lenfosit immunfenotipleme

TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
LENFOSİT İMMUNFENOTİPLEMESİ
için
KILAVUZ BİLGİLER
İlk Çalışma Kopyası
Eylül 2010
Akan Hücre Ölçer (Flow Cytometry) Alt Komitesi tarafından hazırlanan
bu kılavuz bilgiler, Türk İmmunoloji Derneği web sitesine üyelerin
değerlendirme yapmaları; hem içerik hem de format ile ilgili öneri,
eleştiri ve eklemelerini bildirmeleri amacı ile eklenmiştir. Yazışmalarınızı
[email protected] adresine 30 Ekim 2010 tarihine dek iletmenizi
rica ederiz.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT ÇALIŞMA GRUBU
Gülderen Yanıkkaya Demirel
Günnur Deniz
Emel Ekşioğlu Demiralp
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
1. GENEL BİLGİLER
İmmunfenotipleme
1970’li
yıllarda
monoklonal
antikor
teknolojilerinin
geliştirilmesi sonrasında, tıbbın bir çok alanında yaygın olarak kullanılmaktadır.
İmmünfenotipleme; floresan boyalarla görünür hale gelen hücre yüzeyi ve hücre
içi belirteçlerin saptanması yöntemidir. Özgül antikorlarla saptanmak istenen
antijenik yapıların varlığı ya da yokluğu saptanmaktadır.
1970’li yıllarda mikroskopla immunfenotipleme yapılmakta iken; immunolojide ve
akan
hücre
ölçer
programlarının
(flow
hızla
immünfenotipleme
cytometry)
aşama
sistemlerindeki gelişmeler
kaydetmesi
analizlerinin
kısa
sayesinde
sürede
ve
günümüzde
yapılabilmesi
çok
yazılım
renkli
mümkündür.
İmmunfenotipleme; tanı, prognoz öngörüsü ve takip aşamalarında klinisyene
yararlı bilgiler sağlayan ve yönlendirici olan bir yöntemdir. Bu yazıda lenfosit
immünfenotiplemesi ile ilgili temel bilgilerle birlikte preanalitik, analitik ve post
analitik dönem özellikleri; temel immunoloji bakışı ve klinisyene baz bilgi
oluşturabilecek bir formatla anlatılmaya çalışılmıştır.
1.1. Lenfositler
İmmün sistemin temel hücre gruplarından olan lenfositler kandaki çekirdekli
hücrelerin
ortalama
%25’ini
oluştururlar.
Yaşa
göre
farklı
oranlarda
saptanmaktadırlar. Boyutça küçük lenfositler 7-10 μm çapında çekirdekleri daha
koyu renkle boyanan hücreler iken daha büyük boyutlu, LGL (Large Granular
Lymphocyte) olanlar 10-12 μm çapında, sitoplazmaları daha geniş ve granüllü
hücrelerdir.
Çevre kanında dolaşan lenfosit alt gruplarını kabaca T, B ve NK (Doğal öldürücü)
hücreler olarak sınıflandırabiliriz. Kanda dolaşan lenfositlerin ortalama %80’ini T
hücre, %10’unu B hücre geri kalan %10’unu ise NK hücreler oluşturmaktadır. Bu
oranlar hücrelerin alındığı dokuya göre değişebilmektedir, timusta hücrelerin
nerede ise %90’ı T hücre iken dalak ve lenf nodunda %30-40 oranında T hücre
görülmekte, B hücreler daha baskın oranda (%60-70) izlenmektedir (1).
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
1.1.1.
T
hücreler
kemik
iliğinde
oluşan
prekürsör
hücrelerin
timusta
farklılaşması, olgunlaşması sonrasında çevre kanına çıkarlar. T hücreler immün
yanıttaki rollerinin yanı sıra CD4 veya CD8 taşıma özelliklerine göre alt gruplara
ayrılırlar. CD4 taşıyan T helper hücrelerin antikor salınımına yardım ederek
immün yanıtta rol aldıkları, CD8 taşıyan hücrelerin ise sitotoksik T lenfositler
oldukları düşünülse de son yıllarda yapılan araştırmalara göre durum daha
karmaşık görünmektedir. Günümüzde daha çok THR (T hücre reseptörü) ile
etkileşimlerine göre ayırım yapılması uygun görülmektedir. CD4+ T lenfositler
MHC Sınıf II aracılığı ile antijen tanırken, CD8+ hücreler MHC Sınıf I aracılığı ile
antijen tanımaktadırlar. T lenfositler salgıladıkları sitokin profili ile de uyumlu
olarak Th0, Th1, Th2, Th17 gibi alt gruplara da ayrılmaktadırlar. Dolaşımdaki T
hücrelerin yaklaşık %95’i THR alfa/beta pozitiftir, CD4 ya da CD8 pozitifliği
taşımayan <%5 oranındaki T lenfositler ise THR gamma/delta pozitiftirler. NKT
hücreleri olarak adlandırılan bir alt grup ise CD4 ya da CD8 ile birlikte tek bir V
(variable) alfa zinciri (Vα24) şırlar,
ta
antijenik yapıları MHC üzerinden değil
dendritik hücreler üzerinde var olan CD1a üzerinden tanırlar. Erişkin kanında %14 oranında saptanabilen Treg (T regülatör) hücreler ise bir diğer alt gruptur. Treg
hücrelerin
immün yanıt
düzenlenmesinde
etkin
rol aldıkları, otoimmünite
olgularında azalırken kanserde arttıkları, GVHD (Graft versus Host Disease)
oluşmasında da rolleri olduğu bildirilmektedir.
1.1.2. B hücreler 7-10 μm çapında lenfositlerdir. Diğer belirteçler yanında yüzey
immunoglobulin, özellikle IgM ve IgD taşırlar, düşük oranda IgG ve IgA
taşıyabilmektedirler.
normalde
dolaşımda
B
hücrelerden
gelişen
bulunmazlar, bölünme
plazma
hücreleri
yetileri yoktur,
(10-15
μm)
immunglobulin
üretme görevlerini yerine getirirler. CD19, CD20 pozitifliklerinin yanı sıra CD40,
CD79, HLA-DR, FcγRII resept
örleri (CD32) ve kompleman reseptörleri CD21,
CD35 taşırlar. T hücrelerdeki THR benzeri BHR (B Hücre Reseptörü) kompleksini
B hücrelerde CD19, CD21 ve CD81 oluştururlar.
1.1.3. NK (Doğal Öldürücü) Hücreler doğal bağışıklık sisteminin parçasıdırlar,
diğer lenfositlere göre daha granüllü hücrelerdir. Etkileri sitotoksik T lenfositlere
benzerdir, ancak reseptörleri farklıdır ve somatik rekombinasyon genleri ile
kodlanmazlar. Sadece NKT hücreleri adı verilen düşük oranlı bir NK hücre grubu
somatik rekombinasyonla kodlanan alfa/beta reseptörlerini taşır. NK hücreleri
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
yüzeylerinde CD16, CD16+56+, CD49b, CD56, CD57, CD314, CD335, CD336,
CD337 taşırlar. Sitotoksik etkilerini granzyme ve perforin salımı ile gösterirler.
Son yıllarda kabul gören sınıflandırmalara göre ise, T lenfositler alfa/beta ve
gamma/delta T lenfositler olarak iki ana gruba ayrılmakta NKT hücreleri ayrı bir
alt grup olarak incelenmektedirler (Bakınız. Tablo 1).
Tablo 1. Lenfosit Alt Grupları Sınıflandırması
Lenfosit Tipi
İşlevleri
αβ T Hücreler
CD4+ helper
CD8+ sitotoksik
Treg hücreler
γδ T hücreler
B hücreler
Doğal
Öldürücü
Hücreler
NKT hücreler
B hücre farklılaşması
(humoral immünite)
Makrofaj aktivasyonu
(hücre aracılı
immünite)
Enfekte hücreler ve
tümör
hücrelerinin
öldürülmesi
Diğer T hücrelerin
işlevini baskılar
(immün yanıtın
düzenlenmesi, öze
yönelik toleransın
sağlanması)
Helper ve sitotoksik
işlevler
(doğuştan
bağışıklık)
Antikor oluşturma
(humoral immünite)
Virüsle enfekte ya da
hasarlı hücrelerin
öldürülmesi
(doğal bağışıklık)
Doğuştan ve
kazanılmış immün
yanıtları baskılar ya
da aktive eder.
Antijen
reseptör ve
özgüllüğü
αβ
heterodimerler
peptid-Sınıf II
MHC
kompleksi için
geniş bir
özgüllük
αβ
heterodimerler
peptid-Sınıf I
MHC
kompleksi için
geniş bir
özgüllük
αβ
heterodimerler
γδ
heterodimerler
Petid ve non
peptid
antijenler için
kısıtlı kısıtlı
özgüllükler
Yüzey antikoru
Her tipte
molekül için
geniş
spektrumda
özgüllükler
Farklı aktivatör
ve inhibitör
reseptörler
MHC ve MHC
benzeri
moleküller için
sınırlı
özgüllükler
αβ
heterodimerler
(Glikolipid-CD1
için sınırlı
özgüllük)
Belli başlı
belirteçler
CD3+,
CD8-
CD4+,
CD3+,
CD8+
CD4-,
CD3+, CD4+,
CD25+
(En çok bilinen
immunfenotip,
farklı alt
grupları var)
CD3+, CD4 ve
CD8 değişken
Fc reseptörleri,
Class II MHC,
CD19, CD21
CD16 (IgG için
Fc reseptörü),
CD56, bazı alt
gruplarda
CD57, KIR,
KAR
CD16 (IgG için
Fc reseptörü),
CD3
% Oran
Çevre
Kanı
Lenf
Nodu
Dalak
50 – 60
50 – 60
50 – 60
20 - 25
15 – 20
10 – 15
<%5
10
10
<%5
?
?
10 – 15
20 - 25
40 – 45
10
Ender
10
10
Ender
10
Abbas AK ve ark. Cells and Tissues of the Adaptive System, Cellular and Molecular Immunology
Int. Edition (6th ed.), 2007’den modifiye edilerek alıntılanmıştır.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
2. AKAN HÜCRE ÖLÇER ile LENFOSİT İMMÜNFENOTİPLEMESİ
1970’li yıllarda monoklonal antikor ve floresan boya teknolojilerindeki gelişmeler
daha önce DNA ve partikül analizi için kullanılan akan hücre ölçer sistemlerinin
immünfenotipleme için kullanılmasına yol açmıştır. Diğer bir çok laboratuar
testinde olduğu gibi immünfenotipleme için de preanalitik, analitik, veri analizi ve
raporlama aşamaları sonuçların kalitesi açısından önemlidir.
2.1. PRE ANALİTİK AŞAMA
2.1.1. Monoklonal Antikor ve Panel Seçimi
Günümüzde daha çok bilgi sağlayıcı olmaları nedeni ile çok renkli paneller
kullanılmaktadır.
Tek
renkle
çalışıldığında
bir
parametre
hakkında
bilgi
sağlanabilmekte iken, çok renkli çalışmada renk sayısı arttıkça değerlendirilebilen
parametre
seçimi
de
artmaktadır.
Renk
ayırımı,
standardizasyonun
iyi
sağlanamaması gibi nedenlerle rutin uygulamalarda dört renkli kombinasyonların
uygulanmasının yeterli olacağını düşünmekteyiz.
Panel seçiminde özellikle dikkatli olunması gereken unsurları sıralarsak; öncelikle
hangi parametreyi çalışmak üzere bu analizi yapmak istediğimizi belirlemek
gerekir.
İlgili
antikorların
klonlarının
amaca
uygunluğu
mutlaka
kontrol
edilmelidir, üretici kataloglarına bakıldığında CD3 gibi temel bir belirteç için bile
birden fazla klon seçeneği olduğu görülecektir. Her klon analizde ölçülmek
istenen epitopu tanımayabilir, bu nedenle uygunluğu mutlaka doğrulanmalıdır.
Total lenfosit tanısında CD3 yerine CD2 kullanılması doğal öldürücü hücrelerin de
(NK) CD2 taşımaları nedeni ile uygun değildir (3). Çok renkli çalışmalarda renk
kombinasyonlarının seçimi önemlidir. Bazı antikorlar bazı floresan boyalarla
uygun sonuçlar vermeyebilir (Bazı antikorlar FITC konjuge olduklarında yanlış
pozitifliklere yol açabilirken aynı antikorun PE konjugatı ile daha sağlıklı sonuçlar
elde edilmektedir, örneğin CD10).
2.1.2. Örnek Özellikleri ve Örnek Taşınması
Çevre kanı, kemik iliği aspirasyon örnekleri, beyin omur ilik sıvısı, periton sıvısı,
solid
doku
örneklerinden
yapılabilmektedir.
(lenf
nodu
vb.)
lenfosit
immunfenotiplemesi
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Her türlü immunfenotipleme için örnek alımı ve laboratuara ulaştırılmasında
dikkat edilmesi gereken kurallar bu örnekler için de geçerlidir. Çevre kanı, kemik
iliği örnekleri heparin veya EDTA’lı tüplere alınabilirler. Bu tüpler oda ısısında
saklandıklarında ortalama 24 saate dek örneklerde belirgin değişikliğe yol
açmamaktadırlar. Kan sayımlarının da sağlıklı yapılabilmesi için pratikte daha çok
EDTA’lı tüpler kullanılmaktadır. Hücrelerin herhangi bir reaktif ile fikse edilmesi;
frajil hücrelerin kaybı, antijen ekspresyonunun azalması ve otofloresansın
artması gibi istenmeyen etkilerin ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Pıhtılaşmış,
içinde aggregatlar olan örneklerden hücrelerin aggregatlara yapışmış olması
nedeni ile immünfenotipleme yapılmamalıdır.
Şekil 1. Örnek dağılım özelliklerinin zaman içinde değişimi
Örnek alındığında
12 saat sonra
24 saat sonra
Aynı örneğin zaman içinde boyut ve granülariteye göre saçınım özelliklerinin
değişimi ve işaretleme alanında oluşan değişiklikler Şekil 1.de izlenmektedir. 24
saat sonrasında ölü hücrelerin artması, hücre membranında oluşan değişiklikler
nedeni ile granülosit popülasyonu azalırken lenfosit popülasyonu net sınırlarla
izlenemez hale gelmektedir.
Çevre kanı ve kemik iliği örnekleri alınırken; tüplerin amaca uygun antikoagülan
içerdikleri, tüp üzerinde işaretli volüm kadar örnek alındığı, etiketlemenin doğru
yapıldığı mutlaka kontrol edilmelidir.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Beyin omur ilik sıvısı, periton sıvısı vb. sıvılar oda ısısında herhangi bir additif
içermeyen steril kaplar içinde taşınmalıdır. Bu tür örneklerin en geç iki-altı saat
içinde çalışmaya alınması gereklidir. Hücrelerin daha uzun süre etkilenmeden
kalabilmesi için hücre kültürü medyumu ile 1:1 oranında sulandırılarak 48 saate
dek bekletilmeleri mümkün olabilmektedir.
Ancak bu tür örnekler kıymetli
örnekler oldukları için bekletilmeden çalışılmaları uygundur.
Solid doku örnekleri mutlaka dondurulmadan ve fikze edilmeden en geç 1 saat
içinde laboratuvara ulaştırılmalıdır. İdeal taşıma ve saklama yöntemi steril bir
kapta serum fizyolojik içinde örnek gönderilmesidir. Islatılmış sargı bezi içinde
gönderilen örneklerde hızla hücre ölümü gerçekleşmesi nedeni ile analiz
yapılamamaktadır. Örnek 1 saat içinde laboratuara ulaştırılamayacaksa yaklaşık
0.5 cm.lik kesitler yapılarak serum fizyolojik içine alınması daha doğru olacaktır.
Bu tür örneklerden patoloji laboratuarına da örnek gönderilecekse akan hücre
ölçer laboratuarı ile patoloji laboratuarının iyi bir iletişim ve iş birliği oluşturması
gereklidir.
Tüm immünfenotipleme örneklerinin ortam ısısında (17 – 25oC) taşınması
gereklidir. Daha soğuk ya da daha sıcak ortamlarda örnek transportu hücre
membranında
değişikliklere
yol
açarak
antijenlerin
saptanma
oranlarını
etkilemektedir. İmmünfenotipleme örnekleri buzdolabında saklanmamalıdır.
Takip gerektiren örneklerin (belirli zaman dilimlerinde yeniden ölçüm yapılması
gereken örneklerin) günün aynı saatinde alınması sonuçların karşılaştırılabilirliği
açısından önemlidir.
2.1.3. Örneklerin Hazırlanması
Örnek hazırlama ve yıkama aşamalarında kullanılan tüm solüsyonların steril
bidistile su ile hazırlanması, pH değerlerinin her gün ölçülerek 7.2 – 7.4
değerinde tutulması, tüm solüsyonların 0.2 mikronluk laboratuar tipi filtrelerden
geçirilerek kullanılması önemlidir.
İmmunfenotipleme örneklerinin hazırlanmasında çevre kanı ve kemik iliği
aspirasyonu örnekleri için tam kan lizis uygulaması standart hale gelmiş
bulunmaktadır.
Mononükleer hücre süspansiyonu hazırlayarak çalışmak bazı
hücrelerin yüzeyinden antijenik bağlanma bölgesinin kopmasına (CD8, CD56
vb.), hücrelerin bir bölümünün kaybedilmesine yol açtığı için giderek daha az
kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Tüm akan hücre ölçer analizlerinde olduğu
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
gibi lenfosit immunfenotipleme örneklerinde de hücre sayısının bilinmesi ve
hazırlık aşamasında <10,000 hücre/µl olacak şekilde hücre konsantrasyonunun
ayarlanması gerekir. Kalibrasyonu iyi yapılmış, günlük kalite kontrolleri düzenli
olarak
yapılan
konsantrasyonun
bir
kan
sayım
ayarlanması
sistemi
hem
de
ile
kan
işaretli
sayımı
alandaki
yapılması
hücre
hem
oranının
karşılaştırılabilmesi için veri sağlayacaktır. Günümüzde daha çok direkt boyama
yöntemleri kullanılarak örnek hazırlanmaktadır.
Hazırlık aşamasında her laboratuar çalışılan teste uygun olarak hazırlık yöntemi
belirlemektedir. Son yıllarda “no wash/lyse” yöntemi olarak adlandırılan yıkama
yapmadan örnek hazırlama yöntemi daha ideal bir yöntem olarak kabul
edilmekte ise de değişken floresan/protein oranları, non spesifik bağlanmaların
tam anlamı ile bertaraf edilememesi nedeni ile pratikte, ”lyse/wash” sistemi daha
iyi sonuçlar elde edilmesini sağlamaktadır. Bu amaç için kullanılmak üzere çok
sayıda ticari kit bulunmaktadır, ancak laboratuarların kendi lizis solüsyonlarını
hazırlamaları
(örneğin,
NH 4 Cl 2 )
hem
daha
ucuz
hem
de
pratiktir.
Lizis
solüsyonlarının pH değeri 7.2 – 7.4 olmalıdır.
Örnek laboratuara ulaştıktan sonra lenfosit immünfenotiplemesi için temel
aşamalar aşağıdaki akış şemasında özetlenmiştir.
Şekil 2. Lenfosit immunfenotipleme örnekleri analizi akış şeması
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Örnek Kabulu
Hücre Sayımı
(otomatik kan sayım cihazı ya da manuel yöntemle)
Hücre Konsantrasyonunun <10.000 hücre/μl’ye ayarlanması
100 μl kan + titrasyonla belirlenen miktarda antikor
15 – 30 dk oda ısısı ya da buzdolabında karanlıkta inkübasyon
2 ml lizis solüsyonu
10 dk oda ısısında karanlıkta inkübasyon
2 kez yıkama
400 g, 5 dakika
Lab protokolünde varsa fikzatif 1:1 oranında
Akan hücre ölçer analizi
Lenfosit
immunfenotipleme
panellerinde
araştırma
amacı
ile
çok
farklı
monoklonal antikor kombinasyonları kullanarak bir çok alt grubu tanımlamak
mümkündür. Aşağıda Tablo 2’de daha çok rutin amaçla kullanılabilecek antijenik
yapılar listelenmiştir.
Tablo 2. Lenfosit Yüzey Antijenleri
T hücreler
Pan T hücre : CD3, CD2, CD7, CD5
T hücre Alt Grubu : CD4 (T helper), CD8 (T sitotoksik/supressor)
İşlevsel Yüzey Belirteçleri : CD28, CD38, CD45RA, CD45RO, CD62L
Aktivasyon Belirteçleri : CD25, CD40L, CD69, CD71, HLA-DR
B Hücreler
Pan B Hücreler : CD19, CD20, yüzey immunoglobulinler
B hücre Alt Grubu : CD5, CD21
İşlevsel yüzey belirteçleri : CD27, CD40
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Aktivasyon belirteçleri : CD23, CD25
NK (Doğal Öldürücü) Hücreler
Pan NK hücresi : CD16, CD56
NK Alt Grubu : CD2, CD8, CD57
2.1.4. Çevre Kanı Dışındaki Örneklerin Hazırlanması
Vücut sıvılarından alınan örneklerin hazırlanması doku parçaları içermedikleri
takdirde oldukça kolaydır.
Örneklerin 300 g de santrifüjlenmesi,
süpernatan
atıldıktan sonra hücrelerden sayım yapılarak konsantrasyon ayarlaması yapılması
gereklidir. Hücrelerin boyanmasında izlenen yöntem çevre kanı ve kemik iliği
aspirasyonu örnekleri ile aynıdır.
Solid doku örneklerinde örnek özelliklerine göre hazırlık aşaması farklılık
gösterebilir. Lenf nodu örneklerinde izotonik bir çözelti içine alınan örnek
laboratuvara ulaşır ulaşmaz bir petri içinde bisturi ve pens yardımı ile ikiye ayrılır.
Gerekli ise bir bölümü patoloji laboratuarına gönderilir, diğer bölümü ise
solüsyonunun içinde, bisturi yardımı ile kazınarak hücre süspansiyonu elde edilir.
İstenirse anatomik/histolojik bölgelerden ayrı ayrı hücre süspansiyonu elde
edilebilmesi mümkündür. Solüsyona dökülen hücreler tüpe aktarılıp 50 mikronluk
bir filtreden geçirildikten sonra santrifüjlenir, hücre
sayımı yapılıp hücre
konsantrasyonu (1000 -10,000 hücre /mikrolitre) ayarlandıktan sonra boyama
aşamasına geçilir.
Hücre kültürlerinden immünfenotipleme yapılabilmektedir, ancak hücre ve örnek
özelliklerinin çalışmayı yapacak kişi tarafından tam olarak bilinmesi gereklidir.
Süspansiyon halinde bir kültürden immünfenotipleme yapılması yapışan hücrelere
göre çok kolaydır. Süspansiyon kültürünün alınıp 50 mikronluk bir filtreden
geçirilmesi sonrasında hücre konsantrasyonu ayarlanıp direkt ya da indirekt
boyama yöntemleri ile hücrelerin boyanması ve rutin analize benzer şekilde
analizi yeterlidir. Yapışan hücreler için sorun, flasktan kaldırma aşamasında hücre
membran
bütünlüğünün
etkilenmesi,
kullanılan
solüsyonlara
bağlı
olarak
membrandan “shedding” ile antijenik yapıların yitmesidir. Bu örneklerden hücre
içi yapılarla ilgili immünfenotipleme göreceli olarak daha kolay yapılabilmektedir.
2.1.5. Sistem Kalibrasyonu ve Kalite Güvencenin Sağlanması
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Masa üstü akan hücre ölçer sistemlerinin kalibrasyon ve bakımı “sorting” yapan
sistemlere göre daha kolaydır. Örnek analizi öncesinde sistem her açıldığında
kalibrasyon kontrolü ve renk ayırımı ile ilgili standardize edilmiş boncuklar
geçirilerek sistemin performansı kontrol edilmeli, geçerli sonuçlar elde ediliyorsa
analiz aşamasına devam edilmelidir. Her laboratuar bu konuda kendi kalite
kontrol programını oluşturmalı, yapılan tüm işlemler kayıt altına alınmalıdır.
Kullanılan antikorlar MultiCheck, Cyto-Trol benzeri ticari ürünler kullanılarak
mutlaka kontrol edilmelidir. Her laboratuar bu kontrol malzemelerini kullanma
sıklığını kendi koşullarına uygun olarak belirlemeli, elde edilen sonuçlar zaman
parametresi
olan
grafiklerle
(Levy-Jennings
grafikleri)
süreklilik
açısından
izlenmelidir. Şekil 2’de CD4 için örnek bir izleme grafiği görülmektedir.
Yüzde Pozitiflik
Analiz Günleri
Levy-Jennings grafiklerinin kullanımı sadece floresans parametreleri için değil, FS
(Forward Scatter-Öne Saçınım) ve SS (Side Scatter-Yana Saçınım) parametreleri,
sistem voltaj ve kazanç değerleri için de kullanılabilir ve geriye dönük olarak
sistem performansı hakkında değerli bilgiler sağlar.
Biyolojik değişkenlikler nedeni ile sadece lenfosit immunfenotiplemesi değil, tüm
akan hücre ölçer testleri için biyokimya laboratuarlarında geçerli olan kesinlik
(precision), doğruluk (accuracy), bias hesaplamalarının yapılması zordur. Bu
nedenle özellikle yeni başlayan laboratuarların kontrol amacı ile sağlıklı bilinen
kan örneklerini hasta örnekleri ile eş zamanlı çalışmaları, yapılan analizin
kalitesini güvence altına almak için uygun olacaktır.
2.2. ANALİZ AŞAMASI
Analiz aşamasına gelindiğinde dikkat edilecek konuları ana başlıklar altında
toplarsak;
-
Örnek geçirilecek protokol, panel ile tüple çalışılan monoklonal antikor
kombinasyonu uyumlu olmalıdır. Kullanıcı FL1’de yeşil floresans veren FITC
benzeri boya, FL2’de PE gibi portakal rengi floresans, FL3’te kırmızı, FL4’de
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
bordo/mor renkli floresans ölçebileceğini bilmelidir. Her cihaz modelinde
filtre
özellikleri
farklı
olabileceği
için
kullanıcının
kendi
sisteminin
özelliklerini iyi öğrenmesi gereklidir.
-
Voltaj ve kazanç ayarları kalibrasyon kontrolünde kullanılan ayarlarla aynı
olmalıdır. Örnek analizi sırasında değişiklik yapılıyorsa mutlaka kaydı
olmalıdır. Kantitatif ölçüm yapılıyorsa kantitasyon boncuklarının geçirildiği
ayarlarla hücrelerin analizinin yapıldığı ayarlar aynı olmalıdır.
-
Önceden hazırlanmış ve standardize edilmiş panellerden örnek geçirilmesi
her zaman daha sağlıklı sonuçlar elde edilmesini sağlayacaktır.
-
Her tüpte belirli sayıda hücre sayılmalıdır. Genel eğilim her tüpte 5,000 10,000, işaretlenen bölgede en az 2500 hücre sayılması yönündedir. Az
sayıda hücre saptamaya yönelik analizlerde >1000 hücre/işaretli alan
saymak ve her tüpte aynı sayıda hücre saymaya çaba gösterilmelidir.
-
Analizi yapan kişinin ne tür bilgi toplamaya çalışıldığı hakkında fikri
olmalıdır.
-
Panel ismi, tüp numaraları vb bilgiler sisteme eksiksiz ve genel geçer
nomenklatüre uygun yazılmalıdır.
-
Paneldeki sıralama ile tüpler üzerindeki etiket sıralaması uyumlu olmalıdır.
-
Analiz sırasında kullanıcı ekranı izlemeli, “flow cell”den geçen hücre
sayısında, saçınımda değişiklikler olması halinde analizi durdurarak sorunu
giderdikten sonra yeniden analiz yapmalıdır.
Çevre kanı örneklerinde FS/SS doğrusal (linear), floresan parametreler ise
logaritmik skala ile çalışılmalıdır. Dağılımın iyi olmadığı vücut sıvıları, doku
örnekleri vb örneklerde SS de logaritmik olabilir. Ancak rutin uygulamada
kullanılmamalıdır.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Şekil 1. CD45/SS ve FS/SS grafiklerinde lenfosit popülasyonlarının işaretlenmesi.
Şekil 1’de de izlendiği üzere lenfositler daha küçük boyutlu, granülsüz, CD45 ile
parlak boyanan hücrelerdir.
2.2.1. İşaretleme (Gating)
Lenfosit popülasyonuna ölü hücreler, çekirdekli eritrositler ve dev trombositlerin
karışması ile hücre kontaminasyonu gelişebilir. Saf lenfosit popülasyonu üzerinde
analiz yapabilmek için CD45/CD14 (CD45=Pan Lökosit belirteci; CD14=Olgun
Monosit belirteci) işaretlemesi ile kontrol uygulamak özellikle yeni başlayanlar
için çok yararlıdır. Lenfositler CD45/SC grafiklerinde daha az granüler ve
CD45parlak olmaları ile diğer hücrelerden ayırt edilebilirler. Kan sayımında
saptanan lenfosit yüzde oranının en az %90 oranında işaretleme alanı içinde
olması beklenir. Eğer bu oran sağlanamıyorsa örnek hazırlama ile ilgili önemli
sorunlar yaşanmış kabul edilerek yeniden örnek hazırlama yoluna gidilmelidir.
Bazı lenfoma ve AIDS olgularında hücrelerin aşırı frajilitesi nedeni ile bu oran
sağlanamayabilir, bu örneklerde vorteksleme daha düşük hızlarda yapılmalı,
santrifüjleme ve yıkamalarda daha dikkatli olunmalıdır.
Eğer lenfosit işaretleme alanında %90 üzerinde lenfosit yoksa elde edilen
sonuçlarda düzeltme yapılması gereklidir. Bu düzeltme işlemi elde edilen antikor
pozitifliğinin
işaretleme
alanındaki
lenfosit
saflık
oranına
bölümü
ile
yapılmaktadır. Örneğin CD4 %44 oranında pozitifse ve işaretli alanda lenfosit
oranı %83 saflıkta ise 44:0.83= %53 gerçek CD4 pozitifliği oranıdır.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Şekil 3. Lenfosit Alt Grupları için “dot plot” grafiklerle antikor pozitiflikleri.
Çok
renkli
çalışmalarda
renk
ayrımının
(kompenzasyon)
doğru
yapılması
önemlidir. Son beş yılda geliştirilen akan hücre ölçer sistemlerinde renk ayırımı
analiz sonrasında da yapılabilmektedir; ancak şu anda ülkemizde yaygın olarak
kullanılan eski sistemlerde, örneklerin geçmesi aşamasında renk ayırımı ayarlarını
yaparak örnek analizi yapılması gereklidir. Doğru kompenzasyon yapabilmek için
çok renkli çalışmada kullanılan antikorların tek renkle geçirildiklerinde elde edilen
pozitiflikleri ile renk ayrımı sonrasında elde edilen pozitiflikleri karşılaştırılmalıdır.
FL2
FL1
Şekil 4. Solda kompenzasyonu yapılmamış çifte pozitiflik var gibi görünen grafik,
sağda aynı verilerle kompenzasyon yapılmış olan grafik.
Analiz sırasında en sık karşılaşılan sorunlar ve çözüm önerileri Tablo 3’te
sunulmuştur.
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Tablo
3.
İmmünfenotipleme
Analizinde
Karşılaşılan
Sorunlar
ve
Çözümleri
SORUNLAR
“Non specific” bağlanma
ÇÖZÜMLERİ
Ortamda ölü hücreler varsa işaretleme ya da
canlılık boyaları (7-AAD, PI) ile
canlı hücrelerin ayrılması
Fc reseptör bloklama
İnsan IgG veya PBS içinde %10 otolog serum
(AB serum da olabilir)
Reseptör “recycling” (Antijenin yüzeyde daha az
oranda eksprese edilmesi)
Örnek çalışılırken uyulması gereken ortam
şartlarının (ısı, nem vb) uygun olması,
santrifüjlemede hız ve sürelere azami uyum
gösterilmesi
Yüksek oranda öz ışıma (otofloresans)
Her panelde antikor ve boya olmadan tüm
işlemlerden geçirilmiş bir ilk tüp kullanımı
İlaç kullanımı ile ilgili bilgilerin bilinmesi (Bazı
antibiyotikler ve anti kanser ilaçlar hücrelerin öz
ışımasını artırmaktadır)
Renklerin karışımı
Kompenzasyon
İlk kez çalışılan testlerde tek renkli antikorla
kontrol
Çok soluk ya da parlak boyanmaların olması
Antikorların titrasyonu
Sistem kalibrasyonu, PMT’lerin kontrolü
Antikor/floresan kombinasyonunun uygun
olmaması
Bazı antikorlar bazı floresan boyalarla birlikte iyi
sonuç vermeyebilirler. Klinik sonuç verilecekse
IVD (in vitro diagnostic use) onayı olan
antikorların kullanımına özen gösterilmelidir.
Protein/floresan konsantrasyonu mümkün
olduğunca 1’e yakın antikorlar kullanılmalıdır.
Analiz sırasında aniden geçişin durması
Aynı panelde tüpler arası saçınım farklılıkları
Hatlarda tıkanıklık olabilir. Önce “Prime”
düğmesine basarak basınçla sıvı geçirmek
gerekir. Hatlar açılmazsa sırası ile proteolitik
solüsyon, düşük konsantrasyonda çamaşır suyu
(%10) ve distile su ile sistemde yıkama
yapılmalıdır.
Akan hücre ölçer sistemlerinin standardizasyonu
İçin günlük, aylık, yıllık kalite kontrol ve
bakımların düzenli olarak yapılması ve takibi,
sistemin UPS aracılığı ile güç kaynağına bağlı
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
olması
Retiküloz, aşırı eksersiz sonrası kan alımı, gün içi değişiklikler, örnek taşıma ve
saklama
koşulları
lenfositler
üzerine
etkidikleri
için
analiz
kalitesini
de
etkilemektedirler. Kortikosteroidlerin kullanımı lenfosit marjinasyonunu artırır,
CD4 pozitifliği bu kişilerde daha düşük düzeyde izlenebilir, bu olgunun hastalığa
bağlı bir değişim olmayabileceği değerlendirilmede göz önünde bulundurulmalıdır.
Akan hücre ölçer testleri için validasyon yapılması oldukça zordur, bu nedenle
daha çok laboratuarlar arası karşılaştırma programlarına katılımla değerlendirme
yapılmaktadır.
3. VERİ ANALİZİ
Veri analizinde tüm belirteçler için aynı işaretli bölgeden analiz yapılması
gereklidir. İşaretlemede her laboratuvar kendine özgü yöntemi seçmekte özgür
olsa da, genel geçer kurallara uyulması gereklidir. FS/SS (Forward Scatter/Side
Scatter), CD45/SS, CD3, CD19 vb işaretli bölgelerden analiz yapılabilmesi
mümkündür. Son yıllarda daha çok tercih edilen yöntem CD45/SS işaretleme
bölgesinin kullanımıdır. Bu yöntem tercih edildiğinde her tüpte CD45 bulunması
gerekliliği pratikte göz önünden bulundurulması gereken bir unsurdur.
Örneğin: T helper hücrelerin saptanmasına yönelik CD45-FITC/CD4-PE/CD3PerCp işaretli bir tüpün analizinde;
CD45/SS, CD3/CD45, CD3/CD4 scattergramları olmalıdır. Bu scattergramlardan
birincisinde (CD45/SS) CD45 pozitif hücreler üzerinde ilk işaretleme alanı (Gate
1) CD3/CD45 scattergramında ise ikinci işaretleme alanı olmalıdır (CD3+ hücreler
üzerinde), üçüncü scattergram ikinci scattergramda yapılan işaretleme üzerinden
CD3+ hücreler içinde CD3+CD4+ hücrelerin oranını sağlamalıdır. Tüm hücreler
içindeki CD3+CD4+ hücreler saptanmak isteniyorsa CD45/SS ile izlenen işaretli
alandan ölçüm yapılmalıdır (Şekil 1).
Örnek analizinin doğrulaması için sık kullanılan öğelerden birisi “Lymphosum”
hesaplanmasıdır (5). Aşağıdaki formülle hesaplanmaktadır.
“Lymphosum” = T hücre + B hücre + NK hücre = %100 ± 5
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
Örneğin: “Lymphosum” = CD3 + CD19 + CD56 = %100 ± 5
Benzer bir formülle (CD2 + CD19/CD20 = %95 ± 5) de doğrulama yapılabileceği
de bildirilmektedir ancak pratikte daha çok CD3, CD19 ve CD56 ile hesaplama
yapılan formül kullanılmaktadır (6).
Tekrarlanabilirlik için en sık uygulanan yöntem aynı hastadan en az üç,
mümkünse altı ayrı örnek aynı anda alınıp her biri ayrı ayrı boyanır. Örnekler
arasında ±%3 farklılık kabul edilebilir değerdir. Bu değer dışında değerler elde
ediliyorsa yöntem, sistem ve kullanıcı ile ilgili olası sorunlar gözden geçirilmelidir.
Veri analizi için geliştirilmiş manuel, otomatik ve yarı otomatik modlarla çalışan
bir çok yazılım programı bulunmaktadır. Her üretici kendi yazılım programını
sistemle birlikte sağlamaktadır ancak gereksinimlere yönelik geliştirilmiş bağımsız
yazılım programları olan Flow Jo, FCS Express gibi programlar da yaygın olarak
kullanılmaktadır. Özellikle çoklu analizler için gelişkin yazılım programlarının
kullanılması bir çok bilgiye daha doğru ve hızlı erişimi sağlamaktadır.
Veri analizi için sorunlu alanlardan birisi veri analizinin kullanımı iyi bilen kişiler
tarafından daha çok manuel yöntemlerle yapılmasıdır, ancak son yıllarda
geliştirilen programlarla 96 ve 384 kuyucuklu mikro plaklardan dahi okuma yapıp
otomatik analiz yapacak sistemler geliştirilmektedir.
4. RAPORLAMA
Lenfosit immünfenotipleme raporlarında ülkemizde geliştirilmiş bir standart
format bulunmamaktadır. Yurt dışında yapılan standardizasyon çalışmalarında
her raporda hasta kimlik bilgilerinin yanı sıra örnekteki hücre miktarı, örnek alma
tarihi, çalışma tarihi, çalışmayı yapan kurum, teknisyen ve onaylayan kişi ile ilgili
bilgilerle birlikte kullanılan monoklonal antikorların IVD (in vitro diagnostic use –
in vitro tanıda kullanım) onayı olup olmadığı, kullanılan sistem, dış kalite kontrol
programı katılımı vb bilgilerin yer alması önerilmektedir. Tek başına yüzde
pozitifliklerin sonuç olarak verilmesi uygun bulunmamaktadır. Absolut değerler ve
mümkün ise MFI (Mean Florescent Intensity – Ortalama Floresan Yoğunluğu) ya
da MESF (Molecular Equivalent of Soluble Florochromes)
değerlerinin birlikte
verilmesi önerilmektedir. Parlak ve soluk boyanmalar, farklı boyanma özellikleri
gösteren hücre grupları raporda bildirilmelidir.
Absolut değerlendirmeler örnek
analizi sırasında referans boncuklar (TruCount vb) geçirilerek tek aşamada
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
yapılabileceği gibi kan sayım sonuçlarından yararlanılarak iki aşamada da
yapılabilir. İki aşamalı yöntemde aşağıdaki formül uygulanır:
Lökosit sayısı x %lenfosit x %antikor pozitifliği = Absolut sayı/μL
10,000
Yaş ve cinsiyete uygun normal değerler, her laboratuarın kendi popülasyonu için
oluşturması gereken değerlerdir. Genel bir referans kullanılması istenirse,
çocuklar için yurdumuzda yapılmış, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından
yayınlanmış sağlıklı bir çalışmanın sonuçları referans değerler olarak kullanılabilir
(7).
Lenfosit immünfenotiplemesi ile bazı hastalıkların prognozu, bazı tedavi ya da
uygulamalara oluşturacakları immün yanıtın önceden tahmin edilebilmesi de
mümkün olmaktadır. HIV
Syndrome)
hastalığının
ile
tanı,
oluşan
AIDS (Acquired Immune
takip
ve
tedavisinde
CD4
Deficiency
ve
CD38
immünfenotiplemesi önemli bir yer tutmaktadır. Hematopoietik kök hücre
transplantlarında, transplanttan sonra ilk 7-21 saatte CD3+CD4+CD8β+ hücrelerin
oranında artış olması GvHD (Graft versus Host Disease) için yüksek oranda
prediktif bir test olarak bildirilmektedir (8).
5. DİĞER BİLGİLER
İmmunfenotipleme sonuçları her ne kadar çok gelişmiş akan hücre ölçer
sistemleri ile elde ediliyor olsa da yorumlanarak hasta sonucu verilen testler
olması nedeni ile kullanıcı ve raporlama yapan doktorun bilgi birikimi ve deneyimi
sonucu etkilemektedir.
Rutin lenfosit immünfenotiplemesi yapan tüm laboratuvarların dış kalite kontrol
programlarına katılarak sonuçlarının karşılaştırılabilirliğini saptaması gereklidir.
Dış kalite kontrol programları sayesinde rutin uygulamada fark edilemeyen bir
çok aksaklık gözlenebilir (9). Özellikle ABD’de akan hücre ölçer laboratuarları
karşılaştırma
programlarında
aldıkları
sonuçlara
göre
sınıflandırılmakta,
karşılaştırma programlarında kabul edilir (acceptable) sonuç alan laboratuarlara
sertifika verilirken herhangi bir dönemde geçerli sonucu olmayan laboratuar
sertifikalı aşamasından bir alt aşama olan “provisionally certified” konumuna
geçmektedir. Üst üste iki dönem yeniden geçerli sonuç alan laboratuarların
yeniden sertifikalı olmaya hak kazanmaktadırlar. Birbirini izleyen üç dönemde
olumsuz
sonuç
alan
laboratuarlar
“suspended”
laboratuar
olarak
TÜRK İMMUNOLOJİ DERNEĞİ
AKAN HÜCRE ÖLÇER ALT GRUBU
KILAVUZ BİLGİLER - 1
değerlendirilmektedirler.
Ülkemizde
gönüllü
katılımla
üç
yıldan
beri
gerçekleştirilen bir lenfosit alt grupları laboratuarlar arası karşılaştırma programı
bulunmaktadır.
İmmünfenotipleme sonuçlarının nihai değerlendirmesi ilgili klinisyen tarafından
yapılacaktır. Ancak örnek ya da sonuç ile ilgili özellikli durum söz konusu ise
laboratuvar
hekimi
bu
durumu
raporda
belirtmelidir.
Sadece
lenfosit
immunfenotiplemesi için değil tüm akan hücre ölçer testleri için; kalibrasyonu iyi
yapılmış sistemlerde, optimizasyonu iyi yapılmış hazırlık yöntemleri ile bilinçli
kullanıcıların test üretmeleri hasta sağlığı ve hekimin sonuçların doğru kullanımı
açısından önemlidir.
Kaynaklar:
1. Rich RR. The human immune response. Clinical Immunology, Principles and Practice.
Editörler: Rich RR, Fleisher TA, Shearer WT, Schroeder HW, Frew AJ, Weyand CM. Mosby
Elsevier, ABD, say. 3 – 17, 2008.
2. Abbas AK ve ark. Cells and Tissues of the Adaptive System, Cellular and Molecular
Immunology Int. Edition (6th ed.), 2007.
3. Landay A, Ohlsson-Wilhelm B, Giorgi JV. Application of flow cytometry to the
study of HIV infection. AIDS 4:479-497, 1990.
4. Landay A, Auer R, Duque R et al. Quality assurance and immunophenotyping of
peripheral blood lymphocytes; Tentative guideline. National Committee for Clinical
Laboratory Standards 1992;Guideline No H42T.
5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Enumeration of Immunologically
Defined Cell Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline, 2nd ed. CLSI
document H42-A2. Wayne, PA:Clinical and Laboratory Standards Institute; 2007.
6. Perfetto S, Ross W, Riley RS ve ark. Quality assurance and quality control in flow
cytometry. Riley RS, Mahin EJ, Ross W. Editörler. Clinical Applications of Flow
Cytometry. New York, NY: Igaku-Shoin; 1993.
7. İkincioğulları A, Kendirli T, Doğu F, Eğin Y, Reisli I, Cin S, Babacan E. Peripheral
blood lymphocyte subsets in healthy Turkish children. Turk J Pediatr. 46(2):125130, 2004.
8. Brinkman RR, Gasparetto M, Shang-Yung JL, Ribickas A, Perkins J, Jannsen W,
Smiley R, Smith C. High content flow cytometry and temporal data analysis for
defining a cellular signature of Graft versus Host Disease. Biol Blood Marrow
Transplant. 13(6):691-700, 2007.
9. Centro FC PT ILC programı, TÜRKAK web sitesi.
http://www.turkak.org.tr/pt/ab_proje.asp?#YTler
10. Gratama JW, Kraan J, Van den Beemd R, Hooibrink B, Van Bockstaele DR,
Hooijkaas H. Analysis of Variation in Results of Flow Cytometric Lymphocyte
Immunophenotyping in a Multicenter StudyCytometry (Communications in Clinical
Cytometry) 30:166–177, 1997.