rekombinant DNA

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I
REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ
KLONLAMA
Genetik mühendisliği, Canlılarla ilgili temele ve
uygulamaya ait sorunların çözülmesi için bir çok bilim
dalına ait bilgilerin ve çeşitli tekniklerin birlikte
kullanıldığı bir teknolojidir.
Genetik mühendisliği, en geniş anlamda, insanlar
tarafından belli bir amaca yönelik olarak genetik materyal
üzerinde yapılan çalışmalar olarak tanımlanabilir.
Genetik mühendisliğinin katkıları:
A. Bilimsel katkı.
•
Moleküler biyolojinin gelişimi.
B. Uygulamalı alanlara katkı.
•
Endüstri sektöründe kıymetli ürünlerin bol, saf ve ucuza
eldesi.
•
Tıpta hastalıkların tanı ve tedavisi.
•
Tarım ve hayvancılıkta iyileştirme.
•
Çevre kirliliğinin önlenmesi vb.........
Organizmaların genleri üzerinde yapılan planlı işlemler
⇒ genetik analizlerin yapılması
⇒ istenilen özellikleri taşıyan canlıların geliştirilmesi
Genetik Klonlamada Tarihçe
8 Deniz hayvanlarında döllenme O.Hertwig 1875
8 İlk kez anne rahmi dışında döllenme L.Schenk 1878
8 Tüp ortamında insan yumurta hücresi döllendi. MF Menkin 1944
8 Dondurulmuş sperm ile inek yumurtası döllendi.
1952
8 Deney tüpünde döllenen bir memeli yavru doğdu. 1959
8 Dondurulmuş embriyodan yavru fareler elde edildi. 1972
8 Louise Brown isimli bebek deney tüpünde döllendi anne rahmine yerleştirilerek sağlıklı doğum yaptırıldı. 1978
8 Avusturalyada donmuş embriyodan sağlıklı bir kız çocuğu elde edildi. 1984
Genetik Klonlamada Tarihçe
8 Kiralık anne Mary Beth bebeğini vermeyi reddetti. 1986
8 Embriyo hücrelerinin çoğaltılmasıyla çok sayıda kuzu elde edildi. 1987
8 İnsan embriyosu klonlandı çok tepki aldı. J.Hall 1993
✔ Dolly klonlandı. I.Wilmut 1997
8 Fransada bir dananın 63 klonu elde edildi. 1999
8 Totipotent stem hücrelerinden deneysel organogenezis 2000
8 Farede gen klonlama yöntemiyle insan kulağı gelişimi sağlandı. 2001
8 Avusturalyada bir at klonlama ile Coada eşek doğurdu. 2002
8 Amerikada ex vivo yapay rahim geliştirildi. 2002
Tarihçe
-­‐Yerleşik
yaşama geçen insanların,
dayanarak, seleksiyon yapmaları
gözlemlerine
-­‐Klasik bitki ve hayvan yetiştiriciliği ve iyileştirilmesi (tür
içinde kısıtlı)
-­‐Doku ve hücre kültürlerinin geliştirilmesi
⇒ Somatik hücre genetiği
⇒ Rekombinant DNA teknolojisi
Rekombinant DNA teknolojisi
Rekombinant DNA teknolojisi’nin genetik temeli;
rekombinasyon
Rekombinasyon: Yeni bileşim – yeniden oluşum. Bir
molekülün-­‐hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin(orijinal)
yapısından farklılık göstermesi durumudur.
I -­‐ In vivo rekombinasyon
II-­‐ In vitro rekombinasyon
Rekombinasyon, farklı genotipteki bireyler arasında
eşleşmeler meydana geldiğinde, ana-­‐babaya ait kalıtsal
özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya
gelmesine yol açan olaylar dizisidir.
Rekombinant DNA teknolojisi
REKOMBİNANT DNA: Doğal olarak bir arada bulunması
mümkün olmayan DNA moleküllerinin birleştirilerek yeni
bir kombinasyon oluşturulmasını ifade eder.
Moleküler düzeyde rekombinasyon farklı nükleotid
dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren
bölgeleri arasındaki parça alış verişi sonucunda
meydana gelen yeni gruplanmalardır.
→
rekombinant DNA molekülleri→
Rekombinasyonun Temeli
• Eşeyli üreme gösteren organizmalarda (ökaryotlarda)
genelde mayoz bölünmedeki crossingover olayı
sonucunda,
Bakterilerde;
transformasyon,
konjugasyon ve transdüksiyon sonucu meydana gelir.
• Krossingover işlemi; rekombinant DNA oluştursa da,
rekombinant DNA terimi, daha çok farklı biyolojik
kaynaklardan elde edilen DNA moleküllerinin
birleştirilmesi anlamında kullanılır.
Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında
homoloji (benzerlik) olmasına dayandığı için, doğada
rekombinasyon olayı aynı türe ait bireyler arasında
ya da çok yakın türler arasında kısıtlı kalmıştır.
Rekombinasyonun Temeli
Cohen ve arkadaşları (1973); rekombinasyon olayının,
birbiriyle hiç ilişkili olmayan organizmalara ait DNA
molekülleri arasında in vitro olarak ve istenilen biçimde
gerçekleştirilebilmesi
v Doğal rekombinasyon mekanizmalarıyla olanaksız olan
yeni gen kombinasyonlarının bu teknolojiyle mümkün
olması.
vBir organizmanın genotipi önceden belirlenmiş ve
yönlendirilmiş şekilde değiştirilebilmesi.
Rekombinant DNA Teknolojisi
Rekombinant DNA teknolojisi (genetik mühendisliği),
bir organizmadan herhangi bir yolla izole edilen bir
genin (DNA parçasının) uygun bir konağın içerisine
sokularak orada çoğalmasını ve bazen de anlatım
yapmasını amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin
toplamıdır.
Bu teknoloji, en geniş anlamda, belli bir amaca yönelik
olarak doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan
çalışmaları kapsar.
Klonlama Tipleri
I. DNA/Gen düzeyinde klonlama
II. Hücre düzeyinde klonlama
III. Organizma /çekirdek düzeyinde klonlama
Başarılı Klonlama Yapabilmek İçin Gen;
8 Bağımsız olarak replike olabilmeli
8 Konak hücreye kolaylıkla transfer edilebilmeli
8 Seleksiyona olanak tanımalı
DNA/Gen düzeyinde klonlama
Gen Klonlama
Gen klonlaması, bir organizmadan elde edilen ve içinde
istenilen geni taşıyan DNA parçalarının, taşıyıcı özellikte
bir DNA molekülüne (vektör) bağlanarak rekombinant
DNA oluşturulması; rekombinant DNA moleküllerinin
uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılması
Konak hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA molekülleri
döllere geçerler ve yavru hücrelerde de kopya sayılarını
artırırlar. Çok sayıda hücre bölünmesiyle oluşan bir klonda
hücrelerin her birinde istenilen geni taşıyan rekombinant
DNA moleküllerinin bir ya da daha fazla sayıda kopyası
bulunur.
• Gen klonlaması “Gene cloning” (ya da DNA
klonlaması) tek bir genden (DNA molekülü
parçasından) kökenlenen ve hepsi birbirinin aynı olan
bir DNA populasyonu elde etmektir.
Rekombinant DNA teknolojisi ile sentezlenen identik
DNA/gen kopyalarına denir.
• Klon (Clone) : tek bir atadan kök alan, birbirine özdeş
organizmalar ya da hücrelerdir.
Klon Bir tek atasal diploid hücreden mitoz bölünme yoluyla
birden fazla hücre eldesine denir.
Genel anlamda Klonlama; Moleküler biyoloji teknikleri
kullanarak bir DNA dizisine eş DNA üretmek veya bir
hücreden yola çıkarak hücre bölünmesi ile genetik
olarak birbirine eş hücre grubunun oluşturulmasıdır.
Gen klonlamanın hedefleri:
1. Genleri tanımak ve fonksiyonlarını öğrenmek
2. İnsan sağlığı veya ticari bakımdan önem arz eden
proteinlerin ucuz ve kolay bir şekilde üretilmesi,
saflaştırılması ve kullanıma sunulması
3. Enzim ve özellikle kanser tedavisine yönelik olarak
monoklonal antikorların ucuz ve kaliteli olarak
üretilmesi
4. Hormonların, antibiyotiklerin ve antioksidanların
(vitaminler) üretimini sağlayarak etkilerini arttırma,
yan etkilerini azaltma ve maliyetini düşürme
5. Aktif ve önemli proteinleri hücre kültüründe bol
üretme
Gen klonlamanın hedefleri:
6. Bazı metabolitlerin ilaç olarak kullanılması için uygun
sentez ve üretim yöntemi üretme
7. Hücre doku ve kültürü çalışmaları ile bitki doku ve
hücrelerinden bitki üretimi
8. Suni doku ve organ üretimi
9. Gen tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi
10. Hayvanlarda ıslah metodlarının geliştirilmesi
11. Aşı üretimi
12. Ülkemizde yetişen yüksek ekonomik değeri olan
organizmaların gen analizlerinin yapılması ve
rekombinant meyve ve sebzelerin üretilmesi
…..ve daha birçok hizmet alanı oluşabilir!
Gen Klonlamasının Aşamaları ve Kullanılan Temel Yöntemler
Gen Klonlamasının Aşamaları A. GEN İZOLASYONU (Total mRNA izolasyonu, cDNA üretimi)
B. KLONLANACAK GENİ TAŞIYAN DNA PARÇALARI İLE
VEKTÖRE BAĞLANMASI (LİGASYON)
C.
REKOMBİNANT
DNA
MOLEKÜLLERİNİN
OLUŞTURULMASI Rekombinant DNA eldesi
D. REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN KONAK
HÜCRELERE SOKULMASI Rekombinant DNA’nın hücreye
transferi ve çoğaltılması, cDNA kütüphanesi, Genomik
DNA kütüphanesi, Kütüphanelerin problar ile taranması,
Klonlanan genin doğrulanması
E. REKOMBİNANTLARIN SELEKSİYONU
A. GEN İZOLASYONU
A. GEN İZOLASYONU
* İlgilenilen geni taşıyan DNA parçalarının elde
edilmesidir. Bu amaçla;
**Bir organizmadan izole edilip saflaştırılmış DNA
moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan,
parçalamak amacıyla;
•Mekanik yöntemler (kontrollü çalkalama, ultrason
uygulaması vb.)
•!!! Restriksiyon endonukleazları’nın kullanımı
Restriksiyon Endonukleazları (Restriksiyon Enzimleri)
Çift zincirli DNA moleküllerinde özel baz dizilerini tanıyan
ve her iki zincirde kesme yapan enzimler
endodeoksiribonukleazlar’dır.
Bu enzimler, bakterilerde hücre içine giren yabancı
DNA ’ ları (örneğin faj DNA ’ larını) parçalamakta ve
onların aktivitelerini kısıtlamakta iş görürler (restriksiyon).
Bakteri kendi DNA ’ sını bu enzimlerin etkisinden
restriksiyon
endonukleazın
tanıdığı
nukleotid
dizilerindeki
bazı
bazları
metilleyerek
korur
(modifikasyon).
Restriksiyon Enzimleri
v Modifikasyon enzimi tanıdığı dizi içindeki özel yer veya
yerlere genellikle bir metil grubu ekler.
vRestriksiyon
enzimi
değişikliğe
(modifikasyona)
uğramamış bir tanıma dizisinin varlığında bir endonukleaz
gibi davranır ve DNA’nın her iki zincirini bir ya da bir çok
kere kesecek biçimde işlev yapar.
vRestriksiyon enzimleri; DNA da çift zincirdeki, çoğunlukla
4-­‐6 baz çiftinden oluşan, özel dizileri (palindrom) tanırlar.
Örneğin, 5’-­‐ G A A T T C –3’
3’-­‐ C T T A A G – 5‘
Restriksiyon Enzimlerinin Sınıflandırılması
Tip I restriksiyon endonukleazları, çift zincirli DNA da bir
tanıma dizisi ile etkileşime girdikten sonra DNA boyunca
1000-­‐5000 nukleotidlik bir mesafede ilerleyip DNA’nın bir
zincirinde gelişigüzel bir noktada kesme yaparlar.
•Restriksiyon ve modifikasyon aktiviteleri aynı enzim
tarafından gerçekleştirilir. 3 alt birimden (DNA da özel bir
diziyi tanıyan, DNA yı metilleyen ve kesme yapan)
oluşurlar. Bu alt birimlerin ancak üçü birlikte olduklarında
işlevlerini yapabilir; buna göre, restriksiyon endonukleaz
aktivitesi metilleyici aktivitesi olmaksızın DNA da kesme
yapamaz. Hem kesme hem de metilleme reaksiyonları için
ATP ve S-­‐adenozilmetionin gereklidir.
!!! II. tip restriksiyon endonukleazları, çift zincirli
DNA molekülünde rotasyonal simetri eksenine sahip bir
kaç (4-­‐6) nukleotidlik bir hedef diziyi tanırlar ve bu hedef
dizide kesme yaparlar. Bazıları iki zincirde hedef dizideki
tanıma noktalarından belli uzaklıkta ve zıt yönde (zikzak
biçiminde) kesmeler yaparlar. Oluşan parçaların uçlarında
birbirinin tamamlayıcısı tek zincirli çıkıntılar meydana gelir
(yapışkan uçlu parçalar). Bazıları ise hedef dizideki
tanıma noktalarında tam karşılıklı olarak iki zincirde
kesme yaparlar (küt uçlu parçalar).
II. tip enzimlerin restriksiyon ve modifikasyon aktiviteleri
ayrıdır ve birbirinden bağımsız olarak çalışabilir. Kesme
aktivitesi için ATP ve S-­‐adenozilmetionine gereksinimleri
yoktur.
Restriksiyon Enzimlerinin Adlandırılma Sistemi (Smith ve Nathans, 1973)
a) Konak organizmanın cins adının ilk harfi ve tür adının ilk iki harfinden
meydana gelen, italik biçimde yazılan, üç harfli bir kısaltma; örneğin, E.
coli’’ye aitse Eco, H. influenza’ya aitse Hin.
b) Konak bakterinin ırk veya tipine ait simgenin alt yazı ile verilmesi;
örneğin, EcoK gibi. Restriksiyon-­‐modifikasyon sistemi bir virus veya
plazmidde bulunuyorsa bu özelliğin de alt yazı ile belirtilmesi; örneğin,
EcoR1.
c) Konak organizma birden fazla restriksiyon-­‐modifikasyon sistemine
sahipse bunların Romen rakamlarıyla belirtilmesi; örneğin., HindI.
d) Restriksiyon enzimlerinin (R), modifikasyon enzimlerinin (M) olarak
belirtilmesi; örneğin, R.HindIII, M.HindIII.
(Pratikte, bütün kısaltmalar aynı hizada yazılmakta ve sadece restriksiyon
enzimleri söz konusu olduğunda R simgesi de kullanılmamaktadır)
•AarI
•BseNI (BsrI) •Eam1105I
•HpyF10VI (MwoI) •AasI (DrdI) •BseSI
•Ecl136II (SacI) •KpnI
•PfoI
Psp5II (PpuMI) •AatII
•BseXI (BbvI) •Eco24I (HgiJII) •Kpn2I (BspMII) •Psp1406I (AclI) •Acc65I (KpnI) •Bsh1236I (FnuDII) •Eco31I
•KspAI (HpaI) •PstI
•AdeI (DraIII) •Bsh1285I (McrI) •Eco32I (EcoRV) •LweI (SfaNI) •PsuI (XhoII) •AloI
•BshNI (HgiCI) •Eco47I (AvaII) •MbiI (BsrBI) •PsyI (Tth111I) •AluI
•BshTI (AgeI) •Eco47III
•MboI
•PvuI
•Alw21I (HgiAI) •Bsp68I (NruI) •Eco52I (XmaIII) •MboII
•PvuII
•Alw26I (BsmAI) •Bsp119I (AsuII) •Eco57I
•MlsI (BalI) •RsaI
•Alw44I (ApaLI) •Bsp120I (ApaI) •Eco57MI
•MluI
•SacI
•ApaI
•Bsp143I (MboI) •Eco72I (PmaCI) •MnlI
•SalI
•BamHI
•Bsp143II (HaeII) •Eco81I (SauI) •Mph1103I (AvaIII) •SatI (Fnu4HI) •BclI
•Bsp1407I
•Eco88I (AvaI) •MspI (HpaII) •ScaI
•BcnI (CauII) •BspLI (NlaIV) •Eco91I (BstEII) •MssI (PmeI) •SchI (PleI) •BcuI (SpeI) •BspPI (BinI) •Eco105I (SnaBI) •MunI (MfeI) •SdaI (Sse8387I) •BfiI
•BspTI (AflII) •Eco130I (StyI) •MvaI (EcoRII) •SduI
•BfmI (SfeI) •Bst1107I (SnaI) •Eco147I (StuI) •Mva1269I (BsmI) •SmaI
•BfuI
•BstXI
•EcoO109I (DraII) •NcoI
•SmiI (SwaI) •BglI
•Bsu15I (ClaI) •EcoRI
•NdeI
•SmuI (FauI) •BglII
•BsuRI (HaeIII) •EheI (NarI) •NheI
•SspI
•Bme1390I (ScrFI) •BveI (BspMI) •Esp3I
•NmuCI (Tsp45I) •TaaI (Tsp4CI) •BoxI (PshAI) •CaiI (AlwNI) •FspAI
•NotI
•TaiI (MaeII) •BpiI (BbvII) •CfrI
•GsuI
•NsbI (MstI) •TaqI
•BplI
•Cfr9I (SmaI) •Hin1I (AcyI) •OliI
•TasI (TspEI) •Bpu10I
•Cfr10I
•Hin4I •PaeI (SphI) •TatI
•Bpu1102I (EspI) •Cfr13I (AsuI) •Hin6I (HhaI) •PagI (BspHI) •TauI
•BseDI (SecI) •Cfr42I (SacII) •HincII (HindII) •PauI (BsePI) •Tru1I (MseI) •BseGI (FokI) •CpoI (RsrII) •HindIII
•PdiI (NaeI) •Van91I (PflMI) •BseJI (BsaBI) •Csp6I (RsaI) •HinfI
•PdmI (XmnI) •VspI
•BseLI (BsiYI) •DpnI
•HpaII
•Pfl23II (SplI) •BseMI (BsrDI) •DraI (AhaIII) •HphI
•BseMII
•Eam1104I
(Ksp632I) •Hpy8I (MjaIV) •XagI (EcoNI) •XapI (ApoI) •XbaI
•XceI (NspI) •XhoI
•XmaJI (AvrII)
•XmiI (AccI)
DNA kopyasının (c DNA) elde edilmesi
vHücrelerden,
klonlanması
amaçlanan genin transkripsiyon
ürününü de içeren, RNA
moleküllerinin izolasyonu.
v Ters (revers) transkriptaz
enzimiyle
bu
RNA
moleküllerinin tamamlayıcısı
olan
DNA
kopyalarının
çıkarılması (cDNA).
PCR yöntemi
³ DNA moleküllerindeki özel dizilerin (örneğin istenilen bir
genin) hücre içerisine sokulmadan izole edilip çoğaltılabilmesi.
³ Genomdan istenilen (çok az miktarda olabilen) bir bölgenin,
milyonlarca kopyasının elde edilebilmesi.
!!! Bu dizinin (aynı organizmadaki ya da yakın bir başka
organizmadaki) hiç değilse bir kısmının daha önceden bilinmesi
gerekli.
v Nukleotid dizisi bilinen bir bölgeden yararlanılarak
(çoğaltılacak olan bölgenin bulunduğu DNA’da farklı zincirlerdeki
zıt uçların tamamlayıcısı özellikte) 2 oligonukleotid (primer)
sentez edilmesi.
PCR yöntemi
v Her reaksiyonu üç temel aşamadan oluşan PCR’nin
uygulanması: (1) DNA nın denatürasyonu, (2) Primer
dizilerin DNA nın tek zincirlerine bağlanması, (3) DNA
polimeraz tarafından zincir uzatma reaksiyonu.
Denatürasyon için, kısa süreli yüksek sıcaklık
uygulaması, ortamdaki primerlerin birbirinden ayrılmış
zincirlere bağlanarak replikasyonun başlatması için
sıcaklık derecesinin düşürülmesi. Enzim, yüksek
sıcaklığa dayanıklı bir DNA polimeraz (örn. termofilik
bakteri, Thermophylus’dan elde edilen Taq polimeraz ).
Her reaksiyon çevriminde
kalıp
zincir
sayısı
logaritmik olarak artması
nedeniyle kısa bir zaman
süresi (bir kaç saat) içinde
çok sayıda ve istenilen
geni taşıyan DNA parçası
oluşması; örneğin, 35
çevrim sonunda hedef
DNA ’ nın (genin) kopya
sayısında ~ 1 milyon kat
artış.
B. KLONLANACAK GENİ TAŞIYAN DNA PARÇALARI İLE VEKTÖRÜN BAĞLANMASI (LİGASYON)
REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN OLUŞTURULMASI
⇒ Rekombinant DNA molekülleri
♦ Restriksiyon enzimleri tarafından meydana getirilen yapışkan
uçların birbirini tanıması
C. REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN OLUŞTURULMASI
•
İzole edilen geni taşıyan DNA parçalarının taşıyıcılık
görevi yapacak uygun DNA moleküllerine
bağlanmasıyla
elde
edilen
moleküllerin
(rekombinant DNA) elde edilmesi.
• Genetik mühendisliğinde rekombinant DNA, doğal
olarak birlikte bulunmayan (farklı kökenli) DNA
molekülleri (veya parçaları) arasında laboratuvar
koşullarında yaratılmış yeni düzenleme (birlik).
Bağlanma reaksiyonlarındaki bazı sorunlar
Vektörün, kendi uçlarının birleşmesiyle, yeniden halka
biçimini kazanması ⇒ rekombinant DNA oluşum
olasılığının azalması.
Engellemek için
v Vektörün 5 ’ uçlarındaki fosfat gruplarının yok
edilmesi.
v Vektör ve yabancı DNA kesimlerinin yapılmasında
farklı ancak uygun uçlar yaratan restriksiyon enzimleri
kullanılması ya da iki DNA ’ da farklı enzimlerle çift
kesmeler yapılması.
♦ Bağlayıcı (adaptör) moleküller kullanmak
♦ Homopolimerik tek zincirli
kullanmak (kuyruklama yöntemi)
kuyruklar
Taşıyıcı (vektör) DNA molekülleri Konak hücre içine kolaylıkla girebilmeleri ve buna göre
taşıdıkları geni istenilen bir konak içine sokabilmeleri.
v
v Bağımsız replikasyon yapma yetenekleri ve böylece
çoğalmaları sırasında ona bağlı olan ve kendi başına
çoğalma yeteneği genellikle olmayan genin (DNA
parçasının) de çoğalması, kaybolmadan döle geçmesi ve
çok sayıda kopyasının meydana gelmesi (gen
amplifikasyonu).
Rekombinant DNA= bir yolcu (geni içeren DNA parçası) +
onu taşıyan bir taşıt aracı (vektör DNA’sı)
Kullanılan vektör sistemler
•
•
•
•
•
•
•
Plazmid vektörler Viral vektörler kosmidler
Ekspirasyon (shuttle) vektörler Ti plazmidi Cosmid vektörler Yac Vector Genetik Klonlamada Kullanılan Vektörler
8 Plazmid 5-­‐10 kb
8 Bakteriyofaj 20 kb
8 Cosmid 50 kb
8 YAC 100 kb
8 Baculovirus 150 kb
8 BAC 200 kb
8 PAC 250-­‐300 kb
1. PLAZMİDLER
Bakteri hücrelerinde ve bazı ökaryotik hücrelerde
(örneğin, mayalarda) esas DNA molekülünün dışında,
daha küçük, (genellikle) halka biçiminde çift zincirli DNA
molekülleri.
v Bağımsız replikasyon yapma yeteneği
v (Bazılarında) bir hücreden diğerine geçebilme yeteneği
v (Bazılarında) esas DNA molekülünün yapısına da
girebilme yeteneği
v Replikasyon ve transfer ile ilgili genler dışında (çoğu
kez) diğer bazı işlevlere ilişkin genleri taşıma
Başarılı plazmid vektör geliştirilmesinde önemli ölçütler
1. Plazmid vektör mümkün olduğu kadar küçük olmalı ve
ilgilenilenlerin dışında genetik bilgi hiç taşımamalı ya da çok az
taşımalıdır.
Plazmidin küçük molekül ağırlıklı olmasının avantajları
v İzolasyon ve çalışma kolaylığı,
v Hücredeki kopya sayılarının çok olması → klonlanan genin
dozaj etkisinin artması
vRestriksiyon enzimlerine ait çok sayıda hedef noktası bulunması
olasılığının az olması
2. İstenilen konak içinde kolaylıkla çoğalabilmeli ve sonuçta fazla
sayıda vektör ve dolayısıyla rekombinant molekül elde
edilebilmeli.
Başarılı plazmid vektör geliştirilmesinde önemli ölçütler
3. Konakta kararlı devamlılık göstermeli.
4. Konakçı sınırı geniş olmalı.
5. Genlerin yerleşim bölgeleri, restriksiyon enzimlerinin kesme
yerleri ve (mümkünse) nukleotid dizisi iyi bilinmeli.
6. Transformasyona uğrayan hücrelerin uğramayanlardan ayırt
edilmesine olanak verecek ve kolaylıkla seçilebilir (örneğin,
antibiyotiklere direnç sağlama gibi) fenotipler veren bir ya da bir
kaç işaret (“marker”) gene sahip olmalı.
7. İdeal olarak, yabancı bir DNA parçasının girişiyle veya
restriksiyon enziminin kesmesiyle aktivitesini kaybedecek ek işaret
genleri de taşımalı (girişe bağlı inaktivasyon).
8. İşaret genin birinde ya da diğerinde bulunan çok sayıda değişik
restriksiyon endonukleazlara ait kesme noktalarını içermeli.
Plazmidler
• gen aktarımında
başarılı
• geniş
çapta
kullanılmakta
Özellikle fazla büyük
olmayan
DNA
parçalarının
klonlanmasında
başarı şansı daha
yüksek .
2. VİRUS DNA’LARI
Çift Zincirli DNA Virusleri
En başarılı sonuç verenleri bakteriyofajlar (özellikle ılımlı
fajlar)
Ilımlı fajlarda
° litik yaşam
° lizojenik yaşam
λ fajı
Genomu ~49 kb çiftlik doğrusal ve çift zincirli DNA
molekülü. Konak hücrede DNA ’ nın iki ucundaki
tamamlayıcı tek zincirli bölgelerin eşleşmesiyle ⇒ halka
biçimi [cos bölgesi (yapışkan yer, “cohesive site”)]
⇒ vektör geliştirilmesinde önemli.
λ fajının tüm genleri tanımlanmış ve haritalanmıştır;
tüm dizisi bilinmektedir.
Genomdaki genlerin yerleşim biçimleri ⇒ kümeler
oluşturmaları
⇒ klonlama vektörü olarak kullanılmalarında avantaj.
Orta kısımda bakteri genomuna girişi kontrol eden
(lizojenik yaşam için gerekli olan)
Genomun sağında ve solunda litik evre (lizis ve kapsid
oluşumu) için gerekli olan genler
λ fajı
λ fajı partikülünün olgunlaşması sırasında, fajın baş
kısmı genom DNA’sının % 75-­‐105’ini kılıf içine alabilir. λ
vektör sisteminin temel özelliği başın DNA ile tam olarak
dolması gerekliliğidir.
Lizojenik evre genleri genomun sadece % 23.3 ünü
kapsadıkları için, bu parçaları yok edilmiş fajlarda başın
tam dolması kuralı etkilenmez ve faj litik üreme
yapabilir. Bu nedenle, bu bölgenin yerine yabancı DNA
sokulduğunda fajın bakteriye bulaşma yeteneği
etkilenmez ve plak oluşturur. Ayrıca, bu bölgenin yerine
sokularak λ vektörüyle boyu 14 kb (% 28) kadar olabilen
yabancı DNA parçaları taşınabilir.
λ fajı
Normal tipte λ DNA’sı restriksiyon endonukleazları için
çok sayıda hedef noktası içerdiği için uygun bir vektör
değildir.
Geliştirilmiş λ vektörler:
v Delesyonlar yapılarak, yabancı DNA nın girebileceği
tek hedef noktasına sahip girme tipi vektörler
v Yabancı DNA tarafından yok edilerek yeri alınacak bir
parçada (özellikle lizojenik yaaşamı etkileyen bölgede)
restriksiyon enzimleri için bir çift veya daha fazla hedef
noktaya sahip yer değiştirme tipi vektörler
λ fajının vektör olarak kullanım avantajları
v 40 kb kadar büyük DNA’ları içine alıp bakterilere
sokabilmeleri
v Bakteriye plazmidlere göre çok daha yüksek oranda
girebilmeleri
Biyolojik içerikte güvenlilik
Konak ve vektörün sadece laboratuvardaki özel üreme
koşullarında canlılıklarının ve devamlılıklarının sağlanması
→ litik üreme için gerekli genlere anlamsız mutasyonlar
sokulması (güvenilir λ vektörler). Bu mutasyonlar faj
üretimini tamamen engeller. Ancak, bu mutasyonları
baskılama yeteneğinde olan bazı E. coli K-­‐12 ırklarının
konak olarak kullanılmasıyla faj üretimi sağlanabilir.
Tek Zincirli DNA Virüsleri.
M13 fajı
Genomu 6407 nukleotidden oluşan tek zincirli halka biçiminde.
DNA’sı bakteriye girdiğinde ⇒ RF molekül (Replikatif form)
~100-­‐200 yeni RF molekül sentezi sırasında, (-­‐) zincir virus
genlerinin ürünlerinin sentezini de sağlar. Bu ürünlerden biri, artık
sadece (+) zincirlerin sentez edilmesini yol açar. (+) zincirler kılıf
proteinleri içinde paketlenerek olgun faj partiküllerini oluştururlar.
Faj partikülleri hücre çeperi parçalanmadan (veya hücre zarar
görmeden) hücreden çıkarlar. Ancak, infeksiyon hücrelerin
üremesini yavaşlatır ve M13 fajı yeni bakterilerde infeksiyona
devam ettikçe hücrelerde üremenin yavaşlamasını gösteren plaklar
meydana gelir.
M13 fajı
M13 fajının RF DNA ’ sının klonlama vektörü olarak
kullanımı
Oldukça küçük olan bu M13 DNA ’ sı restriksiyon
enzimlerine ait tek hedef noktaları içerir.
Yabancı DNA, M13 içine girdiğinde bu diziyi taşıyan tek
bir zincir faj içerisinde paketlenir ⇒ İki zincire ait bilginin
M13 aracılığıyla ayrı ayrı klonlanma olasılığı !!!
M13 vektörüyle klonlama
⇒ Sanger tekniğiyle nukleotid dizisi saptanması
⇒ in vitro mutagenez
M13 DNA’sından geliştirilmiş vektörlere bir örnek:
E. coli β-­‐galaktosidaz geninin bir kısmı + promotör ve operatör bölgeyi içeren 200
nukleotidlik kısım (klonlama bölgesi)
Yabancı genin başarılı şekilde sokulması için, klonlama bölgesinde ~ 50 nukleotidlik
yapay bir DNA parçası (EcoRI, BamHI, SalI, PstI vb için tanıma dizileri) (çoklu
klonlama yeri)
Vektörün lac bölgesine yabancı DNA’nın
girmesi β-­‐galaktosidaz sentezini yok
eder ⇒ (X-­‐gal içeren) seçici besi
ortamında faj plakları renksiz olur,
rekombinant olmayan mavi renklilerden
kolaylıkla ayırt edilebilir.
SV40
Memeli Hücrelerindeki Klonlamalarda Kullanılan Virüs Vektörler
Genomu oldukça küçük (5243 bç) halka biçimindeki çift
zincirli DNA molekülü. Genomun restriksiyon haritası,
nukleotid dizisi tanımlanmış ve genlerinin yerleri
bilinmektedir. Genomu hem bağımsız hem de konak hücre
kromozomlarının bir parçası gibi çoğalabilir.
Konak hücredeki litik infeksiyon aşamaları:
•protein kılıfın yok olarak virus DNA ’ sının nukleusa
hareketi, erken mRNA ve protein sentezi ve virusun teşvik
ettiği konak hücrenin DNA sentezi, geç mRNA ve protein
sentezi, hücresel parçalanma (lizis).
SV40
SV40’ın normal tipi vektör olarak kullanılamaz (⇐ yabancı
DNA eklendiğinde virus partikülü içine sığamayacak kadar
büyük bir DNA molekülü meydana gelir).
⇒ Uygun restriksiyon enzimleri ile (örneğin geç anlatım
yapan genlerin bulunduğu bölge) kesilerek kullanıma
uygun hale getirilebilir.
⇒ Virüsün genomunda transkripsiyonun başlaması,
tamamlanması, işlenme ve poli A kuyruğu eklenmesiyle
ilgili olan ve vektör olarak kullanımda gerekli olan genlerin
kalması sağlanır.
SV40’ın vektör sistemi olarak kullanımı
SV40 DNA’sı ile yabancı DNA’nın bir parçası arasında
rekombinantlar meydana getirmek ve melez molekülleri
izin veren (permisiv) hücreler içine sokmak
⇒ rekombinant DNA içeren kapsülle çevrili virionlar
oluşturmak.
v SV40 ile yabancı DNA arasında rekombinantlar
oluşturmak ve virionlar halinde paketlememek.
⇒ Rekombinant DNA ya hücre DNA’sından bağımsız
olarak plazmid gibi replikasyon yapar ya da bir
kromozomun içerisine yerleşir.
SV40’ın vektör sistemi olarak kullanımı
Rekombinant DNA içeren SV40 partikülleri meydana
getirmek için, SV40 DNA’sının erken veya geç bölgesinin
yerine yabancı DNA’nın bir parçasının geçirilmesi
⇒ Rekombinant moleküller virusun temel işlevlerini
yapacak ürünleri sentez edemezler; çünkü, örneğin,
erken bölgede T antijenleri geç bölgede de kapsid
proteinlerini şifreleyen genler bulunur.
Bu nedenle, yabancı DNA içeren virus partikülleri elde
etmek için eksik virus fonksiyonları, aynı anda yardımcı
( “ helper ” ) virus partikülleri kullanılarak
komplemantasyonla sağlanır.
SV40 dışında vektör olarak kullanılan başka hayvansal virüs çeşitleri
Hayvansal viral vektörlerin geliştirilmesi
v Memeli hücreleri konak olarak kullanılarak DNA dizilerinin
replikasyonla doğrudan klonlanması
v Yabancı genlerin genomda (örneğin bir genetik hastalığa yol
açan) bir allelin yerini almak üzere transfer edilmesi.
• Konakta kromozom dışında bağımsız olarak çoğalan vektörler.
Çoğu “bovine papilloma virus” dan türevlenir. Virüs genomunun bir
kısmını ve yabancı DNA ’ nın gireceği restriksiyon noktalarını
içerirler.
• Konağın genomuna giren vektörler. Kuş ve fareleri konak olarak
kullanan retroviruslardan geliştirilirler. Retrovirusların bazı genleri
yok edilir ve yabancı genleri taşıyacak biçime getirilir.
Bitki Hücrelerindeki Klonlamalarda Virus Vektörler
Çift zincirli Caulimoviruslar ve tek zincirli Geminiviruslar
Caulimoviruslar’ın pek azının biyolojik özellikleri bilinmektedir. Konak
sayısı kısıtlı ve konakta (özellikle, tahıl bitkilerinde) önemli hastalıklar
meydana getirirler.
En iyi bilinen örnek, karnıbaharda mozayik hastalığına yol açan
“cauliflower mosaic virus” (CaMv). CaMV genomu 4.5-­‐5 megadaltonluk
çift zincirli halka biçiminde DNA molekülü. Vektör olarak kullanımıyla
ilgili çalışmalar başlangıç aşamasında ve bazı olumsuz özelliklere sahip.
Örneğin, virusun saf DNA’sı bulaşıcı olduğu halde özel bir bölgeden
kesildiğinde bu özelliğini kaybetmektedir. Restriksiyon enzimleri
tarafından çok sayıda noktada kesilmektedir. Konak hücrenin
kromozomları içine girebildiğine ilişkin kanıt henüz yoktur. Ayrıca,
DNA’sının replikasyonu ve genlerinin işlevleri de pek bilinmemektedir..
Kosmidler (“Cosmid”ler)
• Cosmid vektörler hem λ virus vektörü gibi cos
bölgesi içeren , hem de plazmid vektörler gibi ori ve
antibiyotiğe dirençlilik genlerini içeren DNA
molekülleridir. Bu sayede, l vektöründe olduğu gibi
rekombinant molekül virus parçalarına sokulabilir
ve plazmid vektörde olduğu gibi bakteride çoğaltılıp
seçilebilir. Cosmid vektörler, yaklaşık 45 kb
büyüklüğünde DNA yı taşıyabilirler.
Cosmid Vektörlerinin Oluşum Aşamaları
• λ cos bölgesini içeren plazmid BamHI gibi bir restriksiyon
endonükleaz la kesilir ve böylece linear hale getirilir.
• Linear yapı 5 ’ fosfatların uzaklaştırılması için alkali ile
muamele edilir. Böylece yapının tekrar halkasal hale gelişi
engellenir.
• 35-­‐45 kb büyüklüğündeki ökaryotik DNA fragmentleri linear
hale getirilmiş plazmidle muamele edilir.
• Bu hale getirilmiş cosmid vektör virusun kapsidi içine konur.
Virusun bakteriyi enfekte etmesi sağlanır.
• Virus içindeki bu yapıyı bakteriye verir. Bakteri içine giren bu
rekombinant DNA cos genleri ile halkasal hale gelir.
• Daha sonra bu vektör, üzerinde bulunan orjin noktası ve
antibiyotiğe direnç geni sebebiyle antibiyotik bulunan
kültürlerde bakteri tarafından çoğaltılır.
Kosmidler (“Cosmid”ler)
λ DNA’sının “cos” bölgesi + plazmidlerde antibiyotiklere
direnç ve replikasyon için gerekli genlerin taşındığı
kısımlar.
Kosmidler ( “ cosmidler ” ), bakteri hücresine faj gibi
bulaşır ve hücre içinde plazmid gibi çoğalırlar.
λ vektörünün maksimum klonlama yeteneği ile plazmid
vektörlerin en iyi yeteneklerini bir arada taşırlar.
⇒ (λ genomunun hemen tamamı kaybolduğu için)
taşıma kapasitesi ~ 45-­‐50 kb’a kadar yükselebilir.
⇒ ökaryotik
kullanılırlar.
genlerin
klonlanmasında
başarıyla
Mekik Tipi (“Shuttle”) Vektörler
• Bu vektörün en büyük özelliği iki alıcı hücresinin
bulunmasıdır. Vektör bu alıcı hücrelerin birisinde
sayısal olarak çoğalırken, diğerinde klonladığımız geni
ürüne dönüştürür.
• Üzerinde her iki alıcı hücrede de çoğalmasını
sağlayacak orjin noktaları ve her iki konumda da
ayırdedilebileceği marker genleri taşır.
• Bu vektör üzerinde bakteriye ait orjin ve ampisiline
direnç geni vardır. Eğer bu yapı transformasyonla
ampisiline hassas bakteriye verilir ve besiyeri
ortamına da ampisilin konursa bakteri bu yapıyı
çoğaltacaktır. Böylece klonlanan genin yapısı
incelenebilir.
Mekik Tipi (“Shuttle”) Vektörler
• Bu yapıyı Leu` olan mayalara transforme eder ve
besiyeri ortamına leusin koymazsak, maya leusin
ihtiyacını vektördeki Leu (+) genini ürüne
dönüştürerek
gidecektir.
Leusin
oluşurken
klonladığımız DNA bölgeside ürüne dönüşmüş
olacaktır. Bu yapı sayesinde de genin fonksyonu
çalışılabilir.
• Bu sistem tıbbi ve biyolojik olarak önemli
proteinlerin doğal kaynaklardan bol miktarda elde
edilmesini
sağlar.
Mekik Tipi (“Shuttle”) Vektörler
Kosmidlerin dışında, farklı kökenlerden türevlenen
replikasyonla ilgili bölgelerin bir araya getirilmesiyle
oluşturulmuş melez taşıyıcılar.
Örneğin, bir plazmid ve SV40’ın replikasyon bölgesini
taşıyanlar hem bakteri hem de hayvan hücrelerinde
çoğalabilirler. Aynı şekilde, maya ve bakteriye ait
plazmidlerdeki replikasyon dizilerini taşıyanlar da bu iki
organizma grubunda çoğalabilirler.
Bu tip vektörler, farklı konaklarda
yapılabilecek işaret genleri de taşırlar.
seleksiyonu
Agrobacterium tumefaciens’in Ti Plazmidi.
• Bitkilerdeki genetik mühendisliği çalışmaları için en
önemli araç toprak bakterisi olan Agrobacterium
tumefaciens ‘ in Ti plazmididir.
• Agrobacterium ile enfekte bitkilerde tümör oluştuğu
görülür.
Bakterinin
bitkide
tümör
hücresi
oluşturabilmesi için bitkiye bir yapı aktarması
gerekmektedir. Bakterinin bitkiye aktardığı yapı Ti
plazmidi üzerinde bulunan T DNA bölgesidir. Bu gen
bölgesi bitki kromozomuna entegre olur ve burada
ifade olmaya başlar. Öyleyse bir bitkiye gen
aktarılmak istendiğinde vektör olarak bu yapı
kullanılabilir.
Agrobacterium tumefaciens’in Ti Plazmidi.
• Öncelikle bakteriden plazmidi izole edilir. Plazmidin
kesim noktası T DNA içindedir. Restriksiyon
endonükleazla plazmid kesilir. Aynı restriksiyon
endonükleazla kesilmiş klonlanacak gen plazmidle
aynı ortama konur ve ortama DNA ligaz ilave edilir.
Oluşan rekombinant Ti plazmidleri kültürdeki bitki
hücrelerine verildiğinde üzerine klonlanacak geni
taşıyan T DNA bitki hücre kromozumuna entegre olur.
Bitki hücresinin bölünerek yeni bir bitki hücresi
oluşturmasına izin verilir. Oluşan bitkinin her hücresi
aynı zamanda klonlanan gen bölgesini içerir.
• Bu yöntemle zararlılara karşı dirençli bitki varyeteleri
oluşturulabileceği gibi büyüme hormonu ve grip aşısı
içeren bitkiler de üretilebilir.
Yabancı genler T-­‐DNA
kısmının
içine
yerleştirilir.
Bakteri
bulaşmasıyla
Ti
plazmidi
bitki
hücrelerine
sokulduğunda T-­‐DNA
konak
hücrenin
kromozomu içine girer.
Bu
hücrelerin
kültürünün
yapılmasıyla transgenik
(hücreleri
içinde
yabancı gen taşıyan)
bitkiler oluşur.
Yapay Maya Kromozomu (“Yeast Artificial Chromosome”, YAC)
Maya (Saccharomyces cerevisiae) kromozomlarının yapısındaki
önemli bazı bölgeleri taşıyacak biçimde geliştirilmiş bir vektör tipi.
YAC doğrusal biçimdedir, iki ucunda maya kromozomlarının
telomer dizilerini, maya kromozomuna ait replikasyon başlangıç
bölgesini içerir. Ayrıca, hücre bölünmesinde düzenli dağılımı
sağlayacak bir maya sentromeri, seleksiyonda kullanılmak üzere
işaret gen ve yabancı DNA’nın girmesine yarayacak restriksiyon
noktaları bulunur.
Diğer vektörlerden ayrılan en büyük özelliği çok büyük miktarlarda
(100.000-­‐1.000.000 arası) DNA fragmentlerinin klonlanabilemesidir.
Bu vektör en yaygın olarak insan kromozomlarının fiziksel haritasının
çıkarılmasında , insan genom projesinde kullanılmaktadır.
YAC
• Vektörün yapısına bakacak olursak:
• CEN: sentromer dizilerini içerirler. Hücre bölünmesi sırasında vektörün
kardeş hücrelere ayrılmasını sağlar.
• ORİ: replikasyon orjini
• ARS: otonom olarak çoğalmayı sağlayan gen dizileridir.
• TEL: telomer bölgeleridir. Linear hale getirilmiş yapının stabilitesini sağlar ve
nükleazlar tarafından kesilmesini engeller.
• MARKERLAR: 3 marker vardır;
• SUP4: bu marker SmaI in kesme noktasını içerir. Böylece yapının kesilip linear
hale getirilip getirilemediği kontrol edilir . yapı linear hale gelmiş ise bu gen iş
göremez hale gelmiştir.
• URA 3 ve TRP I : eğer yapı kesilmiş ise iki kola ayrılmış demektir. Bu markerlar
yapının sağ ve sol kolunu belirler. URA 3 sağ kolda TRP I ise sol kolda bulunur.
• Ayrıca yapı BamHI ile kesilerek uçlarda telomer kısımları kalacak hale getirilir.
Bu aşamadan sonra sağ ve sol kol haline gelmiş vektöre klonlanacak DNA
bölgesi DNA ligazla birlikte ilave edilerek rekombinant yapı oluşturulur ve
maya hücresine verilir.
YAC VEKTÖRLERİNİN KULLANIM ALANLARI
• Mutant genlerin incelenmesinde
• Mutant farelere bir seri fare genom fragmenti
verildiği takdirde mutant genlerde bir düzelme
beklenir. Örn: Tirozinaz’ın normal kopyasını taşıyan
YAC vektörü albino fareye verildiğinde pigment
oluşumuna neden olduğu görülmüştür. Bu genlerin
tanımlanabilmesi için bir yoldur.
• Genetik hastalıkların izlenmesinde
• Insan
genetik
hastalıklarının
farelerdeki
modellerinin gözlenmesinde kullanılır.
Örn : Down sendromlu ( trizomi ) fareler üretilerek
hastalığın seyri gözlenebilir.
• Insan hastalıklarının araştırılması ve tedavisinde
YAC VEKTÖRLERİNİN KULLANIM ALANLARI
• Transgenik fareler üretilerek insan hastalıklarının
incelenmesinde ve bu hastalıkların tedavisinde
kullanılırlar. Örn : araştırmacılar insan immunoglobulin
genleri taşıyan transgenik fareler geliştirmişlerdir. Bu
fareler hastallıkların tedavisinde potansiyel bir
annntikor kaynağı durumundadırlar.
• YAC vektörleri kullanılarak transgenik farelerin eldesi:
• YAC vektörleri fare zigotunun pronükleusuna
mikroinjeksiyonla verilir. Zigot uterusa yerleştirilir ve
normal gelişimi gözlenir. Diğer bir yöntem fare
embriyonik kök hücresinin alıcı hücre olarak
kullanılmasıdır. DNA-­‐lipid kompleksi endositozla kök
hücre tarafından alınır. YAC ile kök hücre genomunun
kaynaşması sağlanır. Bu hücre blastosist aşamasındaki
fare embriyosuna ilave edilir.
Yapay Bakteri Kromozomları (“bacterial artificial chromosomes”,BAC’lar)
Temeli F plazmidine dayanan vektörler. F plazmidi oldukça büyük
⇒ taşıma kapasitesi fazla (→300 kb).
P1’den Türevlenen Yapay Kromozomlar (“P1-­‐derived artificial chromosomes”, PAC’lar)
P1 fajı DNA’sından (110 kb) türevlenen kozmid tipi vektörler.
Taşıma kapasiteleri fazla (→300 kb).
D. REKOMBİNANT DNA MOLEKÜLLERİNİN KONAK HÜCRELERE SOKULMASI Rekombinant DNA Moleküllerinin Konak Hücrelere Sokulması Konak olarak ilk ve en yaygın kullanılan hücreler
bakteriler (özellikle Escherichia coli’).
E. coli ’ nin çeşitli ırkları genetik açıdan çok iyi
tanımlanmıştır; plazmid, faj ve kosmidler için konak
görevi yapabilirler.
Günümüzde konak olarak, mayalar, bitki ve hayvan
hücreleri de geniş çapta kullanılmaktadır.
Rekombinant DNA’nın konak hücreye sokulmasında kullanılan yöntemler:
Transformasyon, taşıyıcı: plazmid DNA’sı, konak hücre:
bakteriler ve bazı ön uygulamaların yardımıyla ökaryotik
(maya, bitki, hayvan) hücreleri.
Transfeksiyon (transdüksiyon), taşıyıcı: virus DNA ’ sı,
konak hücre: bakteriler ve ökaryotik hücreler.
Ayrıca, lipozomlar vb başka taşıcılar ve mikroinjeksiyon,
biyolistik, elektroporasyon vb teknikler
Memeli Hücrelerine Gen Transfer Teknikleri
8 Microinjection***
8 DAAE-­‐Dextran Mediated
8 Electroporation
8 Lipofection
8 Calcium Phosphate***
8 Protoplast Fusion
8 Polyprene
8 Viral infection*** (Lentivirus, Retrovirus, Adenovirus)
*: Yaygın kullanılan yöntemler
The construction of Mammalian Transfection Vector For Expression of Cytosine-­‐ 5 Specific DNA Methyltransferase
Gene M.Msp1 In Cultured Cells
Ozturk OZDEMIR
Received 01.05.1997
E. REKOMBİNANTLARIN SELEKSİYONU Rekombinant DNA
molekülleri
replikasyon
konak hücreler
çok
sayıda
kopya (klon)
Rekombinant
klonların oluşumunu
etkileyen aşama ve
etkenler
Seleksiyon Yöntemleri
1. GENETİK YÖNTEMLER
Konak hücreye girmiş rekombinant DNA molekülünde
bulunan gen ya da genlerin belirledikleri karakterlerin
gözlenmesi (fenotipik yöntemler) (dolaylı yöntemler)
Çok kullanışlı (geniş bir populasyona kolaylıkla
uygulanabilir)
Yöntemin kullanılabilirliğinin ön koşulu, izlenen genin içine girmiş
olduğu konakta anlatım yapabilmesi (genetik komplemantasyona
dayalı seleksiyon)
a) Konak Hücrelerde Vektörün Seleksiyonu
Vektördeki işaret genlerden yararlanılarak vektörün varlığının
saptanması.
b) Vektöre Sokulmuş DNA Parçasındaki Genin Seleksiyonu
Yabancı (özellikle klonlanan) DNA parçasını taşıyan vektörlerin
(rekombinant DNA moleküllerinin) seleksiyonu.
Klonlanan
DNA
parçasının vektördeki bir
işaret genin içine girmesi
sonucunda
o
genin
anlatımının (ve gene özel
karakterin)
ortadan
kalkmasının izlenmesi.
♦
Transformasyon
Beyaz renkli koloniler hedef geni taşımaktadır
♦ Klonlanması amaçlanan genin konak hücrede anlatım
yapabildiği
koşullarda,
genetik
komplemantasyondan
yararlanılarak doğrudan söz konusu genin seleksiyonunun
yapılması.
Örneğin, bazı biyosentez genlerini taşıyan E. coli DNA parçaları
oksotrofik özellikteki konak E. coli ’ de komplemantasyon
yapmalarıyla seçilebilir.
Seleksiyon Yöntemleri
2. İMMÜNOKİMYASAL YÖNTEMLER
Sokulduğu konak hücrede anlatım yapabilen bir yabancı genin
varlığının immünokimyasal olarak saptanması.
Yöntemin avantajı, konakta seçilebilecek bir fenotipik özelliğe yol
açmayan genlerin de saptanmasına olanak vermesi.
Yöntemin uygulanabilmesi için de ön koşul genin anlatım yapması
ve bir protein ürün meydana getirmesi.
Ek olarak, sentez edilen protein konak hücrede daha önce
bulunmadığı için (antijen olarak kabul edilen) bu proteinin
saptanabilmesi için özel antikorlar gerekli
Seleksiyon Yöntemleri
3. NÜKLEİK ASİT MELEZLEME YÖNTEMLERİ
Konak hücrelerden rekombinant DNA’yı alanların doğrudan bu
DNA moleküllerinin varlığının saptanmasıyla seçilmesi.
Yöntemin moleküler düzeyde temeli tamamlayıcı özellikteki
nükleik asit molekülü zincirleri arasında melez moleküller
oluşması.
Seleksiyon doğrudan geni taşıyan DNA parçasının varlığının
saptanmasına yönelik (fiziksel yöntem)
Bu amaçla “prob” (sonda) olarak adlandırılan, aranılan nükleik
asit dizisinin kısmen ya da tamamen tamamlayıcısı olan
polinükleotidlerden yararlanılır. DNA veya RNA yapısında olabilen
problar radyoaktiviteyle ya da başka yollarla işaretlenir.
Klonlama Stratejileri ve Kitaplık Oluşturulması
Kitaplık (Banka)
Bir organizmadaki DNA dizilerinin tümünü ya da bir
kısmını içeren DNA klonları topluluğu.
Genom Kitaplıkları Kurulması
“Shotgun” (rastgele) klonlama (Hogness)
Bir organizmaya ait genom DNA ’ sının (genellikle
restriksiyon enzimleri uygulamasıyla) çeşitli boylarda
parçalara ayrılması, bu parçaların uygun bir vektöre
bağlanarak konak hücrelere sokulmasıyla elde edilen
klon takımı ⇒ genom kitaplığı (bankası).
Genom kitaplığında o organizmanın genomunun hemen
tüm parçaları bulunur.
Genom Kitaplıkları Kurulması
Klonlama sırasında, ön seleksiyon ve herhangi bir dizinin
frekansının artırılması için zenginleştirme işlemi yapılmadan
genoma ait tüm parçaların klonlanması ⇒ “shotgun” klonlama.
Yapılabilecek ön seleksiyon, sukroz gradienti santrifüjlemesi ya da
jel elektroforezi gibi tekniklerle DNA parçalarında boy saptaması
ve bir genin sığamayacağı kadar küçük ya da vektöre
bağlanamayacak kadar büyük parçaların devre dışı bırakılması.
Esas seleksiyon son aşamada, transformasyona uğratılan
hücrelerde yapılır.
Shotgun klonlamanın önemi, binlerce (hatta milyonlarca) farklı
nukleotid dizisinden oluşan bir koleksiyondan bir genin izole
edilebilmesine olanak vermesi.
⇒ Bir organizmanın uygun bir konakta kurulmuş genom kitaplığı o
organizmanın tüm genlerinin araştırılması için devamlı bir kaynak
!!!
Genom Kitaplıkları Kurulması
Her vektör molekülü yabancı DNA ’ nın küçük bir
parçasını taşıyabileceği için, genom kitaplığı kurulurken
mümkün olabilecek en az sayıda klonda tüm dizilerin
taşınmasını sağlayacak vektör kullanımına dikkat
edilmesi gerekir.
Bir genomdaki tüm dizileri içermek için gerekli klon
sayısı klonlanan DNA parçalarının ortalama boyuna ve
klonlanan genomun boyuna bağlıdır..
• Cosmid vektörü ile DNA klonlama
Hücreye transferinin kontrolü
Ampicillin + X-­Gal media
Ampicillin media
II. Hücre düzeyinde klonlama
III. Organizma /çekirdek düzeyinde klonlama
Kopyalama işlemi;
•Embriyonik dönemde bir kök hücre (Embriyo kopyalama
olasılığı)
•Farklılaşmasını tamamen tamamlamış bir vücut hücresi
kullanılarak yapılabilir. Böylece yetişkin bir organizmadan
alınan hücre kullanılarak yetişkin bir organizma
kopyalanabilir.
Nükleer Transplantasyon
Wilmut ve arkadaşları; donör hücre olarak 6 yaşında sağlıklı bir
koyunun meme epitel hücresi ve resipient (alıcı) hücre olarak ise aynı
koyunun metafaz II evresinde bekletilmiş yumurta hücresi kullandılar.
Klonlama sonrası elde
edilen ve annesiyle
%100 aynı genotip ve
fenotipte olan sağlıklı
kuzuya DOLLY adını
verdiler.
DOLLY
Nükleer Klonlamanın Önemi
8 Yumurta hücresinin embriyogeneziste spermden
farklı artı (+) öneminin olduğu,
8 Ökaryotik hücrenin G0 evresinde totipotent
kromatin organizasyonu kazandıği,
8 Metafaz II evresinde yumurta hücresinin
klonlama için en uygun faz olduğu,
8 Memelilerde eşeysiz üremenin mümkün olduğu,
8 Bir gen yerine çekirdeğin tamamının transplante
olabileceği gösterildi.
Klonlama Sonrasında;
8 Unipotent hücrenin totipotent hücreye dönüştürülmesi,
8 Sinir hücrelerinin rejenerasyonu,
8 Telomerlerde ” end replication problem”giderilerek, yaşlanmanın geciktirilmesi,
8 Stem (kök) hücrelerinden spesifik doku eldesi,
8 Epigenetik modifikasyon ile kanser tedavisine yeni bir yaklaşım,
8“Ex vivo gene replacement” ile genetik tedavi ve
8 İnsan genom projesi önemli bir ivme kazanmıştır.