme şartları
Protoplast izolasyonunda kullanılan
enzimler ve enzim karışımları
Ozmotik şartlar ve plazmolizasyon
Enzim inkübasyonu
Protoplastların yıkanması ve saflaştırılması
İzolasyon sonrası uygulanan testler
yıkama
solüsyonları,
Protoplast kültürü yapılışı
Yaprak mezofil hücreleri (klorofil içerdiklerinden
melezlemede yapılan renksel ayrımda avantajlıdır)
somatik
Embriyonik hücreler (daha hızlı gelişme ve bölünme gösterirler)
Genç bitki dokuları
Henüz olgunlaşmamış bitki doku ve organları (embriyo, kotiledon,
meyve kabuğu)
Meristematik hücreleri içeren dokular (gövde apikal meristemi, yan
ve kök ucu meristemleri)
Özel protoplast kaynakları (polen tanesi, skutellum, stoma hücreleri
vb.)
Eksplantın alındığı bitkinin gelişme devresi ve
şartları
Kültür ortamı komponentleri
Sıcaklık
Işık
Yıkama solüsyonları;
CaCl2, manitol, CPW
Enzimler;
Selülaz, hemiselülaz, pektinaz
Ozmotik basıncı ayarlamak için;
Manitol
Sorbitol
Glikoz
Sakkaroz
KCl
CaCl2 kullanılır.
İnkübasyon süresi kısa tutulmalıdır.
Sıcaklık arttıkça inkübasyon süresi kısalır.
En çok kullanılan saflaştırma metodları;
Filtrasyon
Santrifüj
Karışık metod
Daha yoğun bir çözelti içinde yüzdürme
Filtrasyon metodunda, ortalama protoplast
çapına göre değişen ve azalan porozitede bir
seri filtreden protoplastlar geçirilir ve az
sayıda santrifüj işlemi uygulanır.
En çok kullanılan teknik filtrasyon ve santrifüj
işleminin birlikte uygulanmasıdır.
İlk önce protoplast karışımı bir filtreden
geçirilir, daha sonra 5-10 dk santrifüj edilir.
Bazı
durumlarda
protoplastlar
sakkaroz
çözeltisinde düşük devirde santrifüj edilir.
Sakkaroz çözeltisi protoplastlardan daha fazla
yoğun olduğu için protoplastlar çözelti üzerinde
toplanırlar ve pipetle çekilerek uzaklaştırılırlar.
Buna yüzdürme metodu denir.
Hücre duvarı kalıntısının tespiti
Canlılık testleri
Protoplast büyüklüğü ve verim tespiti
Somoklonal varyasyon yaratılarak, bunlar
arasından amaca uygun fertlerin seçilmesi,
Melezlenmeleri mümkün olmayan türlerin
protoplast füzyonu ile melezlenebilmeleri,
Protoplastlar bünyelerine makro moleküller,
organeller ve hatta hücre çekirdekleri de
alabildiğinden, istenilen bilgilerin yeni bitkilere
aktarılması.
Protoplast Kültürü
Sıvı damla kültürleri tekniği
Agaroz blokları kültürü tekniği
Sıvı kültür tekniği
Agaroz damla kültürü
Agar içinde kültür tekniği
Agar üzerinde sıvı kültür tekniği
Asılı veya oturan damla kültürü
Protoplastların tutuklanması
Nörs kültürleri ve besleyici hücreler
Agaroz ortamı kültürü tekniği
Strese tepki: enzim etkisi
hücresinin
kendi
savunma
geliştirmesi
sonucu bitki
mekanizmasını
Tamir mekanizması: hücre zarında ve zar
proteinlerinde oluşan zararın giderilmesi, yeni
zarın oluşturulması
Adaptasyon: organellerin ve sitoplazmanın
morfolojik ve fonksiyonel olarak adaptasyonu
Hücre bölünmesi: hücre hayat döngüsünün
yeniden başlaması, hücre bölünmesi ve kallus
oluşumu
Morfogenesis:
organize
hücre
gelişmesi,
bölünmenin uyarılması ve değişimin başlayarak
organize doku ve daha sonra bitkilerin
oluşturulması
Protoplast füzyonu ve somatik
melezleme, pre-zigotik eseysel
uyusmazlıklar nedeniyle, klasik
melezleme ile elde edilemeye
hibritlerin elde edilmesinde
kimyasal ve fiziksel yöntemlen
kullanılarak
uygulanan
bir
tekniktir.
Somatik hibridizasyon
Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek,
sitoplazma veya her ikisinin de birbirleriyle
belirli ortam ve şartlarda birleştirilmesidir.
Füzyon sonucu oluşan yapılara füzyon ürünleri
veya heterokaryonlar denir.
M. sativa x M. coerulea somatik hibridine
ait çiçekler
Füzyonu olacak her iki cins veya türden tekrarlanabilir bir şekilde
protoplastlar elde edilir
Protoplastlar çeşitli metodlarla birleştirilir (füzyon)
Füzyon ürünlerinin seçimi yapılır
Heterokaryonların kültürü sonucu önce
rejenerasyonu yoluyla bitkiler elde edilir
Somatik melezler seleksiyona tabi tutulur
Somatik melez bitkiler ebeveynlerle karşılaştırmalı olarak analiz
edilir
Verim ve tarla denemeleri yapılır
Tohum üretimi ve tescil işlemi yapılır.
kallus
sonra
sürgün
Protoplast füzyonunda;
Polietilen glikol (PEG) ile füzyon ve
Elektrofüzyon metodları kullanılmaktadır.
RAPD profilleri
Kromozom sayımı
Southern analizi
Flow Sitometri
RFLP
İn situ genomik melezleme gibi biyokimyasal ve
sitolojik metodlar kullanılarak yapılır.
Fraksiyon I protein analizi
Kromozom sayısı ve karyotipi
İzozimler
Mitokondriyel DNA miktarının tespiti
Kloroplast DNA miktarının tespiti
Nüklear DNA miktarının tespiti
Genel morfoloji (somaklonal varyasyon)
Her bitki türü için tekrarlanabilir bir şekilde
protoplasttan
bitki
elde
etme
metodu
geliştirilmiş değildir.
Heterokaryonların etkin bir şekilde ayırımı
yapılamamaktadır.
Somatik melez bitkiler genellikle steril olmakta,
döl vermemekte veya fertil olması durumunda
çok
geniş
bir
somaklonal
varyasyon
göstermektedir.
www.bahcebitkileri.org
www.bahcebitkileri.org/bitkibiyoteknolojisi