Yeni Nesil Dizileme Sistemleri

Yeni Nesil Dizileme Sistemleri
Barı
ş Otlu
İnönü Üniversitesi Tı
p Fakültesi
Tı
bbi Mikrobiyoloji Anabilimdalı
5. Yeni Nesil Dizileme Kongresi
Yeni Nesil Dizileme Pazarı
milyar dolar
•2018 de tahmin edilen pazar payı4 milyar dolar.
cihaz
sarf malzeme
http://www.electronics.ca/store/next-generation-sequencing.html
Kişisel Genom Bilgisi
• 1982 «Human Polymorphism Study Center» ilk akademik enstitü Paris’te
kuruldu. Amacıinsan nüfusunun tüm olasıpolimorfizmleri bir envanterini yapmak
ve hastalı
klar ile ilişkilendirmek.
1975-“Plus and Minus” Yöntemi
• Sanger ve Coulson tarafı
ndan bu metod, sonraki 30 yı
l süresince geliştirilerek
modern dizileme yöntemleri için yol gösterici olmuştur.
ATGCTGC
Kalıp DNA
DNA
polimeraz
4 dNTP
Biri 32P ile işaretli
ATGCTGC
+C +T +A+G-C-T -A -G
T
primer IIIIII
IIIIII
TACG
1975-“Plus and Minus” Yöntemi
• ΦX174 Bakteriyofajı
nı
n “tümü genomu” dizilendi.
1977-Maxam-Gilbert Yöntemi
• DNA’nı
n kimyasal modifikasyonunu takiben DNA’nı
n özgül bölgelerden kı
rı
lması
prensibine dayanı
r.
poliakrilamid jel
32
32
32
32
32 32 32 32
P
PPGGGC
CC
P
TTT
G
A
AA
PC
C
P
T
G
G
A
T32
G
P
T
C
C
G
A
T
G
A
5’--32
P
C
T
ACG
CPC
G
PT
GA--3’
A+G
G
C
C+T
1977- Sanger zincir sonlandı
rma
5’
A A T C T GGGC T A C T CGG G CG TG C G T T
A C G C A Aprimer
A G C C C CG
C AA C G C A A
GC
CA
AC G C AA
GC
A T GA G C C C CG
CC
A C C C GA TG
CC
CC
GC
CG
C AA C G C A A
GA
GC
AG
A G A C C C G A T G A G C C C C GC A C G C A A
poliakrilamid jel
dNTP’s
A
C
G T
A
G
P32
ddNTP’s
ATGC
G
A
G
A
G
3’
1986- İlk Otomatize Cihaz
• Leroy hood ve Aplied Biosystem tarafı
ndan tanı
tı
ldı
.
1990-İnsan Genom Projesinin Başlaması
1995- İlk Bakteriyel Tüm Genomun Dizilenmesi
• Haemophilus influenzae ve Mycoplasma genitalium’un tüm genom dizilemesinin
yapı
ldı
ğıduyurulmuştur.
1995- İlk Bakteriyel Tüm Genomun Dizilenmesi
• Bu çalı
şmada; yeni nesil dizileme sistemlerine de temel oluşturacak
“shotgun dizileme” yaklaşı
mıortaya konmuş
tüm genom
ATGCTATGT
GCTATGTATGC
GCGCTAGCT
GCTATGTAT
ACTGCTGTCGAATCGGCCTTTAAGGCTGACTGGTAGCCCGTGAGAGATTTGA
1995- İlk Bakteriyel Tüm Genomun Dizilenmesi
• Her bir DNA parçası
nı
n ayrıayrıdizilenebilmesi için izole edilebilmesi gereklidir.
RE
tüm genom
RE ile kesim
parçaları
n
plazmite
aktarı
lması
klonal çoğalma
RE
RE
RE
RE
RE
RE
1995- İlk Bakteriyel Tüm Genomun Dizilenmesi
• Yine bu çalı
şmada;
yeni nesil dizileme sistemlerine de temel oluşturacak basamaklar belirlenmiştir.
library construction
DNA’nın parçalara ayrılarak
kütüphanenin oluşturulması
high-throughput sequencing
DNA parçalarının ayrı ayrı
dizilenmesi
assembly
dizilerin birleştirilmesi
1998-Celera
• İnsan genom projesine, Craig Venter’in kurduğu Celera adlıözel teşebbüs dahil
olmuştur. Geliştirilen en kritik sistem 96 örneği 3 saat içinde çalı
şabilen
ABI Prisim 3700 sistemidir.
3 ay içerisinde 20 Gb genom dizileme
2001-İnsan Genom Projesinin Tamamlanması
2001-İnsan Genom Projesinin Tamamlanması
• Projenin tamamlanması
;
postgenomik alanı
n başlangı
cı
nıoluşturmuş.
• Yaklaşı
k 3 milyar dolar harcanmı
ş 11 yı
l süre geçmiştir
• Yöntemler;
- yoğun emek gerektiren,
- zaman alı
cıve oldukça maliyetli.
• İnsan genom projesi dizileme teknolojileri ile ilgili yeni yaklaşı
mlara ihtiyaç
olduğunun fark edilmesine ve birçok yeni fikrin doğması
na da neden olmuştur.
Yeni Nesil Dizileme Sistemlerinin Doğuşu
• Bu dizileme sistemleriyle;
yüksek doğrulukta ve hı
zda dizileme yapabilmekte ve
genom dizi bilinmeyen bir canlı
nı
n genom dizisinin ortaya çı
karı
labilmektedir.
(De Novo dizileme).
• Bu sistemlerin ortak özeliği;
• Aynıanda milyonlarca kı
sa dizilemenin yapı
lması
dı
r.
Massive Paralel Sequencing
Yeni Nesil Dizileme Sistemlerinin Doğuşu
454 Life Science Roche Applied Science
• Pirodizileme ile “sentez yoluyla dizileme” prensibine dayalı
dı
r.
Kütüphanenin hazırlanması
Genomik DNA ‘nın
RE ile parçalara
ayrılması
adaptör moleküllerin
eklenmesi ve
denatürasyon
dizileme primerinin
bağlanacağı adaptör
PCR primerinin
bağlanacağı adaptör
DNA parçalarının yakalanması ve zenginleştirme
454 Life Science Roche Applied Science
Boncuklar santrifüj ile plak tabanı
na çöktürülür
Pirodizileme reaksiyonu ve CCD kamera ile ı
şı
manı
n tespiti
A
T
G
C
Genome Analyzer illumina
• Geliştirilen ikinci yeni nesil dizileme cihazıdır ve farklı bir yöntem kullanılır.
• Tüm reaksiyon mikroskop slaytına benzer katı bir fazda gerçekleştirilir.
Genome Analyzer illumina
tüm genom
kütüphane oluşturulması
bağlanma
ve adaptör moleküllerin
eklenmesi
köprü PCR
DNA pol
Klonal çoğalma ve
kümelerin oluşması
denatürasyon
Genome Analyzer illumina
• Nükleotidlerin 3’ OH uçları kimyasal olarak kapatılmış olduğundan zincir sonlanmasına
neden olur.
T
Yı
kama ve
3’ OH
ucunun
yeniden
açı
lması
T
G
T
G
C
Yı
kama
T
G
C
Yı
kama
T
T
G
C
T
A
Yı
kama
T
G
C
T
A
HiSeq 2000 illumina
• Tek yükleme ile iki bireye ait genomu kişi başı10.000 dolarlı
k bir maliyetle
dizileyebilmektedir.
Kütüphane hazı
rlanması
1-14 gün
Zenginleştirme
5 saat
Sentez ile dizileme
2-10 gün
Verilerin analizi
2 gün
Intelligent Bio-Systems Qiagen
SOLID Applied Biosytem
• Örneğin hazırlık aşamaları, hedefin klonal (küme) olarak çoğaltılması ve emülsiyon PCR
basamakları 454 sistemine oldukça benzerlik göstermektedir.
adaptör
DNA parçası
adaptör
DNA parçası
DNA parçası
adaptör
adaptör
iç adaptör
SOLID Applied Biosytem
3’
C-T-n-n-n
-z-z
primer
3’
3’
C-A-n-n
-z-z-z
ligaz
adaptör dizi
p5’
G-A
kalıp dizi
ayrı
lma
3’
C-T-n-n-n -z-z
G-A
ayrı
lma
ligaz
3’
p
C-T-n-n-n C-A-n-n-z-z-z
G-T
G-A
3’
-z-z-z
G-G-n-n
3’
-z-z-z
G-C-n-n
İon Torrent
• Herhangi bir optik okuma veya floresan ışımanın yer almadığı bir sistem olan bu sistem
2010 yılında tanıtılmış diğerlerinden oldukça farklı bir sistemdir.
A
C
T
A
T
C
A
C
G
C
G
A
A
G
C
C
A
T
A
G
C
C
A
T
A
G
C
C
A
T
T
C
A
G
C
C
A
T
C
A
G
G
A
C
A
C
T
A
İon Torrent
• İyon yarı iletken dizilemesine dayalı bu dizileme yöntemi, DNA'nın polimerizasyonu
sırasında açığa çıkan hidrojen iyonlarının tespitine dayalıdır.
Yeni Nesil Dizileme Cihazları
:
İlk yeni nesil dizileme sistemleri,
yüksek doğruluk, hı
z ve düşük fiyata tahminden daha hı
zlıeriştiler.
Yöntem iki dezavantaja
Yöntem iki dezavantaja sahipti.
sahipti.
• PCR’ı
n pahalıve zaman alı
cıbir işlem olması
dı
r. • PCR’ı
n pahalıve
• Diğeri ise bu aşamada hatalıbazları
n çoğaltı
lması
dı
r. zaman alı
cıbir
işlem olması
dı
r.
• Diğeri ise bu
aşamada hatalı
bazları
n
çoğaltı
lması
dı
r.
İkinci Yeni Nesil Dizileme Cihazları
:
Tek molekül dizileme sistemleri
Helicos Genetic Analysis Helicos BioSciences
• Bu sistemde, poly(dA) kuyruğu eklenen DNA parçaları
, katıyüzeye bağlanmı
ş
oligo(dT) primerleri ile yakalanı
r.
Helicos Genetic Analysis BioSciences
• Bu sistemde, poly(dA) kuyruğu eklenen DNA parçaları
, katıyüzeye bağlanmı
ş
oligo(dT) primerleri ile yakalanı
r.
G
C
A
C
T
T
T
T
T
T
1
A
C
T
G
C
G
A
A
A
A
A
A
A
T
T
T
T
T
T
2
G
T
C
A
T
C
A
A
A
A
A
A
katı yüzey
T
T
T
T
T
T
3
T
C
A
C
G
T
A
A
A
A
A
A
1
22
33
Pacific Biosciences
“Sı
fı
r mod dalga alanı
” (zero-mode waveguide ZMW) olarak adlandı
rı
lan, optik
kuyucuk tabanı
na tek bir DNA polimeraz bağlanmı
ştı
r.
Pacific Biosciences
“Sı
fı
r mod dalga alanı
” (zero-mode waveguide ZMW) olarak adlandı
rı
lan, optik
kuyucuk tabanı
na tek bir DNA polimeraz bağlanmı
ştı
r.
DNA pol
uyarı
m
ı
şı
ma
Daha da Yeni Nesil Dizileme Sistemleri
Daha da Yeni Nesil Dizileme Sistemleri
Microfluidic DNA Sequencing
Polony Sequencing
Millikan Sequencing by Nucleotide
Single-Molecule DNA Sequencing with Engineered Nanopore