PowerPoint Sunusu
advertisement
HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ Doç. Dr. Dilek Çolak Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Bilim Dalı FEN. 2004. Ankara Virolojik Tanı Yöntemleri Direkt tanı yöntemleri İndirekt tanı yöntemleri Virolojik Tanı Yöntemleri 1. Direkt Tanı yöntemleri • Direkt inceleme Histoloji Sitoloji • Elektron mikroskobisi yöntemi • Hücre kültürleri • Antijenlerin saptanması İmmün boyama (-floresan, -peroksidaz, vb) ELISA Lateks agl. • Nükleik asitlerin tayini Moleküler testler Virolojik Tanı Yöntemleri 2. İndirekt Tanı Yöntemleri • Özgül antikorların araştırılması IgM IgG IgG avidite serum, BOS, vb Sitoloji: Virus grubu ! Tzanck smear HSV - VZV Sitoloji: İntranükleer inklüzyonlar CMV Elektron Mikroskobisi Yöntemi Dışkı Rotavirus, Adenovirus Vezikül sıvısı HSV, VZV Elektron Mikroskobisi Yöntemi Adenovirus Rotavirus (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) Elektron Mikroskobisi Yöntemi Direkt görüntü Virus karekterizasyonu Hızlı Ayrdedici Pahalı Duyarlılık 106part./ml Araştırma lab. İmmün Elektron Mikroskobisi Hücre kültürleri • Konvansiyonel CPE Hücre kültürleri • Geç sonuç (1-30 gün) • Örnek kalitesi ve transportu çok önemli • Kontaminasyon riski • Örneklerin toksik etkisi • Üremeyen viruslar Hücre kültürleri • Hızlı hücre kültürleri CMV 48 saat Viral Antijenlerin Saptanması • Hızlı • Canlı virusa gerek yok • İmmünfloresan boyama (FAT) • EIA • Lateks agl. Viral Antijenlerin Saptanması • • • • • RSV Influenza Parainfluenza Adenovirus HSV • • • • Varicella-zoster CMV Rotavirus HBV Viral Antijenlerin Saptanması Nazofaringeal aspirat RSV Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus Dışkı Rotaviruses Adenoviruses Deri HSV VZV Kan CMV (pp65 antijenemi testi) Viral Antijenlerin Saptanması İmmünfloresan boyama Viral Antijenlerin Saptanması FAT Deride HSV (DFA) (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) Viral Antijenlerin Saptanması CMV antijenemi testi; Periferik kan lökositleri CMV pp65 antijeni 3-4 saat Ciddi lökopenide yetersiz kalır! pp65 antijenemi testi Viral Antijenlerin Saptanması FAT RSV Influenza A HSV 1-2; Duyarlılık FAT 80 Shellvial-IP 87.6 Kon.kültür 100 Özgüllük PPD 93.3 92.3 100 100 100 100 Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:909-912 NPD 95.1 96.9 100 1188 nazal yıkama örneği sitospin preparatı FAT x Hızlı hücre kült. Virus ADV Infl.A Infl.B PI.1,2,3 RSV Toplam Duyarlılık 62.5 80 67.4 88.5 93.8 86.7 % Özgüllük 100 98.6 100 99.7 95.6 93.8 Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56 PPD NPD 100 93.8 85 99.6 100 98 96.4 98.9 87 98 87.9 93.1 FAT yönteminde: • Örnek kalitesi çok önemli • Örnekte yeteri kadar hücre olmalı “yalancı negatif sonuç” • Deneyimli personel gerekli • Çok sayıda örneğin incelenmesi zor Viral Antijenlerin Saptanması EIA Viral Antijenlerin Saptanması EIA • Çok çeşitli örnek çalışılır • Fazla sayıda örnek çalışılır • Otomasyon Viral Antijenlerin Saptanması Membran EIA Viral Antijenlerin Saptanması Lateks aglütinasyon Nükleik Asit Tayini Moleküler testler • Polimeraz zincir reaksiyonu Klasik PCR Real-time PCR • Hibridizasyon Nükleik Asit Tayini Klasik PCR Nükleik Asit Tayini Nükleik Asit Tayini Real-time PCR Plato fazı Geçiş fazı Sinyal Logaritmik faz Eşik çizgisi Baz çizgisi 10 20 Döngü sayısı 30 Nükleik Asit Tayini Real-time PCR Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı Nükleik Asit Tayini Real-time PCR ürün saptama SYBR green I Fluorescense resonance energy transfer (FRET) Hibridizasyon probları Taq-man probları Molecular beacons SYBR green FRET Taq-man probları Molecular Beacons • 1-DNA ekstraks. • Tam kan Hybrid capture CMV DNA testi 4- Konjugat • 2-Hedef DNA’nın CMV RNA probu ile hibridizasy on • 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulması by antibody •5.Kemilüm. saptama ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği Test H.kült. FAT PCR % Duyarlılık Özgüllük PPD NPD 76.9 100 100 64.7 73.1 100 100 61.1 88.4 100 100 78.6 FAT (-) diğer testler Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28:257-264 132 KHT alıcısı ADV, >5000 örnek perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar boğaz sürüntüsü Periferik kan löokositlerinde PCR (+) İnvaziv ADV inf. göstergesi Lion T, et al. Blood 2003;102:1114-1120 Moleküler testler: Avantajları • Hızlı Tedavi monitörizasyonu • Duyarlılık yüksek “latent viruslar için kantitatif testler” • Pek çok patojen için uygulanabiliyor • Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az “MagnaPure+LightCycler” Moleküler testler: Dezavantajları • Çoğu standardize değil “internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları” • Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor “tanı karmaşası” • PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı • Rutin sonuç verirken dikkat! • Pahalı •Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla “in house PCR” Seroloji: BOS’da antikor tayini: Herpesviruslar Respiratuvar viruslar İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli BOS spesifik Ab :serum spesifik Ab BOS IgG:serum IgG 1.5 İletişim Laboratuvar klinik Toplantılar Karşılıklı bilgilendirme Hasta bilgileri paylaşılmalı ..... ..... Yorum Elde edilen sonuçlar neyin göstergesi ne diyor şimdi n’olacak? Mikrobiyolog yaptığı testin sonucunun yorumunu yapabilmeli Klinisyen istediği testin sonucunun yorumunu istemeli, öğrenmeli “Rekabet ile işbirliğini harmanlayıp; düşleri ortak bir gerçekliğe aktarmak...” Bahar Ö. Düzgören
