Mikrobiyoloji Laboratuvar* Ders 2

Mikrobiyoloji Laboratuvarı
Ders 2
Arş. Gör. Ayşenur YAZICI
Erzurum Teknik Üniversitesi
Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
2017
Mikrobiyoloji Çalışma Alanları
Birçok mikrobiyolojik proseste, çalışma malzemelerinin,
besiyerlerinin ve stok kültürlerin çevrede bulunan mikroorganizmaların
oluşturacağı kontaminasyondan korunması gerekmektedir. Bu
bakımdan aseptik teknikler, çalışmanın güvenilirliği ve doğruluğu
açısından önem taşımaktadır.
Laboratuvar dizaynı
Laboratuvar dizaynı
Bakteri ve Fungus çalışma alanlarının temizliği
için gerekli olan malzemeler
Dezenfektan solüsyonları olarak %70’lik Etil Alkol, %4’lük Çamaşır suyu
kullanılır.
Bünzen beki ve UV strerilizatörleri çalışma ortamının havasını temizler.
Çalışma ortamı %70’lik EtOH ile temizlenmelidir. Kültürlerle çalışırken
veya inkübatör dışında kültürler varken kesinlikle yeme ve içme
yapılmamalıdır.
Birçok mikroorganizma yüksek sıcaklığa, kurutmaya ve kaynatmaya
dirençli sporları üretirler. Bu sporlar yüksek basınç ve sıcaklık
koşullarında belirli bir süre tutularak ortamdan uzaklaştırılabilir. Bu
işlemi düdüklü tencere mantığı ile çalışan otoklav adlı cihaz otomatik
olarak yapmaktadır.
Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon
Tarihçe
• Mikroorganizmaların varlığı henüz bilinmemesine rağmen yazılı
insanlık tarihinin ilk başlarından beri insanlar, hastalıklara karşı
koymak amacı ile dezenfeksiyon ve sterilizasyon işlemlerini
uygulamışlardır.
Tarihçe
• Eski Mısırlılar, enfeksiyöz maddeleri sterilize ve mumyaları dezenfekte
etmek için ateşi kullanmışlardır.
Tarihçe
• Yunanlılar binalarını dezenfekte etmek için kükürt yakarlarken,
Yahudiler cüzzamlı hastaları izole edip geride kalan bütün eşyaları
yakmışlardır.
Tarihçe
• 16.yüzyılda veba salgınında da ölenlerin vücutları, topluca yakılarak
ortadan kaldırılmıştır.
12
Tarihçe
• Dezenfeksiyon amacıyla kimyasal maddelerin kullanımı ve
sterilizasyon amacı ile ışığın kullanımı 19. asırda Robert Koch, Louis
pasteur ve Joseph Lister sayesinde olmuştur.
13
Sterilizasyon
• Herhangi bir cismin veya maddenin, birlikte bulunduğu tüm
mikroorganizmaların her türlü canlı şekillerinden, tamamen
temizlenmesi işlemidir.
• Sterilizasyon kesin bir ifadedir.
Bir nesne veya ortam ya sterildir ya da değildir, az steril veya çok
steril gibi bir ifadeler yanlıştır.
Sterilizasyon
Sterilite Güvenilirlik Düzeyi (Sterility Assurance Level)
• Sterilizasyondan sonra ortamda canlı mikroorganizma bulunma
ihtimalidir.
• Günümüzde kabul edilebilir sterilite güvenilirlik düzeyi;
ortamdaki bakteri sporlarını 1/1.000.000 (log 10-6 - % 99.9999)
azaltan sterilite güvenilirlik düzeyidir.
• Bu tanım sterilizasyon işleminin pratikte ölçülebilir, kontrol edilebilir
olmasını sağlamıştır.
Dezenfeksiyon
• Mikrobiyal kontaminasyonun kabul edilebilir güvenlik sınırlarına çekildiği,
bakteriyel sporların büyük bir kısmının etkilenmediği, gerçek anlamda
yalnızca patojen mikroorganizmaları bulundukları cansız ortamdan
uzaklaştırma işlemidir
Dezenfektan
Dezenfeksiyon işleminde kullanılan kimyasal maddelerdir
Dekontaminasyon
• Nesnelerden veya canlı dokulardan patojen mikroorganizmaların
temizlik, dezenfeksiyon, sterilizasyon ve/veya antisepti ile
uzaklaştırma işlemidir
Antisepsi
• Patojen mikroorganizmaları öldürmek veya çoğalmalarını önlemek
için vücut yüzeyine yerel olarak kimyasal maddelerin uygulanmasıdır.
Antiseptik
Mikroorganizmalara uygulandığında üremelerini önleyerek veya onları
öldürerek zararsız hale getiren,özellikle canlı dokulara uygulanabilen
maddelerdir.
Sterilizasyon Yöntemleri
I-YÜKSEK ISI İLE STERİLİZASYON
1-Kuru ısı
2-Kızıl dereceye kadar ısıtma veya yakma
3-Alevden geçirme
4-Nemli ısı
A-Sıcak su
- Kaynatma
- Tindalizasyon
B-Buharlı ısı
- Basınçlı buhar
- Basınçsız buhar
II-SÜZME (FİLTRE) İLE STERİLİZASYON
III-KİMYASAL MADDELERLE STERİLİZASYON
1-Sıvı ortama kimyasal maddeler ekleme
A-Timol
B-Kloroform
2-Gaz uygulama
A-Etilen oksit
B-Beta propiolakton
IV-IŞINLARLA STERİLİZASYON
1- Ultraviyole
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon
• En sık kullanılan sterilizasyon yöntemidir.
• Yüksek ısı ile, mikroorganizmaların proteinleri denatüre olur.
• Basit, ucuz ve hızlı sonuç alınır.
•Hem çalışanlar hem de doğa açısından toksik atık oluşturmaz
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon
Isı Derecesi: Isı derecesi arttıkça sterilizasyon işleminin süresi kısalır
pH: Nötr ortamda sterilizasyon süresi uzar. Asit ve alkali ortamlarda ise
kısalır.
Ortamın Nemi: Nem oranı arttıkça gerekli ısı derecesi ve etki süresi
kısalır. Mikroorganizma içindeki su oranı arttıkça protein koagülasyonu
çabuklaşacağından sterilizasyon kolaylaşır (Bakteri sporları içinde su az
olduğundan sterilizasyona daha dayanıklıdır).
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon çeşitleri
Su buharı ile sterilizasyon
Basınçsız buharla
sterilizasyon
Basınçlı Buharla
Sterilizasyon
A) Nemli ısı ile
sterilizasyon
Kaynatma
Sıcak su ile sterilizasyon
Tindalizasyon
Pastör fırını
B) Kuru ısı ile
sterilizasyon
Yakma ve alevden geçirme
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon çeşitleri
A) Nemli ısı ile sterilizasyon
• Su buharı ile sterilizasyon
a) Basınçsız buharla sterilizasyon
Arnold kazanı = Koch kazanı. Doymuş ve akım halindeki basınçsız
su buharı ortamında 100 oC de en az 30 dakikada yapılan sterilizasyon.
Yüksek ısıya dayanıksız maddelerin sterilizasyonu bu yöntemle yapılır.
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon çeşitleri
A) Nemli ısı ile sterilizasyon
• Su buharı ile sterilizasyon
b) Basınçlı buharla sterilizasyon
Buharla doymuş bir ortamda, basınç altında ve 100 oC nin
üzerindeki ısılarda yapılan sterilizasyondur.
İlk otoklav 1879 da
Charles Chamberland
tarafından geliştirilmiştir.
Otoklava malzeme yerleştirilirken nelere dikkat edilmeli ?
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Buhar geçirgenliğine sahip malzeme ile paketleme yapılmalı.
Eşyalar çok sıkışık olarak yerleştirilmemeli, aralarında buhar geçişine ve
dolanımına uygun boşluk bulunmalı.
Malzeme otoklava girmeden önce temizlenip kurutulmalı, sonra
paketlenmeli.
Buhar girişini ve vakumlamayı engelleyecek büyüklükte paketleme
yapılmamalı.
Kullanılan buharın kalitesi çok iyi olmalı ve içerisinde sıvı halde su
bulunmamalı.
Sıvıların sterilizasyonunda, çözeltiler bulundukları kabın % 80 ine kadar
doldurulmalı.
Sterilizasyon sırasında otoklav içinde kesinlikle hava kalmamalı. Bu, ısının
yükselmesini ve havanın bulunduğu kısımdaki malzemeye (genellikle cihazın
alt kısmı) buharın girmesini engeller (hava yastığı).
Otoklav kazaları
45 ton ağırlığında bir otoklav
(çap 4 m, uzunluk 26 m)
4500 m uzağa fırladı
40 kg TNT eşdeğeri patlama
Otoklav kazaları
Otoklav kazaları
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon çeşitleri
A) Nemli ısı ile sterilizasyon
• Sıcak su ile sterilizasyon
a) Kaynatma
100 oC de 5-10 dk kaynatma ile dezenfeksiyon, 30 dakika kaynatma
ile sterilizasyon sağlanabilir . Musluk suyu kireçli olabileceğinden, damıtık su
tercih edilmeli.
-SS, DCA, TCBS, Selenit F, Tetratiyonatlı buyyon gibi bazı besiyerlerinin
sterilizasyonunda da kullanılır.
-100C’de 5-10 dk da penset, makas, bisturi gibi maddelerin
dezenfeksiyonu
b) Tindalizasyon
• Benmari denilen sterilizasyon aleti içerisinde yapılır.
• Steril edilecek malzeme 56 - 100 oC'de üç gün süreyle, 30-60 dakika tutularak
yapılır.
• Her tindalizasyon işleminden sonra 1 gece oda ısısında bekletilir.
• Bu bekleme sırasında ortamda bulunan sporlu bakteriler açılarak, vejetatif hale
geçerler.
• İlk günkü işlemde ortamdaki sporsuz bakteriler ölürler.
• İkinci günkü işlemde açılan sporlu bakterilerin vejetatif şekilleri ölürler.
• Üçüncü günkü işlemde ise ortamda kalmış olan sporlardan oluşabilen vejetatif
bakteriler ölürler.
34
Sterilizasyon Yöntemleri
Isı ile sterilizasyon çeşitleri
B) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon
• Pastör fırını
Avantajları
kurulması ve bakımı kolaydır. Metal aletlerde aşınmaya (neden olmaz tek
bir parametre (ısı) ile kontrol edilebilir
Dezavantajları
ısıya duyarlı malzemelerin sterilizasyonunda kullanılamaz yüksek ısı ve uzun
süreye gereksinim gösterir. Sporlar kuru ısıya nemli ısıdan daha dirençli.
Sterilizasyon Yöntemleri
Süzme ile filtrasyon
Süzme mekanizmalarına göre;
a) adsorbsiyonla mikroorganizmaları tutan süzgeçler
(Berkfeld, Chamberland, Seitz gibi)
Bakteri yüzeyi ile, filtrenin elektrik yükünde farklılık nedeniyle, süzme
işlemi sırasında bakteriler filtrenin deliklerine yapışarak adsorbe olurlar.
Bu sayede süzüntüye geçemezler.
b) mikroorganizmaları mekanik olarak tutan süzgeçler (HEPA filtreler)
Filtrenin delikleri bakterilerden küçük olduğu için bakterileri tutarlar.
Bakteriler filtrenin üzerinde kaldığı için, süzüntü steril hale gelir.
Sterilizasyon Yöntemleri
Süzme ile filtrasyon
• Filtre gözenek çapları bazı büyük protein moleküllerinin geçebileceği
boyutlarla küçük virüs partiküllerinin geçebileceği boyutlara kadar farklı
genişliktedir
Gözenek çapları;
tüm bakteriler için 0.2 µm
maya hücreleri için 3 µm
virüsler için 0.2 µm
•Filtrelerin periyodik olarak kontrolü yapılmalı, temizlik ve değişim
işlemleri aksatılmamalıdır
Sterilizasyon Yöntemleri
Süzme ile filtrasyon
Mikrobiyolojide filtrelerin kullanım alanları;
• çözeltilerin ve havanın sterilizasyonu
• farklı büyüklükteki mikroorganizmaların birbirinden ayrılması
• toksin, antijen, ve enzimlerin hücrelerden arındırılması
• çözeltilerin saflaştırılması
Sterilizasyon Yöntemleri
Işınlama ile sterilizasyon
• Isı ve diğer yöntemlerle steril edilemeyen ortamların sterilizasyonu
• Kullanım alanları sınırlı
• Çevreye de etkili olduklarından sınırlı olarak ve önlem alınarak
uygulanabilir.
Sterilizasyon Yöntemleri
Işınlama ile sterilizasyon
a. İyonize edici radyasyon
•
X ışınları, gama ışınları, beta ışınları
•
- mikroorganizmların nükleik asitlerine etki ederler.
•
Uygulama alanları sınırlı, maliyeti yüksek ve insan sağlığı yönünden tehlikeli
(mutajenik)
•
Daha çok oda ve alet dezenfeksiyonunda kullanılır.
Sterilizasyon Yöntemleri
Işınlama ile sterilizasyon
b. UV ışınları (mor ötesi ışınlar)
• Dezenfeksiyon için gerekli dalga boyu 253.4 nm
• İyonize ışınların aksine radyasyon enerjileri ve penetrasyon güçleri azdır
•
Bu nedenle daha çok hava, su ve yüzey sterilizasyonunda kullanılır
Mikroorganizmaların DNA
yapılarını kırar, ya replikasyon
inhibe olur ya da mutasyon
Sterilizasyon Yöntemleri
Işınlama ile sterilizasyon
b. UV ışınları (mor ötesi ışınlar)
•
UV lambaları ve UV sterilizatörleri
•
UV stalizatör su içindeki mikroorganizmaların %99.99’nu yok eder
•
Ameliyathaneler, doku kültürü yapılan odalar, antibiyotiklerin
hazırlandığı odalar, mikoloji laboratuvarında kullanılırlar.
Sterilizasyon Yöntemleri
Kimyasal maddeler ile dezenfeksiyon ve sterilizasyon
• Dezenfeksiyon, sterilizasyondan sporisid aktivitesinin olmaması ile ayrılır.
• Dezenfektanlardan farklı olarak endosporlara da etkili olan sterilanların
kullanıma girmesiyle günümüzde dezenfeksiyon terimi, mikrobiyal
kontaminasyonu minimal düzeye düşürmekten, sterilizasyona kadar uzanan
geniş bir kavramı içine alır.
Sterilizasyon Yöntemleri
Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon
Yüksek seviyeli dezenfektanlar
Bakteri sporları hariç mikroorganizmaların tümünü 20 dakikada, 6-10 saatte
bakteri sporlarını da öldürdüğünden, yüksek seviyeli dezenfektan olarak
değerlendirilir.
Sterilizasyon Yöntemleri
Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon
Orta seviyeli dezenfektanlar
Bakteri sporları hariç Tüberküloz basili ve diğer mikroorganizmalara yaklaşık
10 dakikada etkili dezenfektanlar
Sterilizasyon Yöntemleri
Kimyasal maddeler ile sterilizasyon ve dezenfeksiyon
Düşük seviyeli dezenfektanlar
Vejetatif bak.lerin çoğunu, bazı mantarları ve yaklaşık 10 dk’da bazı virusları
öldürebilen dezenfektanlar
Bakteri sporları ve Tbc basiline etkili değil
Sterilizasyon Yöntemleri
Kimyasal maddeler ile sterilizasyon (soğuk sterlizasyon)
•
ETİLEN OKSİT (EO)
•
HİDROJEN PEROKSİT
•
PERASETİK ASİT
•
OZON
•
KLORİN DİOKSİT (ClO2)
•
DÜŞÜK ISILI BUHAR ve FORMALDEHİT
DİRENÇLİ
Prionlar
STERİLİZASYON
Bakteriyel Sporlar
B. subtilis
Mikobakteriler
Mycobacterium tuberculosis
Lipid içermeyen veya küçük viruslar
Rhinovirus, Coxsackie virus
Mantarlar
Candida sp.
Vejetatif bakteriler
P. aeruginosa, S. aureus
Yüksek Düzey
Orta Düzey
Düşük Düzey
Lipid içeren veya orta büyüklükteki viruslar
HBV, Herpes simplex virus, HIV
DUYARLI
mikroorganizmaların dezenfektanlara direnci ve dezenfeksiyon düzeyi